Một số đặc điểm dịch tễ học và sinh học bệnh sán lá gan lớn trên bò ở đồng bằng sông cửu long và thử hiệu quả của thuốc tẩy trừ

Chính vì vậy đề tài được thực hiện nhằm nghiên cứu những đặc điểm hình thái, dịch tễ học và sinh học của sán lá gan lớn SLGL trên bò ở vùng Đồng bằng sông Cửu Long ĐBSCL.. Chương 1: GIỚI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG

HÀ HUỲNH HỒNG VŨ

MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ HỌC VÀ SINH HỌC BỆNH SÁN LÁ GAN LỚN TRÊN BÕ Ở ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG VÀ THỬ HIỆU QUẢ CỦA THUỐC TẨY TRỪ

LUẬN ÁN TIẾN SĨ CHUYÊN NGÀNH BỆNH LÝ HỌC VÀ CHỮA BỆNH VẬT NUÔI

Mã số 62640102

Cần Thơ – 2018

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG

HÀ HUỲNH HỒNG VŨ

MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ HỌC VÀ SINH HỌC BỆNH SÁN LÁ GAN LỚN TRÊN BÕ Ở ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG VÀ THỬ HIỆU QUẢ CỦA THUỐC TẨY TRỪ

LUẬN ÁN TIẾN SĨ

CHUYÊN NGÀNH BỆNH LÝ HỌC VÀ CHỮA BỆNH VẬT NUÔI

Mã số 62640102

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS.TS NGUYỄN HỮU HƯNG

Cần Thơ - 2018

LỜI CẢM TẠ

Trong suốt thời gian học tập thực hiện đề tài và hoàn thành luận án, tôi luôn nhận được sự giúp đỡ của nhiều tập thể và cá nhân Nhân dịp này, tôi không biết nói gì hơn ngoài lời cảm ơn chân thành đến những người đã quan tâm, lo lắng và giúp đỡ tôi trong thời gian qua

Trước tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến ba mẹ đấng sinh thành cùng anh chị em trong gia đình thân yêu luôn là nguồn động lực thúc đẩy tôi nỗ lực và phấn đấu Cảm ơn vợ và các con đã tạo điều kiện cho tôi có thời gian học tập thật tốt Tất cả những người thân yêu nhất đã dành cho tôi rất nhiều tình cảm,

-sự khuyến khích và ủng hộ tôi trong quá trình học tập và hoàn thành luận án tiến

sĩ

Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Nguyễn Hữu Hưng, đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập, thực hiện và hoàn thành luận án Đặc biệt, thầy là người truyền cho tôi lòng nhiệt huyết và niềm đam mê khoa học, khơi dậy trong tôi sự tự tin, nỗ lực, cố gắng không ngừng và không chùn bước trước những khó khăn trong suốt thời gian thực hiện luận án tiến sĩ

Chân thành cám ơn Ban Giám Hiệu Trường Đại Học Cần Thơ, Ban Chủ nhiệm Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng, Bộ môn Thú Y đã tạo điều kiện thuận lợi cho chúng tôi trong quá trình học tập cũng như trong thời gian tiến hành

đề tài Xin ghi nhớ công ơn của quý Thầy, Cô Bộ môn Thú y, Khoa Nông nghiệp

và Sinh học ứng dụng đã hết lòng truyền đạt những kinh nghiệm và kiến thức quý báu cho tôi trong suốt thời gian học

Xin cảm ơn:

Các bạn, các em sinh viên trong phòng thí nghiệm ký sinh trùng Bộ môn Thú Y, Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng, Đại học Cần Thơ Các anh, chị, bạn nghiên cứu sinh, học viên cao học và các em sinh viên đại học đã đồng hành cùng tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu, chia sẻ những khó khăn, khuyến khích và động viên tôi trong suốt thời gian qua

Ban lãnh đạo và các cán bộ kỹ thuật Chi cục Chăn nuôi thú y tỉnh, trạm chăn nuôi thú y huyện, các hộ chăn nuôi bò ở các tỉnh An Giang, Bến Tre, Đồng Tháp, Sóc Trăng, Vĩnh Long và Trà Vinh, đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi trong việc thu mẫu

Xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu Trường Đại học Đồng Tháp, Ban Chủ nhiệm Khoa Tài nguyên và Môi trường, Trường Đại học Đồng Tháp đã tạo điều kiện để tôi được tham gia học tập nâng cao trình độ chuyên môn Các bạn đồng nghiệp đã không ngừng động viên và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập

Cuối cùng xin kính chúc tất cả mọi người thật nhiều sức khỏe, hạnh phúc

Tác giả luận án

Hà Huỳnh Hồng Vũ

TÓM LƢỢC

Bệnh sán lá gan là một trong những bệnh ký sinh trùng quan trọng không những gây ảnh hưởng to lớn đến sức khỏe vật nuôi mà còn gây thiệt hại kinh tế đáng kể đến ngành chăn nuôi Chính vì vậy đề tài được thực hiện nhằm nghiên cứu những đặc điểm hình thái, dịch tễ học và sinh học của sán lá gan lớn (SLGL) trên bò ở vùng Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) Với các mục tiêu cụ thể như sau: xác định thành phần loài sán lá gan lớn đang lưu hành tại ĐBSCL, nghiên cứu vòng

đời phát triển của loài Fasciola sp từ giai đoạn bên ngoài môi trường và bên

trong ký chủ Ngoài ra, đề tài sẽ góp phần hoàn thiện mô tả triệu chứng lâm sàng, khảo sát bệnh tích đại thể, vi thể và thử nghiệm thuốc tẩy trừ sán lá gan lớn trên

bò Đề tài được thực hiện từ tháng 11/2013 đến tháng 6/2017 trên bò tại 6 tỉnh ĐBSCL với các kết quả thu được như sau:

Bò tại 6 tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long nhiễm sán lá gan lớn với tỷ lệ nhiễm chung là 20,50% Trong đó, bò địa phương nhiễm sán lá gan lớn với tỷ lệ nhiễm cao nhất (21,55%) kế đến là bò lai Sind (20,86%) và tỷ lệ nhiễm thấp nhất

ở bò sữa (9,15%) Bò nhiễm sán lá gan có khuynh hướng tăng dần theo lứa tuổi, thấp nhất là bò <1 năm (8,24%); kế đến là bò 1-2 năm (19,06%); và cao nhất là

bò >2 năm (31,38%) Tỷ lệ nhiễm sán lá gan lớn ở bò nuôi bán chăn thả (26,74%) cao hơn bò nuôi nhốt (10,55%) Phương pháp mổ khám bò tìm sán lá gan lớn có

tỷ lệ nhiễm tương đồng với phương pháp xét nghiệm phân tìm trứng (22,01% với cường độ nhiễm 9,93±0,34 sán/cá thể; so với phương pháp xét nghiệm phân 20,50%) Bò nuôi tại ĐBSCL chịu ảnh hưởng tác động của mùa vụ, bò nhiễm sán

lá gan lớn với tỷ lệ cao nhất là vào mùa khô (26,07%) và thấp nhất là mùa mưa (14,79%) Tỷ lệ nhiễm sán lá gan lớn ở bò nuôi tại ĐBSCL thay đổi theo vùng sinh thái, bò nuôi ở vùng sinh thái nước ngọt nhiễm sán lá gan lớn với tỷ lệ cao nhất là 24,14% và thấp nhất là bò nuôi ở vùng sinh thái nước mặn và lợ với tỷ lệ nhiễm sán lá gan là 9,01%

Phân tích định danh SLGL bằng phương pháp hình thái học, kỹ thuật sinh học phân tử PCR-RFLP và giải trình tự gene cho thấy các mẫu sán lá gan lớn ở

ĐBSCL đều là loài Fasciola gigantica Tỷ lệ tương đồng giữa các mẫu sán lá gan

F.gigantica thu thập tại ĐBSCL cao dao động từ 99,6% đến 100%

Vòng đời SLGL Fasciola gigantica trên bò phát triển qua các giai đoạn từ trứng Fasciola gigantica trong môi trường có nước phát triển thành mao ấu (miracidium) và thoát ra khỏi trứng sau 10-19 ngày, miracidium bơi lội trong môi

trường nước với thời gian từ 10 đến 12 giờ sau khi nở Vào trong vật chủ trung

gian ốc Lymnaea swinhoei và Lymnaea viridis, miracidium phát triển đến

sporocyst (bào ấu) là khoảng 10 ngày, sporocyst đến redia (lôi ấu) là từ 4 đến 28

ngày, redia đến cercaria (vĩ ấu) từ 12 đến 28 ngày Sau 42 ngày, cercaria thoát ra khỏi ốc, bơi tự do trong nước, sau 1- 2 giờ thì cercaria rụng đuôi hình thành

adolescaria (nang ấu) Fasciola gigantica trưởng thành trong gan và ống dẫn mật

của bò và đẻ trứng, thải trứng theo phân ra ngoài môi trường sau 111-115 ngày

Bò nhiễm SLGL thể hiện một số triệu chứng lâm sàng phổ biến như là gầy rạc, suy nhươc, tiêu chảy xen kẽ táo bón, ăn ít và nhai lại yếu, niêm mạc nhợt

nhạt, lông xù Ở gan bò nhiễm SLGL có bệnh tích: viêm và xơ, Fasciola được

bao bọc trong nhu mô gan làm trên bề mặt gan có những khối u tròn lớn màu nâu, trên bề mặt gan có vết xuất huyết, gan nhạt màu hơi vàng hoặc màu trắng xám Ống dẫn mật tăng sinh, thành ống dẫn mật xơ hóa, bề mặt ống dẫn mật có nhiều hạt màu đỏ và chảy dịch nhầy đục, vàng nâu và có mùi, calci tích tụ trong ống mật, thành ống dẫn mật dày lên Bệnh tích vi thể gan nhiễm SLGL cho thấy sán non cư trú trong nhu mô gan, ống dẫn mật tăng sinh, vách ống dẫn mật hóa xơ dày thấm calci ép bể các tiểu thùy gan ở kế cận Nhu mô gan xuất huyết, ứ huyết, gan vàng, một số vùng trên nhu mô gan bị hoại tử, xuất hiện các nốt mủ và trong nhu mô gan xuất hiện các tổ chức xơ, tiểu thùy gan teo nhỏ do tăng sinh mô liên kết sợi

Thuốc albendazole liều 15mg/kg thể trọng hoặc triclabendazole liều 20mg/kg thể trọng cho uống một liều duy nhất đều có thể tẩy sạch sán lá gan 100% Thuốc an tòan và không gây phản ứng phụ trong điều trị

Từ khóa: Bò, Đồng bằng sông Cửu Long, Fasciola, tỷ lệ nhiễm

ABSTRACT

Fasciolosis is an important parasitic disease which has not only great

influence on animal health but also causes considerable economic losses of the livestock industry Therefore, the thesis was aimed at studying the characteristics about morphology, epidemiology as well as biology of liver flukes in cattle in the Mekong Delta Specifically, the thesis focused on identifying the liver fluke

species (Fasciola spp.) and their distribution in the Mekong Delta, studying the full development of life cycle of Fasciola inside and outside the hosts Besides,

the study also documented symptoms, gross lesions and histopathological lesions

of Fasciolosis and screening anthelminths in infected cattle The study was done

from November 2013 to June 2017 in cattle in six provinces of the Mekong Delta with many remarkable results

The overall prevalence rate of liver fluke infection in cattle in six surveyed provinces in the Mekong Delta was 20.50% The local cattle had the highest liver fluke infection rate of 21.55%, followed by Sindhi hybrids cattle with 20.86% and the lowest infection rate belonged to dairy cattle 9.15% It was also noted that the infection rate of liver fluke in cattle increased according to the age In fact, under 1 year-cattle, 1-2 year-cattle and those of higher over 2 years had the infectious rate 8.24%, 19.06%, 31.38%; respectively According to the animal husbandry method, semi free-range cattle had the higher infection rate of

Fasciola sp (26.74%) than confined cattle with 10.55% Fasciola sp was

detected by post-mortem examination and Benedek’s sedimentation methods, providing quite similar infection rate of 22.01% (intensive rate 9.93±0.34 flukes/individual) and 20.50%; respectively Seasonal factors also had great

impact on the prevalence of Fasciola sp infection in domestic cattle in the

Mekong Delta The highest prevalence was recorded in the dry season (26.07%)

and lowest ones in the rainy season (14.79%) The Fasciola sp infection rate was

influenced by ecological areas; the cattle were in freshwater ecological area had

highest rate of Fasciola sp infection (24.14%) and the lowest was the cattle in sea water and brackish water ecological areas with the rate of Fasciola sp

infection as 9.01%

Analyzing morphological characteristics and molecular biology including

PCR-RFLP and sequencing were applied in Fasciola sp identification The

results from three above mentioned methods have confirmed that liver flukes in

cattle in the Mekong Delta were Fasciola gigantica The high pairwise

percentage of nuclear ribosome DNA internal transcribed spacer I (ITS1)

sequence among F.gigantica specimens in the Mekong Delta ranged from 99.6%

to 100%

The development life cycle of Fasciola gigantica in the cattle was decsribed

from embryonated egg stage in the water environment and then developed to miracidium and miracidium escaping from the eggs after 10-19 days Excysted miracidium freely moved in water from 10 hours to 12 hours after hatching During this time, miracidium was found infected by the approriate intermediate

hosts namely Lymnaea swinhoei and Lymnaea viridis snails In these snails,

miracidium developed to sporocysts in 10 days, then sporocysts to redia from

4-28 days and the final stage in snail from redia to cercaria took from 12-4-28 days After 42 days, cercaria were emerged from snails and were into the water, after 1-2 hours cercaria loose their tails and encysted as metacercaria (infective larva)

Fasciola gigantica was developed into adult liver fluke in bile ducts and liver of

cattle (host) and laid eggs and excreted into the evironment after 111-115 days infection

Fasciola gigantica infected cattle had some clinical symptoms such as

emaciation, reduced rumination, diarrhea alternating with constipation, anorexia, pale mucous membrane, bad hair condition, deep orbits and rheum The gross lesions in infected cattle were recorded as liver inflammation and cirrhosis,

encapsulated immature Fasciola destroyed the liver tissues causing hemorrhage,

brown round neoplasm in liver surface, the infected livers having ivory-white yellow or clay-colored The bill ducts were enlarged thick and fibrosis wall, the surface of bill ducts having red dots and turbid, yellowish exudation, calcified accumulation inside the bill ducts and thick cholangioles Histopathological of

liver Fasciolosis illustrated that the migration of juvenile liver flukes damaged

and digested liver parenchyma and calcified and hyperplasia of bile duct epithelium, causing of compression neighbor interlobulars Hemorrhage, congestion, and necrotic in liver parenchyma, yellowish liver and some purulent

in liver, and the increasing of fibroplasia resulting in small liver lobe atrophy were observed in histophathological specimens

Albendazole (15mg/kg) and triclabendazole (20mg/kg) with an oral single

dose were both effective up to 100% in eliminating Fasciola These drugs were

found safety and no adverse effects noticed during the treatment

Key words: Cattle, Mekong Delta, Fasciola, infection rate

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của nghiên cứu sinh Hà Huỳnh Hồng Vũ với sự hướng dẫn của PGS.TS Nguyễn Hữu Hưng Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực và chưa từng được công bố bởi tác giả khác trong bất kỳ công trình nào trước đây

Người hướng dẫn khoa học Tác giả luận án

PGS.TS Nguyễn Hữu Hưng Hà Huỳnh Hồng Vũ

2.1.7 Chẩn đoán bệnh sán lá Fasciola ở trâu bò 17 2.1.7.1 Chẩn đoán dựa vào dịch tễ học của bệnh sán lá gan bò 17 2.1.7.2 Chẩn đoán bệnh sán lá gan dựa vào triệu chứng lâm sàng 17 2.1.7.3 Chẩn đoán tìm sán lá gan lớn trên bò 18

2.1.8 Các phương pháp xác định loài sán lá gan lớn do Fasciola sp 19

2.10 Một số dược phẩm tẩy trừ sán lá gan 26 2.2 Tình hình nghiên cứu bệnh sán lá gan lớn 29 2.2.1 Tình hình nghiên cứu sán lá gan lớn ở bò trên thế giới 29 2.2.1.1 Thiệt hại do sán lá gan lớn gây ra 29 2.2.1.2 Phân loại, phân bố và tình hình nhiễm của sán lá gan lớn ở

2.2.1.3 Vật chủ trung gian của Fasciola sp 34 2.2.1.4 Vai trò của thực vật thủy sinh đối với sự lưu tồn và phát triển

2.2.1.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự lưu tồn và phát triển Fasciola

2.2.2 Tình hình nghiên cứu sán lá gan ở trong nước 45

2.2.2.1 Tình hình nghiên cứu xác định loài Fasciola sp ở Việt Nam 45 2.2.2.2 Tình hình nhiễm sán lá gan lớn ở trâu bò tại Việt Nam 46

2.2.2.3 Vật chủ trung gian của Fasciola sp 51 2.2.2.4 Tình hình nghiên cứu nang sán lá gan ở thực vật thủy sinh 55

2.2.2.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự lưu tồn và phát triển Fasciola

3.1.1 Xác định tình hình nhiễm sán lá gan lớn trên bò tại các tỉnh

3.4.1 Xác định tình hình nhiễm sán lá gan trên bò tại Đồng bằng

3.4.2.1 Phương pháp định danh phân loại sán lá gan bằng hình thái

3.4.2.2 Phương pháp định danh sán lá gan lớn bằng kỹ thuật sinh học

3.4.3 Nghiên cứu vòng đời của Fasciola sp 68 3.4.3.1 Phương pháp định danh phân loại ốc nước ngọt 68

3.4.3.2 Theo dõi quá trình phát triển của trứng sán lá gan Fasciola sp

ở ngoài môi trường trong điều kiện thí nghiệm 70

3.4.3.3 Theo dõi thời gian sống của miracidium trong nước 71 3.4.3.4 Theo dõi quá trình phát triển của ấu trùng sán lá gan trong ký

3.4.3.5 Gây nhiễm ấu trùng sán lá gan lớn cho bò 74 3.4.4 Nghiên cứu các dấu hiệu lâm sàng và bệnh tích đại thể và

những biến đổi vi thể trên bò nhiễm sán lá gan lớn 75 3.4.4.1 Nghiên cứu triệu chứng của bò nhiễm SLGL 75 3.4.4.2 Nghiên cứu bệnh tích đại thể và mô bệnh học gan nhiễm sán

3.4.5 Nghiên cứu biện pháp phòng trừ sán lá gan lớn bò 77

4.1 Kết quả tình hình nhiễm sán lá gan trên bò tại ĐBSCL 81

4.1.2 Kết quả mổ khám xác định tình hình nhiễm SLGL trên bò tại

4.2.1 Kết quả xác định loài sán lá gan bằng phương pháp truyền

4.2.2 Kết quả xác định loài sán lá gan bằng phương pháp sinh học

4.2.2.1 Kết quả phân tích PCR-RFLP trong định danh loài sán lá gan

ký lớn sinh trên bò tại Đồng Bằng Sông Cửu Long 97 4.2.2.2 Kết quả xác định trình tự đoạn gen ITS1 100

4.3.1 Sự phân bố các loài ốc nước ngọt - ký chủ trung gian của sán lá

4.3.2 Sự phát triển của trứng Fasciola sp 107

4.3.3 Thời gian sống của miracidium trong môi trường nước 110

4.3.4 Sự phát triển của ấu trùng sán lá gan lớn trong ký chủ trung

gian ốc Lymnaea swinhoei và Lymnaea viridis 111 4.3.5 Kết quả gây nhiễm ấu trùng sán lá gan lớn cho bò 115 4.3.6 Kết quả xác định loài sán lá gan của bò gây nhiễm 117 4.3.6.1 Kết quả xác định loài sán lá gan bằng phương pháp truyền

4.3.6.2 Kết quả phân tích PCR-RFLP trong định danh loài sán lá gan

4.3.6.3 Tóm tắt vòng đời của sán lá gan lớn trên bò 119 4.4 Kết quả khảo sát những biểu hiện triệu chứng bệnh của nhiễm sán

Danh mục liệt kê các công trình khoa học đã công bố 161

DANH SÁCH BẢNG

2.1 Phân biệt trứng Fasciola sp với trứng Paramphistomum

explanatum và Paramphistomum cervi

5

2.2 Các vị trí có sai khác về nucleotide và acid amin của SLGL Việt

Nam và SLGL thế giới của đoạn giao gen ITS1

24

2.3 Tỷ lệ nhiễm F hepatica ở gia súc trên thế giới 32 2.4 Tỷ lệ nhiễm Fasciola gigantica ở gia súc trên thế giới 33 2.5 Vật chủ trung gian của F hepatica trên thế giới 36 2.6 Vật chủ trung gian của F gigantica trên thế giới 38 2.7 Tỷ lệ nhiễm SLGL ở trâu bò tại Việt Nam 50 2.8 Tỷ lệ nhiễm ấu trùng SLGL ở Lymnaea sp tại Việt Nam 54

3.2 phân bố mẫu khảo sát theo giống, lứa tuổi, phương thức nuôi,

mùa và vùng sinh thái tại các tỉnh ĐBSCL 61

3.6 Dự đoán kiểu cắt hạn chế (restriction patterns) của các enzyme

cắt giới hạn Ezyme RsaI ở vùng ITS1 của sán lá gan lớn

66

3.7 Thành phần mix cho một phản ứng cắt enzyme 67 3.8 Các mẫu sán lá trong Ngân hàng gen cung cấp chuỗi ITS-1 sử

3.9 Tổng số lượng ốc nước ngọt thu thập tại 6 tỉnh ĐBSCL 69 3.10 Bố trí thí nghiệm quá trình phát triển của trứng SLG lớn 71

3.11 Bố trí thí nghiệm thời gian sống của miracidium trong nước 72

3.12 Bố trí gây nhiễm ấu trùng sán lá gan cho ốc Lymnaea 73 3.13 Bố trí gây nhiễm sán lá gan cho bò thí nghiệm 74 3.14 Bố trí thử nghiệm albendazole tẩy trừ sán lá gan bò 77 3.15 Bố trí thử nghiệm triclabendazole tẩy trừ sán lá gan bò 78 3.16 Bố trí thử nghiệm mebendazole tẩy trừ sán lá gan bò 79 4.1 Tỷ lệ nhiễm sán lá gan trên bò tại ĐBSCL 81 4.2 Tỷ lệ nhiễm sán lá gan lớn theo giống bò tại các tỉnh ĐBSCL 84 4.3 Tỷ lệ nhiễm sán lá gan lớn theo lứa tuổi bò tại các tỉnh ĐBSCL 86 4.4 Tỷ lệ nhiễm sán lá gan lớn trên bò theo phương thức nuôi tại các

tỉnh ĐBSCL 87 4.5 Tỷ lệ nhiễm sán lá gan lớn trên bò theo mùa tại các tỉnh ĐBSCL 89 4.6 Tỷ lệ nhiễm sán lá gan lớn trên bò theo vùng sinh thái ở các tỉnh

4.7 Tỷ lệ nhiễm sán lá gan trên bò tại các tỉnh ĐBSCL 94 4.8 Kích thước SLG thu thập trên bò tại các tỉnh ĐBSCL 96 4.9 So sánh trình tự chuỗi nucleotide vùng ITS1 của các chủng sán

4.12 Tần số xuất hiện các loài ốc nước ngọt tại các tỉnh ĐBSCL 105

4.13 Sự phát triển của trứng Fasciola sp trong môi trường nước 107

4.14 Thời gian miracidium chết trong môi trường nước sau khi thoát

4.21 Một số bệnh tích vi thể trên gan bò nhiễm Fascioala gigantica 128

4.22 Hiệu quả của thuốc albendazole trong tẩy trừ SLGL Fasciola

DANH SÁCH HÌNH

4.1

Biểu đồ so sánh tỷ lệ nhiễm sán lá gan trên bò ở các tỉnh ĐBSCL

82 4.2 Biểu đồ so sánh tỷ lệ nhiễm sán lá gan lớn theo giống bò tại các tỉnh

của 12 mẫu sán la gan lớn ở ĐBSCL so với sán lá gan trên thế

4.16 Kết quả điện di sản phẩm PCR M: thang chuẩn 100bp 118

4.21 Gan sưng và xơ hóa – trên bề mặt gan có vệt xuất huyết 124

4.23 Thành ống dẫn mật dày lên và tích tụ calci trong ống mât 124 4.24 Ống dẫn mật màu trắng đục nổi cộm lên 124

4.27 Các vết xuất huyết xuất hiện trên gan 125

4.37 Tăng sinh ống dẫn mật và hóa xơ quanh ống dẫn mật trong

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

ADN Acid Deoxyribo Nucleic Axít deoxyribonucleic

COX1 Cytochrome c Oxidase subunit I Một gen thuộc hệ gen thể

dNTP Deoxynucleoside triphosphates Đơn vị cấu tạo nên ADN

ELISA Enzyme linked immunosorbent

assay

Phản ứng miễn dịch gắn men

F.gigantica Fasciola gigantica

F hepatica Fasciola hepatica

ITS Internal Transcribed Spacer Đoạn giao gen

LAMP Loop Mediated Isothermal

Một gen thuộc hệ gen ty thể

NCBI National Center for Biotechnology

WHO World Health Organization Tổ chức y tế thế giới

Chương 1: GIỚI THIỆU 1.1 Tính cấp thiết của đề tài

Theo Tổ chức y tế Thế giới (WHO) bệnh sán lá gan lớn (SLGL) là một trong những bệnh quan trọng được phát hiện ngày càng nhiều ở người và động vật, có hơn 2,4 triệu người tại hơn 70 quốc gia bị ảnh hưởng bởi bệnh do SLGL

(WHO, 2015; Amer, 2016) Bệnh SLGL ở người và động vật do hai loài Fasciola

gigantica và Fasciola hepatica gây ra Trong những năm qua các nghiên cứu về

bệnh SLGL đã cho biết bệnh này nằm trong danh sách bệnh truyền lây giữa vật nuôi và người

Các bệnh do sán lá gan gây ra cần phải thông qua vật chủ trung gian là các loài ốc nước ngọt, động vật giáp xác và thực vật thủy sinh như rau muống, rau cải xoong, các loại cỏ sống dưới nước Với đặc điểm của vùng Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) là trồng lúa và rau màu nên rất thích hợp cho ốc nước ngọt và thực vật thủy sinh phát triển Xét điều kiện tự nhiên và vị trí địa lý thì ĐBSCL là khu vực ưu thế phát triển chăn nuôi bò nhờ tận dụng thức ăn thô xanh từ nguồn phụ phẩm – phế phẩm nông nghiệp và công nghiệp chế biến Tuy nhiên, phần lớn chăn nuôi tập trung ở các nông hộ với quy mô nhỏ, thức ăn tận dụng là chính, trình độ người chăn nuôi còn thấp, việc ứng dụng khoa học kỹ thuật trong chăn nuôi còn hạn chế, hình thức chăn nuôi chủ yếu là bán chăn thả nên khả năng bò nhiễm giun sán rất cao

Đặc biệt, bệnh SLGL có thể lây sang người nếu người ăn phải kén sán

Metacercariae Gần đây, bệnh sán lá gan lớn trên người xảy ra ở các tỉnh miền

Trung và thành phố Hồ Chí Minh ngày một gia tăng (Nguyễn Văn Đề, 2005) Tại Việt Nam, bệnh SLGL ở người có xu hướng tăng dần, từ năm 2006 đến năm 2010

có số ca mắc bệnh là 15.764 và số ca đã tăng lên trên 20.000 năm 2011 Bệnh phân bố ở 52 tỉnh thành từ Bắc đến Nam và loài gây bệnh được xác định chủ yếu

là F gigantica (Nguyễn Văn Đề và ctv., 2012)

Bệnh SLGL đã được một số tác giả trong nước thực hiện nghiên cứu dưới

góc độ phân tử Bước đầu, các nghiên cứu này đã giúp xác định loài SLGL gây

bệnh ở nhiều vùng khác nhau trong nước Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu phân tử

về SLGL ở khu vực ĐBSCL

Theo Viện Sốt rét Ký sinh trùng – Côn trùng Quy Nhơn, thì gần đây các động vật bị nhiễm SLGL được điều trị không có hiệu quả do sự gia tăng kháng

thuốc của loài sán đối với một số thuốc đặc hiệu (www.impe-qn.org.vn) Do đó

để thiết lập một chương trình phòng chống bệnh sán lá gan cần phải nắm rõ mối tương tác giữa ký chủ và ký sinh vật như đường xâm nhập, kiểu lây truyền và tuổi cảm thụ của ký chủ Mặt khác, chúng ta phải nắm được các yếu tố ảnh hưởng khác như thời tiết, khí hậu, đất đai, v.v và dự báo tổn thất do sán lá gan gây ra trong khu vực Vì vậy, để thực hiện được những mục tiêu đó, yêu cầu người làm công tác thú y phải có một số kiến thức về các lĩnh vực có liên quan như dịch tễ học, bệnh học, sinh thái môi trường, quy luật nhiễm ký sinh trùng cũng như tác hại của chúng gây ra cho cơ thể vật nuôi

Để hạn chế thiệt hại do sán lá gan gây ra thì việc nghiên cứu bệnh sán lá gan

và kiểm soát bệnh là rất cần thiết Tuy nhiên, cho tới nay hầu như chưa có một công trình nghiên cứu nào có tính tổng hợp để xác định thành phần loài, đặc điểm sinh học và sự phân bố của sán lá gan ở khu vực ĐBSCL Do đó nghiên cứu đề

tài: “MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ HỌC VÀ SINH HỌC BỆNH SÁN LÁ GAN LỚN TRÊN BÒ Ở ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG VÀ THỬ HIỆU QUẢ CỦA THUỐC TẨY TRỪ” là rất cần thiết nhằm làm rõ hơn một số đặc

điểm hình thái, dịch tễ học, sinh học của sán lá gan trong điều kiện sinh thái ở Đồng bằng sông Cửu Long Đồng thời cung cấp thêm tư liệu khoa học về loài

Fasciola sp ký sinh trên bò ở Đồng bằng sông Cửu Long giúp cho công tác

phòng chống bệnh được hiệu quả

1.2 Mục tiêu của đề tài

Xác định được loài, sự phân bố, đặc điểm sinh học và các yếu tố ảnh hưởng đến tỷ lệ nhiễm sán lá gan lớn trên bò tại các tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long

Đề xuất được biện pháp tẩy trừ bệnh sán lá gan lớn trên bò tại các tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long

1.3 Ý nghĩa khoa học

Là công trình nghiên cứu có hệ thống về sán lá gan lớn Fasciola gigantica

trên bò: xác định tình hình nhiễm bệnh và các yếu tố liên quan đến sự phân bố của mầm bệnh Định loài bằng hình thái học và sinh học phân tử sử dụng kỹ thuật PCR-RFLP và giải trình tự gen ITS1

Là công trình đầu tiên ở ĐBSCL nghiên cứu vòng đời SLGL trên bò, xác định thành phần ký chủ trung gian, nghiên cứu bệnh lý lâm sàng ở bò, điều trị thử nghiệm và đề ra biện pháp tẩy trừ

Cung cấp thêm tư liệu khoa học về loài Fasciola sp ký sinh trên bò ở

(ĐBSCL), đồng thời bổ sung cho giáo trình ký sinh trùng thú y để phục vụ công tác giảng dạy

1.4 Ý nghĩa thực tiễn

Kết quả đề tài là cơ sở khoa học để khuyến cáo người dân ở vùng (ĐBSCL) áp dụng biện pháp phòng trị bệnh SLGL một cách hữu hiệu, nhằm giảm thiểu những tác động có hại, góp phần phát triển chăn nuôi bò theo hướng bền vững

1.5 Những đóng góp mới của luận án

- Đây là công trình nghiên cứu đầu tiên xác định được loài Fasciola

gigantica lưu hành trên bò nuôi tại ĐBSCL bằng kỹ thuật sinh học phân tử

- Đây là công trình đầu tiên nghiên cứu thành công vòng đời SLGL

(Fasciola gigantica) trên bò tại ĐBSCL

- Mô tả triệu chứng lâm sàng bệnh tích đại thể và vi thể bệnh sán lá gan lớn

do loài Fasciola gigantica gây ra, tạo cơ sở khoa học cho công tác chẩn đoán phát

hiện bệnh nhanh để kịp thời điều trị

Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Bệnh sán lá gan lớn

2.1.1 Phân loại sinh học

Theo David and Erasmus (1972) và Nguyễn Thị Lê (2000), sán lá gan ký sinh và gây bệnh cho gia súc nhai lại được xếp trong hệ thống phân loại động vật như sau:

Ngành Plathelminthes (Schneider, 1873)

Phân ngành Platodes (Leuckart, 1954)

Lớp Trematoda (Rudolphhi, 1808)

Phân lớp Prosostomidea (Skrjabin and Guschanskaja, 1962)

Bộ Fasciolida (Skrjabin et Schulz, 1937)

Phân bộ Fasciolata (Skrjabin et Schulz, 1935)

Họ Fasciolidae (Railliet, 1895)

Phân họ Fasciolinae (Stiles et Hassall, 1898)

Giống Fasciola (Linnaeus, 1758)

Loài Fasciola hepatica (Linnaeus, 1758)

Loài Fasciola gigantica (Cobbold, 1885)

là do chúng tồn tại dưới 2 thể là nhị bội (diploid form) và tam bội (triloid form)

Cấu tạo: trứng sán có từ 20 - 30 phôi bào; trong các giai đoạn phát triển của

trứng, lúc đầu các phôi bào phân bố đều, sau đó phôi bào tập trung dần vào trung

tâm và hình thành mao ấu ở trong trứng (Mas – Coma et al., 2009)

Hình 2.1 Trứng sán lá gan lớn (Nguồn: www.cdc.gov/parasites/fasciola/diagnosis.html)

Bảng 2.1 Phân biệt trứng Fasciola sp với trứng Paramphistomum explanatum và

Phân bố không đều gồm một đầu dày và một đầu thưa

Kích thước 0,111-0,151 x

0,063-0,078mm 0,120-0,190mm x

0,110-0,120 x 0,072mm

0,060-0,012-0,0178 x 0,048mm

(Nguồn: Phạm Sỹ Lăng và Nguyễn Hữu Hưng, 2015)

Sức đề kháng: trứng sán rất nhạy cảm với điều kiện khô hạn và tác động

trực tiếp của ánh sáng mặt trời Grigoryan (1958) cho biết, nhiệt độ 24 - 260C và

pH 6,5 – 7 là tốt nhất cho sự phát triển của trứng sán lá gan, trứng không sống ở nhiệt độ trên 430C, điều kiện khô hạn cũng làm trứng chết nhanh Guralp et al

(1964) cho biết thời gian cho sự phát triển thành miracidium trong trứng F

gigantica khác nhau phụ thuộc vào nhiệt độ, khoảng 10 - 11 ngày ở 37 - 380C, 21

- 24 ngày ở 250C và 33 ngày ở 17 - 220C Asanji (1988) thấy rằng, trứng bị kích thích nở khi tiếp xúc với ánh sáng mặt trời hoặc ánh sáng mạnh, khi thoát khỏi vỏ

trứng, miracidium sống trong nước khoảng 18 - 26 giờ

Ấu trùng

Mao ấu (miracidium): khi còn ở trong trứng, mao ấu có kích thước nhỏ

(nhỏ hơn khi đã thoát vỏ), bọc trong một lớp màng, túi tinh chưa hình thành Hình thái nhìn chung giống như khi đã chui ra ngoài (Hình 2.2)

Cấu tạo: mao ấu có lớp lông ở xung quanh, nhờ vậy chúng có khả năng bơi

lội trong nước tìm cơ hội nhiễm vào ốc

Mao ấu gồm có túi tinh ở phía đầu, hai bên có tuyến đỉnh Cơ quan bài tiết được tạo thành từ một đôi tế bào ngọn lửa và các ống dẫn Tế bào hình ngọn lửa hoạt động rất mạnh (trong trứng cũng như khi đã ra ngoài) Mắt của mao ấu nằm

ở mặt lưng, cấu tạo theo kiểu dấu nhân chéo nhau thành khối màu đen

Mao ấu sau khi ra môi trường rất nhanh chóng tìm một vật chủ thích hợp để xâm nhập, những mao ấu không tìm được vật chủ sẽ chết trong vòng 24 giờ (Mas

– Coma et al., 2009)

Hình 2.2 Hình Miracidium của sán lá gan lớn

(Nguồn: www.biologie.uni-erlangen/parasit/fasciola)

Bào ấu (sporocyst): là một dạng ấu trùng thứ hai của sán lá, bào ấu có dạng

hình túi được bao bởi màng mỏng Các cơ quan của bào ấu mất đi và xuất hiện các cơ quan mới Mao ấu có mắt, phát triển thành bào ấu thì mắt không còn, vẫn

được phủ lông như mao ấu, các tuyến đỉnh, túi tinh cũng không thấy ở bào ấu (Hình 2.3)

Hình 2.3 Bào ấu của sán lá gan lớn

(Nguồn: www.zoology.bio.spbu.ru/Education/Grishankov/Plathelminthes2.pdf) Đặc điểm giống nhau giữa hai dạng ấu trùng này là cơ quan bài tiết được cấu tạo bởi các tế bào ngọn lửa rất hoạt động Bào ấu hình thành ống ruột và hầu, các bộ phận này còn nằm trong khối tế bào thân rất lớn, ngoài ra trong cơ thể bào

ấu còn có một đám phôi khác nữa Do hiện tượng đơn tính sinh, về sau các đám

phôi này sẽ phát triển thành redia (lôi ấu) Kích thước của bào ấu sau 6 ngày từ

khi mao ấu nhiễm vào ốc là: 0,250 - 0,291 x 0,156 - 0,177 mm; trung bình 0,272

x 0,167 mm Khoảng 3 – 7 ngày, bào ấu sinh sản vô tính cho ra nhiều redia, một bào ấu cho ra 5-15 redia (Dalton, 1999)

Lôi ấu (redia): có hai hệ: redia thế hệ 1 và redia thế hệ 2 cùng phát triển

trong ốc redia có dạng hình giun, ít hoạt động, đã xuất hiện một số nét của sán

trưởng thành như giác miệng, giác bụng, hầu, thực quản và ruột, ống ruột chạy dọc cơ thể của ấu trùng, đuôi dài hơn thân giúp di chuyển được dễ dàng, redia lớn hơn bào ấu, kích thước sau 7 ngày trung bình 0,494 x 0,134mm; chiều dài ống ruột trung bình 0,338mm, giác miệng trung bình 0,078 - 0,063mm Toàn bộ cơ thể có màu vàng đậm, các đám phôi thấy rõ và lớn hơn (Hình 2.4)

Thời gian càng dài thì kích thước redia càng lớn, sau 35 ngày kể từ khi

nhiễm ấu trùng lông, đạt kích thước trung bình: thân 1,48 x 0,2mm, ruột 0,68 x 0,121mm, hầu 0,077 x 0,063mm (Dalton, 1999)

Hình 2.4 Rediae của sán lá gan lớn

(Nguồn: www.dpd.cdc.gov/DPDX/HTML )

Vĩ ấu (cercaria): là dạng ấu trùng sống tự do của sán lá gan lớn, được phát

triển từ redia cấu tạo gồm thân và đuôi Vĩ ấu còn non phần thân dài hơn, khi già

phần đuôi dài hơn

Vĩ ấu đã mang phần nào những đặc điểm cấu tạo của sán lá trưởng thành, cơ quan bám gồm giác miệng và giác bụng, ống tiêu hoá có lỗ miệng, hầu gồm hai mảnh hình hạt đậu, ruột gồm những tế bào tròn xếp sát nhau hình thành nên vai hai bên thân vĩ ấu có các tế bào hình trứng xếp thành hai đường chạy từ cuối giác miệng đến núm đuôi; ngoài ra, trong cơ thể còn có những hạt nhỏ sáng là nguồn cung cấp năng lượng cho hoạt động của ấu trùng (hạt glycogen) (Dalton, 1999)

Hình 2.5 Cercariae của sán lá gan lớn

(Nguồn: www.dpd.cdc.gov/DPDX/HTML)

Nang ấu (metacercaria): được hình thành từ ấu trùng đuôi, trong giai đoạn

này ấu trùng không còn đuôi và tạo thành nang, hình cầu, kích thước nang kể cả màng ngoài 0,208 - 0,291mm; trung bình 0,244mm Kích thước nang đo theo màng trong là 0,177 - 0,25mm; trung bình 0,203mm

Hình 2.6 Nang ấu trùng sán lá gan lớn (Nguồn: www.dpd.cdc.gov/DPDX/HTML) Khi phát triển đến giai đoạn nang ấu trùng, sức đề kháng của chúng tăng lên

rõ rệt Nang ấu có khả năng tồn tại ở nhiệt độ - 40C đến - 60

C Ở điều kiện nhiệt

độ bình thường, những nang ấu có trong cỏ khô bị ẩm và trong môi trường nước

có thể tồn tại đến trên 5 tháng Nang ấu trùng chỉ tồn tại khi nhiệt độ và độ ẩm thuận lợi, trong điều kiện khô ráo chúng không thể sống sót nhưng trong khi độ

ẩm cao và nhiệt độ thích hợp nang ấu trùng có thể sống sót đến 1 năm (Andrews

et al., 1999)

Sán lá trưởng thành

Tất cả các loài sán lá gan nói chung ở người đều có hình lá và dẹp, kích thước dao động từ 1-30mm SLGL trưởng thành hình chiếc lá, thân dẹt và bờ mỏng, kích thước 20 - 30 x 10 - 12mm, màu trắng hồng hoặc xám đỏ, giác miệng (oral sucker) nhỏ, kích thước 1mm, giác bụng (ventral sucker) to hơn, kích thước 1,6mm Cơ thể sán được bao phủ bởi một lớp cutin mỏng và có nhiều chóp nhỏ Chúng thường “bám dính” với nhiều cơ quan khác của vật chủ thông qua các giác hút (một giác hút ở phía trước gọi là giác miệng và một cái còn lại ở giữa gọi là giác bụng) Miệng thường nằm ngay ở giác miệng và nối với manh tràng, chia hai nhánh và mỗi nhánh mở rộng về một phía của cơ thể Đặc điểm chính của sán lá gan lớn là sự có mặt của các tế bào hình ngọn lửa trong hệ bài tiết của sán Sán lưỡng tính, bộ phận sinh dục có lỗ nằm gần giác bụng (Hình 2.7)

Hình 2.7 Sán lá gan lớn trưởng thành

(Nguồn: www.impe-qn.org.vn/impe-qn/vn/portal/InfoPreview.jsp?ID=2467)

Cơ quan sinh dục đực bao gồm một hay nhiều tinh hoàn kết nối với một ống đơn thuần hoặc một ống dẫn tinh lớn, nhờ vào một ống ngắn hoặc ống dẫn tinh Ống dẫn tinh sẽ kết thúc bằng một cơ quan sinh dục đực Cơ quan sinh dục cái bao gồm một buồng trứng duy nhất kết nối với ống dẫn trứng Ống dẫn trứng nối với

vài ống hoặc ống noãn hoàng Ống dẫn trứng nối tiếp với ootype rồi được bao quanh bởi một khối tuyến ngoại tiết (tuyến Mehlis) Tử cung nằm ở cuối của ootype Sự tự

thụ tinh hiếm khi xảy ra trong các loài sán lá, cũng như nhiều loài sán lá khác, sán lá gan lớn lưỡng tính, có thể thụ tinh chéo hoặc tự thụ tinh, trong cơ thể sán có cả cơ quan sinh dục đực và cái Hệ thống sinh dục rất phát triển, tử cung sán chứa đầy trứng Sán có giác bụng và giác miệng, giác miệng đóng kín và không nối với cơ quan tiêu hóa Sán không có hệ thống tuần hoàn, hô hấp và cơ quan thị giác, hệ bài tiết ở cuối thân (Dalton, 1999)

SLGL có cả những loại sinh tinh bất thường (abnormal spermatogenic type : AST) bao gồm nhiễm sắc thể nhị bội (diploid form), tam bội (triloid form) và đa bội

mà không thụ tinh và loại sinh tinh bình thường (normal spermatogenic type: NST)

của Fasciola sp được tìm thấy ở một số quốc gia châu Á như Trung Quốc, Đài

Loan, Ấn Độ, Nepal, Philippines, Thái Lan và Việt Nam Tại vùng Đông Nam Á,

loài sán có loại AST cùng khu vực phân bố với NST F.hepatica và NST F.gigantica Tương tự, tại châu Phi, chủ yếu gặp chủng F.gigantica Ngược lại, ở châu Âu, Nam

và Bắc Mỹ, châu Đại Dương là các địa danh phân bố chủ yếu của F.hepatica (Itagaki and Tsutsumi, 1998; Marcilla et al., 2002; Nguyễn Văn Đề và ctv., 2003)

A- Fasciola gigantica B- Fasciola hepatica

2.1.3 Vòng đời

Vòng đời của SLGL rất đặc biệt trong lớp sán lá Chúng chỉ có 1 vật chủ trung gian là ốc, sau đó hình thành nang ở thực vật thủy sinh trước khi nhiễm vào vật chủ theo con đường ăn uống Trong khi đó, hầu hết các loại sán lá khác vòng đời qua 2

vật chủ phụ trước khi xâm nhập vào vật chủ chính (Phạm Sỹ Lăng và ctv., 2015)

Vòng đời của SLGL được mô tả như sau: SLGL trưởng thành đẻ trứng ở đường dẫn mật của vật chủ, trứng theo dịch mật vào đường tiêu hóa, sau đó trứng theo phân rời khỏi cơ thể vật chủ ra ngoài môi trường Ngay sau khi ra ngoài môi trường trứng vẫn chưa có phôi, trứng mất khoảng chừng 2 tuần để phát triển thành

trứng chín (trứng có mao ấu bên trong), sau đó mao ấu (miracidium) thoát vỏ di chuyển ra ngoài môi trường và bơi lội trong nước Ở điều kiện thuận lợi, miracidium

có thể bơi với vận tốc 1 mm/s Đặc điểm bơi lội giúp cho miracidium có thể tìm và xâm nhập vào vật chủ phụ (vật chủ trung gian) là ốc thuộc giống Lymnae

miracidium sau khi ra môi trường nhanh chóng tìm một vật chủ thích hợp để xâm

nhập, những miracidium không tìm được vật chủ sẽ chết trong vòng 24 giờ Coma, et al., 2009) Sau khi xâm nhập vào ốc, miracidium mất lông và trở thành bào

(Mas-ấu (sporocyst) Bào (Mas-ấu phân chia và phát triển thành lôi (Mas-ấu (redia) Redia tiếp tục phát triển thành vĩ ấu (cercaria) Các vĩ ấu của Fasciola spp có chiều dài cơ thể vào

khoảng 0,25 đến 0,35 mm với một đuôi dài, mảnh, không chia nhánh, kích thước khoảng 0,5 mm Nhìn chung, 4-7 tuần sau khi nhiễm, cư trú và phát triển trong cơ

thể ốc cercaria sẽ rời khỏi ốc ra ngoài môi trường Trong thời gian ở ngoài môi trường, cercaria cần có điều kiện độ ẩm và nhiệt độ thích hợp, nhiệt độ tới hạn là

100C Khi mới rời khỏi ốc, cercaria bám vào lá cỏ hoặc là các loài rau ngập nước khác giống như cải Xoong Sau đó cercaria rụng đuôi tạo thành nang ấu (metacercaria) với 4 lớp bao bọc Các lớp bao bọc này được hình thành từ các chất

tiết của các tuyến nang nằm bên trong cơ thể vĩ ấu Lớp vỏ ngoài hoạt động như một hàng rào chống lại sự xâm nhập của vi khuẩn và vi nấm Việc hình thành vỏ nang có thể mất đến 2 ngày Các nang ấu trùng có sức chịu đựng cao và là dạng lây nhiễm cho các vật chủ cuối cùng của SLGL Nói chung, các nang ấu thường được lây nhiễm vào các động vật nhai lại giống như trâu, bò, dê, cừu Tuy nhiên, chúng cũng

có thể lây cho các động vật có vú khác bao gồm cả con người Một mao ấu tạo ra từ trứng sán có thể tạo ra 4.000 nang ấu trùng do quá trình phân chia ở các giai đoạn

bào ấu và redia Nang ấu chỉ tồn tại khi nhiệt độ và độ ẩm thuận lợi, trong điều kiện

khô ráo chúng không thể sống sót nhưng trong khi độ ẩm cao và nhiệt độ thích hợp

nang ấu có thể sống sót đến 1 năm (Andrews, 1999) Các nang ấu (metacercaria)

bám vào thực vật thủy sinh được động vật ăn cỏ và người ăn vào, khi đến ruột chúng xuyên qua ruột non, đi vào khoang phúc mạc Từ đó, nó di chuyển trực tiếp đến gan Quá trình di chuyển từ đường tiêu hóa đến gan mất khoảng 7 ngày Trong gan, chúng chưa trưởng thành ngay mà chui vào nhu mô gan và tiếp tục di chuyển sâu vào trong gan Ở trong gan, chất dinh dưỡng chủ yếu của SLGL là máu Giai đoạn này thời gian khoảng 6 tuần Sau giai đoạn này, SLGL xâm nhập vào ống dẫn mật

và phát triển thành con trưởng thành tại đây Thời gian kể từ khi nhiễm vào cơ thể vật chủ đến khi hoàn toàn trưởng thành mất khoảng 3 tháng SLGL sau khi trưởng thành bắt đầu đẻ trứng và trứng lại tiếp tục thực hiện vòng đời tiếp theo Con trưởng thành có thể sống sót trong nhiều năm ở trong gan của vật chủ Trung bình một ngày một con sán trưởng thành đẻ từ 20.000 đến 50.000 trứng (Andrews, 1999)

Hình 2.8 Vòng đời của sán lá gan lớn (Nguồn:www.dpd.cdc.gov)

Thời gian hoàn thành vòng đời của SLGL phụ thuộc nhiều yếu tố, liên quan đến sự phát triển của các giai đoạn ở ngoài môi trường và trong vật chủ trung gian

là ốc Theo Guralp et al (1964) khoảng 80% cercaria ra khỏi ốc vào buổi tối Tại Brazil, Gomes (1985) đã thu được cercaria sau 56 ngày gây nhiễm

miracidium cho ốc ở nhiệt độ 27-290C Tổng số cercaria có thể có trong mỗi ốc

thường là hàng trăm, nhưng có thể khác nhau từ vài trăm đến hàng nghìn

Bitakaramire (1968) đã thu được trung bình 653 Cercaria của sán F gigantica /ốc L natalensis được gây nhiễm, nhưng Grigoryan (1958) đã thu được 2.700

cercaria /ốc, Guralp et al (1964) thu được 7.179 cercaria/ốc trong thời gian 75

ngày Sharma et al (1989) cho biết, ở 25-270C, cercaria bắt đầu ra khỏi ốc sau 20

ngày gây nhiễm, nhưng nhiều nhất khoảng 46-50 ngày sau khi nhiễm (Asanji, 1988) Thời gian này sẽ dài hơn khi nhiệt độ giảm đi và có thể kéo dài đến 197

ngày (Dinnik J.A and Dinnik N.N, 1963) Theo Da Costa et al (1994), sau gây nhiễm, cercaria từ ốc ra môi trường nước thành các đợt, mỗi đợt có khoảng 50-70

cercaria được giải phóng ra khỏi ốc Dreyfuss and Rondelaud (1997) cho biết,

trong một lần gây nhiễm, cercaria thoát ra khỏi ốc có thể tới 15 đợt (thường là 3

đợt hoặc có thể ít hơn)

Dar et al (2010) đã thí nghiệm gây nhiễm 4 miracidium/ốc Radix natalensis

- ký chủ trung gian của sán lá F hepatica tại Ai Cập, ở điều kiện nhiệt độ 240C

Kết quả cho thấy thời gian trung bình 24,3 ngày có 90,7 cercaria được giải phóng /ốc và cercaria được giải phóng ra trong 2 - 13 đợt

Theo Ueno et al (1975) sau khi thoát khỏi ốc, cercaria hóa nang thành

adolescaria Khoảng 2/3 số adolescaria bám vào giá thể trong nước, số còn lại

không bám vào giá thể mà trôi nổi trong nước Adolescaria hình khối tròn, màu

nâu đen, bên trong chứa phôi hoạt động Phôi có giác miệng, giác bụng, ruột phân nhánh và túi bài tiết

Điều kiện nhiệt độ và độ ẩm của nước ta rất thuận lợi cho sự nhiễm bệnh của sán lá gan lớn Ở những vùng có mầm bệnh tồn tại, cứ trung bình 3 tháng, sán

lá gan lớn lại hoàn thành vòng đời trong cơ thể trâu bò, nghĩa là lại tạo ra một đời sán mới trong cơ thể Con vật khi đã có sán lá gan ký sinh có thể tiếp tục nhiễm mầm bệnh mới, dẫn đến tình trạng số lượng sán trong cơ thể tăng dần theo tuổi

trâu, bò (Phan Địch Lân, 2000; Nguyễn Hữu Hưng, 2011)

2.1.4 Triệu chứng bệnh sán lá gan ở trâu bò

Triệu chứng lâm sàng là biểu hiện ra bên ngoài bởi các tác động gây bệnh

của sán lá Fasciola Triệu chứng ở trâu, bò biểu hiện nặng hay nhẹ phụ thuộc vào

cường độ nhiễm sán lá gan, tuổi trâu bò, tình trạng sức khoẻ và chăm sóc quản lý

- Thể cấp tính thường gặp ở trâu bò 1,5 - 2 năm tuổi (Phạm Văn Khuê et al.,

1996) trong giai đoạn sán lá non di hành hoặc khi nuôi dưỡng, chăm sóc kém Trâu bò biểu hiện: ăn uống sút kém, suy nhược, chướng bụng, ỉa chảy, miệng hôi, sốt, gan sưng to và đau, thiếu máu, vàng da, đôi khi có triệu chứng thần kinh (lảo đảo, xiêu vẹo) Trâu bò có thể chết do xuất huyết nặng, trúng độc và suy nhược

cơ thể

Thể mãn tính thấy phổ biến ở trâu, bò trưởng thành, khi trâu bò được nuôi dưỡng tốt và sán lá ở giai đoạn trưởng thành ký sinh trong ống dẫn mật với số lượng ít Thể mãn tính thường xuất hiện sau thể cấp tính 1 - 2 tháng (Phạm Sỹ

Lăng và ctv., 2015)

Phan Địch Lân (1994) đã theo dõi 37 trâu bị bệnh sán lá gan nặng, thấy các triệu chứng thường lặp đi lặp lại như: gầy rạc, suy nhược cơ thể (37/37); phân nhão không thành khuôn, có lúc ỉa lỏng (32/37); niêm mạc mắt nhợt nhạt, thiếu máu kéo dài (27/37); lông xù, da mốc, lông dễ rụng (26/37); phân đen, thối khắm (22/37); mắt sâu có dử (18/37); bụng ỏng, ỉa chảy kéo dài (13/37); thủy thũng ở nách, hai chân trước, gan to (11/37); thủy thũng ở ngực, ức liên tục (9/37)

Nhìn chung, khi trâu bò bị bệnh sán lá gan kéo dài nếu không được điều trị kịp thời thì trâu bò thường chết trong tình trạng thiếu máu, ỉa chảy và suy kiệt

2.1.5 Bệnh tích của trâu, bò mắc bệnh sán lá gan

Tuỳ theo mức độ nhiễm sán lá mà bệnh tích có sự khác nhau Đối với trâu

bò nhiễm sán lá nặng, bệnh tích thấy rõ là viêm gan cấp tính, gan sưng to, màu nâu sẫm, xung huyết Trên mặt gan có thể thấy những đường di hành của sán lá non tạo thành những vệt đỏ thẫm, dài 2 - 4mm, trong nhu mô gan có sán lá non với số lượng nhiều Lớp thanh mạc xuất huyết nhẹ, đôi khi có tơ huyết Khi bò nhiễm SLGL mức độ nặng thấy viêm phúc mạc, gan xuất huyết nhiều, niêm mạc mắt nhợt nhạt

Ở những trâu bò nhiễm sán lá gan đã lâu, gan viêm mãn tính, những chỗ mô gan bị phá hủy tạo thành sẹo màu vàng xám Gan xơ cứng, niêm mạc ống dẫn mật dầy, có hiện tượng calci hoá mặt trong thành ống Lòng ống dẫn mật giãn rộng,

chứa đầy dịch màu nâu và sán lá Fasciola Khi ống mật bị calci hoá nhiều, sán lá

ở chỗ đó thường bị chết hoặc chuyển đến chỗ ít biến đổi hơn (Phạm Sỹ Lăng,

Nguyễn Hữu Hưng và ctv., 2015)

Nghiên cứu bệnh sán lá gan ở trâu bò, Phan Địch Lân (1994) cho biết: khi

mổ khám trâu bò bị bệnh sán lá gan thấy có bệnh tích đặc biệt là gan to hơn nhiều

so với bình thường (gấp 2 - 3 lần) Gan màu đỏ sẫm, biểu hiện xung huyết Dưới

vỏ gan thấy ứ nước, trên mặt gan còn giữ lại những đường ngoằn ngoèo do sán lá

di hành Tổ chức liên kết phát triển tạo nên những sẹo đặc biệt Trong gan còn thấy những sán lá non không đến được ống dẫn mật, đóng kén to bằng hạt đậu và chết trong kén Cắt tổ chức gan thấy lạo xạo do biến chất thoái hoá, do tăng sinh

tổ chức liên kết nên gan cứng và xơ gan Trường hợp viêm phúc mạc xoang bụng chứa nhiều nước (cổ chướng)

2.1.6 Quan sát mô bệnh học gan nhiễm sán

Tình trạng bệnh lý của gan nhiễm sán

Gan xuất huyết

Xuất huyết là sự thoát ra khỏi mạch máu tất cả những thành phần của máu Xuất huyết xảy ra khi con vật còn sống vì muốn có xuất huyết phải có áp suất huyết (Nguyễn Văn Khanh, 1993)

Vết xuất huyết trên gan xuất hiện các dạng như xuất huyết điểm (từng chấm nhỏ như xuất huyết đinh ghim), xuất huyết từng mảng trên từng thùy của gan, đôi khi trên toàn bộ gan Quan sát vùng gan xuất huyết có màu đỏ hay tím bầm (do hồng cầu đã thoái hóa)

Trường hợp xuất huyết nhẹ, gan hơi nhạt màu, thể chất gan bình thường, không tăng kích thước

Trường hợp xuất huyết nặng, bề mặt gan nhạt màu, có mảng xuất huyết lớn màu đỏ sậm ăn sâu vào trong nhu mô gan Gan mềm, ấn tay vào dễ lõm xuống, có tăng kích thước nhưng không đáng kể Gan dễ cắt, mặt cắt có rỉ máu màu tím bầm, ứ máu ít

Cơ chế

Mao mạch bị vỡ ra thì hồng cầu thoát mạch

Tầm quan trọng và hậu quả của xuất huyết: Gan bị xuất huyết nhiều, thú có thể bị chết vì thiếu máu

Gan ứ huyết

Ứ huyết là sự tăng lượng máu trong phần tĩnh mạch gây ra sự cản trở lưu thông huyết ở một cơ quan hay một vùng, tạo ra những thay đổi vĩnh viễn như hóa sợi tại mô gan Trong mao mạch, hồng cầu kết thành từng chuỗi dẫn tới rối loạn dinh dưỡng tế bào, rối loạn quá trình oxy hóa tế bào

Tầm quan trọng và hậu quả của ứ huyết: Khi máu ứ ở gan lâu ngày, gan sẽ

bị thiếu oxy kéo dài dẫn đến hoại tử tế bào gan quanh tĩnh mạch trung tâm tiểu thùy Tình trạng này kéo dài gan sẽ bị thoái hóa mỡ, xơ hóa, gan trở nên to, rắn và

bờ sắc

Cơ chế

Tất cả những nguyên nhân làm cản trở máu tuần hoàn về tim do ứ máu ở gan, suy tim phải, viêm ngoại tâm mạc co thắt, bệnh phổi mãn tính, tắc tĩnh mạch chủ dưới và viêm tĩnh mạch gan hoặc do bị chèn ép đều gây rối loạn chức năng

mô xung quanh và các tế bào gan kế cận làm cho một vùng hay toàn bộ gan có màu vàng Sau đó sắc tố mật vào hệ thống huyết, bạch huyết và được mang đi khắp nơi trong cơ thể làm cho cơ thể thú và nước tiểu có màu vàng, trong khi phân có màu xám trắng vì không có mật

Gan hoại tử: là sự chết định vị của mô trong cơ thể khi con vật còn sống

Vùng hoại tử dễ nhận biết dựa vào cấu trúc, màu sắc của nhu mô hoặc ranh giới của bệnh tích được phân cách rõ với mô xung quanh

Gan có mủ: là loại viêm có rất nhiều bạch cầu trung tính tích tụ lại Có hai

loại mủ: mủ tươi và mủ khô (mủ hóa calci Khi cắt ngang qua nốt mủ, nếu là mủ khô có hai phần: phần ngoài nốt mủ hơi sệt có màu vàng sậm, bên trong khô như vôi Nếu mủ tươi, khi cắt ngang qua nốt mủ, mủ có màu vàng sệt chảy ra Những nốt mủ này nổi cộm đều khắp mặt gan và ăn sâu vào trong nhu mô gan

Cơ chế

Mô hoại tử bị vi trùng xâm nhập, nếu là loại vi trùng sinh mủ thì những bọc

mủ sẽ xuất hiện trong mô hoại tử và sẽ có bạch cầu trung tính đang tan rã ở các mức độ khác nhau trong khối hoại tử

Gan nhiễm mỡ: là tình trạng những giọt mỡ xuất hiện trong tế bào chất của

tế bào gan làm ảnh hưởng xấu đến chức năng chung của gan Hầu hết mỡ đến gan

để tích trữ tạm thời, ở đây hầu hết mỡ trung tính được biến thành phospholipid để phân phối tới các cơ quan và mô, nếu sự biến đổi này bị cản trở, mỡ trung tính sẽ tích tụ trong các tế bào gan (Văn Đình Hoa và Phan Thị Thu Oanh, 2002)

Tầm quan trọng và hậu quả: nếu tình trạng trên kéo dài tế bào sẽ chết, nếu

hư hại nhẹ tế bào trở lại bình thường Các tế bào chết hoặc tổn thương được loại

ra bởi hiện tượng tự hủy và thực bào

Xơ gan

Xơ gan là tên gọi chung của quá trình tổn thương mãn tính ở gan do nhiều nguyên nhân và nhiều cơ chế sinh bệnh khác nhau gây ra các biến đổi hình thái tương đối giống nhau ở gan Đặc điểm nổi bật của xơ gan là sự thành lập mô liên kết sợi lan rộng khắp các tiểu thùy và làm cho mô liên kết kẽ nhiều hơn nhu mô của tiểu thùy Mô liên kết bằng sợi phôi bào nhưng thường là mô liên kết sợi trưởng thành, có sự xâm nhập của tế bào lympho và bạch cầu đơn nhân chủ yếu ở vùng khoang cửa

Các dạng xơ

Xơ vùng tĩnh mạch cửa: tổ chức liên kết rất dày đặc, có khuynh hướng bao quanh các tiểu thùy Cấu trúc tiểu thùy có thể bị biến dạng bởi sự tăng sinh của nhu mô Đây là tình trạng theo sau thể viêm gan do ngộ độc cấp tính

Xơ trong tiểu thùy: sự phát triển tràn lan của tổ chức xơ trong tiểu thùy

Xơ trong vùng mật: tổ chức sợi bao quanh ống dẫn mật, nếu nhiều tế bào sợi

sẽ phát triển lan rộng vùng khoảng cửa xung quanh tiểu thùy

Xơ trung tâm tiểu thùy: sự gia tăng mô liên kết sợi ở chung quanh tĩnh mạch trung tâm đưa đến ứ huyết kinh niên

Cơ chế

Sán tích tụ ở gan phá hủy tế bào gan, sau đó hình thành mô liên kết sợi đến thay thế Tuy nhiên nhiều trường hợp thể tích gan to lên nhưng chức năng giảm

đi

2.1.7 Chẩn đoán bệnh sán lá gan do Fasciola ở trâu bò

2.1.7.1 Chẩn đoán dựa vào dịch tễ học của bệnh sán lá gan bò

Chẩn đoán sán lá gan ký sinh ở bò, qua nghiên cứu về yếu tố dịch tễ học giúp ta có thể tìm được những nguyên nhân phát sinh ra bệnh sán lá gan, con đường truyền lây, những quá trình phát triển và dập tắt của bệnh

Những điều kiện liên quan đến dịch tễ học của bệnh đã giúp cho ngựời làm công tác nghiên cứu có thể nắm được:

Điều kiện tự nhiên trong vùng, yếu tố thổ nhưỡng, ảnh hưởng đến quá trình bệnh phát triển như độ cao, khu hệ thực vật, khu hệ động vật

Sự hoạt động của con người như tập quán chăn nuôi, sự đi lại của con người

và súc vật có thể mang theo các loài sán

Điều kiện dịch tễ học là yếu tố quan trọng giúp rất nhiều trong quá trình tìm

ra các loài sán lá gan ký sinh trên bò, khu hệ giun sán ký sinh trong vùng, ký chủ trung gian, mùa vụ mắc bệnh Do đó, việc điều tra yếu tố dịch tễ học không thể thiếu được trong phương pháp chẩn đoán sán lá gan trên bò nuôi

2.1.7.2 Chẩn đoán bệnh sán lá gan dựa vào triệu chứng lâm sàng

Việc chẩn đoán bệnh sán lá gan không chỉ dựa vào triệu chứng lâm sàng của con vật như các bệnh truyền nhiễm khác (bệnh truyền nhiễm do vi khuẩn hay do

vi rút) vì những lý do sau:

Triệu chứng của bệnh sán lá gan không điển hình, nên trong chẩn đoán thường bị nhầm lẫn Bò nhiễm ít sán, bò sẽ không chết và không thể hiện triệu chứng lâm sàng, nếu bò nhiễm nặng nhiều sán thì mới có thể có biểu hiện triệu chứng lâm sàng

Triệu chứng lâm sàng của bệnh sán lá gan biểu hiện nặng hay nhẹ còn tùy thuộc vào tình hình dinh dưỡng, sức đề kháng, mức độ cảm nhiễm Con vật nếu

có điều kiện dinh dưỡng tốt, sức đề kháng mạnh, triệu chứng lâm sàng sẽ biểu hiện không rõ hoặc không có Ngược lại nếu nuôi dưỡng kém, sức đề kháng yếu,

con vật dễ mắc bệnh, triệu chứng lâm sàng sẽ rất nặng (Phạm Sỹ Lăng và ctv.,

2015) Trong chẩn đoán bệnh sán lá gan ở bò sẽ không chính xác nếu chỉ dựa vào triệu chứng lâm sàng mà phải tìm thấy căn bệnh (trứng, ấu trùng hoặc sán trưởng thành ký sinh)

Do chẩn đoán này không đặc trưng cho nên cách chẩn đoán dựa vào triệu

chứng chỉ cho chúng ta dự đoán mà thôi

nhất là ở những trâu bò nhiễm ít hoặc ở giai đoạn sán lá còn non

b Trên bò chết (mổ khám)

Áp dụng phương pháp mổ khám từng phần Phương pháp này có thể tìm thấy được tất cả các loài sán lá gan ở các giai đoạn và các tổ chức cơ quan mà chẩn đoán khi gia súc còn sống với các phương pháp kiểm tra phân không thể phát hiện như sán ở giai đoạn ấu trùng di hành hoặc ở sán còn non chưa đẻ trứng Sothoeun (2006) đã nghiên cứu và cho biết, có tới 27% số bò mổ khám có sán lá

F gigantica trong gan, nhưng khi xét nghiệm phân lại cho kết quả âm tính

(trường hợp này là âm tính giả)

Với phương pháp chẩn đoán này giúp ta có thể đánh giá được tỷ lệ, cường

độ nhiễm sán, qua định danh phân loại hình thái học và sinh học phân tử ta có thể xác định được chính xác loài sán lá gan gây bệnh Đồng thời có thể tìm thấy được những tổn thương ở gan, mật mà sán ký sinh

2.1.7.4 Phương pháp chẩn đoán miễn dịch

Thường khi gia súc nhiễm sán thì trong máu sẽ xuất hiện kháng thể Dựa vào đặc điểm này có thể dùng các biện pháp chẩn đoán huyết thanh học để xác định hàm lượng kháng thể hay kháng nguyên trong máu Một số phương pháp miễn dịch phát hiện súc vật nhiễm sán lá gan đã được sử dụng như phương pháp miễn dịch gắn men ELISA, phương pháp miễn dịch huỳnh quang Tuy nhiên, do khó khăn về trang thiết bị và việc chế kháng nguyên chuẩn, nên các phương pháp này còn ít được dùng trong chẩn đoán bệnh ký sinh trùng nói chung và bệnh sán

lá gan nói riêng Tại Việt Nam, Lương Tố Thu và ctv (1997), Nguyễn Thị Thanh Giang và ctv (2011) đã dùng kháng nguyên tự chế từ loài F gigantica ký sinh

trên trâu, bò Việt Nam, sử dụng trong phản ứng ELISA để chẩn đoán bệnh sán lá gan trâu, bò và thu được kết quả tốt

Nhiều tác giả nước ngoài đã áp dụng phương pháp ELISA để chẩn đoán

bệnh sán lá gan ở súc vật nhai lại tại Australia (Molloy et al., 2005), tại Anh (Catherine et al., 2010), tại Bỉ (Charlier et al., 2009; Bennema et al., 2009; Bennema et al., 2011) … Các tác giả cho biết, ELISA là phương pháp chẩn đoán

bệnh sán lá gan hiệu quả, có độ nhạy và độ đặc hiệu cao

2.1.8 Các phương pháp xác định loài sán la gan lớn do Fasciola sp

Có nhiều phương pháp khác nhau để xác định loài ký sinh trùng nói chung

và SLGL nói riêng như: phương pháp hình thái học; phương pháp dựa vào sản

phẩm Protein của ký sinh trùng; phương pháp dựa vào đặc điểm dịch tễ học và vòng đời; phương pháp dựa vào đặc tính phân bố theo vùng, khu vực địa lý, theo vật chủ; phương pháp dựa vào đặc tính sinh lý, sinh hóa; phương pháp huyết thanh học; phương pháp mô bệnh học nhuộm màu tế bào, cá thể … và các phương pháp dựa vào các kỹ thuật sinh học phân tử (Lê Thanh Hòa, 2007) Tuy nhiên, đối với SLGL, 2 phương pháp xác định loài chủ yếu được sử dụng là phương pháp hình thái học và sinh học phân tử dựa trên các chỉ thị phân tử gen ty thể và gen nhân tế bào

này có sự khác nhau về hình dạng và kích thước của lớp mô biểu bì, các đặc điểm

khác biệt ở cơ quan sinh sản và tiêu hóa (Nguyễn Thị Lê, 2000; Mas-Coma et al.,

2009) Trong các nghiên cứu về hình thái SLGL trước đây, đa số tập trung vào

loài F hepatica, rất ít nghiên cứu đối với F gigantica và cũng không nhiều nghiên cứu so sánh hình thái của 2 loài F gigantica và F hepatica Trong một

thời gian dài, phân loại SLGL dựa vào hình thái đã bộc lộ nhiều điểm hạn chế,

nhất là ở các khu vực có 2 loài SLGL cùng tồn tại (Coma et al., 2009; Coma et al., 2015) Gần đây, một số nghiên cứu dựa trên các phương pháp đo đạc chuẩn trên các dòng F gigantica và F hepatica thuần cho thấy, giữa 2 loài dòng

Mas-thuần có một số chỉ số có sự khác biệt rõ ràng như tỷ số chiều dài/chiều rộng (BL/BW), khoảng cách từ giác bụng đến cuối thân (VS-P), chu vi cơ thể (BR) Chính vì vậy, các chỉ số này được một số tác giả sử dụng để phân loại sơ bộ

SLGL Nghiên cứu của Periago et al (2006) trên 251 cá thể SLGL thu thập tại 3 quốc gia nơi chỉ tồn tại các loài SLGL thuần chủng là Tây Ban Nha (84 cá thể F

hepatica thuần chủng), Corsica - một hòn đảo thuộc nước Pháp (86 cá thể F hepatica thuần chủng) và Burkina Faso (81 cá thể F gigantica thuần chủng) đã

tiến hành xác định giá trị của hơn 20 chỉ số hình thái quan trọng như: chiều dài, chiều rộng, tỷ số chiều dài/chiều rộng, kích thước giác bụng, giác miệng, khoảng

cách từ giác bụng tới cuối thân (VS-P), chu vi cơ thể (BP) … Kết quả cho thấy, F

hepatica thu thập từ Tây Ban Nha có kích thước chiều dài dao động từ 11,64 đến

22,93 mm (trung bình 17,41 ± 0,23mm), chiều rộng từ 6,41 đến 13,88mm (trung

bình 10,02 ± 0,17mm) và từ Corsica chiều dài dao động từ 12,22 đến 29,00mm (trung bình 20,45 ± 0,37mm), chiều rộng từ 4,88 đến 14,07mm (trung bình 10,71

± 0,18mm) Trong khi đó, kích thước chiều dài của F gigantica thu thập từ

Burkina Faso dao động từ 28,82 - 52,30mm (trung bình 39,72 ± 0,58mm), chiều rộng từ 6,03 đến 11,84mm (trung bình 8,45 ± 0,14mm) Với các kết quả này, có

thể thấy các chỉ số BL/BW, VS-P có sự khác biệt rõ ràng giữa F hepatica và F

gigantica Cụ thể, với F hepatica, SLGL ở Tây Ban Nha chỉ số BL/BW dao động

từ 1,29 đến 2,77 (trung bình 1,74 ± 0,03), ở Corsica dao động từ 1,33 đến 2,80

(trung bình 1,91 ± 0,03) Trong khi, chỉ số BL/BW ở F gigantica ở Burkina Faso

dao động từ 3,40 đến 6,77 (trung bình 4,70 ± 0,08) Dựa vào các kết quả này,

Periago et al (2006) phân loại SLGL thành 2 nhóm:

+ Nhóm có hình thái giống với F hepatica (chỉ số BL/BW dao động từ 1,29 đến

2,8; VS-P từ 8,86 đến 25,08 mm);

+ Nhóm có hình thái giống với F gigantica (chỉ số BL/BW dao động từ 3,40 đến

6,78; VS-P từ 26,28 đến 50,09 mm)

Một số nghiên cứu đã chứng minh cách phân loại này cũng đúng với các quần thể

SLGL thuần chủng ở các khu khu vực khác (Ashrafi et al., 2006) Tuy nhiên, tại những nơi có tồn tại cả 3 kiểu gen F hepatica, F gigantica và Fasciola sp xuất

hiện những cá thể có kích thước các chỉ số BL/BW và hoặc VS-P nằm ở khoảng

trung gian và kích thước các chỉ số của F hepatica, F gigantica có những khoảng gối lên nhau (Ashrafi et al., 2006; Fayez et al., 2015) Sự xuất hiện dạng

trung gian của SLGL không những làm tăng thêm tính phức tạp trong phân loại loài SLGL mà còn gây ra những khó khăn nhất định trong chẩn đoán loài SLGL

gây bệnh ở một khu vực địa lý nhất định (Choi et al., 2015; Nguyễn Thị Giang Thanh và ctv., 2015; Yakhchali et al., 2015) Mặc dù vậy, phương pháp xác định các chỉ số hình thái của Periago et al., 2006; Periago et al., 2008) là phương pháp

nghiên cứu đơn giản, có thể thực hiện bởi những người không có chuyên môn để

mô tả đặc điểm hình thái của SLGL mà không cần tới những người có trình độ

chuyên môn sâu (Periago et al., 2008; Mas-Coma et al., 2009 Chính vì thế,

phương pháp này vẫn được nhiều nghiên cứu áp dụng để xác định các chỉ số hình thái, tính đa hình về hình thái và phân loại SLGL trước khi thực hiện các giám định phân tử Một số nghiên cứu tiêu biểu áp dụng phương pháp này như Ashrafi

et al (2006), Mufti et al (2014), Wannasan et al (2014) và Yakhchali et al

(2015)… Các tác giả này cũng có cùng quan điểm, ở các quần thể SLGL F

hepatica và F gigantica thuần chủng, không có các cá thể lai, các chỉ số BL/BW

và VS-P được chứng minh là một công cụ hữu ích để phân biệt loài hoặc dự báo, nhận định về sự tồn tại của dạng trung gian

2.1.8.2 Phương pháp sinh học phân tử xác định và phân biệt F hepatica và

F gigantica

Sự ra đời của sinh học phân tử giúp các nhà khoa học có thêm nhiều công

cụ để xác định một loài sinh vật hay phân biệt các loài sinh vật với nhau Đối với

Fasciola sp nhiều công cụ khác nhau đã được thiết kế để xác định và phân biệt

giữa F hepatica và F gigantica như: PCR cơ bản kết hợp với giải trình tự,

multiplex-PCR, RFLP-PCR, SSCP-PCR, LAMP Trong đó, PCR kết hợp với

giải trình tự và RFLP-PCR là các công cụ thường được lựa chọn hơn cả (Ai et al

2011)

Để phân biệt 2 loài SLGL F hepatica và F gigantica, rất nhiều nghiên

cứu đã sử dụng phương pháp PCR-RFLP Đa số tác giả sử dụng hệ gen nhân làm chỉ thị đích cho kỹ thuật này, trong đó một số vùng gen đích thường được lựa

chọn là 28S, ITS1, ITS2 … Đối với vùng gen 28SrRNA, Saki et al (2011) và Yakhchali et al (2015) sử dụng cặp mồi 28F1 và 28R600 để khuếch đại 1 phần

đoạn gen 28SrRNA có kích thước 618 bp của SLGL và sử dụng 2 enzyme giới

hạn AvaII, DraII để phân biệt F hepatica và F gigantica ở Iran Đối với đoạn

giao gen ITS-1, cặp mồi ITS1-F, ITS1-R khuếch đại đoạn 680 bp chứa đoạn ITS1

và enzyme giới hạn RsaI đã được nhiều tác giả như Ichikawa and Itagaki (2010), Dar et al (2012), Khaled et al (2012), Mohanta et al (2014) và Reaghi et al (2016)… sử dụng để phân biệt F hepatica và F gigantica cũng như xác định dạng trung gian Theo Ichikawa and Itagaki (2010) sản phẩm PCR kích thước

680 bp chứa trình tự ITS1 đầy đủ sau khi bị cắt bởi RsaI sẽ cho các band trên bản điện di 360, 100 và 60 bp ở F hepatica; 360, 170 và 60 bp ở F gigantica; 360,

170, 100 và 60 bp nếu là dạng trung gian Đối với vùng giao gen ITS2, Shafiei et

al (2013) đã sử dụng cặp mồi ITS2-F, ITS2-R khuếch đại đoạn gen kích thước

khoảng 540 bp và các enzyme MspI, KpnI để phân biệt F hepatica và F

gigantica Cũng với chỉ thị ITS2, Ghavami et al (2009) lại sử dụng các enzyme BamH1 và PagI để phân biệt F hepatica và F gigantica Đối với hệ gen ty thể,

không có nhiều nghiên cứu sử dụng phương pháp PCR-RFLP để phân biệt SLGL

Nghiên cứu của Simsek et al (2011) là một trong số ít sử dụng chỉ thị gen ty thể

để phân biệt 2 loài F hepatica và F gigantica Tác giả này đã sử dụng cặp mồi JB3, JB4.5 khuếch đại đoạn gen kích thước 447 bp là 1 phần của gen cox1 và các enzyme RsaI và AluI để phân biệt F hepatica và F gigantica Có lẽ, do tính biến