Nghiên cứu phương pháp phát hiện virut HAdV gây bệnh đau mắt đỏ ở việt nam bằng kỹ thuật PCR kết hợp với giải trình tự

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --- Nguyễn Quang Hưng NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN VIRUT HAdV GÂY BỆNH ĐAU MẮT ĐỎ Ở VIỆT NAM BẰNG KỸ THUẬT PCR KẾT HỢP GIẢ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Nguyễn Quang Hưng

NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN VIRUT HAdV GÂY BỆNH ĐAU MẮT ĐỎ Ở VIỆT NAM BẰNG KỸ THUẬT PCR KẾT HỢP GIẢI TRÌNH TỰ

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2017

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-** -

Học viên : Nguyễn Quang Hưng

NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN VIRUT HAdV GÂY BỆNH ĐAU MẮT ĐỎ Ở VIỆT NAM BẰNG KỸ THUẬT PCR KẾT HỢP GIẢI TRÌNH TỰ

QH.2014.T.CH - 60420121

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến tới TS Nguyễn Văn Sáng – giảng viên tại Bộ môn Di truyền, Trường đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học quốc gia Hà Nội, người Thầy đã luôn tận tình hướng dẫn, chỉ bảo trực tiếp giúp em tiếp thu được nhiều kiến thức về kỹ thuật chuyên môn và tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện khóa luận này Những chỉ dẫn của Thầy là định hướng quan trọng cho em trong quá trình thực hiện khóa luận

Tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới TS BS Hoàng Anh Tuấn – Trưởng khoa Xét nghiệm tổng hợp – Bệnh viện Mắt TW, người đã tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn này

Em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới các thầy cô trong Bộ môn Di truyền học, Khoa Sinh học nói riêng và các thầy cô trong Trường Đại học Khoa học Tự nhiên nói chung

Em xin cảm ơn các thầy cô đã hết lòng giảng dạy kiến thức và giúp đỡ em trong suốt bốn năm học vừa qua

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới em Nguyễn Tiến Đạt và Nguyễn Thu Huyền làm việc tại phòng thí nghiệm bộ môn di truyền là những người đã giúp đỡ em rất nhiều trong quá trình em thực hiện đề tài này

Tôi xin chân thành cảm ơn Đại học Quốc gia Hà Nội đã hỗ trợ nghiên cứu này trong

Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn đồng nghiệp anh chị tại Phòng Vi sinh - Khoa Xét nghiệm tổng hợp - Bệnh viện Mắt Trung ương, gia đình, và người thân – những người đã luôn bên cạnh, tạo điều kiện và động viên cho em động lực để phấn đấu trong quá trình học tập cũng như trong quá trình thực hiện khóa luận này

Hà Nội, tháng năm 2017

Nguyễn Quang Hưng

QH.2014.T.CH - 60420121

MỤC LỤC

MỤC LỤC 2

DANH MỤC BẢNG 5

DANH MỤC HÌNH 6

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Bệnh đau mắt đỏ 3

1.1.1 Tình hình bệnh đau mắt đỏ trên thế giới 3

1.1.2 Tình hình bệnh đau mắt đỏ tại Việt Nam 3

1.1.3.Triệu chứng đau mắt đỏ do HAdV 3

1.1.3 Con đường lây lan của bệnh đau mắt đỏ do HAdVs 4

1.2 TỔNG quan về HAdv và HAdv gây bệnh đau mắt đỏ 5

1.2.1 Human Adenovirus (HAdV) 5

1.2.2 HAdV gây bệnh đau mắt đỏ 10

1.3 Phương pháp phát hiện nhanh các chủng HAdV 10

1.3.1 Phương pháp phân lập virut 10

1.3.2 Phương pháp khuếch đại gen chỉ thị 11

1.4 Kỹ thuật PCR 11

1.4.1 Nguyên lý 11

1.4.2 Vùng gen đích và ý nghĩa 12

1.5 Kĩ Thuật Giải trình tự 13

1.6 XÂY DỰNG CÂY CHỦNG LOẠI PHÁT SINH 14

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 17

2.1 ĐỐI tượng nghiên cứu, hóa chất và thiết bị 17

QH.2014.T.CH - 60420121

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 17

2.1.3 Hóa chất 17

2.2 phương pháp nghiên cứu 18

2.2.1 Tách chiết ADN hệ gen của human adenovirus 19

2.2.2 Thiết kế mồi 20

2.2.3 PCR khuếch đại các đoạn gen hexon, penton và fiber 21

2.2.4 Tinh sạch, giải trình tự các đoạn gen hexon, penton và fiber 23

2.2.5 Phân tích trình tự và xây dựng cây mô hình quan hệ di truyền 24

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26

3.1 Kết quả thu thập mẫu bệnh phẩm 26

3.2 KẾT QUẢ KHUẾCH ĐẠI các ĐOẠN GEN chỉ thị 26

3.2.1 Kết quả khuếch đại đoạn gen hexon (600 bp) 26

3.2.2 Kết quả khuếch đại đoạn gen penton (1118 bp) 27

3.2.3 Kết quả khuếch đại đoạn gen fiber (1264 bp) 28

3.3 KẾT QUẢ GIẢI và so sánh trình tự 29

3.3.1 Kết quả phân tích trình tự gen hexon 30

3.3.2 Kết quả phân tích trình tự gen peton 32

3.3.3 Kết quả phân tích trình tự gen fiber 34

3.4 kết quả phân tích cây quan hệ di truyền 39

3.4.1 Phân loại các chủng HAdV dựa trêntrình tự gen hexon 39

3.4.2 Phân loại các chủng HAdV dựa trêntrình tự gen penton 41

3.4.3 Phân loại các chủng HAdV dựa trêntrình tự gen fiber 43

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45

KẾT LUẬN 45

QH.2014.T.CH - 60420121

KIẾN NGHỊ 45

TÀI LIỆU THAM KHẢO 46

QH.2014.T.CH - 60420121

DANH MụC BảNG

Bảng 2 1.Các thiết bị chính sử dụng trong nghiên cứu 18

Bảng 2.2 Tên và trình tự các cặp mồi đã thiết kế 21

Bảng 2.3 Thành phần phản ứng PCR 21

Bảng 3 1Phân tích kết quả giải trình tự gen hexon 30

Bảng 3 2 Phân tích kết quả giải trình tự gen penton 32

Bảng 3 3 Phân tích kết quả giải trình tự gen fiber 34

Bảng 3 4Số lượng các chủng HAdV đã phát hiện dựa trên cả ba đoạn gen hexon, peton và fiber 29

QH.2014.T.CH - 60420121

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Bệnh đau mắt đỏ và hình ảnh mô tả

Hình 1.2 Hình ảnh các hạt Adenovirus trên kính hiển vi điện tử 6

Hình 1.3 Mô hình cấu trúc vỏ capsid của HAdV 7

Hình 1.4 Cấu trúc và tổ chức các gen trong hệ gen HAdV 8

Hình 1.5 Cơ chế xâm nhiễm của HAdV 9

Hình 2.1 Sơ đồ tổng quát quy trình nghiên cứu 19

Hình 2.2 Một phần các trình tự đoạn gen Hexon sau khi so sánh bằng phần mềm MEGA7 24

Hình 3.1.Kết quả điện di sản phảm PCR khuếch đại đoạn gen hexon từ các mẫu bệnh phẩm chứa hệ gen ADN của HAdVs 27

Hình 3.2 Kết quả điện di sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gen penton từ các mẫu bệnh phẩm chứa hệ gen ADN của HAdVs 28

Hình 3.3.Kết quả điện di sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gen fiber 29

Hình 3.4 So sánh trình tự gen hexon của các mẫu đã giải trình tự 31

Hình 3.5 So sánh trình tự gen penton của các mẫu đã giải trình tự 33

Hình 3.6 So sánh trình tự gen fiber của các mẫu đã giải trình tự 37

Hình 3.7 Cây phát sinh chủng loại dựa vào gen hexon 40

Hình 3.8 Cây phát sinh chủng loại dựa vào gen penton 42

Hình 3.9 Cây phát sinh chủng loại dựa vào gen fiber 43

DNA/ADN Deoxyribonucleic Acid

DDW Deionized distill water

di chứng về sau, gây giảm thị lực hoặc thậm chí mù lòa Đau mắt đỏ do nhiều nguyên nhân gây như nhiễm trùng, dị ứng, do hoá chất hoặc các tác nhân vật lý Một trong những tác nhân chính gây ra bệnh đau mắt đỏ ở người là Human Adenovirus (HAdV) Bệnh đau mắt đỏ gây ra bởi HAdV có tốc độ lây lan rất nhanh

và phát triển thành dịch, đe dọa trực tiếp đến sức khỏe cộng đồng

Ở Việt Nam, bệnh đau mắt đỏ do HAdV đã và đang hoành hành liên tục suốt hơn 10 năm qua với số lượng người bị nhiễm rất cao, có năm lên tới 80.000 người Hàng năm, cứ vào khoảng tháng 7 đến tháng 10, khi thời tiết thuận lợi, dịch đau mắt

đỏ do HAdV lại bùng phát Khi bệnh xuất hiện, số lượng bệnh nhân tăng rất nhanh, đặc biệt là ở những nơi có mật độ dân cư cao như trường học, bệnh viện, nhà máy

và các thành phố lớn

Adenovirus (AdV) là nhóm virut thuộc họ Adenoviriae, gồm bốn giống khác nhau; trong đó có giống Mastedenovirus chuyên gây bệnh ở người, được gọi là Human Adenovirus, viết tắt là HAdV Hiện nay có trên 50 chủng adenovirus khác nhau, do đó khả năng phát triển loại vaccine điều trị là rất thấp Do chưa có vaccine phòng bệnh, việc phát hiện sớm tác nhân gây đau mắt đỏ để có phác đồ điều trị phù hợp là rất quan trọng

Trước kia, phương pháp định danh các chủng HAdV thường được thực hiện bằng cách phân lập virut, sau đó xác định nhóm huyết thanh của virut bằng phản ứng ngưng kết kháng nguyên hoặc tách chiết ADN hệ gen và cắt bằng enzyme giới hạn để định loại Những phương pháp này có nhược điểm là phức tạp, tốn thời gian

và có độ chính xác còn hạn chế Do vậy, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu:

“Nghiên cứu phương pháp phát hiện virut HAdV gây bệnh đau mắt đỏ ở Việt

Nam bằng kỹ thuật PCR kết hợp giải trình tự” với các mục tiêu cụ thể sau:

1 Thiết kế được các cặp mồi đặc hiệu phục vụ cho việc nhân gen hexon, penton, fiber của các chủng HAdV gây bệnh đau mắt đỏ

QH.2014.T.CH - 60420121

2

2 Tối ưu được quy trình PCR nhân đặc hiệu các gen hexon, penton, fiber của các

chủng HAdV gây bệnh` đau mắt đỏ

3 Sử dụng quy trình PCR nhân đặc hiệu các gen hexon, penton, fiber trên các mẫu

bệnh phẩm thu được tại Bệnh viện Mắt Trung ương

4 Giải trình tự gen ba gen hexon, penton và fiber và xây dựng được cây chủng

loại phát sinh nhằm xác định chính xác các chủng HAdV tại Việt Nam và chỉ ra được chủng HAdV gây bệnh đau mắt đỏ phổ biến ở Việt Nam

Nghiên cứu này được tài trợ bởi Đại học Quốc gia Hà Nội trong đề tài mã số QG.17.19

QH.2014.T.CH - 60420121

3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1.1 Tình hình bệnh đau mắt đỏ trên thế giới

Bệnh đau mắt đỏ gây ra bởi adenovirut ở người (human adenovirus - HAdV)

là căn bệnh về mắt phổ biến nhất trên thế giới Bệnh có tốc độ lây lan rất nhanh và phát triển thành dịch, đe dọa trực tiếp tới sức khỏe cộng đồng[1;24] HAdV phân bố

ở nhiều vùng địa lý khác nhau trên thế giới và thường xuyên gây ra các trận dịch ở nhiều quốc gia như Mỹ, Đức, Trung Quốc, Hàn Quốc, Đài Loan, Ấn Độ, Nhật Bản, Thái Lan v.v Chỉ tính riêng ở Nhật Bản, trong vòng 10 năm trở lại đây đã ghi nhận ít nhất 3 trận dịch đau mắt đỏ do HAdV Ở Đài Loan cũng ghi nhận 2 trận dịch

1.1.2 Tình hình bệnh đau mắt đỏ tại Việt Nam

Tại Việt Nam đau mắt đỏ là bệnh dịch định kỳ phát sinh khi giao mùa và lây lan nhanh trên diện rộng ở nhiều tỉnh thành Dịch đau mắt đỏ xuất hiện và diễn biến phức tạp, đặc biệt là những đợt bùng phát dịch trên diện rộng trong phạm vi cả nước vào năm 2013 Bệnh đau mắt đỏ đang có tốc độ lây lan khá nhanh trên cả miền Bắc

và miền Nam khiến người dân hoang mang và xáo trộn, ngoài ra bệnh dịch gia tăng khiến dư luận dấy lên nghi ngờ về khả năng cung ứng thuốc phòng và trị bệnh đau mắt đỏ của Việt Nam, điều nay kéo theo nhiều cửa hàng thuốc tây có biểu hiện thông báo cháy hàng nhằm tăng giá chuộc lợi

Theo ghi nhận tại miền Bắc, các tỉnh lân cận và ngoại thành Hà Nội sự bùng phát dịch khiến cho học sinh phải nghỉ học, nhiều người phải nghỉ làm để tránh lây lan cộng đồng Tại bệnh viện Mắt trung ương có khoảng 1200 - 1500 lượt người bệnh đến khám điều trị được bác sĩ chẩn đoán là đau mắt đỏ trong mùa dịch

1.1.3.Triệu chứng đau mắt đỏ do HAdV

Bệnh đau mắt đỏ do HAdV có thể xảy ra ở mọi lứa tuổi, thường khởi phát ở các trẻ nhỏ Bệnh có thể xảy ra ở một mắt nhưng đa số bị bệnh ở cả hai mắt, thông thường một mắt phát bệnh trước vài ngày sau mới phát bệnh ở mắt thứ hai

Người bị bệnh thường cảm thầy khó chịu ở mắt, phải thường xuyên dụi mắt, cảm thấy ngứa, cộm, chói, đau nhức mắt, sợ ánh sáng, chảy nước mắt và đôi khi

QH.2014.T.CH - 60420121

4

sáng ngủ dậy tiết tố kết mạc (dử mắt) làm cho hai mi dính chặt lại nên rất khó mở mắt Đỏ mắt, kết mạc phù nề do cương tụ mạch máu lớp nông của kết mạc, xuất huyết dưới kết mạc, mi mắt có thể sưng nề khiến mắt khó quan sát

Một số trường hợp tiến triển nặng, các sợi Fibrine trong dịch tiết của kết mạc

sẽ kết hợp với tế bào viêm và vi khuẩn tạo thành một màng giả bám chặt ở mặt trong kết mạc, gây sưng húp mi mắt, loét trợt biểu mô giác mạc rất nguy hiểm Có thể kèm theo xuất huyết kết mạc và chảy nước mắt lẫn máu hồng gây tổn thương giác mạc, làm cho giác mạc bị mờ đục do thẩm lậu viêm và apxe, khi đó thị lực của bệnh nhân giảm rất nhiều

Toàn thân người bênh có thể có sốt nhẹ, có sưng hạch góc hàm hoặc hạch sau tai, họng đỏ, amidan sưng to Một số trường hợp trẻ đau mắt đỏ do virut HAdV

có thể kèm theo các triệu chứng viêm đường hô hấp như ho, sốt nhẹ, sổ mũi, khò khè sẽ bị nổi hạch trước tai sưng và đau

1.1.3 Con đường lây lan của bệnh đau mắt đỏ do HAdVs

Bệnh có thể lây từ người này sang người khác do bệnh có nguồn lây là virut gây bệnh, virut có rất nhiều trong nước mắt và dử mắt người bệnh và có thể lây cho người khác qua các đường khác nhau bao gồm:

Lây qua các vật dụng sinh hoạt: do dùng chung khăn mặt và chậu rửa mặt

dụi mắt và cầm nắm vào các đồ vật dùng chung như khăn mặt, chậu rửa, ly chén, tay nắm cửa, đồ chơi, chăn gối hay gặp ở những người trong cùng gia đình, các nhà trẻ, mẫu giáo, Bệnh không lây qua việc nhìn vào mắt người bệnh, vì vậy việc đeo kính chỉ giúp người bệnh bớt chói mắt, bụi bặm và khó chịu chứ không ngăn chặn

Lây qua đường nước bọt: nước mắt được tiết ra sau khi làm nhiệm vụ dinh

dưỡng và làm sạch cho mắt sẽ thoát qua đường dẫn nước mắt (lệ đạo) để xuống mũi, họng Ở người bị đau mắt đỏ do HAdV trong nước mắt này có chứa rất nhiều virut và khi bệnh nhân nói chuyện quá gần, ho hắt hơi, thơm, hôn thì virut HAdV sẽ theo nước bọt bắn ra ngoài và lây bệnh cho người khác

Vì vậy bệnh có thể lây lan nhanh thành dịch ở những nơi tập trung đông dân

cư như trường học, doanh trại, ký túc xá, bến tàu xe, bệnh viện Ở một số nơi do

vệ sinh kém (như ở một số vùng nông thôn) có thể lây qua vật trung gian là ruồi, muỗi

1.2.1 Human Adenovirus (HAdV)

Adenovirut (AdV) là nhóm virut thuộc họ Adenoviriae, gồm bốn giống khác nhau, trong đó có giống Mastedenovirut chuyên gây bệnh ở người Các adenovirut gây bệnh ở người này có tên gọi là human adenovirut và được viết tắt là HAdV Các HAdV lây nhiễm hàng tỷ người trên thế giới và gây ra rất nhiều bệnh khác nhau như bệnh đường hô hấp, tiêu hóa, tiết niệu và bệnh về mắt[4;16]

QH.2014.T.CH - 60420121

6

Hình 1.1.Hình ảnh các hạt Adenovirus trên kính hiển vi điện tử [36]

HAdV là virut có kích thước khoảng 80-100 nm, có vỏ capsid 20 mặt được cấu thành bởi protein cấu trúc HAdV không có lớp màng lipid kép bao bọc bên ngoài Hệ gen của HAdV là phân tử ADN sợi kép mạch thẳng, có kích thước khoảng 35 kbp[33;36] Vỏ capsid của HAdV có các loại protein chính là hexon, penton và fiber Hexon là protein cấu tạo nên bề mặt bên, các penton nằm ở đỉnh và các fiber là các sợi nhỏ gắn vào các đỉnh penton Cấu trúc phân tử của các protein tham gia cấu thành nên HAdV được rất nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu Tuy nhiên, cho đến nay cấu trúc chi tiết ở mức độ phân tử của nhiều protein cấu thành nên HAdV vẫn chưa được làm sáng tỏ

QH.2014.T.CH - 60420121

7

Hình 1.2 Mô hình cấu trúc vỏ capsid của HAdV[38]

Hệ gen của HAdV là một phân tử ADN sợi kép có cấu trúc dạng thẳng, chứa các gen không phân mảnh Số lượng các gen và thành phần các gen trong hệ gen của HAdV thay đổi tùy theo chủng HAdV Kích thước hệ gen các chủng HAdV gây bệnh đau mắt đỏ khoảng 35 kbp trong đó có khoảng 38 gen mã hóa protein Các gen

mã hóa protein này được sắp xếp thành các nhóm là các đơn vị phiên mã, mỗi đơn

vị phiên mã chứa từ 1-8 trình tự mã hóa protein Mỗi đơn vị phiên mã sẽ tạo ra một phân tử tiền mARN và sau đó được cắt thành nhiều phân tử mARN Các đơn vị phiên mã E1A, E1B, E2A, E2B, E3 và E4 mã hóa cho các protein tham gia điều khiển quá trình phiên mã và sao chép ADN của HAdV Do vậy, những gen này sẽ được phiên mã ở giai đoạn sớm của chu trình sinh sản của virut HAdV Chữ E của các đơn vị phiên mã này có nguồn gốc từ chữ sớm (Early) Các đơn vị phiên mã từ L1 đến L5 (L1-L5) mã hóa cho các protein vỏ capsid hoặc tham gia vào quá trình lắp ghép capsid Do vậy các gen thuộc các đơn vị phiên mã L1-L5 được phiên mã ở giai đoạn muộn Chữ L của các đơn vị phiên mã này có nguồn gốc từ chữ muộn (Late) Các đơn vị phiên mã L1-L5 được điều khiển bởi cùng một vùng promoter và

có cùng một vị trí khởi đầu phiên mã Do vậy, tất cả các gen do các đơn vị phiên mã L1-L5 mã hóa sẽ được biểu hiện cùng một lúc

Fiber Hexon

Penton base

QH.2014.T.CH - 60420121

8

Hình 1.3 Cấu trúc và tổ chức các gen trong hệ gen HAdV [37]

- Cơ chế xâm nhiễm và gây bệnh của virut HAdV

Quá trình xâm nhiễm của HAdV bắt đầu bằng sự kiện domain ngoại biên của

protein sợi (fiber) của HAdV gắn vào thụ thể bề mặt CAR (Coxsackie-Adenovirut

receptor) của tế bào vật chủ [29] Sau đó, motif có trình tự RGD nằm ở penton base

liên kết với αV integrins của tế bào chủ và kích hoạt quá trình xâm nhiễm của virut

bằng con đường nhập bào (endocytosis) Sau đó, virut trải qua quá trình cởi bỏ lớp

vỏ ở trong endosome và di chuyển vào trong nhân tế bào vật chủ ADN virut không

gắn vào nhiễm sắc thể tế bào vật chủ mà tồn tại độc lập Sau đó, quá trình phiên mã

và dịch mã các gen của HAdV diễn ra, tổng hợp nên protein cấu thành nên virut

mới ADN virut cũng được nhân lên và lắp ráp với các protein vỏ để hình thành lên

virut mới Enzyme HAdV protease cắt các tiền protein vùng lõi của HAdV làm cho

ADN của virut lỏng lẻo và linh động hơn giúp cho HAdV trưởng thành Virut

HAdV trưởng thành sẽ được giải phóng khỏi tế bào và tiếp tục xâm nhiễm các tế

bào khác[26;33]

QH.2014.T.CH - 60420121

9

Hình 1.4 Cơ chế xâm nhiễm của HAdV[37]

Hiện nay, có trên 50 chủng adenovirut khác nhau, do đó, khả năng phát triển loại vắc-xin điều trị là rất thấp Việc phát triển vắc-xin cho từng chủng hoặc một số chủng HAdV cũng chưa đạt được những thành công đáng kể Cho đến nay, chưa có một loại vắc-xin điều trị cho bất kỳ dạng adenovirus nào được thương mại hóa Chỉ

có một loại vắc-xin cho hai chủng HAdV-4 và HAdV-7 gây bệnh viêm đường hô hấp cấp nguy hiểm ở người đã được quân đội Mỹ sử dụng từ những năm 1960 Tuy nhiên, đây là loại vắc-xin sống và sử dụng qua đường uống trực tiếp Các thử nghiệm lâm sàng đối với loại vắc-xin của HAdV-4 và HAdV-7 ở dạng sống cho thấy có vô số tác dụng phụ không mong muốn với tỷ lệ rất cao như nghẹt mũi (33%), ho (33%), đau họng (27%), đau đầu (20%), đau bụng (17%), đau khớp (13%), buồn nôn (13%) và tiêu chảy (13%) Do vậy, còn rất nhiều vấn đề cần phải nghiên cứu để có thể phát triển được loại vắc-xin phòng ngừa các chủng HAdV một cách an toàn và hiệu quả Việc tiếp tục phân lập và nghiên cứu các chủng HAdV là hết sức cần thiết Đặc biệt, cần phải nghiên cứu cấu trúc hệ gen, tốc độ tiến hóa hệ gen, tốc độ biến đổi các gen quan trọng mã hóa cho các kháng nguyên bề mặt nhằm tìm ra các kháng nguyên có tính bảo thủ cao, có thể phát triển vắc-xin tái tổ hợp, giúp ngăn chặn sự hoành hành của bệnh dịch do HAdV gây ra

QH.2014.T.CH - 60420121

10

Hiện nay ở Nhật (Aoki K., Y Tagawa, (2002) tỉ lệ nhiễm HAdV gây bệnh đau mắt đỏ chủ yếu là chủng 37, còn tại Việt Nam theo những nghiên cứu trước đây

tỉ lệ mắc HAdV gây bệnh đau mắt đỏ chủ yếu do chủng 8

1.2.2 HAdV gây bệnh đau mắt đỏ

Ở Việt Nam, bệnh đau mắt đỏ do HAdV đã và đang hoành hành liên tục suốt hơn 10 năm qua với số lượng người bị nhiễm rất cao, có năm lên tới 80.000 người Hàng năm, cứ vào khoảng từ tháng 7 đến tháng 10, khi thời tiết thuận lợi, dịch đau mắt đỏ do HAdV lại bùng phát Khi bệnh xuất hiện, số lượng bệnh nhân tăng rất nhanh, đặc biệt là ở những nơi có mật độ dân cư cao như trường học, bệnh viện, nhà máy và các thành phố lớn Bệnh xuất hiện ở mọi lứa tuổi, từ trẻ em đến người già Con đường lây nhiễm virut đau mắt đỏ rất đa dạng thông qua con đường nước bọt,

hô hấp, và thông qua tiếp xúc Đến nay, bệnh đau mắt đỏ gây ra bởi HAdV chưa có vắc-xin phòng chống, chưa có thuốc điều trị Điều này càng làm cho công tác phòng

và chống dịch đau mắt đỏ ở nước ta trở nên khó khăn và phức tạp Các virut nói chung và virut HAdV nói riêng luôn có khả năng biến đổi hệ gen rất nhanh và có thể xuất hiện chủng HAdV mới, nguy hiểm Nếu không có các nghiên cứu phân tích

hệ gen và kiểm soát sự biến đổi các chủng HAdV ở Việt Nam thì khi xuất hiện chủng HAdV mới có độc lực cao, chúng ta sẽ không có biện pháp ứng phó kịp thời

Do chưa vắc-xin phòng bệnh và chưa có thuốc điều trị đặc hiệu bệnh đau mắt

đỏ do HAdV gây ra, nên các phương pháp phòng chống chủ yếu dựa vào phòng bệnh, giữ vệ sinh và cách ly nguồn bệnh Khi bị nhiễm bệnh, thuốc corticosteroids

có tác dụng chống viêm và giảm triệu chứng được dùng để điều trị cho bệnh nhân đau mắt đỏ do HAdV Nhưng corticosteroids có tác dụng phụ là làm chậm quá trình giải phỏng virut và lại làm tăng sự sinh sản và kéo dài thời gian nhiễm bệnh, tăng nguy cơ lây lan và có thể dẫn tới các biến chứng nghiêm trọng Do vậy, cho đến nay, vẫn chưa có thuốc đặc trị HAdV Điều này càng làm cho việc nghiên cứu các chủng virut HAdV càng trở lên cấp thiết hơn

1.3.1 Phương pháp phân lập virut

Trước kia, phương pháp định danh các chủng HAdV thường được thực hiện bằng cách phân lập virut, sau đó xác định nhóm huyết thanh của virut bằng phản ứng ngưng kết kháng nguyên hoặc tách chiết ADN hệ gen và cắt ADN hệ gen virut

QH.2014.T.CH - 60420121

11

bằng enzyme giới hạn để định loại Những phương pháp này trước đây được coi là tiêu chuẩn vàng để xác định các chủng HAdV Tuy nhiên, chúng có nhược điểm là phức tạp, tốn thời gian và có độ chính xác còn hạn chế

1.3.2 Phương pháp khuếch đại gen chỉ thị

Gần đây, việc định loại các chủng virut HAdV được tiến hành dựa trên việc

khuếch đại và giải trình tự các đoạn gen chỉ thị của HAdV như gen hexon và fiber

Các gen này có trình tự nucleotit biến đổi nhanh, do vậy rất hiệu quả trong xây dựng cây phát sinh chủng loại và phân loại HAdV Phương pháp này có ưu điểm là phát hiện nhanh, chính xác và có độ nhạy rất cao, có thể định lượng được số bản copy của virut

Hiện nay, việc xác định nguyên nhân gây bệnh đau mắt đỏ ở các cơ sở y tế trong nước cũng như trên thế giới chủ yếu dựa vào triệu chứng, không có các kit chẩn đoán nhanh và chính xác giúp phân loại tác nhân gây đau mắt đỏ Nguyên nhân là do các phương pháp phân loại virut chỉ phù hợp với phòng thí nghiện khoa học, chưa có các kit xét nghiệm đơn giản, nhanh chóng có thể triển khai được ở các bệnh viện Điều này có thể dẫn đến chậm trễ, thậm chí nhầm lẫn trong điều trị, ảnh hưởng nghiêm trọng tới sức khỏe về mắt của bệnh nhân Do vậy, trong đề tài này, chúng tôi tiến hành xây dựng phương pháp phát hiện HAdV gây bệnh đau mắt đỏ chủ yếu ở Việt Nam dựa trên kỹ thuật khuếch đại gene chỉ thị, phục vụ trong chẩn đoán nguyên nhân gây bệnh đau mắt đỏ

1.4.1 Nguyên lý

PCR là phương pháp được xây dựng bởi Kary Mullis vào những năm 1980 Phản ứng được thực hiện dựa trên khả năng tổng hợp sợi ADN mới bổ sung với trình tự khuôn ADN ban đầu của DNA polymerase Enzyme này chỉ có khả năng kéo dài mạch nhờ gắn thêm một nucleotide vào nhóm chức 3’- OH tự do của nucleotide trước đó, do đó nó cần có trình tự mồi chứa đầu 3’- OH tự do để thực hiện kéo dài chuỗi Điều này dẫn đến sự đặc hiệu của phản ứng PCR trong việc khuếch đại một vùng ADN mong muốn (vùng gen đích) bằng cách thiết kế mồi đặc hiệu

Phản ứng PCR được thực hiện bằng máy gia nhiệt, giúp tăng giảm chính xác nhiệt độ của hỗn hợp phản ứng một cách nhanh chóng tại các khoảng thời gian xác

QH.2014.T.CH - 60420121

12

định ở mỗi chu kỳ Đầu tiên, hai sợi của phân tử ADN kép phải được tách ra để cho phép các cặp mồi bám vào khuôn, được gọi là giai đoạn biến tính ADN (94 oC – 98 oC) Sau khi tách sợi, nhiệt độ được làm giảm đến nhiệt độ gắn mồi, cho phép mồi xuôi

và mồi ngược liên kết với các sợi ADN đơn làm khuôn Tùy vào mục đích nghiên cứu, cặp mồi có thể được thiết kế gắn ngẫu nhiên hay gắn đặc hiệu dựa trên trình tự của vùng ADN quan tâm Tiếp theo, enzyme DNA polymerase dựa trên sợi ADN làm khuôn sẽ xúc tác kéo dài chuỗi ADN từ đoạn mồi theo chiều 5’ - 3’ ở nhiệt độ kéo dài chuỗi (72 oC) Quá trình này được lặp lại sau khoảng 25 - 40 chu kỳ Phản ứng có thể tổng hợp được rất nhiều bản sao của trình tự gen mong muốn chỉ trong thời gian vài giờ

Ở nhiệt độ biến tính ADN (khoảng 95 oC), các polymerase của đa số sinh vật đều bị phân giải và mất hoạt tính; vì vậy enzyme sử dụng cho phản ứng PCR cần là enzyme chịu nhiệt Người ta đã phân lập được một số vi khuẩn phát triển trong điều kiện nhiệt độ cao, có thể lên tới 100OC, như vi khuẩn suối nước nóng Thermus aqaticus và tách được polymerase của vi khuẩn này (Taq polymerase) Việc tìm ra

enzyme chịu nhiệt đã mở ra bước tiến quan trọng cho phản ứng PCR và các kỹ thuật ứng dụng phản ứng PCR trong xét nghiệm chẩn đoán và nghiên cứu phân tử

1.4.2 Vùng gen đích và ý nghĩa

Trước đây, việc phân loại các chủng HAdV chủ yếu dựa vào các phương pháp miễn dich thì nay sẽ được phân loại bằng phương pháp PCR và giải trình tự

các đoạn gen hexon, penton và fiber

Như đã phân tích cấu trúc hệ gen cũng như thành phần các protein cấu trúc nên HAdV, các protein hexon, penton base, và fiber knob là ba thành phần chính của vỏ capsid Chúng đóng vai trò là các kháng nguyên đặc trưng được sử dụng trong các phản ứng miễn dịch nhằm xác định, định loại các chủng HAdV Trong hệ

gen HAdV, chúng được mã hóa bởi các gen phiên mã muộn là L2 (penton), L3 (hexon), L5 (fiber) Các gen hexon, penton và fiber chứa vùng gen siêu biến (HVR)

nên chúng được ví như là các điểm nóng về sự tái tổ hợp (recombination) của các chủng HAdV khác nhau

Trình tự vùng siêu biến HVR-7 là vùng quan trọng được sử dụng cho phân loại các chủng HAdV do mức độ biến đổi rất cao Vị trí của HVR-7 thuộc vùng

loop 2 của gen hexon Việc phân loại các chủng HAdV sử dụng trình tự gen hexon

thường phổ biến và hiệu quả hơn trình tự gen penton hay fiber Tuy nhiên hai gen

QH.2014.T.CH - 60420121

13

penton và fiber những năm gần đây được quan tâm nhiều hơn do chúng là một trong

những nhân tố thường xuyên xảy ra sự tái tổ hợp giữa các chủng cùng loài Một số

báo cáo chỉ ra rằng gen penton có khả năng cao xảy ra sự tái tổ hợp Vì vậy nghiên cứu đồng thời cả ba gen hexon, penton và fiber là bước ngoặt lớn trong phân loại

HAdV nhằm mang lại cái nhìn tổng quát hơn về sự biến đổi của các chủng HAdV,

có ý nghĩa so sánh với các phương pháp phân loại truyền thống trước kia, tránh được khả năng định loại sai cho các chủng tái tổ hợp (nếu có)

1.5 KĨ THUậT GIảI TRÌNH Tự

Kỹ thuật giải trình tự là một trong những công cụ hiệu quả trong nghiên cứu

di truyền phân tử Từ phương pháp giải trình tự đột phá đầu tiên của Sanger, đến nay các phương pháp giải trình tự ngày càng được phát triển để đáp ứng với yêu cầu

về độ chính xác, nhanh nhạy, hiệu suất cao cũng như giá thành rẻ

Phương pháp giải trình tự ADN đầu tiên được mô tả bởi Sanger và Coulson được gọi là phương pháp “cộng và trừ” Phương pháp này sử dụng DNA

polymerase từ vi khuẩn Escherichia coli và bacteriophage T4 với các nucleoside

triphosphate khác nhau Sản phẩm tạo ra bởi các polymerase được điện di trên gel acrylamide Do sự không hiệu quả của phương pháp này, nên 2 năm sau đó ông và cộng sự đã mô tả một phương pháp mới mang tính đột phá, giải trình tự các oligonucleotide thông qua chuỗi trùng hợp bằng enzyme

Phương pháp này đã mở ra cuộc cách mạng trong lĩnh vực gen và được biết đến như phương pháp Sanger hay phương pháp dideoxynucleotide Bao gồm một enzyme xúc tác phản ứng trùng hợp các deoxynucleotide triphosphate (dNTP) bổ sung với các mẫu ADN quan tâm Phản ứng sẽ được kéo dài cho đến khi các enzyme kết hợp một dideoxynucleoside triphosphate (ddNTP) được đánh dấu vào chuỗi đang tổng hợp Do các ddNTP không chứa nhóm 3’ - OH nên enzym sẽ không thể xúc tác gắn thêm nucleotide tiếp theo, dẫn đến phản ứng kéo dài bị kết thúc Phản ứng được thực hiện trong 4 ống khác nhau, mỗi ống ngoài thành phần của phản ứng PCR thông thường sẽ chứa một loại ddNTP được đánh dấu

Sau quá trình tổng hợp, sản phẩm gồm hỗn hợp các ADN kích thước khác nhau được điện di trên gel polyacrylamide biến tính theo 4 đường chạy song song

và được đọc bằng phóng xạ tự ghi Các phương pháp giải trình tự bằng enzyme khác cũng được sử dụng để xác định trình tự các đoạn nucleotide trong nghiên cứu

di truyền

QH.2014.T.CH - 60420121

14

Vào năm 1977, hai nhà khoa học người Mỹ Allan Maxam và Walter Gilbert

đã phát minh ra một phương pháp hóa học có thể xác định được trình tự các nucleotide trong chuỗi ADN Theo phương pháp này, trước hết phân tử ADN được đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ 32P ở đầu 5’, tạo ra những đoạn có thể được phát hiện bằng hình ảnh phóng xạ Sau đó các nucleotide trong phân tử ADN được đánh dấu sẽ được xử lý với các hóa chất khác nhau làm biến đổi và cắt phân tử ADN tại những vị trí nucleotide khác nhau Bốn nhóm bị tác động bao gồm: G, A+G, T+C,

và C Kết quả sẽ tạo thành những đoạn oligonucleotide có chiều dài khác nhau 1 base Các đoạn này được điện di trên gel polyacrylamide và hiển thị bằng máy phóng xạ tự ghi, huỳnh quang hay các phản ứng màu nhờ enzyme

Tổng hợp các kết quả, ta thu được trình tự các nucleotide trên mạch đơn ADN, từ đó ta biết được trình tự sắp xếp các nucleotide của gen

Ngày nay, việc giải trình tự được thực hiện dễ dàng nhờ có sự hỗ trợ của máy giải trình tự tự động Máy giải trình tự hoạt động dựa theo nguyên lý của phương pháp Sanger có cải biến Trong đó các ddNTP không được đánh dấu phóng

xạ mà được đánh dấu bằng chất huỳnh quang có màu khác nhau cho mỗi loại ddNTP Máy giải trình tự tự động bao gồm các thành phần chính như: hệ mao quản,

hệ chiếu sáng laser, hệ nhận và xử lý tín hiệu Các vạch điện di trong mao quản sẽ được phát sáng khi đi qua một chùm tia sáng laser Hệ thống nhận diện tín hiệu màu

sẽ ghi lại và mã hóa thành các nucleotide A, T, C, G

1.6 XÂY DỰNG CÂY CHỦNG LOẠI PHÁT SINH

Cây phát sinh chủng loại là một mô hình giả thuyết sử dụng phần mềm để

mô tả mối quan hệ tiến hóa giữa các sinh vật, hay mối quan hệ di truyền của một số nhóm loài gần gũi Nó được xây dựng dựa trên sự so sánh các đặc điểm tương đồng

về hình thái hoặc sự tương đồng của các trình tự phân tử giữa các nhóm sinh vật Các nhánh rẽ của cây phản ánh sự tiến hóa của các loài từ loài tổ tiên Bằng cách liên tục đưa ra các giả thuyết, các nhà khoa học cũng đồng thời xây dựng các thuật toán khác nhau cho cây mô hình để mô tả lịch sử tiến hóa thực sự của một nhóm trình tự hoặc sinh vật Tuy vây, cây mô hình xây dựng được sẽ có những ưu nhược điểm riêng tùy thuộc vào cách lựa chọn mô hình tiến hóa, các phương pháp xây dựng cây của mỗi phần mềm Có hai dạng: cây không gốc (phản ánh mối liên hệ giữa các trình tự) và cây có gốc (phản ánh hướng thời gian tiến hóa)

QH.2014.T.CH - 60420121

15

Cây phát sinh chủng loại phân tử nói riêng không thể thực hiện nghiên cứu trực tiếp nên chỉ có thể được phỏng đoán dựa vào các dữ liệu trình tự hoặc các dữ liệu phân tử khác Hai phương pháp xây dựng cây phát sinh chủng loại phân tử chính: dựa trên khoảng cách (distance-based method) hoặc dựa trên ký tự (character- based method) Với các phương pháp ma trận khoảng cách thì khoảng cách giữa mỗi cặp trình tự được tính toán, và tập hợp thành một ma trận (distance matrix) sử dụng để xây dựng cây mô hình Trong khi đó, phương pháp xây dựng cây phát sinh dựa trên ký tự lại cùng lúc so sánh tất cả các trình tự được sắp xếp và chỉ xem xét một ký tự (vị trí dóng hàng) tại đúng thời điểm tính toán để đưa ra điểm thay đổi cho mỗi mô hình cây phát sinh Theo lý thuyết, cây được xây dựng dựa trên sự xem xét tất cả các con đường tiến hóa có thể xảy ra và chọn ra cây phù hợp nhất Phương pháp này mất nhiều thời gian và khá khó áp dụng trong các trường hợp giả định không phù hợp với dữ liệu phân tử, hơn nữa đặc điểm hay dữ liệu phân

tử được sử dụng phải có mức độ biến đổi phản ánh được sự tiến hóa của loài, tốc độ tiến hóa của gen phải như nhau theo cùng một hướng Các phương pháp được sử dụng chính: Maximum Parsimony, Maximum likelihood và Bayesian

Maximum Parsimony (MP): Phương pháp này sẽ tổng hợp ngẫu nhiên các cây phát sinh chủng loại và phần mềm sẽ tính tổng số nucleotide thay đổi Từ đó tìm ra một cây phát sinh chủng loại có số thay đổi phân tử ít nhất trong các cây được xây dựng Đây là phương pháp khá nhanh Tuy nhiên, do giới hạn của máy tính nên nó thường dẫn đến các cây phát sinh chủng loại có cùng sự thay đổi như nhau nên khó có thể đánh giá được sự lựa chọn cây và mất thời gian khá dài để dựng cây Hơn nữa, phương pháp này không quan tâm đến tốc độ tiến hóa khác nhau giữa các vị trí khác nhau [14]

Distance Matrix Method: Khoảng cách trình tự so sánh được tính toán dựa trên mô hình chuỗi thế nucleotide của Markov Phương pháp xây dựng cây chủng loại phát sinh phù hợp với một ma trận khoảng cách giữa các cặp trình tự dựa trên mức độ thay thế các nucleotide giữa các trình tự đó mà không cần quan tâm đến con đường tiến hóa của chúng Với cách xây dựng này thuật toán sẽ nhanh hơn đối với

dữ liệu phân tử lớn, phù hợp với trình tự có độ tương đồng cao Nhưng hầu hết các

vị trí nhìn chung sẽ được xem như nhau, không để ý sự khác nhau của mức độ tiến hóa giữa các codon khác nhau Phương pháp ma trận khoảng cách được sử dụng rộng rãi nhất là Neighbour-joining, hiệu quả cho việc phân tích dữ liệu lớn và tương đồng

QH.2014.T.CH - 60420121

16

Maximum likelihood : Thuật toán đầu tiên xây dựng cho phân tích Maximum Likelihood của dữ liệu trình tự ADN được phát triển bởi Felsenstein Dựa vào phương pháp thống kê trong đó xác suất thay thế được xem xét cho từng cặp nucleotide trong tất cả chuỗi trình tự được so sánh Từ đó có thể xác định chiều dài cành, cây tiến hóa có xác suất cao nhất là cây cuối cùng được chọn Đây là phương pháp tốn nhiều thời gian nhưng có độ tin cậy cao

Bayesian: là một phương pháp thống kê khác với Maximum likelihood, ở đây thông số trong mô hình được xem xét như các biến số ngẫu nhiên có phân bố thống kê, sử dụng thuật toán Markov chain Monte Carlo (MCMC algorithms) Phương pháp xây dựng cây cũng dựa trên mô hình thế nucleotide giống như Maximum likelihood

Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng phương pháp xây dựng cây phát sinh chủng loại: Maximum likelihood để xây dựng cây có tiến hóa phù hợp nhất

Để kiểm tra sự tin cậy của cây phát sinh được xây dựng nghiên cứu này sử dụng phương pháp Bootstrap Đây là phương pháp lấy mẫu ngẫu nhiên từ một bộ trình tự, xây dựng lại cây từ các bộ dữ liệu đó và kiểm tra tần suất những phần của cây được lặp lại Giá trị của bootstrap biểu thị mức độ tin cậy của cây được xuất ra Giá trị này lớn hơn hoặc bằng 70% thì được coi là có ý nghĩa thống kê và trên 95% được xem là có độ tin cậy cao

Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) là phần mềm được phát triển để so sánh, phân tích các trình tự ADN và protein, từ đó suy ra cây tiến hóa phân tử của gen, genome và các loài qua thời phần mềm được tích hợp nhiều phương pháp so sánh (clustalW), tính toán khoảng cách (Pairw distance), xây dựng cây phát sinh chủng loại (Maximum, parsimony, Maximum Likelihood, ) phù hợp với nghiên cứu này Hơn nữa, MEGA7 đạt hiệu quả cao trong hoạt động và dung lượng nhớ So sánh 765 trình tự dài 2000bp chỉ mất 43 phút và 1GB dung lượng nhớ

QH.2014.T.CH - 60420121

17

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 ĐỐI TƯợNG NGHIÊN CứU, HÓA CHấT VÀ THIếT Bị

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Chúng tôi tiến hành thu thập được 122 mẫu bệnh phẩm tiết tố kết mạc Các mẫu nghiên cứu được thu tại Phòng D.305 - Bệnh viện Mắt Trung ương Người bệnh được chẩn đoán đau mắt đỏ do virut HAdV với các triệu chứng gây ra như viêm kết mạc, giác mạc kèm sốt, viêm họng-hạch và viêm kết giác mạc thành dịch được mời tình nguyện tham gia nghiên cứu Chúng tôi ưu tiên thu mẫu của các người bệnh sinh sống tại các khu vực khác nhau

2.1.2 Quy trình thu mẫu

Kỹ thuật viên Phòng Vi sinh - Khoa Xét nghiệm sẽ thu thập dịch tiết từ mắt người bị bệnh đau mắt đỏ bằng tăm bông vô trùng cho vào ống Enppendof bảo quản -20oC vận chuyển đến phòng thí nghiệm T.231 Bộ môn Di truyền - Trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên, trước khi sử dụng cho việc tách ADN virut

Quá trình thu mẫu tuân thủ theo quy định về y đức và an toàn sinh học; mỗi người bệnh tình nguyện tham gia nghiên cứu được giải thích rõ nội dung nghiên cứu và đều tình nguyện tham gia nghiên cứu, cam kết cho phép sử dụng mẫu bệnh phẩm cho mục đích nghiên cứu

Quá trình thu lấy mẫu bệnh được thực hiện liên tục trong suốt khoảng thời gian từ tháng 9 năm 2015 đến tháng 7 năm 2017 Các thông tin mẫu được liệt kê trong phần phụ lục

Hóa chất sử dụng cho khuếch đại các đoạn gen hexon, penton và fiber: bộ kit

Master Mix 2X của hãng iNtRon

QH.2014.T.CH - 60420121

18

Một số hóa chất khác sử dụng trong thí nghiệm điện di kiểm tra ADN tổng

số của virut, kích thước và lượng các sản phẩm PCR đã được khuếch đại: Agarose, đệm TAE

2.1.4 Dụng cụ và thiết bị

Một số thiết bị sử dụng trong nghiên cứu bao gồm: máy ly tâm, máy PCR, lò

vi sóng, máy điện di, tủ an toàn sinh học được liệt kê trong bảng dưới đây

Bảng 2 1.Các thiết bị chính sử dụng trong nghiên cứu

Spindown

Biometra Analyikjena Astec, Nhật Bản,

Đức

7 Máy soi gel AlphaImager Mini

UV Gel Imaging System

ProteinSimple Mỹ

8 Tủ an toàn

sinh học

Biological Safety Cabinets

Một số dụng cụ khác như: Các loại pipet và đầu tip tương ứng, ống eppendorf loại 1,5 ml và 2 ml

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CứU

Nghiên cứu đã được tiến hành tại phòng thí nghiệm bộ môn Di truyền học, Khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên – ĐHQGHN

Đầu tiên hút 150 μl mẫu dịch bệnh lâm sàng vào một ống Eppendorf 1,5 ml mới, rồi

bổ sung thêm 250 μl Lysis buffer, lắc đều trong 15 giây và ủ ở nhiệt độ phòng trong

10 phút Sau đó, thêm 350 μl Binding buffer vào ống và trộn đều hoàn toàn bằng cách lắc nhẹ nhàng Chất đệm Binding buffer giúp gắn ADN lên màng silica của cột tách chiết Dich ly giải được chuyển lên cột đặt trong một ống eppendorf 2 ml rồi đem ly tâm ở tốc độ 13000 vòng/phút với thời gian 1 phút ở nhiệt độ phòng Loại

bỏ dung dịch trong ống và đặt cột trở lại Sử dụng 500 μl dung dịch đệm Washing buffer A và ly tâm trong 1 phút ở tốc độ 13000 vòng/phút để loại bỏ các thành phần không phải ADN (protein, lipid, muối ) còn bám trên màng Tiếp tục rửa màng cột với 500 μl dung dịch Washing buffer B và đem ly tâm 1 phút ở tốc độ 13000 vòng/phút Thêm một lần ly tâm khô để đảm bảo ethanol có trong đệm Washing được loại bỏ hoàn toàn, không làm ảnh hưởng đến các thí nghiệm sau này (PCR)

Thu thập mẫu bệnh phẩm

Tinh sạch DNA virut

PCR khuếch đại các đoạn gene hexon, penton và fiber

Tinh sạch và giải trình tự sản phẩm PCR

So sánh với cơ sở dữ liệu để nhận diện chủng HAdV

Thiết kế các cặp mồi đặc hiệu

Mồi Hexon: Cặp mồi do chúng tôithiết kế dựa trên vùng trình tự bảo thủ của

đoạn gen đích và được công bố trên tạp chí Khoa học ĐHQGHN vào tháng 9 năm

2016 Cụ thể là đoạn trình tự lân cận vùng HVR-7 của gen Hexon Cặp mồi có một

chút thay đổi so với trình tự cặp mồi đã được công bố trước đó của nhóm nghiên cứu Sarantis và cộng sự năm 2004 nhằm tối ưu khả năng nhân thành công trình tự

HVR-7 dài khoảng hơn 600 bp của gen hexon cho tất cả 7 loài thuộc chi human

adenovirus

Mồi penton và mồi fiber: Từ kết quả nghiên cứu bước đầu của nhóm nghiên

cứu dựa vào một phần trình tự gen hexon đã phân loại được một số chủng human

adenovirus gây bệnh đau mắt đỏ ở Việt Nam Chúng tôi tiếp tục thiết kế hai cặp mồi

cho các gen penton và fiber dựa trên các chủng HAdV-3, HAdV-4, HAdV-7,

HAdV-8, HAdV-37 phát hiện được trong quá trình nghiên cứu, trình tự hệ gen được lấy từ ngân hàng GenBank Trình tự tương ứng với các chủng được sắp xếp với nhau sử dụng phần mềm BioEdit nhằm mục đích so sánh các đoạn tương đồng tại

vùng trình tự siêu biến đổi (HVRs) của gen penton và gen fiber Sau đó mồi được

thiết kế tại đoạn trình tự bảo thủ nhất Trình tự các cặp mồi được thể hiện chi tiết trong bảng dưới đây

CAA CAT GGG -3'

Rv 5'- GCR TTG CGG TGG TGG TT -3'

~600 bp

18734-18756 19328-19344

2.2.3 PCR khuếch đại các đoạn gen hexon, penton và fiber

Mẫu ADN đã tách chiết được dùng làm khuôn cho phản ứng PCR khuếch đại

một phần gen hexon dài khoảng hơn 600 bp, một phần gen penton và toàn bộ gen fiber với kích thước tương ứng là 1118 bp và 1264 bp

Các phản ứng PCR sử dụng cặp mồi ở trên (bảng), mỗi phản ứng được thực hiện trong ống PCR 0,2 ml với tổng thế tích các thành phần là 20 µl, sử dụng máy PCR GenAtlas và BioMetra