Nghiên cứu môi trường và điều kiện lên men sản xuất thực phẩm chức năng nattokinase tái tổ hợp

Chính vì lí do đó, chúng tôi đã tiến hành xác định sự ảnh hưởng của các yếu tố thành phần, điều kiện môi trường, tác nhân vật lý, hóa học tới quá trình lên men để thu nhận được hoạt tính

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1 PGS.TS NGÔ THỊ TƯỜNG CHÂU

2 TS HỒ TUYÊN

Hà Nội – 2017

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và thực hiện luận văn, em đã luôn nhận được sự dạy dỗ, chỉ bảo tận tình của các Thầy, Cô giáo cũng như sự quan tâm chăm sóc từ gia đình và bạn bè

Đặc biệt, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Ngô Thị Tường

Châu và TS Hồ Tuyên Thầy Côđã trực tiếp hướng dẫn, truyền đạt cho em kiến thức

và kinh nghiệm quý báu Luôn nhắc nhở, bảo ban và động viên em suốt thời gian tiến hành đề tài cũng như hoàn thành luận văn tốt nghiệp này

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới tập thể cán bộ, học viên và sinh viên thuộc phòng thí nghiệm phân tích - Khoa Môi trường và Bộ môn Sinh thái Môi trường, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã luôn chỉ bảo, giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi và đóng góp ý kiến quý báu để em hoàn thành luận văn một cách tốt nhất

Cuối cùng, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, người thân và bạn

bè đã luôn bên cạnh động viên, chia sẻ và giúp đỡ em về mọi mặt trong suốt thời gian qua

Hà Nội, năm 2017

Học viên

Hoàng Thị Bích Vân

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1.TỔNG QUAN 3

1.1 Khái niệm về huyết khối 3

1.2 Đại cương về nattokinase 3

1.2.1 Lịch sử phát hiện nattokinase 3

1.2.2 Hoạt tính của nattokinase 4

1.2.3 Cơ chế phân hủy fibrin của nattokinase 5

1.2.4 Sinh tổng hợp và sản xuất nattokinase 5

1.2.5 Tình hình nghiên cứu sản xuất nattokinase 7

1.3 Đại cương về Bacillus subtilis 10

1.3.1 Đặc điểm tế bào 10

1.3.2 Chất cảm ứng IPTG 12

1.4 Ảnh hưởng của các tác nhân vật lý và hóa học khi lên men sản xuất NK 12

1.4.1 Ảnh hưởng của các tác nhân vật lý 12

1.4.2 Ảnh hưởng của các tác nhân hóa học 15

1.4.3 Tình hình nghiên cứu ảnh hưởng của các tác nhân vật lý và hóa học đến sản xuất NK 18

1.5 Các phương thức lên men sản xuất NK 20

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

2.1 Vật liệu 23

2.1.1 Chủng giống 23

2.1.2 Môi trường 23

2.2 Phương pháp nghiên cứu 24

2.2.1 Chuẩn bị giống vi khuẩn B subtilis tái tổ hợp 25

2.2.2 Phương pháp lên men 25

2.2.3 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme 25

2.2.4 Nghiên cứu tối ưu hóa môi trường và điều kiện lên men cho sinh tổng hợp NK 28

2.2.5 Phương pháp xác định ảnh hưởng của các tác nhân vật lý và hóa học khi lên men nhằm nâng cao hoạt tính NK 32

2.2.6 Phương pháp xác định ảnh hưởng của các chế độ lên men 32

2.2.7 Phương pháp xử lý số liệu 33

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34

3.1 Tối ưu hóa thành phần môi trường lên men 34

3.1.1 Lựa chọn môi trường lên men cơ sở 34

3.1.2 Lựa chọn nguồn C 35

3.1.3 Hàm lượng Maltose thích hợp cho sinh tổng hợp NK 36

3.1.4 Lựa chọn nguồn N 36

3.1.5 Hàm lượng đậu nành thích hợp cho sinh tổng hợp NK đến hoạt tính NK 38 3.1.6 Ảnh hưởng của muối khoáng đến sinh tổng hợp NK 38

3.1.7 Ảnh hưởng của chất cảm ứng (tiền chất) đến sinh tổng hợp NK 40

3.1.8 Tối ưu hoá thành phần môi trường lên men theo phương pháp bề mặt đáp ứng (Design Expert Version 7.1) 41

3.2 Tối ưu hóa điều kiện môi trường lên men 52

3.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của pH 52

3.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy 52

3.2.3 Nhu cầu oxy của chủng tái tổ hợp trong quá trình lên men 53

3.2.4 Ảnh hưởng của tuổi giống và lượng giống tới sinh tổng hợp NK 54

3.3 So sánh khả năng sinh tổng hợp NK của chủng tái tổ hợp và chủng tự nhiên (chủng gốc mang gen mã hóa NK) 56

3.4 Ảnh hưởng của các tác nhân vật lý tới sinh tổng hợp NK 57

3.4.1 Ảnh hưởng của tốc độ khuấy tới sinh tổng hợp NK 58

3.4.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ cuối lên men tới sinh tổng hợp NK 59

3.5 Ảnh hưởng của một số tác nhân hóa học tới sinh tổng hợp NK 59

3.5.1 Ảnh hưởng của hàm lượng IPTG và Lactose đến sinh tổng hợp NK 60

3.5.2 Xác định thời điểm bổ sung chất cảm ứng IPTG 61

3.6 Hoạt tính NK của dịch lên men chủng B subtilis BD170 tái tổ hợp trong điều kiện tối ưu hóa ảnh hưởng của các nhân tố vật lý và hóa học 61

3.7 Ảnh hưởng chế độ lên men tới sinh tổng hợp NK 62

3.7.1 Nghiên cứu chế độ lên men theo mẻ 62

3.7.2 Nghiên cứu chế độ lên men bán liên tục 63

3.7.3 So sánh hiệu quả sinh tổng hợp NK của 2 chế độ lên men 65

3.7.4 Hoạt tính NK của dịch lên men trong chế độ lên men 66

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 67

TÀI LIỆU THAM KHẢO 69

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Cơ chế phân giải fibrin invivo bởi nattokinase [29]……… 5

Hình 1.2 Các sản phẩm nattokinase……… 6 Hình 1.3 Hình dạng bào tử B subtilis dưới kính hiển vi …… ……… 10 Hình 2.1 Nuôi cấy chủng vi khuẩn Bacillus subtilis BD170 tái tổ hợp………… 23 Hình 2.2 Môi trường lên men……… 24 Hình 2.3 Lên men N trên thiết bị Bioflo 110 có dung tích 5 lít (3L môi trường)…32 Hình 3.1 Bề mặt đáp ứng của từng cặp yếu tố ảnh hưởng……… 47

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1 Hoạt tính protease và NK của dịch lên men chủng B subtilis BD170 tái

tổ hợp trong một số môi trường cơ sở 34

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của nguồn C đến sinh tổng hợp NK 35

Bảng 3.3 Hàm lượng Maltose thích hợp cho sinh tổng hợp NK 36

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của các nguồn N đến sinh tổng hợp NK 37

Bảng 3.5 Lượng đậu nành thích hợp cho sinh tổng hợp NK 38

Bảng 3.6 Ảnh hưởng của các muối khoáng đến sinh tổng hợp NK 39

Bảng 3.7 Ảnh hưởng của chất cảm ứng đến sinh tổng hợp NK 40

Bảng 3.8 Giá trị mã hóa các yếu tố thực nghiệm trong mô hình tối ưu môi trường lên men chủng B subtillis BD170 tái tổ hợp sinh NK 42

Bảng 3.9 Bảng quy hoạch thực nghiệm 43

Bảng 3.10 Kết quả phân tích hồi quy của mô hình 45

Bảng 3.11 47 phương án trong vùng tối ưu các yếu tố ảnh hưởng tới sinh tổng hợp NK của chủng B subtillis BD170 tái tổ hợp 48

Bảng 3.12 Kiểm chứng sự tương thích của mô hình với kết quả thực nghiệm 51

Bảng 3.13 Ảnh hưởng của pH ban đầu đến sinh tổng hợp NK 52

Bảng 3.14 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên men đến sinh tổng hợp NK 53

Bảng 3.15 Ảnh hưởng của độ thông khí lên men đến sinh tổng hợp NK 54

Bảng 3.16 Ảnh hưởng của tuổi giống đến khả năng sinh NK 55

Bảng 3.17 Ảnh hưởng của lượng giống đến khả năng sinh NK 55

Bảng 3.18 So sánh khả năng sinh tổng hợp NK của chủng tái tổ hợp và chủng tự nhiên (chủng gốc) trong quá trình lên men trong bình tam giác 56

Bảng 3.19 Ảnh hưởng của tốc độ khuấy tới sinh tổng hợp NK 58

Bảng 3.20 Ảnh hưởng của nhiệt độ cuối lên men tới sinh tổng hợp NK 59

Bảng 3.21 Ảnh hưởng của hàm lượng IPTG tới sinh tổng hợp NK 60

Bảng 3.22 Ảnh hưởng của thời điểm bổ sung IPTG tới sinh tổng hợp NK 61

No table of figures entries found.BẢNG KÍ HIỆU VÀ TỪ VIẾT TẮT

MỞ ĐẦU

Hiện nay, tỷ lệ bệnh nghẽn mạch (chứng nhồi máu cơ tim hay nhồi máu não) đang gia tăng ở một số nước châu Á như Nhật Bản, Hàn Quốc, Trung Quốc, Việt Nam Theo báo cáo của Tổ chức Y tế Thế giới mỗi năm có khoảng 17 triệu người chết vì bệnh tim mạch và dự báo rằng các bệnh do nghẽn mạch sẽ là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu vào các năm tới

Theo ước tính thị trường toàn cầu về các thuốc làm tan huyết khối là gần 14

tỷ USD Các loại thuốc làm tan huyết khối như Alteplase (t-PA), Streptokinase, Urokinase (UK), Tenecteplase… có hiệu lực tức thì sau khi tiêm tĩnh mạch Tuy nhiên hiệu lực hoạt động sinh học của các loại thuốc này tồn tại không lâu sau khi tiêm, giá thành đắt, đồng thời cũng có nguy cơ biến chứng gây xuất huyết

Tại Nhật Bản, sản phẩm lên men truyền thống Natto đã rất phổ biến và thu hút nhiều sự chú ý Nó được xem là một loại thức ăn giúp giảm thiểu sự nghẽn mạch máu vì có chứa enzyme phân hủy huyết khối “nattokinase” do GS Sumi Hiroyuki phát hiện năm 1980 Nattokinase (còn gọi là subtilisin natto) là một serine

protease được chiết tách từ sản phẩm lên men đậu nành với vi khuẩn Bacillus subtilis natto Nó không chỉ làm giảm fibrin trực tiếp, mà còn thúc đẩy các tế bào để

phát triển mô plasminogen activator để phân huỷ fibrin

Nattokinase (NK), đại diện tiêu biểu của chất có hoạt tính làm tiêu sợi huyết,

là một đối tượng được nghiên cứu sâu rộng từ lâu nhờ những ưu điểm nổi bật hơn các enzyme phân giải cục máu đông khác về hiệu quả phân giải, độ an toàn cao và

dễ sử dụng Trong y học, NK được ứng dụng để sản xuất các dược phẩm, thực phẩm phòng ngừa và điều trị các bệnh do tắc nghẽn mạch máu gây ra bởi cục máu động

như tai biến mạch máu não, nhồi máu cơ tim, co thắt động mạch vành Vì vậy, phát triển các sản phẩm nattokinase liên quan đã thu hút quan tâm đặc biệt trên toàn thế giới

Theo thống kê, nhu cầu sản phẩm NK ngày càng tăng cao ở thị trường Nhật Bản và Đài Loan Trong nước, các công ty dược phẩm cũng bắt đầu cho ra các sản phẩm từ NK với nguyên liệu nhập ngoại chủ yếu từ Nhật Bản như Nattospes (300 FU/g), Japato (600 FU/g), NK plusTM (3.000 FU/g), Dosaka (300 FU/g) với đơn giá rất cao (trên 10 triệu đồng/kg) Vì vậy, nghiên cứu sản xuất NK với hoạt lực cao, thân thiện môi trường và giá cả phù hợp là một vấn đề cấp thiết và là định hướng quan trọng cho ngành công nghiệp thực phẩm chức năng của nước ta Đồng thời việc sử dụng nguyên liệu đầu vào là đậu nành sẽ góp phần giúp cải thiện chất lượng cuộc sống cho người nông dân tại các vùng nông thôn Việt Nam Chính vì lí do đó, chúng tôi đã tiến hành xác định sự ảnh hưởng của các yếu tố thành phần, điều kiện môi trường, tác nhân vật lý, hóa học tới quá trình lên men để thu nhận được hoạt

tính NK cao nhất với đề tài “Nghiên cứu môi trường và điều kiện lên men sản xuất thực phẩm chức năng Nattokinase tái tổ hợp”

CHƯƠNG 1.TỔNG QUAN

1.1 Khái niệm về huyết khối

Huyết khối (cục máu đông) là kết quả của một loạt các hiện tượng xảy ra trong quá trình cầm máu mà có tác dụng ngăn cản chảy máu vết thương, hàn gắn vết thương để giúp bảo vệ mạch máu Tuy nhiên, huyết khối còn được hình thành trong

cơ thể do sự phát sinh và lan rộng bất hợp lý của phản ứng đông máu của cơ thể dẫn đến hình thành nút huyết khối trong lòng mạch máu Huyết khối ở não sẽ làm cản trở việc cung cấp oxy cho các mô não, gây ra các bệnh lý nguy hiểm như: tai biến mạch máu não, suy não, giảm trí nhớ, đột quỵ… Huyết khối ở tim gây ra các bệnh

lý như: co thắt động mạch vành, nhồi máu cơ tim… Bệnh nghẽn mạch là một bệnh

lý nguy hiểm do quá trình sinh bệnh diễn ra chậm và chỉ phát hiện khi phát bệnh vì không hề có triệu chứng hay cảnh báo trước Bệnh khởi phát rất nhanh, rất đột ngột

và gây ra những biến chứng gây tử vong cao [1,10]

1.2 Đại cương về nattokinase

1.2.1 Lịch sử phát hiện nattokinase

Nhà khoa học đầu tiên nghiên cứu về sự bí ẩn của Natto là tiến sĩ K Yabe, một chuyên gia về vi sinh học Ông công bố những kết quả tìm tòi về quá trình lên men của natto vào năm 1894 Ông cho rằng “Natto là một loại pho-mai thực vật” Vào năm 1905, TS Shin Sawamura đã thành công trong việc phân lập các vi khuẩn

lên men từ đậu nành nấu chín Trong số các vi khuẩn này vi khuẩn Baccillus natto

đem lại mùi hương đặc biệt làm đậu lên men [10] Đến năm 1980, GS Sumi Hiroyuki phát hiện NK là chất sản sinh trong quá trình lên men tự nhiên của đậu

nành nhờ vi khuẩn Bacillus subtilis natto Năm 1986, ông công bố toàn bộ kết quả

nghiên cứu về tác dụng của NK sau khi thử nghiệm gần 200 loại thực phẩm khác nhau và ông thấy rằng NK là một loại enzyme có khả năng phân hủy huyết khối một cách hữu hiệu và mạnh nhất trong các loại enzyme (mạnh gấp 4 lần plasmin - enzyme nội sinh làm tan máu đông và tuyệt đối an toàn cho cơ thể khi hấp thụ qua đường ăn uống) [20]

1.2.2 Hoạt tính của nattokinase

NK là một enzyme ngoại bào, thuộc họ serine protease kiềm, có pI 8,7 và có nhiệt độ tối ưu là 40oC Theo những nghiên cứu của Yibing Feng và ctv (2009), 80% hoạt tính của nó tồn tại ở 50oC sau 1 giờ, 70% ở 60oC sau 40 phút và mất hoạt tính hoàn toàn ở nhiệt độ trên 60oC [39,55]

NK làm tan cục máu đông bằng cách làm tan sợi fibrin (chất sợi buộc các tiểu cầu vón kết lại với nhau hình thành cục máu đông) NK hoạt động mạnh gấp 4 lần plasmin nội sinh (loại enzyme duy nhất trong cơ thể làm nhiệm vụ phân hủy sợi fibrin) với cơ chế tương tự như plasmin này Sức khỏe, tuổi tác và sự suy giảm sản sinh plasmin trong cơ thể càng làm tăng nguy cơ hình thành cục máu đông NK cũng giúp tăng cường plasmin của cơ thể và các thành phần chống đông máu khác như urokinase [25]

NK có tác dụng làm giảm huyết áp Các nghiên cứu chỉ ra rằng NK làm giảm huyết áp bằng cách ức chế Angiotensin Converting Enzyme (ACE) ACE khiến mạch máu bị hẹp lại và huyết áp tăng cao NK có khả năng ức chế ACE và ngăn cản dầy nội mạc mạch, trợ giúp máu lưu thông bằng cách hỗ trợ hệ tuần hoàn và được chứng minh

là có tác dụng ngăn chặn xơ vữa mạch NK còn làm chắc xương, trợ giúp đau khớp, giảm nhức đầu, kháng khuẩn, ngừa bệnh tả, thương hàn và bệnh lỵ [26,30,57]

Cục máu đông làm tắc mạch máu là nguyên nhân chính dẫn đến sa sút trí nhớ, xuất huyết não, nhồi máu cơ tim, đau thắt ngực và trĩ Lợi ích tuyệt vời từ NKhứa hẹn mang lại nhiều lợi ích cho những người mắc bệnh này

1.2.3 Cơ chế phân hủy fibrin của nattokinase

NK phân hủy fibrin theo ba cơ chế chính như sau: A) tham gia phân hủy trực tiếp fibrin – một protein dạng sợi tạo mạng lưới gây đông tụ máu, B) đẩy mạnh hoạt động của urokinase (nhân tố làm tăng cường sự chuyển hóa plasminogen thành plasmin) và C) tăng cường chất hoạt hóa plasminogen mô (t-PA) sản sinh plasmin [29]

Hình 1.1 Cơ chế phân giải fibrin invivo bởi nattokinase [29]

1.2.4 Sinh tổng hợp và sản xuất nattokinase

NK được mã hóa bởi gen apr Gen này chủ yếu được biểu hiện ở pha cân bằng trong quá trình sinh trưởng của Bacillus subtilis dưới sự kiểm soát của

promoter có liên quan đến sự tạo bào tử (Ps, s-sporulation) Ps chỉ hoạt động khi có

sự gắn kết với Spo0A, một protein liên kết DNA giữ vai trò điều hòa chủ đạo (master regulator) và điều hòa trực tiếp hoặc gián tiếp khoảng 500 gen liên quan

chặt chẽ đến quá trình tạo bào tử cũng như hiện tượng biến nạp ở B subtilis Do có

vai trò điều hòa quan trọng, lượng Spo0A ở dạng hoạt hóa (dạng phosphoryl hóa) được kiểm soát khá nghiêm ngặt bởi phức hệ protein phosphorelay (chuỗi các protein chuyển nhóm phosphoryl) và vòng tự điều hòa (autoregulatory loop) Vì vậy,

thực nghiệm đã cho thấy rằng sự tổng hợp NK (subtilisin) trong tự nhiên ở B subtilis khá phức tạp và chỉ đạt mức độ giới hạn [8,14,18]

Từ trước đến nay NK được thu nhận chủ yếu bằng con đường lên men bán

rắn của chủng Bacillus subtilis natto trên cơ chất đậu nành nấu chín hay lên men

dịch thể Thực tế, NK được phân tách từ cơ chất hay môi trường lỏng và nó có hàm lượng không cao cũng như hoạt tính ít ổn định Hay nói cách khác, cách tiếp cận trên thường chỉ có hiệu quả nếu đi kèm công nghệ lên men hoàn hảo với các thông

số đã được nghiên cứu tối ưu hóa [15,58]

Các sản phẩm nattokinase trên thị trường hiện nay:

Hình 1.2 Các sản phẩm nattokinase

1.2.5 Tình hình nghiên cứu sản xuất nattokinase

Mùi nhẹ và kết cấu dạng sợi của natto là một trở ngại lớn cho việc sử dụng natto như một thực phẩm thông thường, vì vậy NK tinh khiết đã được nghiên cứu

sản xuất B subtilis (natto) là giống khởi động được sử dụng để làm natto, thương mại hóa hay quy mô hộ gia đình B subtilis (natto) có thể duy trì hoạt động ở pH 6-12 và kháng lại nhiệt độ cao lên đến 60°C [18] Các chủng B subtilis có trong các

sản phẩm NK thương mại hiện nay có thể duy trì tính khả thi và hoạt động trao đổi chất ở nhiệt độ phòng trong ít nhất 6 tháng

So với quá trình lên men đơn giản, việc chiết xuất và tinh chế NK từ dịch lên men natto là rất khó khăn và không hiệu quả Một số biện pháp cho mục đích này

đã được áp dụng như chiết rút bằng dung môi hữu cơ, kết tủa bằng muối, sắc ký trao đổi ion protein và thẩm tích, nhưng hoạt tính NK thu được từ các biện pháp này vẫn thấp [18] Mặt khác, bên ngoài Nhật Bản, NK ở dạng viên nang thường được uống qua đường miệng, sự có mặt của các tạp chất trong các sản phẩm NK là một trở ngại khi sử dụng nó làm thuốc chữa bệnh huyết khối đối với người ăn chay Hơn thế nữa, các sản phẩm NK hiện nay được quan tâm nhiều hơn bởi Cục Quản lý Dược Liên bang (FDA) do yêu cầu về mức độ tinh khiết cao Vì vậy, công nghệ tái tổ hợp

đã được áp dụng để đáp ứng các yêu cầu nâng cao sản lượng và đơn giản hóa quá trình tinh sạch NK

Các gen NK đã được nhân dòng và biểu hiện ở các hệ thống vật chủ vi sinh

vật khác nhau, bao gồm Escherichia coli[32] và B subtilis Trong đó, B subtilis đã

được công nhận là một vật chủ tốt cho sự biểu hiện của các protein ngoại lai với các hoạt động dược lý bởi không có tính độc [56] Nhiều nỗ lực đã được đầu tư để tăng

cường sản xuất protein tái tổ hợp bằng cách loại bỏ các yếu tố hạn chế[14], sử dụng các vector biểu hiện với sự ổn định cấu trúc cao, tối ưu hóa môi trường sử dụng

phương pháp bề mặt đáp ứng và tối ưu hóa promoter [57] Hiệu quả hơn, chủng B subtilis đã được thiết kế cho sản xuất thừa các protein như enzyme tiêu sợi huyết /NK/subtilisin trong B subtilis WB600 [57]

Việc sản xuất NK thương mại đòi hỏi tối ưu hóa các điều kiện lên men để tối

đa hóa sản lượng NK được tạo ra bởi B subtilis (natto), bao gồm nhiệt độ, pH, và

thời gian lên men tối ưu [3,5] và đặc biệt là môi trường lên men Một loạt các chất dinh dưỡng, như là glycerol, cao nấm men, peptone đậu nành, hoặc bột vỏ tôm đã được đánh giá cho khả năng nâng cao sản lượng NK [24,53] Chiến lược bổ sung cơ chất thích hợp được sử dụng trong các phương pháp lên men mẻ có bổ sung cơ chất (fed-batch fermentation) đã nâng cao đáng kể việc sản xuất NK, liên quan đến sản lượng đạt được bởi lên men mẻ[10] Việc tăng sản lượng của NK đã được báo cáo bởi một số tác giả khi sử dụng nguồn carbon (C) là các loại đường khác nhau như maltose [6], mannitol [16], glucose [46] và fructose [50] Tương tự, muối ammonium sulphate và sodium nitrate cũng đã được xem là nguồn nitơ (N) kích thích sản xuất NK ở vi sinh vật [6] Ngoài ra, peptone (1%) và cao nấm men (1-2%) cũng là các nguồn N tuyệt vời [16,50] Việc bổ sung các hợp chất amino nhất định nào đó đã được chứng minh là có hiệu quả cao trong sản xuất NK ngoại bào bởi

chủng Bacillus lichniformis B4 phân lập tại địa phương [16] Tuy nhiên, aspartate

dường như có tác dụng ức chế đến sự sản xuất của cả protease và protease tiêu sợi huyết [50] Việc sản xuất NK ở các mức thấp cũng đã được báo cáo với việc sử dụng các nguồn N vô cơ trong môi trường lên men [6] Các ion kim loại hóa trị II như Ca, Co, Cu, B, Fe, Mg, Mn và Mo được đòi hỏi trong môi trường lên men để

sản xuất tối ưu NK Tuy nhiên, nhu cầu các ion kim loại cụ thể phụ thuộc vào nguồn enzyme Việc sử dụng MgSO4, AgNO3, CaCl2, MnCl2 ở nồng độ 0,1-0,5 mM hoặc NaN3 ở nồng độ 0,1-0,5 mM đã dẫn đến sự gia tăng trong hoạt động NK của

Bacillus subtilis[22] Khoảng pH 5-8 và nhiệt độ 30-40°C đã được báo cáo là tối ưu cho việc sản xuất NK bởi Bacillus subtilis[51] Đồng thời, Bacillus subtilis A26 cho

sản lượng enzyme tối đa tại tốc độ khuấy trộn là 200 vòng/phút

Mặc dù phương pháp tối ưu hóa một lúc một biến (a variable-at-a time method) truyền thống là đơn giản và dễ dàng thực hiện, tuy nhiên phương pháp này thường không xác định được vùng đáp ứng tối ưu bởi hiệu ứng toàn diện của các biến không được xem xét [26], vì vậy cần sử dụng phương pháp thống kê mô hình kiểu tâm phức (CCD) để tối ưu hóa môi trường lên men sản xuất NK và cuối cùng

đã làm tăng hoạt lực của NK lên đến 1.300 ± 60 FU/ml, cao hơn so với hoạt lực ban đầu khoảng 6,5 lần [18] Các nguồn N và C thích hợp được chọn lọc làm cơ sở cho việc sàng lọc các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính NK bằng thiết kế thí nghiệm Plackett-Burman Trong các yếu tố khảo sát, pepton đậu nành, MgSO4 và NaCl là

ba yếu tố tác động nhiều nhất (p<0,05) Kết quả nhận được môi trường thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp NK gồm: 10 g/l pepton đậu nành, 0,88 g/l MgSO4, 5 g/l NaCl Thời gian lên men sau 16 giờ cho hoạt tính NK cao nhất 152 FU/ml cao hơn trước khi tối ưu 1,8 lần (83 FU/ml) chiếm 45%

Tuy vậy, không có một môi trường và điều kiện lên men nhất định nào là tối

ưu cho quá trình sinh tổng hợp NK của tất cả các chủng vi sinh vật bởi mỗi chủng vi sinh vật có các điều kiện đặc trưng cho sản xuất tối đa enzyme

1.3 Đại cương về Bacillus subtilis

1.3.1 Đặc điểm tế bào

B subtilis có hình que, một dạng tiêu biểu của nhóm vi khuẩn Gram dương [59]

Đó là mô ̣t trực khuẩn nhỏ, hai đầu tròn, kích thước 0,5-0,8 µm x 1,5-3 µm, đứng đơn

lẻ hay tạo thành chuỗi ngắn

B subtilislà một vi sinh vậtmô hình đểnghiên cứu sựhìnhthành nội bào tử (endospore) trong vi khuẩn.Các điều kiện không thuận lợi như sự suy giảm nguồn

carbon,nitơ, … chính là nguyên nhân dẫn tới quá trình hình thành bào tử [61]

Hình 1.3.Hình dạng bào tử B subtilis dưới kính hiển vi

Cấu trúc đặc biệt của nội bào tử quyết định phần lớn tới khả năng tồn tại của nó trước điều kiện môi trường bất lợi Đó là c ấu trúc lõi chứa DNA nhiễm sắc thể được bọc trong chất nhiễm sắc ở trạng thái bị nén chặt và bất hoạt, bảo vệ bào tử khỏi tia UV và ảnh hưởng từ nhiệt Các lớp vỏ xung quanh lõi tính từ trong ra

ngoài cùng bao gồm lớp vỏ lõi bao quanh phần lõi hoặc lớp nguyên sinh chất, lớp cortex chứa peptidoglycan, tiếp đến là các lớp áo bào tử chứa các loại protein khác nhau Cấu trúc lõi bào tử cũng chứa các thành phần thông thường như ribosome và nhiều loại enzyme khác nhau nhưng không hoạt động trao đổi chất [61]

Trình tự bộ gen của vi khuẩn B subtilis đã được giải mã thành công và được công bố vào tháng 11 năm 1997 [60] Tế bào vi khuẩn B subtilis chỉ có một phân

tử DNA nằm trong một nhiễm sắc thể dạng tròn.Kích thước DNA tổng thể của vi

khuẩn này là4.214.814 bp (TIGRCMR) Phần lớn bộ gen B subtilis liên quan đến

các quá trình tổng hợp nguồn carbon [34] Khoảng 87% bộ gen (bao gồm 4.100 gen) mã hóa cho protein 192 gen trong số này được coi là không thể thiếu và 79

gen được coi là cần thiết cho các quá trình sống của B subtilis Hơn 74% khung

đọc mở và 94% gen ribosome được phiên mã cùng hướng và được sao chép Chỉ có 53% số gen là gen đơn bản, trong khi 25% thuộc họ đa gen có 2-77 bản sao của gen trong tế bào [34] Khoảng 220 yếu tố điều hòa phiên mã đã được xác định trong hệ gen Cho đến nay, chỉ khoảng 58% số gen đã được biết chức năng, 42% số gen còn lại vẫn chưa biết rõ được chức năng và đang được nghiên cứu [60]

Vi khuẩnB subtiliscókhảnăngtiết một lượng lớn các loại enzyme ngoại bào do

tế bào của chúng chứa những tín hiệu mã hóa cho các peptidase điều khiển chức

năng tiết này.Nhiều gen trong tế bàovi khuẩn B.subtilis chịu trách nhiệmtổng

tổ hợp donhóm nghiên cứu phối hợp thực hiện đề tài (GS Nguyễn Hoàng Lộc và cs.) tại Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế Sự biểu hiện của enzyme NK được

kiểm soát bới cơ chế kích hoạt phiên mã tại Operon lac

1.3.2 Chất cảm ứng IPTG

Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) là một chất cảm ứng sinh

học phân tử được sử dụng thường xuyên trong lĩnh vực biểu hiện protein IPTG có chức năng kích hoạt phiên mã tại opera lac khi gen bị kiểm soát bới operator Khi chất IPTG c ảm ứng promoter lac của operon lac, IPTG sẽ liên kết với các chất ức

chế quá trình phiên mã tại operator khiến chúng không còn khả năng ức chế phiên

mã như ban đầu, dẫn đến quá trình phiên mã sẽ diễn ra bình thường và sản sinh ra

NK Ở nồng độ cao, IPTG có thể thâm nhập trực tiếp vào tế vào dưới sự liên kết với lactose và ngay lập tức kích thích sự biểu hiện của protein NK nên IPTG là chất cảm ứng được sử dụng rộng rãi trong việc biểu hiện protein bao gồm cả Nattokinase [57]

1.4 Ảnh hưởng của các tác nhân vật lý và hóa học khi lên men sản xuất NK

1.4.1 Ảnh hưởng của các tác nhân vật lý

1.4.1.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH

Nhiệt độ phản ứng và pH của môi trường là các thông số quan trọng của quá trình sinh học mà thường được mong muốn giữ cả hai biến này ổn định và ở các giá trị tối ưu của chúng trong suốt quá trình lên men Ảnh hưởng của nhiệt độ và độ

pH đến một quá trình sinh học có thể rất khác nhau, và bởi vì quá trình sinh trưởng

và phát triển là kết quả của nhiều quá trình enzyme, ảnh hưởng của cả hai thông số nuôi cấy đến toàn bộ phản ứng sinh học là khá phức tạp [11]

Ảnh hưởng của nhiệt độ lên tốc độ sinh trưởng tối đa của một vi sinh vật là tương tự với những gì quan sát được ở hoạt tính của một enzyme Tốc độ sinh trưởng tăng dần tăng đến nhiệt độ tối ưu nhưng nếu tiếp tục tăng nhiệt độ thì tốc độ tăng trưởng giảm nhanh chóng [32] Cơ chế kiểm soát nhiệt độ trong sản xuất enzyme không được hiểu rõ [13], tuy nhiên các nghiên cứu của Frankena et al (1986) cho thấy có một mối liên kết được tồn tại giữa sinh tổng hợp enzyme và

chuyển hóa năng lượng của vi khuẩn thuộc chi Bacillus mà được kiểm soát bởi

nhiệt độ và sự hấp thụ oxy

pH của môi trường nuôi cấy ảnh hưởng mạnh đến nhiều quá trình enzyme

và sự vận chuyển một số chất qua màng tế bào Sự thay đổi độ pH làm thay đổi cân bằng acid-base và các dòng của các chất dinh dưỡng khác nhau, chất gây cảm ứng

và các yếu tố tăng trưởng giữa pha vô sinh và hữu sinh [28] Ảnh hưởng của pH đến hoạt động của tế bào được xác định bởi mức độ nhạy cảm của các enzyme riêng lẻ đối với sự thay đổi pH Enzyme thường hoạt động chỉ trong một khoảng pH nhất định và vì thế hoạt động enzyme tổng số của tế bào chịu ảnh hưởng lớn bởi pH môi trường Các tế bào vi sinh có khả năng đáng kể trong duy trì độ pH nội bào ở mức không đổi ngay cả với sự biến đổi lớn về pH của môi trường ngoại bào[32] Độ pH

trong tế bào chất của các loài thuộc chi Bacillus ưa kiềm (ví dụ: B.firmus) là 8,2-8,5, trong khi đối với các loài thuộc chi Bacillus ưa trung tính (ví dụ: B.subtilis, B.licheniformis), giá trị này là 7,5 [11]

1.4.1.2 Sục khí và khuấy trộn

Trong quá trình lên men, tốc độ sục khí gián tiếp cho biết mức oxy hoà tan trong dịch lên men Nồng độ oxy hoà tan khác nhau có thể đạt được bằng cách: (i)

thay đổi về tốc độ sục khí; (ii) các thay đổi về tốc độ khuấy của hệ lên men; hoặc (iii) sử dụng pha khí giàu hoặc thiếu oxy (các hỗn hợp không khí-oxy hoặc không khí-nitơ thích hợp) làm nguồn oxy [28]

Sự thay đổi tốc độ khuấy ảnh hưởng đến mức độ pha trộn trong các bình tam giác được lắc hoặc hệ lên men và cũng sẽ ảnh hưởng đến sự sẵn có của chất dinh dưỡng Sản lượng tối ưu của protease kiềm được tạo ra ở tốc độ khuấy 200

vòng/phút cho B subtilis ATCC 14416 và B Licheniformis [38] Tuy nhiên, hạ thấp

tốc độ sục khí đã làm giảm đáng kể sản lượng protease [28] Điều này cho thấy việc giảm cung cấp oxy là một yếu tố giới hạn quan trọng cho sự sinh trưởng và phát triển cũng như sự tổng hợp protease

Sự truyền oxy cho thấy những ảnh hưởng khác nhau đối với sự hình thành sản phẩm trong quá trình lên men hiếu khí thông qua việc ảnh hưởng đến các con đường trao đổi chất và việc thay đổi các dòng trao đổi chất Theo điều kiện tăng trưởng tế bào và phân tích con đường trao đổi chất, một số quá trình sinh học đòi hỏi tốc độ truyền oxy cao, trong khi các quá trình khác đòi hỏi điều kiện mà tốc độ truyền oxy được kiểm soát [12]

1.4.1.3 Ảnh hưởng của tỉ lệ tiếp giống và thời gian nuôi cấy

Sản xuất enzyme cũng chịu ảnh hưởng bởi mật độ giống ban đầu được cấy vào Tỉ lệ tiếp giống cần tối ưu để sản xuất protease Sự tăng sản xuất protease bằng cách sử dụng các tỉ lệ tiếp giống nhỏ đã được khuyến khích do tỷ lệ diện tích bề mặt

và thể tích cao hơn dẫn đến tăng sinh tổng hợp protease Nếu tỉ lệ tiếp giống quá nhỏ, số lượng vi khuẩn không đủ sẽ dẫn đến giảm lượng protease được tiết ra Điều này có thể được giải thích vì hạn chế trong các thành phần khác của môi trường lên

men và hàm lượng oxy hòa tan bị giảm [36]

Thời gian lên men cũng ảnh hưởng đến việc sản xuất protease Thông thường protease có thể tự phân hủy trong tự nhiên Vì vậy, năng suất protease có thể tăng lên theo thời gian ủ thích hợp Điều này cũng có thể được giải thích vì hạn chế trong các thành phần khác của môi trường

1.4.2 Ảnh hưởng của các tác nhân hóa học

Nồng độ của các thành phần môi trường thực sự quan trọng vì chúng là các

công cụ để thiết kế môi trường lên men [11] Môi trường nuôi cấy cung cấp cho vi sinh vật tất cả các yếu tố cần thiết cho sự phát triển của chúng Một số vi sinh vật có khả năng tổng hợp tất cả các thành phần tế bào của chúng từ các nguồn C và N Tuy nhiên, hầu hết các vi sinh vật đều cần một số nguồn dinh dưỡng vi lượng (như axit amin, các nguyên tố vi lượng, vitamin ) Các điều kiện nuôi cấy thúc đẩy sản xuất các enzyme như proteases có sự khác biệt đáng kể so với điều kiện nuôi cấy tăng sinh tế bào [28] Hầu hết các enzyme vi sinh vật được sản xuất là kết quả của sự đáp ứng của với các thành phần môi trường, như các chất dinh dưỡng, hormone sinh trưởng và ion Protein kiềm bao gồm 53,8% C và 15,6% N Sản xuất protease phụ thuộc rất nhiều vào sự sẵn có của cả nguồn C và N trong môi trường Việc dư thừa hoặc thiếu hụt C và N có thể kìm hãm sự tổng hợp protease của vi khuẩn [28]

Đối với thực tiễn sản xuất thương mại, việc tối ưu hóa thành phần môi trường được thực hiện để duy trì sự cân bằng giữa các thành phần khác nhau trong môi trường lên men Các nỗ lực nghiên cứu chủ yếu trung vào:

- Đánh giá hiệu quả của nguồn dinh dưỡng C và N khác nhau như là các cơ chất hiệu quả về kinh tế đến sản lượng enzyme;

- Nhu cầu của các ion kim loại hóa trị hai trong môi trường lên men;

- Tối ưu hóa các thông số về môi trường và lên men như độ pH, nhiệt độ, sự sục khí và sự khuấy

Ngoài ra, không có một môi trường nào được xem là tốt nhất cho sản xuất các serine protease từ các chủng vi khuẩn khác nhau Mỗi chủng có nhu cầu dinh dưỡng riêng cho sự tổng hợp enzyme tối đa

1.4.2.1 Ảnh hưởng của nguồn C

Glucose thường được sử dụng trong lên men sản xuất protease Một số nghiên cứu cho thấy sản xuất protease giảm do giảm dị hóa bởi glucose (Kole et al., 1988) Sản lượng protease kiềm tăng cũng được báo cáo bởi một số nghiên cứu khi

có mặt của các loại đường khác nhau như lactose [27], maltose [47], sucrose [34] và fructose [38] Tuy nhiên, một sự kìm hãm tổng hợp protease đã được quan sát thấy khi các thành phần này ở nồng độ cao Trong thực tiễn sản xuất thương mại, nồng

độ carbohydrate cao đã làm giảm hoạt động sản xuất enzyme [7]

1.4.2.2 Ảnh hưởng của nguồn N

Các nguồn N phức tạp thường được sử dụng để sản xuất protease kiềm Nhu cầu bổ sung N là khác nhau giữa các chủng vi sinh vật Mức độ thấp của sản xuất protease kiềm đã được báo cáo khi sử dụng các nguồn N vô cơ trong môi trường sản xuất [38] Sự tổng hợp enzyme được phát hiện là bị kìm hãm bởi các nguồn N có thể được đồng hóa nhanh chóng như axit amin hoặc NH4+ trong môi trường [19] Tuy nhiên, không có kìm hãm hoạt tính protease khi có mặt muối ammonium [31] Sự tăng sản xuất protease cũng được quan sát thấy khi có mặt (NH4)2SO4 và KNO3 trong môi trường lên men [40] Tương tự, NaNO3 (0,25%)

được cho là kích thích sản xuất protease kiềm [9] Sự thay thế NaNO3 trong môi trường cơ sở bằng NH4NO3 làm tăng sản xuất enzyme [34]

Ngược lại, một số báo cáo đã chứng minh việc sử dụng các nguồn N hữu cơ dẫn đến sản xuất enzyme cao hơn các nguồn N vô cơ Bã đậu nành cũng được báo cáo là nguồn N thích hợp để sản xuất protease Thêm vào đó, bằng cách sử dụng sản phẩm thủy phân bằng acid của đậu nành thay cho sữa đậu nành thông thường đã làm tăng 3 lần hoạt tính enzyme tổng số [45]

Ngoài ra, nước chiết ngô cũng được nhận thấy là một nguồn N rẻ và phù hợp [38] Ngoài việc cung cấp nguồn N, nước chiết ngô còn cung cấp một số vi chất dinh dưỡng, vitamin và các yếu tố kích thích sinh trưởng Tryptone và casein cũng

là nguồn cung cấp N tuyệt vời [34] để sản xuất protease Một số hợp chất amin đã

được chứng minh có hiệu quả trong sản xuất các enzyme ngoại bào bởi Bacillus sp

[21] Tuy nhiên, glycine dường như có tác động ức chế trên sự sản xuất protease Casamino acid cũng được nhận thấy là ức chế sản xuất protease [33]

1.4.2.3 Ảnh hưởng của ion kim loại và muối

Các ion kim loại hóa trị 2 như Ca, Co, Cu, Bo, Fe, Mg, Mn và Mo được đòi hỏi trong môi trường lên men để sản xuất tối ưu các protease kiềm Tuy nhiên, yêu cầu đối với các ion kim loại cụ thể phụ thuộc vào nguồn enzyme Kali phosphate đã được sử dụng làm nguồn phosphate trong hầu hết các nghiên cứu [20] và chịu trách nhiệm đệm môi trường Phosphate ở nồng độ 2 g/L được nhận thấy là tối ưu cho việc sản xuất protease Tuy nhiên, khi vượt quá nồng độ này, sự sinh trưởng, phát triển của tế bào bị ức chế và sự sản xuất protease bị kìm hãm [28]

1.4.3 Tình hình nghiên cứu ảnh hưởng của các tác nhân vật lý và hóa học đến sản

xuất NK

Việc sản xuất NK thương mại đòi hỏi tối ưu hóa các điều kiện lên men để

tối đa hóa sản lượng NK được tạo ra bởi B subtilis (natto), bao gồm nhiệt độ, pH,

và thời gian lên men tối ưu [3, 48] Một loạt các chất dinh dưỡng, như là glycerol, cao nấm men, peptone đậu nành, hoặc bột vỏ tôm đã được đánh giá cho khả năng nâng cao sản lượng NK [24, 54] Chiến lược bổ sung cơ chất tối thích được sử dụng trong các phương pháp lên men mẻ có bổ sung cơ chất (fed-batch fermentation) đã tăng nâng cao đáng kể việc sản xuất NK, liên quan đến sản lượng đạt được bởi lên men mẻ[10] Việc tăng sản lượng của NK đã được báo cáo bởi một số tác giả khi sử dụng nguồn C là các loại đường khác nhau như maltose [6], mannitol [16], glucose [46] và fructose [50] Tương tự, muối ammonium sulphate và sodium nitrate cũng

đã được xem là nguồn N kích thích sản xuất NK ở vi sinh vật [6] Ngoài ra, peptone (1%) và cao nấm men (1-2%) cũng là các nguồn N tuyệt vời [16, 50] Việc bổ sung các hợp chất amino nhất định nào đó đã được chứng minh là có hiệu quả cao trong

sản xuất NK ngoại bào bởi chủng Bacillus lichniformis B4 phân lập tại địa phương

[16] Tuy nhiên, aspartate dường như có tác dụng ức chế đến sự sản xuất của cả protease và protease tiêu sợi huyết [50] Việc sản xuất NK ở các mức thấp cũng đã được báo cáo với việc sử dụng các nguồn N vô cơ trong môi trường lên men [6] Các ion kim loại hóa trị II như Ca, Co, Cu, B, Fe, Mg, Mn và Mo được đòi hỏi trong môi trường lên men để sản xuất tối ưu NK Tuy nhiên, nhu cầu các ion kim loại cụ thể phụ thuộc vào nguồn enzyme Việc sử dụng MgSO4, AgNO3, CaCl2, MnCl2 ở nồng độ 0,1-0,5 mM hoặc NaN3 ở nồng độ 0,1-0,5 mM đã dẫn đến sự gia

tăng trong hoạt động NK của Bacillus subtilis[22] Khoảng pH 5-8 và nhiệt độ

30-40°C đã được báo cáo là tối ưu cho việc sản xuất NK bởi Bacillus subtilis[51] Đồng thời, Bacillus subtilis A26 cho sản lượng enzyme tối đa tại tốc độ khuấy trộn

là 200 vòng/phút

Từ trước đến nay, NK được thu nhận chủ yếu bằng lên men bán rắn chủng

Bacillus subtilis natto trên cơ chất đậu nành nấu chín hay lên men dịch thể Chủng B subtilis được nuôi cấy chìm chứa glucose 10 g/l, peptone 50 g/l và các chất khoáng;

ở điều kiện trong bình tam giác sau 12 giờ nuôi cấy, hoạt tính NK là 630 UI/ml; ở điều kiện trong nồi lên men, sau 10 giờ nuôi cấy, hoạt tính NK cao nhất là 3,400 UI/ml Tuy nhiên, ở điều kiện nuôi cấy theo mẻ có bổ sung cơ chất dinh dưỡng trong nồi lên men, sau 19 giờ nuôi cấy, hoạt tính NK là 7,100 UI/ ml, cao gấp 2,1

lần so với không bổ sung cơ chất [14] B subtilis sinh tổng hợp NK cao (459,11

FU/ml) trong môi trường lỏng chứa cao cám mì (1,5-3oBrix), cao đậu nành (1,0-2oBrix), glucose (0,6-2%), trong thời gian 24-36 giờ ở 27°C (Prafulla et al., 2010) Trong môi trường lỏng chứa peptone từ đậu nành 8,28 g/l, CaCl2 0,64 g/l và

cao nấm men 0,74 g/l, B natto NLSSE sinh tổng hợp NK đạt 1300 UI/ml [43] B subtilis LD-8 sinh tổng hợp NK cao trong môi trường lỏng chứa bột gạo 5%, bột

đậu nành 4%, NH4NO3 0,5% và CaCl2 0,01% (w/w), pH 7 và tỷ lệ giống 5%, sau 72

giờ nuôi cấy, hoạt tính NK đạt được là 4220 U/ml [53] B subtilis được nuôi cấy

trên cơ chất bã bậu nành (độ ẩm 80%), ở 37°C trong 20 giờ, hiệu suất NK cao nhất

là 0,108 g/150 g cơ chất (dạng ướt) [52] Bacillus natto được nuôi cấy trong môi

trường lỏng tối ưu: glucose 0,065%; KH2PO4 0,0016% và MgSO4 0,0016%, sau 72 giờ nuôi cấy trên máy lắc ở 37°C, hoạt tính NK đạt được 12,34 FU/ml (Sahelian et

al., 1993) B subtilis được nuôi trên môi trường lên men bán rắn chứa cơ chất bã

đậu và cám mì, dưới các điều kiện nuôi cấy tối ưu như độ ẩm ban đầu 65%, pH 8,

và nhiệt độ 35 oC, hoạt tính NK đạt được là 1577 UI/g [14]

Tuy vậy, không có một môi trường và điều kiện lên men nhất định nào là tối

ưu cho quá trình sinh tổng hợp NK của tất cả các chủng vi sinh vật bởi mỗi chủng vi sinh vật có các điều kiện đặc trưng cho sản xuất tối đa enzyme Vì vậy để nâng cao hoạt tính NK chúng tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của các tác nhân vật lý và hóa học khi lên men trong bình bioflo thể tích 5 lít chứa 3 lít môi trường

1.5 Các phương thức lên men sản xuất NK

Trong thực tế sản xuất, quá trình lên men có thể được tiến hành theo nhiều phương thức khác nhau Trước khi quá trình lên men bắt đầu, môi trường phải được pha chế và khử trùng, khi nuôi cấy khởi đầu phải có một số lượng vi sinh vật vừa đủ

ở trong một trạng thái sinh lý phù hợp để cấy truyền vào hệ lên men sản xuất Kết thúc quá trình lên men các sản phẩm phải được tinh sạch và xử lý thêm

Đối với lên men theo mẻ, vi sinh vật được cấy vào bình lên men sau khi môi

trường đã được vô trùng và đảm bảo các điều kiện thích hợp cho vi sinh vật phát triển Thông thường vi sinh vật sinh trưởng đến khi nào một thành phần chủ yếu của môi trường dinh dưỡng bị giới hạn Khi đó sự sinh trưởng của vi sinh vật chuyển từ pha luỹ thừa sang pha cân bằng Sinh trưởng gắn liền với sự thay đổi kéo dài của điều kiện nuôi, sự giảm chất dinh dưỡng và sự tăng số lượng tế bào Trong quá trình

đó trạng thái sinh lí của tế bào cũng thay đổi Thông thường việc tạo thành sản phẩm bậc 2 liên quan với một trạng thái sinh lí nhất định trong pha sinh trưởng Không thể duy trì được trạng thái này trong một thời gian dài Trong suốt thời gian lên men mẻ, sản lượng nhiệt, sự sản xuất kiềm hoặc acid, và sự tiêu thụ oxygen sẽ biến thiên từ các tốc độ rất thấp ở lúc bắt đầu tới các tốc độ rất cao trong suốt pha

log muộn Vì vậy, điều chỉnh môi trường của một hệ thống như thế khó hơn nhiều

so với quá trình liên tục mà ở trạng thái ổn định các tốc độ sản xuất và tiêu thụ là hằng số Lên men gián đoạn thực hiện theo từng mẻ nên thường có năng suất thấp

và chu kỳ sản xuất bị kéo dài Phương pháp lên men theo mẻ là dễ dàng thực hiện cũng như kiểm soát Ta cũng có thể dễ dàng kiểm soát sự ổn định về di truyền của

vi sinh vật nếu nó bị tác động bởi các chất xúc tác Ngoài ra, nguy cơ nhiễm bệnh,

vi khuẩn trong khi lên men cũng thấp hơn các phương pháp khác (vì đã hạn chế tối

đa sự tiếp xúc của dịch lên men trong bình với môi trường bên ngoài) Tuy phương pháp lên men theo mẻ có những ưu điểm nhất định, nhưng chúng vẫn có những nhược điểm không thể tránh khỏi đó là lượng chất độc tích trữ trong dịch lên men sẽ tăng dần theo thời gian lên men Do đó, số lượng vi sinh vật sẽ giảm nhanh khi chất độc đạt đến một mức nhất định, gây ra sự suy giảm về sinh khối cũng như hoạt tính kháng sinh

Đối với lên men bán liên tục, hay còn gọi là lên men theo mẻ có bổ sung môi

trường, ta bổ sung môi trường đã khử trùng sau khi đã rút một lượng dịch lên men bằng với lượng môi trường bổ sung Cụ thể, khi lên men tiến tới giai đoạn hoàn thành (hoặc gần hoàn thành) thì một lượng dịch lên men được rút ra Ngay sau đó, môi trường mới đã khử trùng được bơm ngay vào bình lên men để đảm bảo thể tích dịch lên men trong bình không thay đổi Khi lượng môi trường bình lên men trở lên nhanh bị ô nhiễm hơn, tần suất rút môi trường cũ, tiếp thêm môi trường mới bắt đầu tăng lên Bằng cách làm như vậy chỉ cần truyền giống một lần vẫn có thể thu hoạch sản phẩm nhiều lần Trên thực tế, chiến lược bổ sung cơ chất tối thích được sử dụng trong các phương pháp lên men mẻ có bổ sung cơ chất (fed-batch fermentation) đã tăng nâng cao đáng kể việc sản xuất NK, liên quan đến sản lượng đạt được bởi lên

men mẻ[10] Việc tăng sản lượng của NK đã được báo cáo bởi một số tác giả khi sử dụng nguồn C là các loại đường khác nhau như maltose [6], mannitol [16], glucose [46] và fructose [50] Tương tự, muối ammonium sulphate và sodium nitrate cũng

đã được xem là nguồn N kích thích sản xuất NK ở vi sinh vật [6] Ngoài ra, peptone (1%) và cao nấm men (1-2%) cũng là các nguồn N tuyệt vời [16,50] Việc bổ sung các hợp chất amino nhất định nào đó đã được chứng minh là có hiệu quả cao trong sản xuất NK ngoại bào bởi chủng Bacillus lichniformis B4 phân lập tại địa phương [16] Tuy nhiên, aspartate dường như có tác dụng ức chế đến sự sản xuất của cả protease và protease tiêu sợi huyết [50] Việc sản xuất NK ở các mức thấp cũng đã được báo cáo với việc sử dụng các nguồn N vô cơ trong môi trường lên men [6] Các ion kim loại hóa trị II như Ca, Co, Cu, B, Fe, Mg, Mn và Mo được đòi hỏi trong môi trường lên men để sản xuất tối ưu NK Tuy nhiên, nhu cầu các ion kim loại cụ thể phụ thuộc vào nguồn enzyme Việc sử dụng MgSO4, AgNO3, CaCl2, MnCl2 ở nồng độ 0,1-0,5 mM hoặc NaN3 ở nồng độ 0,1-0,5 mM đã dẫn đến sự gia tăng trong hoạt động NK của Bacillus subtilis [22] Khoảng pH 5-8 và nhiệt độ 30-40°C đã được báo cáo là tối ưu cho việc sản xuất NK bởi Bacillus subtilis [52] Đồng thời, Bacillus subtilis A26 cho sản lượng enzyme tối đa tại tốc độ khuấy trộn

là 200 vòng/phút

Chính vì mỗi một chế độ lên men có những ưu và nhược điểm nhất định, nên tùy từng điều kiện thí nghiệm và yêu cầu về lượng thành phẩm thu được người ta lựa chọn sử dụng chế độ lên men phù hợp Trong nghiên cứu này, chúng tôi nghiên cứu xác định thông số lên men của cả 2 chế độ lên men: theo mẻ và bán liên tục ở quy mô bình 5 lít chứa 3 lít môi trường, từ đó đánh giá được hiệu quả sản xuất NK của từng chế độ lên men

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu

2.1.1 Chủng giống

Chủng vi khuẩn Bacillus subtilisBD170 tái tổ hợp mang vector pHT43/Nat05

dòng R4 (gen mã hóa nattokinase Nat05 có mã số KU341115 được phân lập từ

chủng B subtilis Natto5) nhận từ nhóm nghiên cứu phối hợp thực hiện đề tài (GS

Nguyễn Hoàng Lộc và cs.) tại Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế

Hình 2.1 Nuôi cấy chủng vi khuẩn Bacillus subtilisBD170 tái tổ hợp

2.1.2 Môi trường

1) Luria-Bertani (LB) (g/l): Cao nấm men 5; Tryptone 10; NaCl 5; pH 7,0

2) MT1 (g/l): Bột đậu nành 5; MgSO4 1; Cao nấm men 10; K2HPO4 2; Maltose

20; Glucose 2; pH 7,0

3) MT2 (g/l): Maltose 30; Đậu nành 20; MgSO4 0,2; CaCl2 0,5; pH 7,0 (hạt đậu nành được ngâm với nước 6 giờ cho mềm và xay nhuyễn thành sữa để làm môi trường)

4) MT3 (g/l): Glucose 10; Pepton 50; CaCl2; MgSO4 0,5; pH 7,0

5) MT4 (g/l): Glucose 10; K2HPO4 1,6; (NH4)2SO4 10; MgSO4 1,6; pH 7,0 6) MT5 (g/l): Cao nấm men 60; Glycerol 60; Peptone đậu nành 12; pH 7,0

7) MT6 (g/l): Đậu nành10; Glucose 10; K2HPO4 1; MgSO4 0,5; pH 7,2

8) MT7 (g/l): Xylose 15; Peptone đậu nành 20; K2HPO4 1; MgSO4 0,5; CaCl2

0,2; KH2PO4 1; pH 7,0

9) MT8 (g/l): Xylose 20; Peptone đậu nành 30; pH 7,0

10) MT9 (g/l): Glucose 10; Peptone 50; MgSO4 2; CaCl2 5; pH 7,0

11) MT10 (g/l): Glucose 10; CaCl2 0,1; MgSO4 1; Na2HPO4 4; NaH2PO4 1; pH 7,0

Hình 2.2 Môi trường lên men

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Chuẩn bị giống vi khuẩn B subtilis tái tổ hợp

Chủng vi khuẩn B subtilis BD170 tái tổ hợp được bảo quản trong các ống

eppendorf chứa glycerin 30% cất giữ tại điều kiện nhiệt độ -86oC Ngay trước khi

sử dụng, giống được hoạt hóa bằng cách nuôi cấy trên môi trường LB lỏng (1% tryptone; 0,5% dịch chiết nấm men và 1% NaCl) qua đêm ở 37oC với tốc độ lắc 220 vòng/phút

2.2.2 Phương pháp lên men

Phân phối 3% thể tích dịch giống được chuẩn bị như trên vào bình tam giác

dung tích 500 ml có chứa 150 ml môi trường Vì chủng B subtilis BD170là chủng

tái tổ hợp, nên khi lên men có bổ sung isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) nồng độ 1 mM, nhằm kích thích sinh tổng hợp NK của chủng Nuôi trên máy lắc ở 200 vòng/phút tại nhiệt độ 30oC và thời gian lên men 48 giờ Dịch lên men chứa enzyme được thu nhận bằng cách ly tâm tách tế bào ở 10.000 vòng/phút, nhiệt độ 4oC trong 10 phút

2.2.3 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme

2.2.3.1 Phương pháp xác định hoạt độ protease

Hoạt độ protease tổng số được xác định theo phương pháp Anson cải tiến:

Dịch nuôi cấy của B subtilis BD170 tái tổ hợp mang gen NK được thu nhận

và kiểm tra hoạt tính protease tổng số bằng phương pháp quang phổ ở bước sóng

660 nm 100 µl dịch nuôi cấy được ủ với 500 µl dung dịch casein 0,65% trong đệm 50 mM Potassium Phosphate, pH 7,5 Phản ứng được tiến hành trong 10 phút ở

37oC Sau đó, phản ứng được kết thúc bằng cách bổ sung 500 µl dung dịch 110 mM trichloroacetic acid (TCA) Hỗn hợp phản ứng được loại bỏ kết tủa bằng ly tâm vơi

tốc độ 15.000 vòng/phút, 4oC 500 µl dịch nổi được ủ với 1,25 ml dung dịch

Na2CO3 và 250 µl dung dịch Folin & Ciocalteu’s Phenol 1N Sản phẩm của quá trình thủy phân casein được xác định bằng quang phổ ở bước sóng 660 nm Hoạt độ protease được xác định dựa vào đường chuẩn sử dụng cơ chất tyrosine Một đơn vị hoạt độ protease được xác định là lượng enzyme cần thiết để thủy phân tạo thành 1µmol tyrosine trong một phút ở điều kiện phản ứng

2.2.3.2 Phương pháp định tính NK

NK được định tính dựa vào khả năng hòa tan huyết khối lợn (phương pháp này có thể cho thấy kết quả trực tiếp về khả năng làm tan cục huyết khối) Cho 1 ml dịch chiết enzyme (ở các độ pha loãng 2 lần) vào 5 g huyết lợn đông, ủ 37oC trong 4 giờ Cân trọng lượng cục huyết đông còn lại sau khi ủ và tính lượng huyết khối tan theo phần trăm so với lượng huyết khối ban đầu So sánh khả năng hòa tan cục huyết khối của các mẫu lên men [4]

2.2.3.3 Phương pháp xác định hoạt tính NK

a) Nguyên tắc:

NK hoạt động trên fibrin, vì vậy hoạt tính NK được xác định bởi sự tăng về lượng của các sản phẩm có trọng lượng phân tử thấp, tan trong acid được tạo ra trong quá trình phân hủy fibrin Sự tăng này được xác định bằng cách đo độ hấp thụ

ở tia cực tím (275 nm) [42]

b) Chuẩn bị dung dịch Fibrinogen:

72 mg fibrinogen được hòa tan trong 10 ml borax buffer (pH 8,5, 150 mM NaCl) để chuẩn bị một dung dịch fibrinogen 0,72% (w/v)

c) Chuẩn bị một dung dịch Thrombin:

Thrombin được hòa tan trong borax buffer (50mM) đến một nồng độ 1.000 U/ml Khi dung dịch này được sử dụng, cần pha loãng 50 lần với borax buffer để có nồng độ 20 U/ml

d) Xác định hoạt tính NK [41]

Chuyển 1,4 ml borax bufer (50mM) và 0,4ml dung dịch fibrinogen vào trong một ống nghiệm và được làm ấm trong bể ổn nhiệt (37oC) trong 5 phút Sau đó thêm 0,1 ml dung dịch thrombin vào, hỗn hợp được khuấy đều và để đứng yên trong bể ổn nhiệt (37oC) trong 10 phút Tiếp đến, thêm 0,l ml dung dịch mẫu vào hỗn hợp, hỗn hợp được khuấy đều trong 5 giây và để đứng yên trong bể ổn nhiệt Sau đó hỗn hợp lại được khuấy đều trong 5 giây tại thời điểm 20 phút và 40 phút sau khi thêm dung dịch mẫu Tại thời điểm 60 phút sau khi thêm dung dịch mẫu, 2

ml dung dịch 0,2 M trichloroacetate (TCA) được thêm vào Hỗn hợp được khuấy đều và giữ đứng yên thêm 20 phút nữa Hỗn hợp phản ứng được ly tâm ở 13.000 vòng/phút trong 5 phút và độ hấp thụ (Ar) của dịch nổi (supernatant) được đo tại bước sóng 275 nm

Đối chứng (control) 1,4 ml borax bufer (50mM) và 0,4 ml dung dịch fibrinogen được chuyển vào trong một ống nghiệm và được làm ấm trong bể ổn nhiệt (37oC) trong 5 phút Sau đó thêm 0,1ml dung dịch thrombin vào, hỗn hợp được khuấy đều và được để đứng yên trong bể ổn nhiệt (37oC) trong 10 phút Tiếp đến, 2 ml dung dịch 0,2M trichloroacetate được thêm vào và khuấy đều Đến lượt 0,1 ml dung dịch mẫu được thêm vào hỗn hợp, khuấy đều và để đứng yên trong 20 phút Hỗn hợp phản ứng được ly tâm ở 13.000 vòng/phút trong 5 phút và độ hấp thụ

(Ac) của dịch nổi được đo tại bước sóng 275 nm

Với định nghĩa một đơn vị hoạt độ enzyme là lượng enzyme được cần thiết

để làm tăng độ hấp thụ lên 1,0 trong 60 phút, hoạt lực NK được xác định theo công thức sau:

A (FU/ml)= [(Ar-Ac)/(0,01×60×0,1)] x D

Trong đó: D là tỉ lệ pha loãng

2.2.4 Nghiên cứu tối ưu hóa môi trường và điều kiện lên men cho sinh tổng hợp

NK

2.2.4.1 Lựa chọn môi trường lên men cơ sở

Chủng B.subtilisBD170 tái tổ hợp được lên men trong các môi trường LB,

MT1, MT2, , MT10, ở nhiệt độ 30oC trong 48 giờ Xác định hoạt tính protease và

NK của dịch lên men Lựa chọn môi trường lên men cơ sở cho hoạt tính protease và

NK (khả năng hòa tan huyết khối) cao nhất cho các thí nghiệm tối ưu hóa tiếp theo

2.2.4.2 Lựa chọn nguồn C

Chủng B.subtilisBD170 tái tổ hợp được lên men trong môi trường cơ sở,

thay thế nguồn C hiện có bằng một lượng C tương đương các nguồn C sau: (i) Tinh bột tan, (ii) Glucose, (iii) Maltose, (iv) Xylose; (v) Saccharose, (vi) Fructose, và (vii) Dextrin ở nhiệt độ 30oC Sau 48 giờ, xác định khả năng làm tan khối huyết của dịch lên men

2.2.4.3 Lựa chọn nguồn N

Chủng B.subtilisBD170 tái tổ hợp được lên men trong môi trường cơ sở,

thay thế nguồn N hiện có bằng bằng một lượng N tương đương các nguồn N sau: (i)

Đậu nành, (ii) pepton, (iii) Cao nấm men, (iv) Tryptone, (v) Casein, (vi) (NH4)2SO4,

và (vii) NaNO3 ở nhiệt độ 30oC Sau 48 giờ, xác định khả năng làm tan khối huyết của dịch lên men

2.2.4.4 Lựa chọn nguồn muối khoáng

Chủng B.subtilisBD170 tái tổ hợp được lên men trong môi trường cơ sở có

bổ sung đơn lẻ các loại muối khoáng: (i) NaCl, (ii) CaCl2, (iii) MgSO4, và (iv)

K2HPO4 với các nồng độ khác nhau, ở nhiệt độ 30oC Sau 48 giờ, xác định khả năng làm tan khối huyết của dịch lên men

2.2.4.5 Lựa chọn chất cảm ứng

Chủng B.subtilisBD170 tái tổ hợp được lên men trong môi trường cơ sở có

bổ sung các nguồn C và N thích hợp và chất cảm ứng (tiền chất) là isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) hoặc methanol với các nồng độ khác nhau, ở nhiệt độ 30oC Sau 48 giờ, xác định khả năng làm tan khối huyết của dịch lên men

2.2.4.6 Tối ưu hoá thành phần môi trường lên men theo phương pháp bề mặt đáp ứng

(Design Expert Version 7.1)

Phương pháp tối ưu hóa bề mặt đáp ứng (Response Surface Methodology - RSM) sử dụng kỹ thuật mô hình thống kê thực nghiệm để phân tích hồi quy đa điểm Tập hợp dữ liệu định lượng nhận được từ thiết kế yếu tố nhằm giải đồng thời các phương trình đa biến Các thành phần môi trường đã lựa chọn có ảnh hưởng đến sinh tổng hợp NK được tối ưu hóa sử dụng thiết kế phức hợp tại tâm điểm Theo thiết kế này, 4 biến được chọn trong thí nghiệm là A (maltose), B (đậu nành), C (MgSO4) và D (CaCl2) được sử dụng để nghiên cứu ảnh hưởng tương tác lẫn nhau

đến sản xuất NK của chủng B subtillis tái tổ hợp Hàm mục tiêu là hoạt tính NK có

trong dịch lên men Mô hình đã đưa ra 30 thí nghiệm với 24 điểm thí nghiệm không thuộc tâm và 6 thí nghiệm lặp lại tại tâm với mức α =1,125 Các yếu tố kiểm tra được mã hóa theo phương trình sau đây:

X 0 là các giá trị tự nhiên của các biến độc lập thứ i tại điểm trung tâm;

δX i là giá trị bước thay đổi (bước nhảy)

Phương trình tối ưu các thành phần môi trường được đưa ra dựa trên cơ sở của phương trình bậc hai sau:

βij là hệ số tương tác qua lại

Dữ liệu được phân tích bởi phần mềm thống kê Design Expert (DX7 version 7.1, Stat-Dee, Minneapolis, Minnesota USA) Chất lượng phù hợp của mô hình được đánh giá bằng R2 và Phân tích phương sai (ANOVA) Kiểm tra thống kê của

mô hình được thực hiện bằng cách kiểm tra thống kê Fisher

Các thí nghiệm được tiến hành trong bình tam giác 200 ml có chứa 50 ml môi trường Mỗi thí nghiệm lặp lại ba lần

2.2.4.7 Lựa chọn pH của môi trường lên men

Chủng B.subtilisBD170 tái tổ hợp được lên men trong môi trường cơ sở chứa

các nguồn C và N thích hợp, điều chỉnh pH của môi trường từ 6,0- 8,0,ở 30oC, sau

48 giờ, xác định khả năng làm tan khối huyết của dịch lên men

2.2.4.8 Lựa chọn nhiệt độ lên men

Chủng B.subtilisBD170 tái tổ hợp được lên men trong môi trường cơ sở chứa

các nguồn C, N và pH thích hợp, ở các nhiệt độ 25, 30, 35, và 37oC Sau 48 giờ, xác định khả năng làm tan khối huyết của dịch lên men

2.2.4.9 Nhu cầu oxy của chủng giống

Nhu cầu oxy của chủng khi lên men trong bình tam giác theo tỷ lệ thể tích

dịch lên men và thể tích bình được xác định như sau: chủng B.subtilis BD170 tái tổ

hợp được nhân giống cấp 1 trong 24 giờ Sau đó được tiếp giống vào các bình tam giác với các thể tích dịch tương ứng Vdịch nuôi/Vbình là: 10, 15, 20, 25 và 30% Sau 48 giờ lên men ở nhiệt độ và pH thích hợp, tốc độ lắc 200 vòng/phút, xác định khả năng làm tan khối huyết

2.2.4.10 Lựa chọn tuổi giống và lượng giống

Tuổi giống tính theo thời gian nhân giống: 18, 24, 30, 36 giờ Lượng giống được tiếp vào môi trường theo tỷ lệ 1, 3, 5, 7 và 9% so với lượng dịch môi trường lên men Sau 48 giờ nuôi trong môi trường thích hợp ở nhiệt độ và pH thích hợp,

tốc độ lắc 200 vòng/phút, xác định khả năng làm tan khối huyết của dịch lên men

2.2.5 Phương pháp xác định ảnh hưởng của các tác nhân vật lý và hóa học khi lên

men nhằm nâng cao hoạt tính NK

Trên cơ sở các điều kiện lên men thích hợp và thành phần môi trường đã được

xác định, nghiên cứu nâng cao hoạt tính NK của chủng vi khuẩn B subtilis BD170

tái tổ hợp bằng các tác nhân vật lý (khuấy, nhiệt độ) và hóa học (IPTG- isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside) và thay đổi nguồn C Maltose bằng Lactose, trên thiết

bị Bioflo 110 có dung tích 5 lít, chứa 3 lít môi trường lên men MT2 cải tiến, nuôi ở

35oC, khuấy 200 vòng/phút, sục khí 1vvp pH 7,0 và tỷ lệ tiếp giống 5% Mẫu được lấy sau khi kết thúc quá trình lên men (48 giờ) và xác định hoạt tính

Hình 2.3 Lên men N trên thiết bị Bioflo 110 có dung tích 5 lít (3L môi trường)

2.2.6 Phương pháp xác định ảnh hưởng của các chế độ lên men

Lên men theo mẻ: Trên cơ sở các điều kiện lên men thích hợp và thành phần

môi trường lên men đã xác định được, nghiên cứu ảnh hưởng của chế độ lên men theo mẻ đến sinh tổng hợp NK của chủng vi khuẩn B subtilis BD170 tái tổ hợp trên