Nghiên cứu điều chế, phân bố sinh học và khả năng gắn với tế bào ung thư của phức hợp miễn dịch phóng xạ 131i rituximab

hóa là Rituximab, được sản xuất và ứng dụng để điều trị bệnhu lympho ác tính không Hodgkin típ tế bào lympho B cho kết quả tốt.Kháng thể này được gắn với đồng vị phóng xạ 131I bằng phươn

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Nguyễn Thị Thu

“NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ, PHÂN BỐ SINH HỌC

VÀ KHẢ NĂNG GẮN VỚI TẾ BÀO UNG THƯ CỦA PHỨC HỢP MIỄN DỊCH PHÓNG XẠ 131I-RITUXIMAB”

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Nguyễn Thị Thu

“NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ, PHÂN BỐ SINH HỌC

VÀ KHẢ NĂNG GẮN VỚI TẾ BÀO UNG THƯ CỦA PHỨC HỢP MIỄN DỊCH PHÓNG XẠ 131I-RITUXIMAB”

Chuyên ngành: Mô - phôi và tế bào học

CỦA HỘI ĐỒNG ĐÁNH GIÁ LUẬN ÁN Người hướng dẫn khoa học Chủ tịch hội đồng đánh giá

Luận án Tiến sĩ

Hà Nội - 2018

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan luận án tiến sĩ “Nghiên cứu điều chế, phân bố sinh học

và khả năng gắn với tế bào ung thƣ củaphức hợp miễn dịch phóng xạ 131 rituximab” là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu và tài liệu trong luận

I-án là trung thực và chƣa đƣợc công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào Tất

cả những tham khảo và kế thừa đều đƣợc trích dẫn và tham chiếu đầy đủ

Nghiên cứu sinh

Nguyễn Thị Thu

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình thực hiện luận án, tôi đã nhận được nhiều sự giúp đỡ từ quý thầy cô, các bạn đồng nghiệp, gia đình và bạn bè Tôi xinbày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc đến:

- GS.TS Mai Trọng Khoa, PGS.TS Võ Thị Thương Lan, đã nhiệt tình hướng dẫn chuyên môn, truyền cho tôi kiến thức, và là tấm gương sáng cho tôi noi theo trên con đường nghiên cứu khoa học

- Các thầy cô trong bộ môn Mô Phôi và Tế bào học, khoa Sinh học, trường Đại học khoa học tự nhiên đã luôn động viên, giúp đỡ chuyên môn và nhắc nhở kịp thời để tôi hoàn thành luận án

- Các bạn đồng nghiệp tại Trung Tâm Nghiên cứu và điều chế đồng vị phóng

xạ, Viện Nghiên cứu hạt nhân đã tham gia thực nghiệm, giúp đỡ, và đồng hành cùng tôi trong thời gian dài tìm tòi, nghiên cứu gắn và điều chế dược chất phóng

xạ trong luận án

- Các bác sỹ Tại Trung Tâm Y học hạt nhân và Ung bướu, bệnh viện Bạch Mai, các bạn đồng nghiệp tại Học Viện Quân Y đã giúp đỡ tôi thực hiện các nghiên cứu đánh giá tiền lâm sàng trong luận án này

- Cuối cùng xin chân thành cảm ơn gia đình tôi đã luôn dành cho tôi những yêu thương và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi học tập

Xin chân thành cảm ơn mọi người đã giúp tôi hoàn thành luận án này!

Nghiên cứu sinh

Nguyễn Thị Thu

MỤC LỤC

Lời cam đoan

Lời cảm ơn

Mục lục 1

Danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt 3

Danh mục các bảng 5

Danh mục các hình ảnh, đồ thị 7

MỞ ĐẦU 9

Chương 1: TỔNG QUAN 11

1.1 Bệnh u lympho ác tính không Hodgkin 11

1.2 Các phương pháp điều trị bệnh ULAKH và điều trị RIT 13

1.3 Dược chất phóng xạ dùng trong điều trị RIT 20

1.4 Đồng vị phóng xạ và các phương pháp gắn kháng thể với 131I 26

Chương 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33

2.1 Nguyên vật liệu, hóa chất, thiết bị 33

2.2 Phương pháp nghiên cứu 34

2.2.1 Nghiên cứu điều chế phức miễn dịch phóng xạ 131I-rituximab 34

2.2.2 Kiểm tra chất lượng phức hợp 131I-rituximab 38

2.2.3 Đánh giá khả năng gắn với tế bào ung thư 44

2.2.4 Đánh giá phân bố, đào thải và an toàn trên động vật thực nghiệm 47

2.2.5 Xử lý kết quả 51

2.2.6 Xây dựng tiêu chuẩn Cơ sở của 131I-rituximab 51

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 53

3.1 Kết quả khảo sát các điều kiện gắn phóng xạ để điều chế phức hợp 131 I-rituximab 53

3.1.1 Kết quả khảo sát nồng độ chloramin T tham gia trong phản ứng tạo phức hợp 131I-rituximab 53

3.1.2 Kết quả khảo sát nồng độ kháng thể tạo phức hợp 131I-rituximab 55

3.1.3 Kết quả khảo sát thời gian phản ứng tạo phức hợp 131I-rituximab 56

3.1.4 Kết quả khảo sát pH phản ứng tạo phức 131I-rituximab 58

3.1.5 Kết quả điều chế phức hợp 131I-rituximab theo hoạt độ riêng 60

3.1.6 Kết quả tinh chế phức hợp 131I-rituximab và theo dõi độ ổn định 63

3.1.7 Kết quả đánh giá tính ổn định của phức hợp 131I-rituximab 65

3.2 Kết quả kiểm tra chất lƣợng phức hợp 131I-rituximab 67

3.2.1 Kết quả kiểm tra độ tinh khiết hoá phóng xạ 68

3.2.2 Kết quả kiểm tra độ tinh khiết hạt nhân phóng xạ 71

3.2.3 Kết quả thử vô khuẩn và nội độc tố vi khuẩn 73

3.2.4 Kết quả kiểm tra tính ổn định 75

3.2.5 Kết quả gắn với tế bào ung thƣ 80

3.2.6 Kết quả đánh giá phân bố, đào thải và an toàn của 131I-rituximab trên động vật thực nghiệm 88

3.2.7 Chứng minh sự thành công của việc điều chế phức hợp miễn dịch phóng xạ 131I-rituximab có thể sử dụng trong điều trị lâm sàng 106

KẾT LUẬN 109

KIẾN NGHỊ 110

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 111

TÀI LIỆU THAM KHẢO 112 PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ADCC Độc tính với tế bào phụ thuộc kháng thể (Antibody Dependent

Cellular Cytotoxicity) ALL Ung thƣ nguyên bào tủy cấp (Acute Lymphoblastic Leukemia) AML Ung thƣ bạch cầu dạng tủy (Acute Myeloid Leukemia)

BET Thử nội độc tố vi khuẩn (Bacterial Endotoxins Test)

CD Cụm biệt hoá (cluster differentiation)

CD20 Cụm biệt hóa CD20 (Clusters differentiation 20)

CDC Độc tính với tế bào phụ thuộc bổ thể (Complement Dependent

Cytotoxicity) CDCC Độc tính với tế bào phụ thuộc bổ thể (Complement Dependent

Cellular Cytotoxicity)

EGFR Epidermal Growth Factor Receptor

FDA Cục quản lý thuốc và thực phẩm Hoa Kỳ

(Food and Drug Administration)

FPLC Fast Protein Liquid Chromatography

FTM Fluid Thyoglicolate Medium

IgG Globulin miễn dịch (Immunoglobulin)

KDa, Da Kilo Dalton, Dalton

Mab, MAb Kháng thể đơn dòng (monoclonal antibody)

NHL U lympho ác tính không Hogdkin (non-Hodgkin’s lymphoma) NSB Phần gắn không đặc hiệu (Non Specific Binding)

NTA Nitroacetic axit

PC Sắc ký giấy (Paper chromatography)

PET-CT Máy chụp cắt lớp bằng đồng vị phát positron (Positron Emission

Tomography) PTS-100 Máy kiểm tra nội độc tố (Endosafe® Portable Test System) RBC Tế bào hồng cầu (Red Blood Cell)

Rf Hệ số lưu giữ (Retardation factor, Retention factor)

RIA Định lượng phóng xạ miễn dịch (radioimmunoassay)

RIT Điều trị miễn dịch phóng xạ (radioimmunotherapy)

SGOT Huyết thanh Glutamic Oxaloacetic Transaminase

SGPT Huyết thanh Glutamic Pyruvic Transaminase

SPECT Thiết bị chụp cắt lớp điện toán bằng bức xạ đơn photon (Single

Photon Emission Computed Tomography) TCC Sắc ký kiểm tra (Tec-Control Chromatography)

TCCS-DPPX Tiêu chuẩn Cơ sở Dược phẩm phóng xạ

TLC Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography)

ULAKH U lympho ác tính không Hodgkin (non-Hodgkin’s lymphoma) ULKH U lympho không Hodgkin (Hodgkin’s lymphoma)

VEGF Yếu tố tăng sinh mạch (Vascular Endothelial Growth Factor) WBC Tế bào bạch cầu (White Blood Cell)

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Hiệu quả điều trị NHL bằng RIT của một số tác giả 17

Bảng 1.2 Các kháng thể gắn phóng xạ đang đƣợc nghiên cứu 25

Bảng 1.3 Các đồng vị phóng xạ dùng trong điều trị đích 28

Bảng 2.1 Khảo sát nồng độchloramin T 35

Bảng 2.2 Thứ tự thực hiện gắn kháng thể với 131I 36

Bảng 3.1 Kết quả khảo sát thời gian phản ứng 55

Bảng 3.2 Bảng số liệu hiệu suất gắn và tỉ lệ mol 58

Bảng 3.3 Hiệu suất gắn phóng xạ theo pH 59

Bảng 3.4 Kết quả so sánh kiểm tra RCP của 131I-rituximab 70

Bảng 3.5 Kết quả đo phổ gamma 131I-rituximab 72

Bàng 3.6 Tính chất vật lý phóng xạ của 131I-rituximab 73

Bảng 3.7 Kết quả theo dõi thử vô khuẩn 74

Bảng 3.8 Kết quả kiểm tra nội độc tố vi khuẩn 74

Bảng 3.9 Tổng hợp hiệu suất gắn và độ sạch hóa phóng xạ của phức kháng thể với phóng xạ 131I 79

Bảng 3.10 Tóm tắt chỉ tiêu chất lƣợng của 131I-rituximab 80

Bảng 3.11 Kết quả thu tế bào bạch cầu từ các mẫu máu bệnh nhân NHL, CD20(+)85 Bảng 3.12 Tỷ lệ gắn của 131I-rituximab gắn với CD20 trên bạch cầu máu ngoại vi bệnh nhân NHL 85

Bảng 3.13 Phân bố thuốc phóng xạ 131I-rituximab trên chuột 88

Bảng 3.14 Phân bố 131I-rituximab trên thỏ, liều tiêm 500 Ci 89

Bảng 3.15 Phân bố 131I-rituximab trên thỏ, liều tiêm 1000 Ci 91

Bảng 3.16 Phân bố 131I-rituximab trên thỏ, liều tiêm 1500 Ci 93

Bảng 3.17 Phân bố 131I-rituximab trên thỏ, liều tiêm 2000 Ci 94

Bảng 3.18 Phân bố 131I-rituximab trên thỏ, liều tiêm 5000 Ci 96

Bảng 3.19 Diễn biến cân nặng của thỏ trong quá trình nghiên cứu 98

Bảng 3.20 Diễn biến nhiệt độ của thỏ trong quá trình nghiên cứu 99

Bảng 3.21 Số lƣợng hồng cầu trong máu ngoại vi của thỏ 99

Bảng 3.22 Nồng độ Hemoglobin trong máu ngoại vi của thỏ 100

Bảng 3.23 Số lƣợng bạch cầu trong máu ngoại vi của các nhóm thỏ 100

Bảng 3.24 Số lƣợng tiểu cầu trong máu ngoại vi của các nhóm 101

Bảng 3.25 Nồng độ ure trong máu ngoại vi của các nhóm thỏ 102

Bảng 3.26 Nồng độ creatinin trong máu ngoại vi của các nhóm thỏ 102

Bảng 3.27 Nồng độ glucose trong máu ngoại vi của các nhóm thỏ 103

Bảng 3.28 Nồng độ SGOT trong máu ngoại vi của các nhóm thỏ 103

Bảng 3.29 Nồng độ SGPT trong máu ngoại vi của các nhóm thỏ 104

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Tế bào B ung thư có biểu hiện kháng nguyên CD20 16

Hình 1.2 Kháng nguyên CD20 xuyên màng tế bào 4 lần 18

Hình 1.3 Cấu trúc của kháng thể rituximab 20

Hình 1.4 Cơ chế tiêu diệt ung thư bằng bức xạ 27

Hình 1.5 Sơ đồ phân rã của 131I 29

Hình 2.1 Hình ảnh bệnh ULKH 46

Hình 2.2 Cho thỏ uống lugol , đo nhiệt độ thỏ 51

Hình 2.3 Sơ đồ chung quá trình nghiên cứu điều chế 131I-rituximab 52

Hình 3.1 Hiệu suất gắn theo nồng độ chloramin T 53

Hình 3.2 Hiệu suất gắn điều chế phức hợp 131I-rituximab 55

Hình 3.3 Hiệu suất gắn theo nồng độkháng thể 56

Hình 3.4 Đồ thị hiệu suất gắn kháng thể rituximab với 131I 61

Hình 3.5 Tách sản phẩm theo các hoạt độ riêng 62

Hình 3.6 Đồ thị kiểm tra độ tinh khiết hóa phóng xạ của 131I-rituximab 63

Hình 3.7 Tách 131I-rituximab qua cột sephadex dùng dung dịch rửa giải là phosphat và nước muối sinh lý 0,9% 64

Hình 3.8 Đồ thị đánh giá tính bền vững của 131I-rituximab trước và sau khi

tách qua cột sephadex 65

Hình 3.9 Đồ thị độ tinh khiết hóa phóng xạ của 131I-rituximab sau khi điều chế, TCC, autoradiography 66

Hình 3.10 Đồ thị độ tinh khiết hóa phóng xạ của 131I-rituximab sau khi bảo quản 22 ngày, TCC, autoradiography 66

Hình 3.11 Đồ thị độ tinh khiết hóa phóng xạ của 131I-rituximab, điện di, 20 x 200mm, 60 phút, Bioscan 68

Hình 3.12 Độ tinh khiết hóa phóng xạ của 131I-rituximab, TLC, Bioscan 69

Hình 3.13 Độ tinh khiết hóa phóng xạ của 131I-rituximab, TCC 69

Hình 3.14 Độ tinh khiết hóa phóng xạ của 131I-rituximab, FPLC 71

Hình 3.15 Phổ gamma của 131I-rituximab 72

Hình 3.16 Đồ thị sắc ký điện di 131I 75

Hình 3.17 Đồ thị sắc ký điện di phức hợp 131I-rituximab sau 1 ngày 76

Hình 3.18 Đồ thị sắc ký điện di phức hợp 131I-rituximab sau 10 ngày 76

Hình 3.19 Đánh giá tính ổn định của 131I-rituximab bảo quản -200C 77

Hình 3.20 Đánh giá tính ổn định của 131I-rituximab bảo quản 40C 78

Hình 3.21 Ổn định của 131I-rituximab ủ trong huyết thanh ở 370C 78

Hình 3.22 Hình chụp tế bào ung thƣ Raji và nguyên bào sợi 81

Hình 3.23 Đồ thị kiểm tra hoạt tính miễn dịch của 131I-rituximab 82

Hình 3.24 Đồ thị gắn bão hòa 131I-rituximab với tế bào ung thƣ Raji 83

Hình 3.25 Hình tế bào bạch cầu lympho ở máu ngoại vi và mô bệnh học 84

Hình 3.26 Hoạt tính gắn của 131I-rituximab với kháng nguyên CD20 86

Hình 3.27 Kháng nguyên CD20-histaggắn lên agarose trên cột sắc ký 87

Hình 3.28 Chụp xạ hình thỏ thí nghiệm trên máy SPECT 90

Hình 3.29 Hình chụp SPECT phân bố 131I-rituximab trên thỏ thí nghiệm 92

Hình 3.30 Hình chụp SPECT phân bố 131I-rituximab trên thỏ 93

Hình 3.31 Hình chụp SPECT phân bố 131I-rituximab trên thỏ 95

Hình 3.32 Hình chụp SPECT phân bố 131I-rituximab trên thỏ 96

Hình 3.33 Đồ thị đào thải sinh học và vật lý trên thỏ tiêm 131I-rituximab 97

Hình 3.34 Hình ảnh đại thể gan thận thỏ tiêm 131I-rituximab 105

Hình 3.35 Hình ảnh mô học tổ chức gan và thận thỏ tiêm 131I-rituximab 105

MỞ ĐẦU

Trong những năm gần đây, cùng với sự phát triển và ngày càng hiện đại củakỹ thuật chụp cắt lớp điện toán bằng bức xạ đơn photon (SPECT) và chụp cắt lớp bằng đồng vị phát positron (PET-CT), nhiều thế hệ thuốc phóng xạ mớicũng đã được phát triển và ứng dụng Sự phát triển đồng bộ này đã làm đổi mới bộ mặt của

y học hạt nhân bởi chất lượng chẩn đoán và hiệu quả điều trị được nâng cao Một trong những nổi bật hiện nay của y học hạt nhân trong trị liệu là việc sử dụng kháng thể đơn dòng đánh dấu với đồng vị phóng xạ dùng trong điều trị ung thư

U lympho ác tính là bệnh ung thư phát sinh từ các tế bào bạch cầu lympho trong các tổ chức của cơ thể người Bệnh phát sinh và biểu hiện chủ yếu ở hệ thống bạch huyết, tuy nhiên bệnh cũng có thể phát sinh, phát triển ở ngoài hệ thống hạch bạch huyết và ngoài tổ chức bạch huyết như ở xương, ống tiêu hóa, não U lympho

ác tính được chia thành hai nhóm chính là bệnh Hodgkin và u lympho ác tính không Hodgkin U lympho ác tính không Hodgkin có tỷ lệ mắc bệnh cao và có xu hướng ngày càng gia tăng trên thế giới cũng như ở Việt Nam, đứng hàng thứ 5 trong các bệnh ung thư ở nước ta Các phương pháp điều trị u lympho ác tính không Hodgkin hiện có là hóa trị, xạ trị và phẫu thuật nhưng kết quả chưa được như mong muốn và

tỷ lệ tử vong vẫn còn cao Việc nghiên cứu tìm kiếm những phương thức điều trị hữu hiệu để đẩy lùi căn bệnh ung thư nói chung cũng như bệnh u lympho ác tính không Hodgkin nói riêng vẫn là thách thức đối với các nhà khoa học hiện nay Nhờ những tiến bộ của công nghệ sinh học và những hiểu biết về sinh học phân tử và sinh học tế bào, các nhà khoa học đã tìm thấy những tổn thương ở mức độ phân tử -

tế bào, từ đó đưa ra những nghiên cứu ứng dụng trong chẩn đoán và điều trị đặc hiệu Do đó, hiên nay điều trị đích đem lại hiệu quả cao trong việc tiêu diệt tế bào ung thư, giảm thiểu ảnh hưởng có hại cho tổ chức lành Trong bệnh u lympho ác tính không Hodgkin, tế bào lympho B có biểu hiện quá mức kháng nguyên CD20 trên bề mặt tế bào Trên cơ sở này, các kháng thể đơn dòng thế hệ mới được sản xuất để điều trị bệnh và khắc phục các nhược điểm từ việc sử dụng kháng thể lấy từ huyết thanh chuột Kháng thể đơn dòng kháng CD20 thế hệ mới có bản chất nhân

hóa là Rituximab, được sản xuất và ứng dụng để điều trị bệnhu lympho ác tính không Hodgkin típ tế bào lympho B cho kết quả tốt.Kháng thể này được gắn với đồng vị phóng xạ 131I bằng phương pháp đánh dấu phóng xạ sử dụng chloramin T làm chất oxy hóa Kháng thể gắn phóng xạ được tinh chế và kiểm tra chất lượng theo tiêu chuẩn của thuốc phóng xạ để sử dụng lâm sàng Đây là dược chất phóng

xạ dùng trong điều trị ung thư bằng kỹ thuật miễn dịch phóng xạ Với thời gian bán

rã 8 ngày, phát tia gamma với năng lượng là 364 keV, tia beta với năng lượng trung bình là 192 keV, 131I là đồng vị phóng xạ lý tưởng cho việc chụp hình và điều trị bệnh khi gắn với phân tử kháng thể Phức hợp kháng thể đơn dòng gắn đồng vị phóng xạ 131I-rituximab khi vào máu kết hợp với kháng nguyên CD20 trên bề mặt tế bào ung thư, phát huy tác dụng điều trị bằng cơ chế bức xạ ion hóa và cơ chế miễn dịch mà ít ảnh hưởng tới tổ chức lành xung quanh

Để nâng cao hiệu quả trong điều trị bệnh u lympho ác tính không Hodgkin và với mong muốn điều chế thuốc phóng xạ 131I-rituximab đạt các tiêu chí dược chất phóng xạ dùng trong lâm sàng, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu điều chế, phân bố sinh học và khả năng gắn với tế bào ung thư của phức hợp miễn dịch phóng

xạ 131I-rituximab” nhằm các mục tiêu sau:

(1) Điều chế được dược chất phóng xạ 131I-rituximab

(2) Đánh giá chất lượng, tính đặc hiệu miễn dịch và tính an toàn của131rituximab trên động vật thực nghiệmbằng các phương pháp vật lý, hóa học và sinh

I-học

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Bệnh u lympho ác tính không Hodgkin

Bệnh u lympho ác tính không Hodgkin là dạng ung thư các tế bào lympho B trong hệ miễn dịch U lympho là nhóm bệnh lý ác tính rất phổ biến Theo các thống

kê dịch tễ học các bệnh lý ác tính, u lympho luôn nằm trong danh sách 10 loại ung thư thường gặp nhất Giống như các loại ung thư khác, tỷ lệ mắc u lympho liên quan với nhiều yếu tố như tuổi tác, giới tính, chủng tộc, địa lý v.v Mọi lứa tuổi đều có thể mắc bệnh này, nhưng nói chung tuổi càng cao thì nguy cơ càng lớn Ở Hoa Kỳ,theo thống kê của Viện Nghiên cứu ung thư Quốc gia năm 2017, bệnh u lympho ác tính không Hodgkin có 72.2400 người mắc mới và 20.140người chết do bệnh này, tỷ lệ mắc bệnh chuẩn là 19,5/100.000 dân Ở Việt Nam, bệnh u lympho

ác tính không Hodgkin đứng hàng thứ 5 trong các bệnh ung thư, tỷ lệ mắc chuẩn theo tuổi là 5,2/100.000 dân [Howlader N., 2017] Hiện nay, cơ chế bệnh sinh u lympho ác tính chủ yếu được thừa nhận, đó là biến đổi cấu trúc di truyền, nhiễm các virus gây ung thư và suy giảm miễn dịch

Biến đổi cấu trúc di truyền: Trong các tế bào của cơ thể có 2 hệ thống gen

duy trì và kiểm soát sự phát triển bình thường của tế bào, đó là hệ thống gen tiền ung thư và gen chống ung thư U lympho là hậu quả của sự rối loạn hoạt động một trong hai hệ thống trên, hoặc hoạt hóa các gen tiền ung thư thành các gen ung thư, hoặc bất hoạt các gen chống ung thư dẫn đến tình trạng tăng sinh không kiểm soát được của tế bào lympho tạo thành u

Về hoạt hóa hệ gen tiền ung thư, cơ chế chủ yếu là quá trình chuyển đoạn hay hoán vị gen Một gen bình thường gồm hai thành phần chuỗi mã hóa quyết định việc tổng hợp protein và chuỗi điều hòa có nhiệm vụ kiểm soát hoạt động của chuỗi

mã hóa Hoán vị gen xảy ra làm cho chuỗi mã hóa của gen tiền ung thư mất trung tâm điều hòa và biến thành gen ung thư Trong các gen ung thư, chuỗi mã hóa thoát

ức chế tự do sản xuất ra các oncoprotein làm cho tế bào phát triển ác tính Một ví dụ minh họa cho cơ chế này là sự chuyển đoạn giữa nhiễm sắc thể số 8 và nhiễm sắc thể số 14 làm hoạt hóa gen ung thư c-myc nằm trên nhiễm sắc thể số 8 Bất thường

này được phát hiện thấy ở 90% các trường hợp u lympho Burkitt [Faramarz Naeim, 2013].Ngoài ra, một cơ chế khác tuy không phổ biến nhưng cũng có vai trò trong bệnh sinh u lympho ác tính đó là đột biến gen Đột biến gen có thể xảy ra ở gen điều hòa hay gen mã hóa, nhưng kết quả cuối cùng là làm thay đổi cấu trúc di truyền tạo

ra các clon tế bào có nguy cơ chuyển dạng ác tính cao

Bất hoạt hệ gen chống ung thư: Hiện tượng này cũng xảy ra thông qua các cơ chế chuyển đoạn, hoán vị, đột biến gen v.v Hậu quả của các quá trình này là làm bất hoạt các gen chống ung thư khiến chúng mất khả năng ngăn chặn sự tăng sinh

ác tính của các tế bào Gen chống ung thư thường gặp nhất có vai trò trong cơ chế bệnh sinh u lympho ác tính là p53 Gen này mã hóa cho việc sản xuất một phosphoprotein kiểm soát sự tăng sinh và chết theo chương trình của tế bào Khi p53 bị đột biến sẽ làm thay đổi hoạt tính của protein tương ứng dẫn đến tế bào tăng sinh không kìm hãm [Vose JM., 2017]

Nhiễm các virus gây ung thư:Người ta đã thừa nhận 3 virus có vai trò trực

tiếp trong quá trình phát sinh u lympho ác tính là Epstein-Barr virus (EBV), HHV8

và HTLV1 [Cord C., 2010] Khi nhiễm các virus này, bộ gen của chúng tích hợp vào DNA (deoxynucleic acid) của tế bào lympho và làm biến đổi nó, từ đó gây chuyển dạng ác tính Vai trò nổi bật nhất gây ác tính hóa các tế bào lympho có lẽ thuộc

về EBV Các nghiên cứu dịch tễ học cho thấy những người có tiền sử mắc bệnh tăng bạch cầu đơn nhân nhiễm khuẩn hoặc có tăng hàm lượng kháng thể kháng EBV trong máu đều có nguy

cơ cao mắc bệnh u lympho [Vose JM., 2017] Hơn nữa, DNA của EBV được phát hiện ở gần 50% tế bào Sternberg và trên 90% trong các tổ chức u lympho Burkitt [Claire Shannon-Lowe, 2017] Trên thực nghiệm, EBV có khả năng kích thích sự phát triển của lympho B cả in vitro và in vivo Tất cả những bằng chứng trên đã cho thấy vai trò trực tiếp của EBV trong bệnh sinh của u lympho ác tính.Gần đây người ta phát hiện vai trò bệnh nguyên của vi khuẩn Helicobacter pyroli đối với u lympho thể MALT (mucosa – associated lymphoid tissue: mô lympho liên quan với niêm mạc) ở dạ dày [Vose JM., 2017] Do vậy điều trị loại trừ H.pylori đã đem lại hiệu quả trong điều trị u lympho thể này

Vai trò của suy giảm miễn dịch:Giữa suy giảm miễn dịch và u lympho ác

tính có mối quan hệ mật thiết Giả thuyết này được đề cập khi người ta nhận thấy tỷ

lệ mắc bệnh u lympho cao ở những đối tượng suy giảm miễn dịch, cho dù là suy giảm miễn dịch bẩm sinh hay mắc phải Cơ chế của hiện tượng này còn phức tạp và chưa được hiểu biết đầy đủ Gianluca và Ricardo (2000) cho rằng trong điều kiện hệ thống miễn dịch của cơ thể bị suy yếu thì nguy cơ nhiễm EBV rất cao và việc xuất hiện u lympho một phần được giải thích là do cơ thể giảm khả năng tiêu diệt các tế bào lympho nhiễm EBV [Cord C., 2010] Nhận định này được chứng minh khi người ta thấy rằng số lượng lympho B nhiễm EBV tăng lên trong máu của những đối tượng bị AIDS[Birx DL, 1986] Giảm khả năng đáp ứng tại chỗ của tế bào lympho T có lẽ cũng đóng vai trò quan trọng của quá trình phát sinh u lympho bởi trên thực tế sự xâm nhập của các lympho T vào khối u giảm một cách rõ rệt ở những người bị suy giảm miễn dịch so với các đối tượng khác

1.2 Các phương pháp điều trị ULAKH và điều trị RIT

1.2.1 Các phương pháp điều trị U lympho ác tính không Hodgkin

Để điều trị bệnh điều trị U lympho ác tính không Hodgkin, ngoài các phương pháp điều trị truyền thống như phẫu thuật hóa trị và xạ trị, còn có những phương pháp điều trị mới Các phương pháp điều trị điều trị U lympho ác tính không Hodgkin bao gồm:

Phẫu thuật: Hiện nay, phương pháp cắt bỏ triệt để vùng hạch bị tổn thương

đã được chứng minh là ít có hiệu quả trong điều trị u lympho ác tính Chính vì vậy, phẫu thuật hầu như chỉ còn giới hạn trong việc giải quyết các biến chứng do hạch phát triển to và chèn ép tại chỗ, chẳng hạn gây tắc ruột hay liệt tủy [Nguyễn Bá Đức, 2007]

Tia xạ:U lympho ác tính không Hodgkin được coi là bệnh mang tính chất hệ thống, vì vậy xạ trị có vai trò tương đối hạn chế Tuy nhiên khi áp dụng phương pháp này ở giai đoạn sớm và mở rộng diện chiếu xạ cả ở ngoài nhóm hạch bị tổn thương thì vẫn mang lại hiệu quả nhất định

Hóa trị liệu:Hóa trị liệu đóng vai trò hàng đầu trong điều trị u lympho ác tính bởi vì hóa trị có thể áp dụng hiệu quả ở tất cả các giai đoạn của tất cả các thể bệnh,

tỷ lệ đáp ứng và thời gian sống trung bình cao; có rất nhiều phác đồ phù hợp với các thể bệnh khác nhau để lựa chọn, áp dụng điều trị tương đối đơn giản Có rất nhiều hóa chất chống ung thư đã được sử dụng trong điều trị u lympho ác tính Tuy nhiện, hóa trị còn gây nhiều tác dụng phụ không mong muốn

Điều trị hóa chất liều cao:Ý tưởng hóa chất liều cao dựa trên lý thuyết cho

rằng khi tăng độ mạnh của hóa chất bằng cách dùng liều cao hơn trong một đơn vị thời gian sẽ làm tăng khả năng diệt tế bào ung thư, từ đó sẽ cải thiện tỷ lệ đáp ứng

và kéo dài thời gian sống của bệnh nhân.Phương pháp được ứng dụng hiện nay là sử dụng các hóa chất với liều có tác dụng điều trị mà độc tính có thể chấp nhận được, người ta gọi là liều chuẩn Tuy vậy, khi điều trị với liều chuẩn một số bệnh nhân không đáp ứng hoặc tái phát sớm[Nguyễn Bá Đức, 2007]

Interferon alpha:Interferon alpha là một tác nhân sinh học có thể áp dụng

trong điều trị ULATKH độ ác tính thấp, đặc biệt là u lympho thể nang Tác dụng điều biến miễn dịch của interferon alpha bao gồm hoạt hóa tế bào giết tự nhiên, tăng cường sản xuất kháng thể từ lympho B, làm cho các tế bào ung thư nhạy cảm hơn với việc tiêu diệt theo cơ chế miễn dịch qua trung gian tế bào, ngoài ra interferon alpha còn có tác dụng trực tiếp chống tăng sinh khối u Interferon alpha thường được kết hợp với hóa chất, nhưng cũng có thể được dùng đơn độc như một thuốc củng cố sau khi bệnh đã ổn định dưới tác dụng của hóa trị liệu Dù được sử dụng dưới hình thức nào thì interferon alpha cũng chứng tỏ được vai trò của mình trong việc cải thiện tỷ lệ sống sót

Sử dụng các yếu tố tăng trưởng tạo máu:Điều trị u lympho ác tính bằng hóa

chất hay tia xạ đều có thể dẫn đến hội chứng ức chế tủy Vì vậy, bệnh nhân phải đối mặt với biến chứng thiếu máu, nhiễm khuẩn, xuất huyết do tình trạng giảm các dòng tế bào máu ngoại vi Khi sử dụng những cytokin này sẽ kích thích quá trình phân chia, biệt hóa, trưởng thành của các tế bào gốc và các tế bào đầu dòng tạo máu, giúp tủy xương nhanh chóng hồi phục Chúng có thể được dùng trước, trong hay sau quá trình trị liệu nhằm mục đích phòng ngừa và khắc phục tình trạng ức chế

tủy Sự ra đời của những yếu tố tăng trưởng tạo máu như EPO (erythropoietin), TPO (thrombopoietin), G-CSF, GM-CSF chẳng những giúp giảm nguy cơ biến chứng trong điều trị mà còn mở ra khả năng mới cho các phương pháp điều trị hiện đại như hóa chất liều cao hay ghép tế bào gốc tạo máu

Ghép tế bào gốc tạo máu:Những bệnh nhân u lympho ác tính kháng thuốc

hoặc tái phát sớm sau các phương pháp điều trị kinh điển thường có tiên lượng xấu Tuy nhiên, những bệnh nhân này vẫn có thể được điều trị đạt lui bệnh hoàn toàn nhờ hóa trị liệu liều cao kết hợp hoặc không kết hợp với tia xạ toàn thân (TBI: Total body irradiation) Phương pháp này sẽ dẫn đến tình trạng ức chế tủy xương và kéo dài, mất khả năng tự hồi phục, trong những trường hợp đó ghép tế bào gốc là một giải pháp Trong điều trị u lympho ác tính, ghép tế bào gốc tự thân là chủ yếu Khi tiến hành ghép tế bào gốc tự thân, vấn đề hòa hợp tổ chức không cần phải đặt ra nhưng có bất lợi là nguồn ghép thường bị ô nhiễm bởi các các tế bào ung thư khiến cho bệnh nhân có thể bị tái phát sớm[Nguyễn Bá Đức, 1995]

1.2.2 Điều trị miễn dịch phóng xạ bệnh u lympho ác tính không Hodgkin

Kháng thể đơn dòng và điều trị miễn dịch phóng xạ:Kháng thể đơn dòng gắn

với các kháng nguyên đặc hiệu trên bề mặt tế bào ung thư và phá hủy các tế bào ung thư qua cơ chế hoạt hóa bổ thể và gây độc tế bào phụ thuộc kháng thể Hiệu lực này không phụ thuộc vào chu kỳ phân bào, vì vậy tác dụng của kháng thể đơn dòng không

bị giới hạn ở những tế bào đang phân chia Đặc biệt là, nếu gắn kháng thể đơn dòng với đồng vị phóng xạ I-131 hoặc một số chất gây độc tế bào như Ricin, độc tố bạch hầu hoặc độc tố trực khuẩn mủ xanh đã qua xử lý thì hiệu quả điều trị sẽ tăng lên rất nhiều.Cho tới nay, kháng thể đơn dòng kháng CD20+ (Rituximab) đã được chứng minh là có hiệu quả trong điều trị ULATKH bởi kháng nguyên CD20+ hiện diện ở 95% u lympho tế bào B [Dong-Yeop Shin, 2016] Rituximab thường được dùng kết hợp với hóa chất, nhất là phác đồ CHOP tạo nên phác đồ CHOP-R Có thể nói sự ra đời của kháng thể đơn dòng là bước đột phá mới trong lĩnh vực điều trị u lympho ác tính.Các tế bào ung thư trong bệnh ULATKH mang những dấu hiệu đặc trưng bất thường, đó là kháng nguyên CD20 Kháng nguyên CD20 đặc biệt biểu hiện trên từ 50.000 - 200.000 vị trítrên phân tử lympho bào B ác tính [Ginaldi, L., 1998], hình 1.1:

Hình 1.1.Tế bào B ung thư có biểu hiện kháng nguyên CD20

Do vậy, kháng thể đơn dòng kháng CD20 là thuốc lý tưởng để nhận biết những kháng nguyên trên những tế bào ác tính đó và tiêu diệt [Grillo-Lopez, 1999], [Gianluca C., Ricardo DF., 2000] Năm 1979, Nadler và cộng sự đã điều trị bệnh nhân u lymphô ác tính đầu tiên bằng kháng thể đơn dòng và đến năm 2006, Gerald DeNardo, Sally DeNardo, David trường đại học California năm 2006 đã điều trị thành công ca bệnh đầu tiên bằng dược chất kháng thể gắn phóng xạ [Robert M., David M Goldern Berg, 2006]

Oliver Press, đã tiên phong trong việc dùng phóng xạ liều cao của 131Igắn kháng thể kháng CD20, để điều trị NHL [Press, O W., 1995] Nhưng từ khi phát triển kỹ thuật kháng thể kháng CD20 khảm (chimeric) giữa người và chuột, gọi là rituximab, đã tạo ra một cuộc cách mạng trong điều trị NHL và làm nền tảng cho những nghiên cứu xa hơn trong việc dùng kháng thể đơn dòng để điều trị các ung thư khác [Kaminski MS, 2005]

Ytrium 90 gắn ibritumomab (Zevalin) điều trị NHLđã cho phép sử dụng ở

Mỹ và sau đó là Châu Âu Năm 2004 Iode-131 gắn tositumomab (Bexxar) [Ansell S.M., Armitage J., 2005] và sau đó I-131 gắn rituximab cũng đã được sử dụng trong lâm sàng Bảng 1.2 tóm tắt hiệu quả điều trị NHL của một số tác giả [Witzig, T E.,

Richard, L Wahl, MD., 2005]

Bảng 1.1.Hiệu quả điều trị NHL bằng RIT của một số tác giả

(a)

Y-90 Ibritumomab (a)

I-131 Tositumomab (b)

I-131 Rituximab (c)

a: Witzig, et al J Clin Oncol 20; 2453-63, 2002

b: Kaminski, et al J Clin Oncol 19; 3918-28, 2001

c: Turmer, et al Cancer Biother Radiopharm 18; 513-24,2003

Đánh giá kết quả điều trị sau hơn 5 năm ứng dụng trên lâm sàng điều trị NHL bằng 131I-rituximab đã có những công bố về liều lượng (1 and 4,5 GBq) và an toàn cho bệnh nhân cũng như người thân xung quanh [Robert K.,2008], [M F Leahy, 2008], [Kang HJ., 2013]

Việc nghiên cứu điều chế 131I-rituximab và các nghiên cứu đánh giá tiền lâm sàng dùng trong điều trị miễn dịch phóng xạ có liên quan đến kháng nguyên CD20, kháng thể đơn dòng và đồng vị phóng xạ [Mather, S., 2000], [Kassis, A.I., 2005] Sau đây là các tính chất cơ bản của các thành phần trong phức hợp:

Kháng nguyên CD20: Kháng nguyên CD20, còn có tên khác là B1, là một

kháng nguyên đặc hiệu đơn dòng tế bào lympho B, biểu hiện trên tế bào lympho B

ở một số giai đoạn nhất định CD20 là một protein không glycosyl hoá có khối lượng phân tử khoảng 33-35 kDa Gene mã hoá CD20 nằm trên nhiễm sắc thể số

11, cánh dài, locus 12-13.CD20 là một protein có 4 vùng xoắn xuyên màng, cả 2 đầu tận NH2 và COOH đều nằm trong bào tương Hai vòng ngoại bào của CD20 rất

khác nhau về kích thước Vòng nhỏ hầu như không lộ ra khỏi màng, vòng lớn có độ dài khoảng 46 axit amin, từ axit amin số 140 đến axit amin số 185 Trên vòng lớn

có cầu disulfid giữa axit amin số 167 và 183 Vòng này chứa đa số các epitope của các kháng thể đơn dòng [Polyak, M J., 1998], [Popoff, I J., 1998] Đến nay, chức năng của CD20 vẫn chưa được biết một cách rõ ràng [Dillman, R O., 2001],[Maloney, D G., 2001], [Deans, J P., 2002] Nghiên cứu trên những con chuột có tế bào B không biểu hiện CD20 không thấy có sự suy giảm chức năng tế bào B rõ rệt Cấu trúc và vị trí của CD20 đã được mô tả [Ginaldi, L., 1998], [Einfeld, D A., 1988], (Hình1.2):

Hình 1.2 Kháng nguyên CD20 xuyên màng tế bào 4 lần

Tuy nhiên, một số nghiên cứu đã chứng minh CD20 có vai trò trung gian trong nhiều hoạt động sinh học của tế bào B thông qua sự gắn kháng thể như: Đối với sự di chuyển của dòng canxi vào tế bào, sự chuyển vị trí và gắn đặc hiệu CD20 vào các “mảng” lipid sau khi CD20 gắn kháng thể là điều kiện tiên quyết đối với sự khởi đầu quá trình dẫn truyền tín hiệu và/hoặc sự tạo thành các kênh canxi [Kanzaki M., 1997] Trên thực tế, khi kháng thể đơn dòng gắn với CD20, nó khóa các chức năng này của CD20 và dẫn đến sự chết có chương trình của tế bào (apoptosis) [Deans J P., 2002], [Ansell S.M., 2005], [Fisher R I., 2003] Đối với chu kì tế bào, kháng nguyên CD20 có vai trò quan trọng trong điều hoà sự phát

triển chu kì tế bào (cell cycle progression), ít nhất là ở tế bào B bình thường Bằng chứng là các kháng thể đơn dòng hướng đích CD20 đều gây thay đổi chu kì tế bào, làm đẩy nhanh sự chuyển tế bào B từ pha G0 sang G1, các kháng thể đơn dòng cùng nhóm với B1 lại ức chế sự chuyển tế bào B từ pha G1 sang pha S/G2 và pha

M [Deans J P., 2002] CD20 là một phân tử đích tiềm năng trong y học bởi kháng nguyên này chỉ biểu hiện trên tế bào B; mức biểu hiện cao (khoảng 100.000 phân tử/tế bào); không biến dạng hay đồng hóa khi gắn với kháng thể; và thường không phát hiện ở dạng hòa tan[Dillman, R O., 2001], [Popoff, I J., 1998], [Einfeld, D A., 1998] Ở chuột bình thường và chuột chuyển gen CD20 của người đều cho thấy CD20 là đích hiệu quả cho sự làm giảm tế bào B Ngoài ra, do CD20 không biểu hiện trong các tế bào gốc tạo máu, không dễ dàng bị đồng hóa và không bị tách rời khi gắn với kháng thể gắn phóng xạ nên là một đích hấp dẫn cho liệu pháp miễn dịch phóng xạ [Fisher, R I., 2003]

Kháng thể kháng CD20:Kháng thể kháng CD20 đầu tiên được FDA phê chuẩn

sử dụng trên người vào năm 1997 [McLaughlin P., 1999] Rituximab được tạo thành bằng kỹ thuật di truyền, dung hợp vùng biến đổi chuỗi nặng và nhẹ của chuột với vùng hằng định IgG1/κ của người (Hình 1.3) Kháng thể lai tạo thành có khả

năng tiêu diệt các tế bào B in vitro và làm giảm lượng tế bào B trong máu ngoại vi

in vivo Sự giảm tế bào B trong tủy xương, lách và các hạch lympho trong đã được

nghiên cứu kỹ sau nhiều năm điều trị trên lâm sàng[ Press O W., 1995], [McLaughlin P., 1999].FDA phê chuẩn rituximab phần lớn dựa trên các thử nghiệm đối với u lympho tế bào B không Hodgkin tái phát nhẹ Tỷ lệ đáp ứng trong nhóm khó chữa này là khoảng 50% khi chỉ sử dụng rituximab Sau đó, trên 380.000 trường hợp đã được kiểm chứng cho thấy độ an toàn tốt.Một số khối u ác tính khác với đặc trưng CD20+ trên tế bào B như bệnh Hodgkin, u lympho không Hodgkin, hội chứng Waldenstrom, cũng được điều trị bằng rituximab mang lại hiệu quả cao [Silverman, G J., 2003], [Plosker G L., 2003].Kết hợp rituximab với methotrexate hoặc cyclophosphamide có hiệu quả đặc biệt[Maloney D G., 2001], [Willman R O 1999]

Hình 1.3.Cấu trúc của kháng thể rituximab

1.3.Dược chất phóng xạ dùng trongchẩn đoán và điều trị

Vào cuối thế kỷ XIX sau phát hiện của Bequerel (1892) về tia phóng xạ và với việc tìm thấy chất phóng xạ Radi, Poloni của Mari và Pie Curi (1898), những chất phóng xạ này đã sớm được đưa vào sử dụng trong lĩnh vực y học, nhưng phạm

vi áp dụng còn nhiều hạn chế Mãi đến năm 1934 chất phóng xạ nhân tạo đầu tiên

đã được tìm ra bởi I Curie và F Joliot, các nhà khoa học này đã chiếu xạ bia boron

và nhôm bằng hạt alpha từ polonium và thấy rõ sự phát ra của possitron từ bia chiếu, thậm chí sau khi bỏ đi nguồn hạt alpha (α) [Gopal B Saha, 2012, tr 49 ] Sự khám phá ra các chất phóng xạ nhân tạo mở ra hướng nghiên cứu mới Kể từ đó nhiều chất phóng xạ nhân tạo đã được sản xuất [Azuwuike O., 1995] Ngày nay, có hơn 2700 chất phóng xạ nhân tạo được sản xuất từ máy gia tốc, lò phản ứng, máy phát neutron và máy gia tốc thẳng[Gopal B Saha, 2012] Sự thành công này đã mở

ra một lĩnh vực mới và việc sử dụng chất phóng xạ trong sinh, y học bắt đầu mở rộng và phát triển [Azuwuike O., 1995] Các chất phóng xạ dùng trong y học ngày nay chủ yếu là các chất phóng xạ nhân tạo.Mở đầu cho nghiên cứu ứng dụng đồng

vị phóng xạ trong y học là công trình của Hertz và Roberts năm 1938 dùng đồng vị phóng xạ 131Iđể thăm dò chức năng tuyến giáp Chỉ đơn giản là cho bệnh nhân uống

131Ivà đo đếm bằng ống đếm nhấp nháy [Mai Trọng Khoa, 2012a]

Dược chất phóng xạ hay thuốc phóng xạ là những hợp chất gắn với hạt nhân phóng xạ và được điều chế dưới dạng thuốc uống hoặc tiêm sử dụng trong chẩn đoán và điều trị bệnh.Thuốc phóng xạ được điều chế dưới nhiều dạng khác nhau tùy thuộc vào mục đích sử dụng [Mai Trọng Khoa, 2012b] Thông thường có các dạng sau:

- Dạng khí: Như khí 85Kr và 133Xe, 133Xe được dung trong thông khí phổi

- Dạng dung dịch thực: Như các hợp chất dánh dấu phóng xạ hòa tan hoàn toàn trong dung dịch, tạo thành một môi trường trong suốt

- Dạng keo hạt: Là dạng keo hạt của các muối vô cơ Các phân tử muối vô cơ kết tụ lại bền vững có kích cỡ vài µm Ví dụ như keo vàng phóng xạ (198Au-colloid) dung trong ghi hình lách và điều trị các khoang ảo hoặc hệ bạch huyết

- Dạng huyền phù nhũ tương: Là dạng kết tụ của các phân tử hữu cơ Thông thường là dạng kết tụ của các phân tử abumin huyết thanh người Dưới điều kiện

pH, nhiệt độ thích hợp làm biến tính protein tạo ra những thể tụ tập kích thước nhỏ

cỡ 20µm, gọi là các hạt vi cầu Với kích thước lớn hơn 20µm gọi là các hạt kết tụ (macroaggregate)

- Dạng viên nang: Giống như các dạng viên nang trong thuốc tân dược Bao nang được làm bằng gelatin Các thuốc phóng xạ có thể là dạng bột hoặc dạng dầu chứa trong bao nang viên

Dược chất phóng xạ dùng trong chẩn đoán:Trong chụp hình chẩn đoán, sau

khi cho uống thuốc hoặc tiêm dược chất phóng xạ vào tĩnh mạch, có thể chụp hình hình thể, xác định vị trí bệnh lý dùng máy quét gamma camera, hoặc chụp lại hình ảnh, nơi có sự tập trung của chất phóng xạ, và xác định vị trí tổn thương hoặc khối u một cách chính xác

Để chẩn đoán hệ thần kinh, các dược chất phóng xạ được sử dụng như

99mTcO4, 99mTc-DTPA, 123I-IMP, 99mTc-HMPAO, 99mTc-ECD, 18F-FDG, 99mTRODAT-1 [Mai Trọng Khoa, 2012b] Vì não là cơ quan có cấu tạo đặc biệt so với các cơ quan khác trong cơ thể, các dược chất phóng xạ dùng cho hiện hình chẩn đoán các bệnh về não phải đi qua được hàng rào mao mạch máu não, hấp thụ được trong mô não và lưu lại trong não với thời gian đủ lâu để có thể hiện hình não

Tc-Trong chẩn đoán tim mạch các dược chất phóng xạ dùng hiện nay như

201TlCl, 99mTc-sestamibi, 99mTc-teboroxim, 99mTc-teboroxim, 111In-antibody, 111antibody, 82RbCl, 18F-FDG [Azuwuike O., 1995]

In-Trong chẩn đoán gan, xương, thận, phổi, có các hợp chất gắn với 99mTc như như Phytec, MDP, DTPA, DMSA, MAA Chẩn doán viêm dùng Leukoscan

Trong chẩn đoán ung thư: Các ung thư nguyên phát như ung thư biểu mô tuyến giáp cục bộ, dùng 123I hoặc99mTc-pertechnetate; Ung thư biểu mô tuyến giáp (tủy) dùng 99mTc-V-DMSA; Ung thư tuyến tụy - dạ dày111In-octreotide (pentetreotide); Ung thư nguyên bào thần kinh dùng 123I-MIBG; Ung thư vú dùng

99m

Tc-MIBI[Gopal B Saha, 2012]

Ngày nay các chẩn đoán hình ảnh bằng PET-CT với các chủng loại dược chất phóng xạ của 18F như 18F-FDG, 18F-peptid đang sử dụng rộng rãi [Kraeber Bodere, 2015]

Dược chất phóng xạ dùng trong điều trị: Việc sử dụng thuốc phóng xạ dùng

trong điều trị bệnh ngày càng phát triển Các phương pháp điều trị bằng đồng vị phóng xạ như xạ trị nội (dùng nguồn hở), xạ trị ngoại (dùng nguồn kín), xạ trị áp sát (branchytherapy) và điều tri đích [Seidl C., 2014].Điều trị nhắm đích ở mức tế bào dùng các đồng vị phát bức xạalpha, bêta gắn các peptid, kháng thể như 90Y, 177Lu,

186Re, 131I, 211At, 212Bi, 213Bi; Điều trị ở cấp độ phân tử được kể đến với nhân phóng

xạ phát hạt điện tử Auger như 125I, 111In, 123I

Các ung thư được chữa trị dùng các dược chất phóng xạ như ung thư tuyến giáp (dùng 131I); Ung thư phôi bào thần kinh giai đoạn III-V, và phaeochromocytoma ác tính (dùng 131I-MIBG) Các rối loạn tăng sinh tế bào tủy dùng 32P và điều trị các giảm đau do di căn xương (dùng 32P, 89Sr, 153Sm-EDTMP or 186Re-HEDP) [Gopal B Saha, 2012] Các thuốc phóng xạ dùng trong điều trị hiện nay đang được thương mại như Na131I, 32P, 153Sm-EDTMP, 131I-MIBG,

177Lu-DOTATATE, 177Lu-J591, Bexxar, Zevalin (điều trị tuyến giáp, di căn xương,

u nguyên bào thần kinh, u thần kinh nội tiết, ung thư tuyến tiền liệt, u lympho bào B không Hodgkin) [David M Goldenberg, 2007]

Dược chất phóng xạ dùng trong điều trị RIT: Hơn hai thập kỷ qua, điều trị

miễn dịch phóng xạ đã tiến bộ vượt bậc nhờ sự phát triển sinh học phân tử và công nghệ sinh học Kháng thể đơn dòng được sản xuất với mức tinh khiết cao có thể dùng trên lâm sàng [I Van M Roitt, 1980] David M Goldenberg và cộng sự, là người dầu tiên dùng kháng thể gắn với 99mTc để chụp hình các di căn ung thư trực tràng, việc chẩn đoán và chữa bệnh bằng kháng thể từ đó không ngừng phát triển

và đổi mới [David M Goldenberg, 2007]

Ngày nay, cùng với các phương pháp chữa ung thư truyền thống, RIT góp phần đáng kể trong việc chữa trị các ung thư tái phát hoặc không đáp ứng với hóa chất Từ khi được sản xuất, kháng thể đơn dòng đã có nhiều ứng dụng trong các lĩnh vực như y học, chăn nuôi, công nghiệp Đặc biệt là trong chẩn đoán và điều trị bệnh, kháng thể đơn dòng khi gắn với chất phóng xạ hoặc hoá chất, sau khi tiêm vào người có thể phát hiện sớm bệnh ung thư, phát hiện sự lan truyền ung thư, phân biệt mô lành với mô ác tính, ngăn chặn và loại trừ sự phát triển của ung thư, điều trị các ung thư ác tính [Pescovitz M D., (2006].Điều trị bằng kháng thể đơn dòng là phương pháp điều trị hiệu quả đối với tế bào ung thư nhưng mức độc thấp nhất đối với tế bào bình thường [Kassis A.I., 2005].Ngay từ những năm 1950 các nhà khoa học đã gắn kháng thể với 131I và đo sự tập trung của phức hợp trong khối u, sử dụng máy đếm phóng xạ và so sánh với mô bình thường [David M Goldenberg, 2007] Cho đến những năm 1980, các nghiên cứu của Hnatowich và cộng sự đã sử dụng các phức trung gian để gắn kháng thể với các đồng vị phóng

xạ như 111In, 90Y [Press O.W, 1996], tạo ra nhiều sản phẩm thuốc phóng xạ mới Đặc biệt là các nhà khoa học quan sát thấy ung thư ruột ở người có biểu hiện kháng nguyên CEA (carcinoma embryo antigen) [Goldenberg Nautius, 1992], từ

đó suy luận là kháng nguyên này có thể là đích để có thể đưa chất phóng xạ đến u ruột một khi kháng thể kháng CEA được gắn với nhân phóng xạ Từ đó ra đời phương pháp sử dụng kháng thể gắn phóng xạ để phát hiện bệnh, các tác giả đặt tên là Radioimmunodetection hoặc Radioimmunotherapy [Goldenberg D.M and Larson S.,1992]

Về sau, nhiều kháng thể đơn dòng mới được phát hiện, các đồng vị phóng xạ khác cũng được dùng, các kháng thể đoạn nhỏ cũng được sử dụng Từ đó, kỹ thuật miễn dịch phóng xạ được ứng dụng để phát hiện các ung thư và các bệnh khác như bệnh đông tụ máu, nhồi máu cơ tim, viêm nhiễm [Goldenberg D M., 2001]

Để điều trị ung thư, kháng thể có thể được sử dụng gắn với chất khác hoặc dùng kháng thể trần Kháng thể trần kháng thể không gắn với một chất nào để điều trị ung thư Các cơ chế trực tiếp tiêu diệt tế bào ung thư khi dùng kháng thể trần là cơ chế ức chế tác dụng sinh học của kháng nguyên bề mặt, cơ chế kích thích sự chết có chương trình của tế bào (apoptosis)[Deans J P., 2002], [Fisher,

R I (2003] Cơ chế gián tiếp là cơ chế miễn dịch, đó là gây độc tế bào phụ thuộc

bổ thể (CDCC), gây độc tế bào phụ thuộc kháng thể (ADCC), cơ chế gây độc phụ thuộc bổ thể (CDC)[Kassis A.I., 2005] Các kháng thể được FDA cho phép

sử dụng trên lâm sàng như Rituximab (kháng thể kháng CD20)[Jan Boucek, J Turner (2009), Kang HJ, 2013], Trastuzumab(Herceptin) (kháng thể kháng protein HER2), Alemtuzumab (kháng thể kháng CD52), Cetuximab (kháng thể kháng EGFR) [Irina V., 2005],Bevacizumab (kháng thể kháng protein VEGF) [Stanislas Blein, 2011] Kháng thể cộng hợp là kháng thể kết hợp với hóa chất hoặc độc chất, chất phóng xạ, liposome, cytokin, sc-Fv enzym Tùy thuộc vào chất gắn với kháng thể mà tạo ra các cách gọi tên khác nhau như kháng thể gắn hóa chất (chemolabeled antibodies), kháng thể gắn phóng xạ (radiolabelled antibodies), kháng thể gắn độc tố (immunotoxin) [I Van M Roitt, 1980],[Kraeber-Bodere, 2015]

Các kháng thể gắn phóng xạ đang sử dụng đƣợc tóm tắt trong bảng 1.2 sau:

Bảng 1.2.Các kháng thể gắn đồng vị phóng xạ đang đƣợc nghiên cứu điều trị

01 90Y-ibritumomab tiuxetan U lympho ác tính không Hodgkin (NHL)

02 131I-tositumomab U lympho ác tính không Hodgkin (NHL)

03 90Y-epratuzumab anti-CD22

IgG

U lympho ác tính không Hodgkin (NHL)

04 213Bi-HuM195 anti-CD33 IgG Bệnh bạch cầu (leukemia)

06 90Y anti -Tac IgG T-cell lymphomas; non-Hodgkin’s and

Hodgkin’s lymphomas

08 177Lu-J591 IgG Ung thƣ tuyến tiền liệt (prostate cancer)

09 90Y-PAM4 IgG Ung thƣ tuyến tụy (pancreatic cancer)

10 131I/90Y-CC49-delta CH2 Ung thƣ ruột kết (colorectal cancer)

09 125I/131I-A33 Ung thƣ ruột kết (colorectal cancer)

11 90Y-T84.66 anti-CEA IgG Các ung thƣ có kháng nguyên CEA

13 131I-Hepama-1 IgG Ung thƣ gan (hepatocellular cancer)

14 131I-cG150 IgG Ung thƣ thận (renal cancer)

17 186Re-bivatuzumab Ung thƣ đầu và cổ (head and neck cancer)

18 125I-425IgG Ung thƣ não (brain cancers), gliomas

19 131I -81C6 anti-tenascin; 211

At-81C6; 90Y-BC-2; BC4

U thần kinh đệm (glicomas)

Hiệu quả của điều trị của kháng thể đơn dòng còn nhiều hạn chế bởi kháng thể sản xuất từ tế bào lai chuột Sau thời gian điều trị, hệ thống miễn dịch của cơ thể phát hiện kháng thể là chất ngoại lai và tiêu diệt ngay khi đưa vào cơ thể Vì lý

do này mà các nhà khoa học đã gắn gen mang đoạn hoạt tính của kháng thể chuột với gen mang kháng thể người [Jones PT., 1986] Việc sản xuất gen kháng thể chuột - người gọi là kháng thể đơn dòng khảm “chimeric“ hoặc “humanized“ Kháng thể mới tạo ra này giống như kháng thể người, vì vậy không bị hệ thống miễn dịch cơ thể phát hiện [Matsuura, 2003] Cách điều trị mới hơn nữa là dùng một đoạn kháng thể thay vì dùng cả phân tử Các đoạn kháng thể nhỏ này có thể đi đến ung thư tốt hơn, vì vậy việc chữa trị sẽ hiệu quả hơn[Goldenberg D M 2001]

Từ khi được gắn với các chất phóng xạ, các kháng thể, và cả những đoạn kháng thể, kháng các kháng nguyên khác nhau liên quan đến các loại bệnh tật đã được phát triển để hiện hình đặc biệt các loại bệnh này [Goldenberg Nautius, 1992] [Maloney, D G (2001]

Các bệnh dùng kháng thể gắn phóng xạ để chụp hình như ung thư trực tràng (satumomab pendetic, arcitumomab), ung thư tuyến tiền liệt (capromab, pendetide),

u lympho ác tính không Hodgkin [Plosker, G L., 2003], ung thư gan, nhồi máu cơ tim, nhiễm trùng và viêm (sulesomab, fanolesomab), nhiễm trùng đặc hiệu và tắc mạch máu [Leahy MF., Turner JH., 2011]

1.4.Đồng vị phóng xạvà các phương pháp gắn kháng thể với 131 I

Đồng vị phóng xạ:Các đồng vị phóng xạ dùng trong nghiên cứu điều trị có

tính đặc trưng và ổn định khi tạo phức hợp với kháng thể thành phức hợp miễn dịch phóng xạ [Kassis A.I., 2005] Các đặc trưng phát bức xạ bức xạ [Gopal B Saha,

2012, tr 97] như sau:

Bức xạ hạt alpha:Bức xạ hạt alpha lý hiệu là , Năng lượng cao 4 - 9 MeV,

quãng chạy trong mô ngắn 50 - 90 m, diệt 2-50 tế bào, diệt đám tế bào ung thư nhỏ hơn 200 m Các đồng vị phát bức xạlà 211At, 225Ac, 212Bi, 213Bi, 212Pb,

223Ra, 227Th [Qaim S.M., 2001]

Bức xạ hạt beta: Bức xạ bêta gồm 2 loại, - và + Năng lượng bức xạ từ 0,1 - 2,5 MeV; quãng chạy trong mô là 0,5 - 12mm, tiêu diệt khoảng 10 - 1000 tế bào Do có khoảng chạy ngắn hơn, nên ít độc tố đối với các tế bào không đặc hiệu, diệt tế bào lành và xung quanh tế bào ung thư là tối thiểu

Bức xạ gamma:Có khả năng đâm xuyên lớn, có thể đi qua lớp chì dày và

nguy hiểm cho con người; có mọi tính chất như bức xạ Rơnghen Có thể chụp hình hình thể và chức năng Khi sử dụng cần tính toán về liều và cách ly bệnh nhân

Bức xạ điện tử Auger: Các đồng vị phóng xạ phátbức xạ Auger là 125I, 165Er,

192Ir, 103Pdphát bức xạ -, quãng chạy trong mô rất nhỏ cỡ nm-m, có khả năng ion hóa, làm tổn thương tế bào

Khi sử dụng đồng vị phóng xạ phát bức xạ alpha hoặc bêta dùng trong điều trị, tế bào ung thư chịu liều bức xạ lớn hơn tế bào bình thường do sự giới hạn về quãng chạy của các tia bức xạtrong mô[Daniel S., 1993], [Bhargawa K.K., 1989], Dewanjee M K 1992] Tế bào ung thư tiếp xúc với bức xạ trong khoảng thời gian lâu [David M Goldenberg, 2007] và bị tiêu diệt như hình 1.4 sau:

Hình 1.4 Cơ chế tiêu diệt ung thư bằng bức xạ

Các nhân phóng xạ sử dụng cho RIT được tóm tắt bảng 1.3

Bảng 1.3.Các đồng vị phóng xạ dùng trong điều trị đích [Press, O.W., 2003] Nhân

E AV (keV)

Năng lượng gamma, (keV)

Quãng chạy trong

mô (mm)

Số lượng

tế bào diệt (*)

(Auger) Ga-67 3,25 ngày

(*) Giả thiết là 1 tế bào ung thư có đường kính là 10 m

Trên bảng tóm tắt, hầu hết là các chất phát bức xạbeta và quãng chạy vài milimet trong mô, một khoảng cách có khả năng diệt tế bào bằng đường kính khoảng 50 - 200 tế bào[Gopal B Saha, 2012] Bức xạbeta nhìn chung thích hợp tiêu diệt các ung thư nhìn thấy được, nhưng quãng chạy lớn của nó cũng có thể gây ra những thiệt hại cho những mô bình thường gần đó Kháng thể gắn với đồng vị phát bêta có thể lưu thông trong máu trong vài ngày, có thể làm hỏng một số tế bào tạo máu trong tủy xương, điều này làm cho số đếm trong máu thấp hơn ở những bệnh nhân đang điều trị và giới hạn hoạt tính phóng xạ phải được đưa ra [Andrew Boswell and Martin W Brechbiel, 2007], [Stanislas Blein, 2011]

Các phương pháp gắn kháng thể với đồng vị phóng xạ:

Từ khi kỹ thuật sản xuất kháng thể đơn dòng phát triển, người ta đã gắn với các đồng vị phóng xạ như 131I, 67Ga, 111In, 123I, 99mTc, 90Y … Việc chọn đồng vị phóng xạ dựa trên những đặc điểm thời gian bán rã phải từ 6 giờ đến 7 ngày là thích hợp [Press O.W., 1996],[Mather S.,2000], năng lượng gamma từ 70 - 300 keV, độ giàu gamma đơn năng trên mỗi phân rã phải cao, không có những bức xạ đặc biệt khác, đồng vị con phải ổn định và sản phẩm ở dạng không có chất mang [Kassis

A.I., 2005] Phức của nhân phóng xạ và protein phải ổn định hóa học invivo

Các nhân phóng xạ khác như 111In có tính chất hoàn hảo hơn, thời gian bán rã

là 68 giờ, năng lượng 171 keV, ổn định in vivo, tuy nhiên vẫn có nhiều nhược điểm

là giá cả cao, tập trung không đặc hiệu trong các cơ quan (phông ở gan, thận, lách cao), khó sản xuất hơn, chỉ để chẩn đoán 99mTc có nhiều ưu điểm hơn, tính chất hạt nhân hoàn hảo, dễ tìm, giá thành thấp, chỉ có điều là thời gian bán rã quá ngắn (6 giờ), và tính phức tạp về mặt hóa học, chỉ dùng trong chẩn đoán [Daniel S 1993], [Peter M 2010]

Đồng vị phóng xạ 131I được dùng trong chẩn đoán vì nó có nhiều thuận lợi là giá thành thấp, dễ sản xuất, sơ đồ phân rã 131I (Hình 1.5) như sau [Azuwuike Owunwanne, 1995]:

Hình 1.5.Sơ đồ phân rã của 131I

Năng lượng phát bức xạ gamma của 131I là 364 keV, các mức năng lượng của

131I là 0,25, 0,33, 0,47, 0,61, 0,81MeV, năng lượng trung bình là 192 keV

Các phương pháp gắn kháng thể với 131 I

Kháng thể gắn với 123I và 131I có thể chụp hình trong khi 131I còn dùng cho điều trị các phương pháp gắn kháng thể với 131I:

Phương pháp thay thế trực tiếp: Dùng chất oxy hoá nhẹ để bảotoàn hoạt tính

miễn dịch của kháng thể, các chất oxy hóa thường dùng là chloramin T, tetrachlorodiphenylglycouril (iodogen) [Fraker P J., 1978] và hydrogenperoxidase (lactoperoxidase) Sự xạ phân có thể sẽ xảy ra, làm giải phóng iod tự do và có thể sẽ tích lũy trong tuyến giáp hoặc trong dạ dày Tuy nhiên trong những năm gần đây, các nhà nghiên cứu vẫn tiến hành nghiên cứu gắn kháng thể với 131I cho mục đích điều trị bệnh ngày càng nhiều[Gopal B Saha, 2012, tr 98]

Phương pháp cộng hợp kháng thể và 131 I: Trong phương pháp này gồm hai

bước, đó là iod hoá phân tử hữu cơ bằng cách thay thế trực tiếp và sau đó cộng hợp với kháng thể Ví dụ iod hoá N-hydroxysuccinimide ester, một dẫn xuất của ortho-iodohippurate và succinimidyl para-iodobenzoate dùng liên kết cộng hoá trị với kháng thể[Dewanjee M K 1992] Hiệu suất gắn nhìn chung là thấp hơn so với gắn trực tiếp

Phương pháp gắn các chất có bản chất protein:Để có sản phẩm protein gắn

với iod phóng xạ, phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất là oxy hóa phân tử

Na131I trong sự có mặt của protein hoặc những phân tử có chứa gốc tyrosine, iod phóng xạ sẽ gắn vào phân tử tyrosine Trong vài trường hợp iod sẽ gắn với phân tử histidine, tryptophan hoặc nhóm sulphydryl[Gopal B Saha, 2012, tr 96] Sau đây là các phương pháp thường dùng:

Phương pháp clo hóa iod (iodine monocloride:Đây là phương pháp đầu tiên

được sử dụng để iod hóa các phân tử protein ICl được cân bằng với iod phóng xạ, sau đó phản ứng với protein cần gắn Tuy nhiên, phương pháp này không được sử dụng rộng rãi do sự dễ phân hủy của các protein bởi 131I [Dewanjee, M K 1992]

Phương pháp iodogen:Dùng Iodogen (1,3,4,6-

tetrachloro-3,6-diphenylglycoluril) hoà tan trong methyl chloride, cho bay hơi, tạo nên ống tráng phủ đồng nhất Chất gắn được trộn vào ống iodogen trong khoảng 10 - 15 phút, lấy hỗn hợp phản ứng ra, iod tự do được tách ra bằng sắc ký lọc gel dùng cột sephadex hoặc vật liệu trao đổi ion DEAE Dùng phương pháp này, sự biến tính của protein là tối thiểu, vì phản ứng xảy ra trên pha rắn và iodogen không hòa tan trong nước Hiệu suất gắn khoảng 70 - 80%[Fraker P J., 1978]

Phương pháp chloramin T:Đây là phương pháp được sử dụng rộng rãi để iod

hóa một khối lượng rất bé phân tử protein để sản xuất các chất gắn cho RIA 125I bị oxy hóa bởi chloramin T trong sự có mặt của protein cần gắn Phương pháp dùng chloramin T có thể gây phân hủy protein nhưng phương pháp này kỹ thuật đơn giản, dễ làm, vì vậy, được chọn để sản xuất chất gắn cho RIA và RIT[Gopal B Saha, 2012, tr 98],[Mather S 2000]

Phương pháp dùng chất oxy hóa hypochloride:Để khắc phục vấn đề phân

hủy protein trong quá trình iod hóa bởi phương pháp chloramin T, một vài phương pháp oxy hóa khác được đưa ra Điển hình là dùng natri hypochloride (NaOCl) làm chất oxy hóa Phương pháp này cũng có những hạn chế nhất định bởi sự chịu đựng độc hại trực tiếp của protein với chất hóa học[Azuwuike Owunwanne, 1995]

Phương pháp điện phân (electrolytic iodination): Phương pháp này được

đưa ra bởi Penirisi và Rosa dùng dòng điện để chuyển I- về dạng I+ Đây là kỹ thuật dùng để iod hóa insulin Cho insulin vào dung dịch NaCl 0,9% và Na125I Điện ly hỗn hợp 40 phút với dòng điện 6 - 7 mA Sản phẩm thu được có hiệu suất cao, hoạt tính sinh học, hoạt tính miễn dịch học cao Ưu điểm của phương pháp này là protein không tiếp xúc trực tiếp với chất oxyhóa, chất khử Nhưng do thời gian tiếp xúc với phóng xạ lâu nên protein dễ bị phân hủy và điện ly ở nhiệt độ phòng dễ làm hỏng protein Hơn nữa, thiết bị đòi hỏi khá phức tạp[Gopal B Saha, 2012]

Phương pháp enzym: Một phương pháp đơn giản để iod hóa protein là dùng

enzym lactoperoxidase Phương pháp này được Marchalonis giới thiệu để iod hóa các phân tử globulin miễn dịch Protein được trộn với 125I và lactoperoxidase Phản

ứng bắt đầu khi thêm một lượng nhỏ hydrogen peroxide và thời gian duy trì là 10 phút Thêm cystein vào để kết thúc quá trình iod hóa và sau đó lọc gel Kỹ thuật này

ít mạnh hơn so với các phương pháp hóa học khác và chỉ sử dụng cho những protein

dễ bị đứt gãy khi dùng chloramin T [Bhargawa K.K.,1989]

Trong các phương pháp kể trên, người ta thường chọn phương pháp dùng chloramin T Trong dung dịch, chloramin T dễ tạo thành acid hypochlorous (HOCl)

Ở dạng Na131I, phân tử 131I ở trạng thái bền, không tham gia phản ứng Khi bị oxy hóa, HOCl thực hiện phản ứng chuyển phân tử Na131I (dạng 131I-) thành 131I+ theo phản ứng như sau:

HOCl + 131I- HO131I + Cl

-HO131I OH- + 131I+

131I+ phản ứng theo chiều thuận và xảy ra nhanh tại pH trung tính Đồng vị phóng xạ 131I dạng cation 131I+ thay thế trực tiếp vào vị trí ortho của hydro trên vòng phenol Quá trình oxy hóa được dừng khi thêm một lượng chất khử natri metabisulfite thích hợp vào, phản ứng khử xảy ra như sau:

Na2S2O5 + NaOH + I2 Na2SO4 + H2O + NaI

Khi dừng phản ứng, các thành phần tách ra khỏi nhau bằng phương pháp lọc gel Theo phương pháp điều chế trên, có hơn 90% kháng thể gắn phóng xạ được tạo thành, một nguyên tử iot phóng xạ (131I) được gắn vào vòng phenol tại vị trí 3’ đồng thời cũng có một số ít nguyên tử 131I gắn vào cả vị trí 5’ Phản ứng cho thấy dược chất phóng xạ 131I-mab thu được cùng với một số chất oxy hóa còn thừa, do vậy dược chất phóng xạ được tinh sạch bằng phương pháp sắc ký lọc gel sephadex[Gopal B Saha, 2012], [Andrew Boswell and Martin W Brechbiel 2007]

CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu, hóa chất, thiết bị

Nguyên vật liệu, hóa chất

- Đồng vị phóng xạ 131I dạng Na131I, nồng độ phóng xạ 3,7-7,4 GBq (100-200 mCi)/ml, hoạt độ riêng 222 GBq/mg, độ tinh khiết hạt nhân phóng xạ 135I, 133I < 0,1%, độ tinh khiết hóa phóng xạ 131I > 99,9% Viện Nghiên cứu hạt nhân sản xuất

- Kháng thể rituximab, 500 mg/10ml, công thức C6566H10082N1746O2056S40, trọng lượng phân tử 150.000 Da Hãng F.Hoffmann-La Roche Ltd, Thụy Sỹ

- Tế bào ung thư Raji, CCL-23, American Type Culture Collection (ATCC)

- Kháng nguyên CD20 mua từ hãng Fitzgerald, Mỹ

- Chuột nhắt trắng dòng Swiss 18-22 g mua từ Viện Vacxin Nha Trang

- Môi trường RPMI 1640 30-2003, ATCC

- Chloramin T (N-chloro para-toluenesulfolamide), C7H7ClNO2S·Na(3H2O), trọng lượng phân tử 227,64g/mol, Sigma

- Natri metabisulphit (SMB)Na2S2O5, trọng lượng phân tử 190,107g/mol, Sigma

- Human serum albumin (HSA) trọng lượng phân tử 66,5 kDa, Fluka

- Niken nitroacetic acid (NTA) Agarose R901-15, hãng Invitrogen, Mỹ

- Natri hydrophosphat, natri dihydrophosphat (Na2HPO4.2H2O, NaH2PO4.H2O) hãng Merck, Đức

- Một số các hóa chất thông dụng như Axit ascorbic, Sigma; Polivinylpyrovidone 25, Glucose; Methanol, Merck; Ethanol, Ether, phormone, Fetal bovine serum (FBS), Sigma; Penicillin và streptomycin, Invitrogen GmbH, Karlsruhe; PBS 1X, Sigma; Nước cất BET (non-pyrogen); Thyoglicolate, Casein Soyabean Diges, Merck

- Các dụng cụ thí nghiệm dùng trong nghiên cứu gồm: Cột sắc ký lọc gel sephadex G25, pD10, Pharmacia,GE Healthcare; Micropipet 2 -20µl, 5 - 50µl, 50 - 200µl,

100 -1000µl; MultiScreen MAFBNOB50, 96 lỗ, Millipore, Pháp; Sắc ký bản mỏng TLC-SG TLC silica gel 60 F254, Giấy sắc ký nhanh Biodex TEC-CONTROL 150-771; Buồng đếm hồng cầu Neubauer (Đức); Và các dụng cụ thủy tinh, chai lọ

Các trang thiết bị chủ yếu được sử dụng

- Máy phóng xạ tự chụp Cyclone PlusPhosphor Scanner, B431200, PerkinElmer

- Máy đo hoạt độ phóng xạ CR- 127, miền đo từ 0,001-80.000 mCi, Capintec, Mỹ

- Máy đo hoạt độ phóng xạ Capintec ISOMED 2000, Mỹ

- Máy đo hoạt độ phóng xạ Caprac 00013, Capintec, Mỹ

- Máy đo gamma GENESYS, 5000 Series

- Hệ phổ kế gamma đa kênh, độ phân giải tại đỉnh năng lượng 1332keV của Co-60

là 1,9keV của hãng Ortec, Mỹ

- Máy đo nhanh nội độc tố vi khuẩn Endosafe-PTSTM Portable Test System 100

- Tủ hút vô trùng, class 100, Mỹ

- Tủ ấm lạnh LCI - 050 EL, nhiệt độ 0-600C, set accuracy ±0,10C, Labtech

- Tủ ấm LIB - 060 DAIHAN, miền đo 5-700C, set accuracy ± 0,20C Labtech

- Máy lọc nước siêu sạch Purelabtm Ultra Genetic,Anh

- Tủ ấm CO2 MCO-5AC (Panasonic, Nhật)

- Kính hiển vi soi ngược Primo Vert (Carl Zeiss, Đức)

- Nồi hấp tiệt trùng loại 50L, model HV-50, hãng Hirayama, Nhật Bản

- Cân phân tích, model EP 214 /EP214C, hãng Ohaus, Mỹ

- Máy đo pH, Model: Hi 2211, hãng Hanna Instruments, Mỹ

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1.Nghiên cứu điều chế phức hợp miễn dịch phóng xạ 131 I-rituximab

Để điều chế phức hợp 131I-rituximab đạt các tiêu chuẩn về dược chất phóng

xạ dùng trong các nghiên cứu đánh giá tiền lâm sàng và ứng dụng điều trị, kháng thể đơn dòng rituximab được gắn với đồng vị phóng xạ 131I dựa trên phương pháp

đã đưa ra bởi Hunter và Greenwood và cải biến [Gopal B Saha, 2012, tr 98] [Daniel S Wilbur, Alan R Fritzberg 1993], gắn các hợp chất sinh học như protein, peptid với chất phóng xạ 131I Theo phương pháp này, chất oxy hóa là chloramin T, đồng vị phóng xạ 131I bị oxi hóa tạo thành iodine-131[131I+] và gắn vào phân tử tyrosine tại vị trí ortho trên vòng phenol với hiệu suất gắn cao Phân tử chloramin T thừa sẽ bị khử bởi sodium metabisulphite Hỗn hợp phản ứng được tách qua cột sắc

ký sephadex và thu sản phẩm [Gopal B Saha, 2012, tr 98]

Các thí nghiệm được tiến hành bằng cách khảo sát nồng độcác chất tham gia phản ứng tạo phức hợp, bao gồm các thí nghiệm khảo sát nồng độchloramin T, nồng độkháng thể, hoạt độ phóng xạ, thời gian phản ứng tạo phức hợp, pH gắn kháng thể với phóng xạ Trong quá trình thiết kế thí nghiệm, cố định các chất tham gia phản ứng, chỉ thay đổi thông số cần khảo sát

2.2.1.1 Khảo sát nồng độ chất oxy hóa tạo phức hợp 131 I-rituximab:Chloramin T

tham gia trong phản ứng với vai trò là chất oxy hóa nhẹ [Leahy MF, 2011] Để phản ứng gắn iod phóng xạ lên kháng thể với nồng độ chloramin T tham gia trong phản ứng là tối thiểu, cần thiết khảo sát nồng độ chloramin T và hiệu suất gắn Trong các chai phản ứng gắn (n=2), cho vào một lượng đệm phosphat 0,5M, pH 7,4 là 50l, sau đó cho kháng thể vào với nồng độnhư nhau là 500g Hoạt độ phóng xạ cho vào mỗi ống gắn là 5mCi, cho ChT vào ống với các nồng độ khác nhau 1, 10, 20, 30,

40, 50 và 60g Kiểm tra pH trong các ống phản ứng là pH 7,5, thời gian phản ứng

Kháng thể 10mg/ml (µl)

I-131 200mCi/ml (µl)

Chloramin T (µg)

Sau khi đủ thời gian, cho thêm vào mỗi ống 10l (2mg/ml) dung dịch

Na2S2O5 Trộn nhẹ các ống 30 giây Các mẫu được phân tích bằng phương pháp sắc lớp mỏng, pha động là dung môi methanol: NaCl 0,9% tỉ lệ 85:15 Kết quả phân tích trên máy Bioscan, tính phần trăm hiệu suất gắn kháng thể với đồng vị phóng

xạ bằng phần mềm Biochrom

2.2.1.2.Khảo sát nồng độkháng thể và thời gian phản ứng tạo phức hợp kháng thể gắn phóng xạ: Dùng các chai phản ứng gắn (n=2), cho vào một lượng đệm

phosphat 0,5M, pH 7,4 là 50l, sau đó cho vào các ống gắn nồng độ kháng thể lần lượtlà 0,1, 1, 10, 100 và 1000g Thời gian phản ứng 1 phút, 3 phút, 10 phút và 20 phút Trong mỗi ống gắn phóng xạ sử dụng 131I có hoạt độ phóng xạ là 2 mCi, pH 7,5, chloramin T 10g, các bước thực hiện như bảng 2.2:

I-131 200mCi/ml (l)

Chloramin T (mg/ml) (l)

Na 2 S 2 O 5 ( 2mg/ml) (l)

độ phòng

10 phútnhiệ

t độ phòng

20 phút nhiệt độ phòng