Biến đổi của gen MT CO1 ty thể ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --- LÊ THỊ QUỲNH THƠ BIẾN ĐỔI CỦA GEN MT-CO1 TY THỂ Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm L

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

LÊ THỊ QUỲNH THƠ

BIẾN ĐỔI CỦA GEN MT-CO1 TY THỂ

Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2017

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

LÊ THỊ QUỲNH THƠ

BIẾN ĐỔI CỦA GEN MT-CO1 TY THỂ

Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS.TS Trịnh Hồng Thái

XÁC NHẬN HỌC VIÊN ĐÃ CHỈNH SỬA THEO GÓP Ý CỦA HỘI ĐỒNG

Giáo viên hướng dẫn Chủ tịch hội đồng chấm luận văn

thạc sĩ khoa học

PGS.TS Trịnh Hồng Thái PGS.TS Nguyễn Quang Huy

Hà Nội - 2017

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên tôi xin chân thành bày tỏ lòng cảm ơn và kính trọng sâu sắc đối với PGS.TS Trịnh Hồng Thái người thầy đã quan tâm, chỉ bảo tận tình, hướng dẫn tôi trong suốt quá trình thực hiên luận văn này

Tôi cũng xin trân trọng cảm ơn ThS Phạm Thị Bích và các thầy cô giáo Khoa Sinh học Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, đặc biệt là các thầy cô giáo trong Bộ môn Sinh lý thực vật và Hóa sinh đã tận tình giảng dạy, dìu dắt tôi trong suốt thời gian học tập tại trường

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các anh chị đã tận tình giúp đỡ và chỉ bảo tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn tại Phòng Proteomics và Sinh học Cấu trúc thuộc Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghê Enzyme và Protein, các bạn học viên cao học và các em sinh viên làm việc tại phòng, đã giúp

đỡ, chia sẻ những khó khăn trong suốt quá trình tôi học tập và thực hiện đề tài này

Con xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Bố, Mẹ, người đã vất vả nuôi con khôn lớn và dạy con những bài học làm người đầu tiên Em cảm ơn anh và chị, những người thân luôn dành tình cảm và những lời động viên em

Cuối cùng tôi xin chân thành cảm ơn những người bạn của tôi, những người luôn ủng hộ giúp đỡ tôi

Hà Nội, ngày tháng năm

Học viên cao học

Lê Thị Quỳnh Thơ

BẢNG KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

ADN Acid deoxyribonucleic

ADP Adenosine diphosphate

ATP Adenosine triphosphate

ARN Acid ribonucleic (ARN)

bp Base pair (cặp bazơ)

BLAST Basic local alignment rearch tool

EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid

HPLC Highperformance liquid chromatography (Sắc kí lỏng hiệu năng cao)

Chromatography) liquichchchrochromatography)chromatography)chromatography)

NCBI National Center for Biotechnology Information

MT-CO1 Cytochrome c oxidase subunit 1

MT-CO2 Cytochrome c oxidase subunit 2

MtDNA Mitochondria DNA (ADN ty thể)

PCR Polymerase chain reaction (phản ứng chuỗi trùng hợp)

RFLP Restriction fragment length polymorphism (đa hình độ dài đoạn cắt

giới hạn) ROS Reactive oxygen species (Các loại oxy phản ứng)

rARN ribosome RNA (ARN ribosome)

tARN transfer RNA (ARN vận chuyển)

UTĐTT Ung thƣ đại trực tràng

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về bệnh ung thư đại trực tràng 2

1.1.1 Tình trạng ung thư đại trực tràng ở trên thế giới và Việt Nam 2

1.1.2 Ung thư đại trực tràng 3

1.1.3 Các yếu tố nguy cơ ung thư đại trực tràng 4

1.1.4 Triệu trứng của bệnh 4

1.1.5 Phân loại ung thư đại trực tràng theo mô học 5

1.1.6 Các chỉ thị sinh học của ung thư đại trực tràng 7

1.2 Tổng quan về ty thể ở người 8

1.2.1 Ty thể 8

1.2.2 Hệ gen ty thể 10

1.2.3 Biến đổi ADN ty thể và ung thư đại trực tràng 12

1.3 Phức hệ cytochrome c oxidase và gen MT-CO1 14

1.3.1 Phức hệ cytochrome c oxidase của chuỗi hô hấp trong ty thể 14

1.3.2 Gen MT-CO1 và protein của nó trong ty thể 14

1.3.3 Biến đổi trên gen MT-CO1 với các bệnh ung thư 15

1.3.4 Các phương pháp phát hiện biến đổi mtDNA 18

1.4 Tình hình nghiên cứu biến đổi gen ty thể và gen MT-CO1ở Việt Nam 20

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.1 Đối tượng 22

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 22

2.1.2 Các hóa chất sử dụng 22

2.1.3 Thiết bị sử dụng trong nghiên cứu 23

2.2 Phương pháp nghiên cứu 23

2.2.1 Khuếch đại đoạn gen MT-CO1 ty thể bằng phương pháp PCR 24

2.2.2 Tinh sạch sản phẩm PCR 26

2.2.3 Giải trình tự trực tiếp 26

2.2.4 Phân tích PCR-RFLP 26

2.2.5 Điện di sản phẩm PCR và sản phẩm cắt bằng enzyme giới hạn 28

2.2.6 Xác định mức độ dị tế bào chất bằng phần mềm phân tích hình ảnh ImageJ 30

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31

3.1 Kết quả sàng lọc biến đổi gen MT-CO1 bằng giải trình tự trực tiếp 31

3.1.1 Kết quả PCR từ cặp mồi 5851F-7595R 31

3.1.2 Các biến đổi trên gen MT-CO1 được xác định bằng giải trình tự

trực tiếp 31

3.2 Kết quả sàng lọc biến đổi C6340T, T6253C bằng phương pháp

PCR-RFLP 35

3.2.1 Kết quả thiết kế mồi và lựa chọn enzyme cắt giới hạn 35

3.2.2 Kết quả PCR-RFLP 36

3.2.3 Kết quả định lượng mức độ đột biến bằng phần mềm ImageJ 38

3.3 Kết quả sàng lọc biến đổi C6340T trên mẫu máu của người bình thường

và một vài mẫu máu của người bệnh 40

KẾT LUẬN 44

KIẾN NGHỊ 45

TÀI LIỆU THAM KHẢO 46

PHỤLỤC

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Tỷ lệ mắc mới và tử vong của UTĐTT trong tổng số các loại ung thư 2

Hình 1.2 Hình ảnh vị trí đại tràng và trực tràng ở người 3

Hình 1.3 Cấu trúc ty thể 9

Hình 1.4 Bản đồ hệ gen ty thể ở người 11

Hình 1.5 Dạng đồng tế bào chất và dị tế bào chất ở ADN ty thể 11

Hình 1.6 Sơ đồ minh họa cơ chế vận chuyển electron qua MT-CO1 15

Hình 2.1 Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR từ cặp mồi 5851F-7595R 25

Hình 2.2 Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR với cặp mồi 6221F-6381R 25

Hình 3.1 Ảnh điện di sản phẩm PCR với cặp mồi (5851F, 7595R) 31

Hình 3.2 Một số vị trí biến đổi của gen MT-CO1 ty thể 32

Hình 3.3 Vị trí nhận biết của enzyme 35

Hình 3.4 Kết quả điện di sản phẩm PCR-RFLP của mẫu bệnh nhân ung thư

đại trực tràng tại vị trí 6340 36

Hình 3.5 Kết quả điện di thí nghiệm lần một trên gel polyacrylamid 10%

và phân tích định lượng bằng phần mềm ImageJ ở những bệnh nhân biến đổi

không hoàn toàn tại vị trí 6340 38

Hình 3.6 Kết quả điện di thí nghiệm lần 2 trên gel polyacrylamid 10%

và phân tích định lượng bằng phần mềm Image J ở những bệnh nhân biến đổi không hoàn toàn tại vị trí 6340 39

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Bảng phân loại TNM của UICC(2002) trong ung thư đại trực tràng 5

Bảng 1.2 Phân loại các giai đoạn phát triển của ung thư đại trực tràng 6

Bảng 1.3 Thống kê một số biến đổi xảy ra trên gen MT-CO1 ở các loại mô 16

Bảng 2.1 Các hóa chất chính sử dụng trong nghiên cứu 22

Bảng 2.2 Tên thiết bị sử dụng trong nghiên cứu 23

Bảng 2.3 Trình tự cặp mồi (5851F, 7595R) và (6221F, 6381R) 24

Bảng 2.4 Thành phần phản ứng PCR 25

Bảng 2.5 Trình tự nhận biết của các enzym cắt giới hạn 27

Bảng 2.6 Thành phần phản ứng cắt với enzyne BccI, TaaI 27

Bảng 2.7 Thành phần gel agarose 1% và 1.5% 28

Bảng 2.8 Các thành phần cần sử dụng cho 1 bản gel dày 0,75 mm,

kích thước 7cm 30

Bảng 3.1 Các vị trí biến đổi trên gen MT-CO1 ty thể ở 27 mẫu UTĐTT 33

Bảng 3.2 Kết quả xác định mức độ biến đổi C6340T

được phân tích bằng phần mềm ImageJ 40

MỞ ĐẦU

Ung thư đại trực tràng (UTĐTT) là một trong những loại ung thư biểu môphổ biến nhất có tỷ lệ mắc mới và tử vong caotrên toàn thế giới và Việt Nam Ung thư đại trực tràng có thể điều trị khỏi hẳn hoặc kéo dài thời gian sống của bệnh nhân nếu được phát hiện và chẩn đoán ở giai đoạn sớm

Trên thế giới, hướng nghiên cứu tìm ra các chỉ thị sinh học cho các bệnh ung thư, trong đó có UTĐTT được sự quan tâm của nhiều nhà khoa học Trong đó, nghiên cứu về các biến đổi trên ADN ty thể cũng là một hướng có nhiều triển vọng

có thể tìm ra các chỉ thị giúp hỗ trợ chẩn đoán sớm ung thư Do ADN ty thể không

có protein histone bảo vệ, cơ chế sửa chữa ADN kém hiệu quả và tồn tại trong bào quan với các phản ứng oxy hóa khử liên tục, do đó ADN ty thể chịu tác động mạnh

mẽ bởi các tác nhân gây đột biến hơn so với ADN nhân Đến nay, hơn 200 đột biến trong hệ gen ty thể người được phát hiện, gây ra các triệu trứng bệnh khác nhau, chủ yếu và tập trung vào cơ, thần kinh, khả năng chuyển hóa và bệnh ung thư

Trên thế giới, có rất nhiều các công trình nghiên cứu về đột biến ADN ty thể liên quan đến các bệnh khác nhau trong đó có các bệnh ung thư Tuy nhiên, ở Việt Nam hướng nghiên cứu này vẫn còn mới mẻ, số liệu công bố chưa nhiều Do đó,

chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Biến đổi của gen MT-CO1 ty thể ở bệnh

nhân ung thư đại trực tràng” nhằm mục tiêu:

- Đánh giá tình trạng biến đổi của gen MT-CO1 thuộc ADN ty thể ở bệnh

nhân UTĐTT

- Xác định đượcmức độ dị tế bào chất của gen MT-CO1đối với một sốmẫu

môcủa bệnh nhân UTĐTT

Đề tài được hỗ trợ từ nguồn kinh phí của đề tài QG.15.05 và được thực hiện tại phòng Proteomics và Sinh học Cấu trúc thuộc Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội

Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về bệnh ung thư đại trực tràng

1.1.1 Tình trạng ung thư đại trực tràng ở trên thế giới và Việt Nam

UTĐTT là một trong những bệnh ung thư phổ biến trên thế giới và gặp nhiều

ở các nước phát triển Theo thống kê năm 2012 của Globocan, UTĐTT đứng thứ 3

về tỷ lệ mắc (9,7%) và thứ 4 về tỷ lệ tử vong (8,5%) do ung thư (Hình 1.1) Tỷ lệ

mắc bệnh trên thế giới có sự khác biệt lớn về vị trí địa lý và từng khu vực địa lý và

cũng khác biệt theo giới tính, tỷ lệ mắc bệnh cao nhất ở Úc/ New Zealand (ASR

44,8 nam và 32,2 nữ trên 100.000) và thấp nhất ở Tây Phi (4,5 nam và 3,8 nữ trên

100.000) trong các trường hợp được chẩn đoán là do ung thư Ở Mỹ, UTĐTT đứng

thứ 4 về tỷ lệ mắc và thứ 2 về tỷ lệ tử vong do ung thư Hàng năm, trên thế giới có

khoảng 1,3 triệu ca mắc mới và trên 600.000 ca tử vong[53]

Hình 1.1 Tỷ lệ mắc mới và tử vong của UTĐTT

trong tổng số các loại ung thư [53]

Ở Việt Nam, UTĐTT đứng thứ 5 sau ung thư dạ dày, phổi, vú, vòm họng và

xu hướng ngày càng tăng Theo dữ liệu thống kê của Glocbocan năm 2012, UTĐTT

đứng thứ 4 ở nam giới, hàng năm có khoảng 4561 ca mắc mới, chiếm 6,5% tỉ lệ

mắc mới ung thư; ở nữ giới UTĐTT đứng thứ 6, khoảng 4207 ca mắc mới, chiếm

7,7% tổng số người mắc mới ở nữ giới[53]

1.1.2 Ung thư đại trực tràng

Đại tràng và trực tràng là phần cuối cùng của hệ thống ống tiêu hóa, thường gọilà ruột già, đóng vai trò quan trọng việc xử lý các thức ăn không tiêu hóa được (chất xơ…), một số vi khuẩn ở ruột già có thể sản xuất các vitamin cho cơ thể, hấp thụ thức ăn và tạo nên phân để thải ra ngoài Đại trực tràng ở người trưởng thành thường có kích thước khoảng 1,5-1,8m; phần ruột lớn hình chữN gồm manh tràng, đại tràng lên, đại tràng ngang, đại tràng xuống, đại tràng sigma và trực tràng[54] (Hình 1.2).Trực tràng là đoạn cuối của ống tiêu hóa đi từ chỗ nối đại tràng sigma cho đến đường lược, dài khoảng 15cm Trực tràng chia làm 3 phần: trực tràng trên cách rìa hậu môn từ 12-18cm, trực tràng giữa cách rìa hậu môn từ 6-12cm và trực tràng rìa hậu môn dưới 6cm[4]

Hình 1.2 Hình ảnh vị trí đại tràng và trực tràng ở người [55]

UTĐTT là loại ung thư hay gặp đứng thứ hai trong các loại ung thư đường tiêu hóa và là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây tử vong nếu không được chẩn đoán và điều trị sớm UTĐTT thường gặp là ung thư biểu mô tuyến, gây nên bởi sự phát triển bất thường của các tế bào có khả năng xâm lấn hoặc lan rộng ra các bộ phận khác của cơ thể và bắt gặp ở bất cứ vị trị nào của đại trực tràng[6] Theo nghiên cứu của Kahamoui cho thấycó 43% ung thư xảy ra ở vị trí của trực tràng, 25% là ở đại tràng sigma, đại tràng lên chỉ là 18%, đại tràng ngang là 9% và đại tràng xuống là 5%[32]

1.1.3 Các yếu tố nguy cơ ung thư đại trực tràng

Có rất nhiều yếu tố nguy cơ gây nên bệnh UTĐTT Dựa vào thống kê cho thấy có 2 nhóm yếu tố chính gây ra bệnh là:

và UTĐTT: hội chứng Lynch, hội chứng Turcot, hội chứng Peutz-Jeghers sẽ dẫn đến bệnh UTĐTT[56]

- Yếu tố không di truyền[56]:

+ Bệnh viêm, loét đại tràng lâu ngày, các tác nhân vật lí, hóa học, chế độ ăn uống, sinh hoạt hay do lão hóa

+ Nổi bật nhất với yếu tố không di truyền là thói quen ăn uống Chế độ ăn uống ít chất xơ, giàu đạm hay thói quen sử dụng bia rượu, hút thuốc lá thường xuyên có thể gây ra những biến đổi trong tế bào mô đại tràng dẫn đến viêm loét trực tràng và dẫn tới UTĐTT

1.1.4 Triệu trứng của bệnh

Dựa vào các triệu chứng của UTĐTT có thể phát hiện bệnh sớm và có những biện pháp điều trị thành công Về mặt lâm sàng, phần lớn bệnh nhân UTĐTT không

có bất kỳ triệu chứng rõ ràng nào cho đến khi bệnh tiến triển đến giai đoạn nặng, tức

là xuất hiện khối u lớn hoặc thậm chí đã di căn Ung thư đại trực tràng thường có một số triệu chứng lâm sàng sau[54,9]:

- Thay đổi thói quen trong đại tiện như: Tiêu chảy, táo bón tăng lên trong thời gian ngắn hoặc cảm giác mót rặn và nặng ở trực tràng

- Chảy máu trực tràng, có máu đen sẫm hoặc đỏ tươi trong phân

- Giảm cân không rõ nguyên nhân

- Thường xuyên mệt mỏi

1.1.5 Phân loại ung thư đại trực tràng theo mô học

Hệ thống phân giai đoạn TNM được phát triển và xác nhận bởi hiệp hội ung thư Hoa Kỳ - AJCC (Americant Joint Committee on Cancer) và liên minh kiểm soát ung thư quốc tế UICC (Union for International Cancer Control) công nhận làm tiêu chuẩn đánh giá các bệnh ung thư Trong hệ thống phân loại TNM ở bệnh UTĐTT, mỗi khối u được phân loại dựa vào các tiêu chí sau(Bảng 1.1)[56]:

Bảng 1.1 Bảng phân loại TNM của UICC(2002) trong ung thư đại trực tràng Theo khối u (T)

TX Khối u không thể đo

T0 Không có bằng chứng cho khối u ban đầu

Tis Ung thư biểu mô tại chỗ

T1 Khối u xâm nhập vào lớp mô liên kết dưới niêm mạc

T2 Khối u đã phát triển đến lớp cơ nằm phía dưới của lớp dưới niêm mạc T3 Khối u đã phát triển xuyên qua lớp cơ vào trong lớp thanh mạc

T4a Khối u phát triển vào trong bề mặt của phúc mạc tạng

T4b Khối u xâm lấn trực tiếp vào các cơ quan cận kề

N1c Khối u trong lớp dưới thanh mạc, mạc treo hoặc mô quanh trực tràng

mà không xâm lấn vào hạch lympho N2 Di căn trong từ 4 hạch lympho trở lên

N2a Di căn trong 4-6 hạch

N2b Di căn trong 7 hạch hoặc nhiều hơn

Theo di căn (M)

M1a Di căn giới hạn trong một cơ quan

M1b Di căn tới hơn 1 cơ quan

Người ta sử dụng hệ thống phân loại này như một đánh giá chung để phân

loại các giai đoạn tiến triển của bệnh UTĐTT [56]

Bảng 1.2 Phân loại các giai đoạn phát triển của ung thư đại trực tràng

1.1.6 Các chỉ thị sinh học của ung thư đại trực tràng

UTĐTT là một trong những ung thư đường tiêu hóa có tiên lượng tốt Tuy nhiên, nếu phát hiện muộn thì cũng giống như tất cả các loại ung thư khác, khả năng điều trị ít hiệu quả

Ngày nay, sự phát triển không ngừng của khoa học kỹ thuật, đặc biệt là các

kỹ thuật sinh học phân tử đã góp phần chẩn đoán, phân biệt, phát hiện sớm và theo dõi hiệu quả điều trị UTĐTT Để chuẩn đoán bệnh ở các giai đoạn đầu một cách đơn giản, ngành y học đã sử dụng các chỉ thị sinh học (biomaker) Chỉ thị sinh học được sử dụng đánh giá trạng thái sinh học của các mô, đánh giá khách quan về các chỉ số trong quá trình sinh học bình thường, quá trình gây bệnh[46] Các chỉ thị sinh học thường dùng cho ung thư đại trực tràng là:

Chỉ thị sinh học trong phân:

Xét nghiệm máu trong phân (FOBT): Phương pháp khá đơn giản, không tốn

kém FOBT là xét nghiệm tìm máu trong phân dùng để khám sàng lọc giúp phát hiệnsớm ung thư đại trực tràng[44] Khi phát hiện thấy máu trong phân của người bệnh thì cần tiến hành các thăm khám bổ sung để tìm ra nguyên nhân gây chảy máu trong đó có nguyên nhân ung thư, polyp

Chỉ thị sinh học trong gen và biểu hiện của gen:

Đột biến gen K-ras được tìm thấy trong 40-50% UTĐTT Bên cạnh đó, đột biến K-ras được tìm thấy trong các tế bào bất thường, đưa ra giả định tổn thương tiền ung thư, báo cáo tìm thấy trong 13-95% trong UTĐTT [46] Do đó, đột biến Kras có thể là đột biến quan trọng trong UTĐTT

P53 mã hóa protein ức chế khối u, điều hòa sự biểu hiện của gen liên quan đến quá trình apoptosis, angiogenesis, chu trình tế bào, duy trì hoạt động của gen Khoảng hơn một nửa người mắc bệnh ung thư có đột biến gen p53 và ở bệnh nhân UTĐTT có 30-60% đột biến gen p53 Các đột biến này xuất hiện ở giai đoạn muộn của UTĐTT vì vậy đột biến gen p53 khó tìm kiếm được ở giai đoạn đầu ở cho bệnh UTĐTT Do tỷ lệ đột biến tương đối thấp nên nó hạn chế cho việc phát hiện UTĐTT dựa trên ADN

Chỉ thị sinh học trong máu và huyết thanh:

Xét nghiệm CEA: Kháng nguyên Carcinoembryonic(CEA) là một tập hợp

các glycoprotein có trọng lượng phân tử lớn liên kết chặt chẽ với nhau và tham gia trong quá trình kết dính tế bào.CEA thường được phát hiện có mặt trong những mẫu huyết thanh Sự kết hợp của xét nghiệm kháng nguyên CEA với các kỹ thuật hình ảnh và khám lâm sàng có thể giúp theo dõi sự đáp ứng với hóa trị, đặc biệt là trong những trường hợp các phương pháp chẩn đoán hình ảnh không đo lường được CEA tăng là chỉ số thường gặp nhất ở những bệnh nhân tái phát không triệu chứng và hiện nay là chỉ số hữu ích nhất để phát hiện sớm di căn gan ở những bệnh nhân sau phẫu thuật[20, 21] Những bệnh nhân mà nồng độ CEA huyết thanh ban đầu cao có

tỷ lệ tái phát cao hơn hoặc thời gian tái phát ngắn hơn so với bệnh nhân có nồng độ CEA huyết thanh ban đầu bình thường

Xét nghiệm CA 19-9 (Cancer antigen 19-9): Xét nghiệm kháng nguyên CA

19-9 có độ nhạy thấp hơn so với xét nghiệm kháng nguyên CEA ở tất cả các giai đoạn của UTĐTT[21] Sự gia tăng nồng độ CA 19-9 trước khi có biểu hiện lâm sàng chỉ xuất hiện ở 25% đến 50% số bệnh UTĐTT tái phát Độ nhạy của xét nghiệm CA 19-9 trong phát hiện UTĐTT tăng lên tương ứng với mức độ bệnh theo phân loại Dukes Xét nghiệm CA 19-9 được sử dụng để theo dõi sự tái phát của bệnh Người bệnh có nồng độ CA 19-9 huyết thanh trước phẫu thuật càng cao có tiên lượng càng xấu[42]

những cấu trúc nhỏ hơn Các tế bào mô cơ xương hoặc thận cần một lượng ty thể lớn hơn các tế bào khác trong cơ thể Ngoài ra, ty thể có khả năng di chuyển phản ứng với những thay đổi sinh lý bên trong tế bào[33]

Về cấu trúc, ty thể được bao bọc bởi một hệ thống màng kép, bao gồm màng ngoài và màng trong, bao lấy khối nền bên trong, khoảng cách giữa hai màng được gọi là xoang gian màng (Hình 1.3) Cả hai màng đều có bản chất là lipoprotein tương tự như màng sinh chất, nhưng có sự khác biệt về hình dạng và các tính chất hóa lý chuyên trách cho việc thực hiện các chức năng sinh lý của chúng[33]

Hình 1.3 Cấu trúc ty thể [57]

Ty thể là nơi chịu trách nhiệm sản xuất năng lượng ATP cung cấp cho tế bào, thông qua quá trình photphoryl hóa oxy hóa (OXPHOS).Các electron được tạo ra bởi quá trình oxy hóa các chất béo và carbohydrate được chuyển đến oxy thông qua các phức hệ phản ứng oxy hóa khử (phức hợp I-IV) để tạo thành nước Proton được bơm qua màng trong của ty thể từ chất nền matrix đến khoảng không gian màng ngoài ty thể để hình thành một gradient điện hóa, được sử dụng từ enzym ATP synthase (phức hợp V) để tổng hợp ATP[27]

Ngoài ra, ty thể đóng một vai trò quan trọng trong quá trình apoptosis - chết theo chương trình - một quá trình sinh học cơ bảncủa các tế bào có vai trò quan trọng giúp các sinh vật đa bào duy trì sự toàn vẹn và chức năng của mô Quá trình này giúp để loại bỏ những hư hại hoặc các tế bào không mong muốn trong sự phát triển ung thư và trong các phản ứng của tế bào để chống ung thư[50]

1.2.2 Hệ gen ty thể

Ty thể là bào quan có hệ gen riêng, với kích thước và số lượng gen nhỏ hơn nhiều lần so với hệ gen nhân Thông thường mỗi tế bào chứa hàng trăm đến hàng nghìn số bản sao ADN ty thể, tùy thuộc vào mức độ hoạt động chuyển hóa của tế bào (càng nhiều hoạt động chuyển hóa thì càng có nhiều ty thể)[14]

ADN ty thể (mtDNA) tồn tại dạng mạch vòng, kích thước 16569 bp, gồm 37 gen trong đó 28 gen phân bố trên sợi nặng và 9 gen phân bố trên sợi nhẹ Hai sợi đơn của mtDNA được phân biệt dựa vào hàm lượng nucleotit: sợi giàu Guanin là sợi nặng, sợi giàu Cytosine là sợi nhẹ Toàn bộ hệ gen ty thể chỉ có một vùng điều khiển (vùng D-Loop) để điều khiển quá trình sao mã, phiên mã cho tất cả các gen trênmtDNA Hầu hết các thông tin được mã hóa bởi các gen trên chuỗi nặng, với 2 gen mã hóa cho rARN, 14 gen mã hóa cho các tARN và 12 gen mã hóa cho các polypeptide Chuỗi nhẹ mã hóa cho 8 tARN và một chuỗi polypeptide[11]

Tất cả 13 sản phẩm protein là thành phần phức hệ enzyme trong hệ thống phosphoryl hóa, được thể hiện như Hình 1.4 [11]:

- Bảy chuỗi polypeptide từ ND1 đến ND6 và ND4L là các tiểu đơn vị của phức

hợp I (NADH dehydrogenase- ubiquinone reductase)

- Một chuỗi cytochrome b là tiểu đơn vị phức hợp III (ubiquinone- cytochrome

Hiện tƣợng đồng tế bào chất và dị tế bào chất của ADN ty thể

Trong mỗi tế bào có tới hàng trăm đến hàng nghìn bản sao, vì vậy một đặc tính quan trọng của di truyền ty thể là dị tế bào chất (heteroplasmy) và đồng tế bào chất (homoplasmy) Nói một cách khác, đồng tế bào chất là tất cả các bản sao của một kiểu gen ty thể đều giống nhau, dị tế bào chất là hỗn hợp của hai dạng kiểu gen ty thể có cả kiểu gen hoang dại và kiểu gen đột biến[47] (Hình 1.5)

Hình 1.5 Dạng đồng tế bào chất và dị tế bào chất ở ADN ty thể

1.2.3 Biến đổi ADN ty thể và ung thư đại trực tràng

Từ những năm 1988 đến nay, người ta đã xác định được hơn 250 đột biến mtDNAgây bệnh đã được công bố trong cơ sở dữ liệu ngân hàng gen ty thể MITOMAP Các đột biến trên gen ADN ty thể có mối liên quan với các bệnh ở người như: bệnh thần kinh của bệnh nhân nhi, bệnh thoái hóa cơ, bệnh mù lòa ở trẻ em Gần đây nhất, đột biến gen ty thể còn liên quan đến một số căn bệnh mãn tính chủ yếu xảy

ra người cao tuổi như: bệnh tiểu đường, bệnh Alzheimer, chứng mất trí, bệnh Parkinson, bệnh tim mạch và ung thư [9]

Các khiếm khuyết trong chức năng ty thể từ lâu đã tham gia vào sự phát triển của ung thư Hơn một nửa thế kỷ trước, Warburg [51] đã bắt đầu nghiên cứu về sự thay đổi ty thể trong ung thư và đề xuất một cơ chế giải thích sự khác biệt trong chuyển hóa năng lượng giữa tế bào ung thư và tế bào thường Ông cho rằng những thay đổi ty thể có thể cung cấp cho mục tiêu điều trị ở một số loại ung thư

Đột biến ADN ty thể có thể phát sinh trong dòng mầm dẫn đến các bệnh ung thư(đột biến dòng mầm gây ung thư) hoặc phát sinh trong các mô (đột biến soma của khối u) và tham ra vào quá trình tiến triển của khối u[14] Cho đến nay, nhiều dạng biến đổi của mtDNA đã được xác định trong UTĐTT Các biến đổi chủ yếu là đột biến điểm, đột biến mất đoạn và thay đổi số lượng bản sao mtDNA Các biến đổi mtDNA này có thể gây ra sự biểu hiện khác thường của các tiểu đơn

vị thuộc chuỗi vận chuyển điện tử được mã hóa bởi ADN ty thể dẫn đến làm giảm

độ hoạt động của chuỗi vận chuyển điện tử, giảm khả năng phosphoryl hóa oxy hóa Khi chuỗi vận chuyển điện tử bị suy giảm về chức năng, nó sẽ tác động đến quá trình tạo thành ATP và gốc tự do, làm biến đổi sự biểu hiện của một số gen nhân, tác động đến quá trình điều hòa protein và quá trình tổng hợp nucleotite của

tế bào[18]

Năm 2001, Hibi và cs đã nghiên cứu ở vùng D-Loop ty thể của 77 mẫu u của bệnh nhân UTĐTT nguyên phát Họ phát hiện ra 7/77 (9%) bệnh nhân có các đột biến soma ở vùng này Trong số 7 biến đổi được phát hiện, có 1 biến đổi được tìm

thấy trong mẫu huyết thanh Kết quả cho thấy sự thay đổi mtDNA cũng có thể được

sử dụng như là một dấu hiệu phát hiện khối u trong huyết thanh[29]

Năm 2011, Akouchekian và cs nghiên cứu ở vùng gen MT-ND1 ty thể trên

30 mẫu mô u và mô lân cận u của bệnh nhân UTĐTT Kết quả thu được: đột biến điểm T4216C tìm thấy ở 8/30 mẫu bệnh nhân UTĐT, làm thay đổi axit amin Tyrosin → Histidin(Y→ H) Ngoài ra còn có các đột biến T3290C, T3456C, A3480G, C3622T, C3741T, T3777C và T3847C cũng được tìm thấy ở 7/30 mẫu bệnh nhân Điều đặc biệt, họ chỉ phát hiện được biến đổi ở mô u và không có trong

mô lân cận u Dựa trên những biến đổi mtDNA ở các mẫu nghiên cứu và những nghiên cứu trước, họ tin rằng việc tìm kiếm đột biến sôma của mtDNA sẽ có giá trị trong chuẩn đoán phát hiện sớm bệnh ung thư [10]

Năm 2015, Mohammed và cs đã sàng lọc sự biến đổi A12308G trên gen mã hóa cho tARNLeu(CUN) trên 30 mẫu mô u UTĐTT và 100 mẫu máu của người khỏe mạnh sử dụng phương pháp PCR và giải trình tự Kết quả biến đổi A12308G trong vùng V-Loop được tìm thấy ở 6 trong 30 mẫu u (20%) và ở 3 trong 100 mẫu đối chứng(3%) A12308G là một dạng biến đổi đa hình trong V-Loop tARNLeu(CUN)

và có thể được xem như là biến đổi gây bệnh trong sự kết hợp với điều kiện bên ngoài ty thể và các gen ty thể khác trong sự phát triển các bệnh khác nhau, đặc biệt là ung thư Biến đổi A12308G và các biến đổi khác cũng có thể gây ra các kiểu hình khác nhau[37]

Năm 2011, Chen và cs đã nghiên cứu mất đoạn mtDNA của 104 bệnh nhân UTĐTT ở khu vực Ôn Châu, Trung Quốc Sử dụng phương pháp real-time PCR phân tích mất đoạn 4977bp và số bản sao mtDNA trong mô u và mô lân cận u (cách

xa khối u) của những bệnh nhân này Kết quả cho thấy mất đoạn 4977bp xảy ra ở những bệnh nhân có độ tuổi trẻ( ≤65 tuổi, p=0,027) Ở những bệnh nhân với mất đoạn 4977bp, mức độ mất đoạn giảm khi giai đoạn ung thư tiến triển(p=0,031) Hơn nữa, số lượng bản sao mtDNA trong mẫu u của bệnh nhân với mất đoạn cao hơn so với mẫu cậnu của các bệnh nhân này và cả với mẫu u của các bệnh nhân không có

mất đoạn 4977bp Số bản sao mtDNA cao tương ứng với mức độ mất đoạn 4977bp

và các giai đoạn ung thư (p<0.001) Nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc mất đoạn 4977bp có thể đóng một vai trò trọng trong giai đoạn đầu của UTĐTT và cũng liên quan đến sự thay đổi số bản sao mtDNA trong tếbào ung thư[16]

Do mtDNA có vai trò quan trọng đối với chức năng sinh lý của ty thể và tế bào, vì vậy những biến đổi ở mtADN sẽ dẫn đến thay đổi chức năng của ty thể Tuy nhiên, vẫn chưa có nghiên cứu nào chỉ ra đột biến mtDNA trong các mô ung thư là nguyên nhân hay hậu quả của việc phát triển khối u Vì vậy, đột biến mtDNA chỉ có thể đóng góp một phần vào sự phát triển của ung thư

1.3 Phức hệ cytochrome c oxidase và gen MT-CO1

1.3.1 Phức hệ cytochrome c oxidase của chuỗi hô hấp trong ty thể

Phức hệ Cytochrome c oxidase (phức hệ IV) là phức hợp metalloprotein có kích thước phân tử lớn, nằm ở màng trong ty thể.Protein COX là enzyme cuối cùng trong chuỗi vận chuyển điện tử của ty thể

Phức hệ COX của người gồm có 13 chuỗi polypeptide khác nhau với tổng

khối lượng phân tử 204 000 daltons, gồm có các tiểu phần CO1, CO2, CO3 được mã hóa từ hệ gen ty thể, ngoài ra các tiểu phần còn lại IV, Va, Vb, VIa,

MT-VIb, VIc, VIIa, VIIb, VIIc, và VIII được mã hóa từ gen nhân[31]

Protein COX là enzyme đóng vai trò quan trọng trong chuỗi hô hấp tế bào, nhận các electron từ cytochrome c và chuyển hóa chúng để chuyển hóa oxy thành nước Năng lượng tạo thành được sử dụng để vận chuyển proton qua màng trong

ty thể[31]

Hoạt tính xúc tác của cytochrome c oxidase:

4 ferrocytochrome c + O2 + 4 H(+) <=> 4 ferricytochrome c + 2 H2O

1.3.2 Gen MT-CO1và protein của nó trong ty thể

Gen mã hóa cho protein cytochrome c oxidase I (COX-1) (MT-CO1) tên khác cytochrome c oxidase I (COX1) được định vị trên sợi nặng bao gồm 1542

nucleotide liên tục không chứa đoạn intron và mã hóa một polypeptide đơn nằm từ

vị trí base 5904 đến 7445[11], đóng vai trò quan trọng trong quá trình hô hấp

Protein MT-CO1 có hai vùng chính là vùng xuyên màng và vùng nằm trong chất nền ty thể Nó bao gồm 3 trong 4 trung tâm hoạt động của phức hệ enzyme COX: heme a, heme a3 và trung tâm hoạt động CuB[52] Bốn điện tử từ cytochrome C sau khi được vận chuyển qua trung tâm hoạt động CuA trong tiểu

phần MT-CO2 và heme a, đến trung tâm khử ôxy heme a3/CuB (Hình1.6)[35]

Hình 1.6 Sơ đồ minh họa cơ chế vận chuyển electron qua MT-CO1[43]

Bốn electron gần như đồng thời được chuyển chodioxy thành hai phân tử nước, do đó ngăn chặn hình thành ROS như anion superoxide (O-

2) hoặc hydrogen peroxide (H2O2)

1.3.3 Biến đổi trên gen MT-CO1 với các bệnh ung thư

Theo dữ liệu thống kê trên ngân hàng gen ty thể MITOMAP, có rất nhiều đột

biến sôma xảy ra trên gen MT-CO1 đã được công bố và được tìm thấy trong nhiều

loại bệnh khác nhau (Bảng 1.3)

Bảng 1.3 Thống kê một số biến đổi xảy ra trên gen MT-CO1 ở các loại mô[59]

Ung thư tuyến tụy :

Jone và cs đã giải trình tự toàn bộ hệ gen ty thể trong 15 dòng tế bào ung thư tuyến tụy.Một vài biến đổi mới được tìm thấy ở hầu hết các mẫu và thường là các

biến đổi sôma ở dạng dị tế bào chất Kết quả giải trình tự trên gen MT-CO1 trong 6

dòng tế bào đã xác định 8 biến đổi gồm 2 biến đổi làm thay đổi axit amin là

G5973A ( Ala-> Thr), G6267A( Ala-> Thr)[30]

Vị trí Gen Sự thay đổi

tụy

1

Ung thư tuyến tiền liệt :

Trên đối tượng bệnh nhân ung thư tuyến tiền liệt người Mỹ gốc Phi, Ray và cs

(2009) đã xác định 120 biến đổi nucleotide ở trên gen MT-CO1 và tìm thấy có 15

biến đổi sai nghĩa (thay đổi axit amin) Tuy nhiên, tỷ lệ những biến đổi này so với với nhóm đối chứng thì thấy không có sự khác biệt(P=0,1) Hai biến đổi T6221C và T7389C liên quan đáng kể với bệnh ung thư tuyến tiền liệt(P<0,05), đặc biệt biến đổi T7398C là biến đổi sai nghĩa có thể dẫn đến sự thay đổi chức năng của protein MT-CO1[41]

Tương tự, trong nghiên cứu của Arnold và cs (2013) đã xác định được biến đổi

tồn tại ở dạng dị tế bào chất T6214C trên gen MT-CO1 dẫn đến làm thay đổi axit

amin từ methionine-một axit amin không cực thành threonine là một axit amin phân cực Mặt khác, methionine là một axit amin có tính bảo thủ cao, nên sự thay thế methionine thành threonine có thể dẫn đến làm suy yếu quá trình oxy hóa của cytochrome c trong phức hệ IV Kết quả nghiên cứu này cũng chỉ ra rằng một số đột

biến trên gen MT-CO1 có thể là nguyên nhân gây ung thư[13]

Ung thư vú :

Bên cạnh các nghiên cứu biến đổi ADN ty thể ở mẫu mô thì một số nghiên cứu

còn tiến hành khảo sát trên máu ngoại vi Trong nghiên cứu của Li và cs thực hiện

sàng lọc biến đổi mtDNA trên máu ngoại vi của 83 mẫu bệnh nhân ung thư vú và

22 mẫu máu đối chứng (người khỏe mạnh) Kết quả nghiên cứu cho thấy, 27 trong tổng số 32 biến đổi có giá trị tỷ số chênh (OR) nhỏ hơn 1, chứng tỏ chúng có vai trò bảo vệ tiềm năng trong ung thư vú 5 biến đổi còn lại gồm mất nucleotide A tại vị trí 2463 và vị trí 13327, mất nucleotide T tại các vị trí 6298, C6296Avà A8860G đều có tỷ số chênh lớn hơn 4 nên được coi là yếu tố làm tăng nguy cơ của ung thư

vú Năm biến đổi này (trong đó có 2 biến đổi C6296A và 6298delT thuộc gen CO1) có thể là những chỉ thị mới của ung thư vú và có thể có các ứng dụng điều trị

MT-trong tương lai[34]

Ung thư đại trực tràng :

Nghiên cứu của Polyak và cs(1998) phân tích toàn bộ gen ty thể ở 10 dòng tế bào UTĐTT bằng phương pháp giải trình tự trực tiếp và đã xác định được 12 đột biến Trong đó, 10 trên 12 đột biến tồn tại ở dạng đồng tế bào chất Các đột biến này

được tìm thấy trong vùng mã hóa của các gen:ND1, ND4L, ND5, cytochrome b, MT-CO1, MT-CO2, MT-CO3, rARN 12S và 16s, hầu hết các đột biến được xác định

là T→C hoặc G→A Đột biến mtDNA trong ung thư đại trực tràng chủ yếu ở dạng đồng tế bào chất, thường biến đổi tại vị trí purine và chứng tỏ có liên quan đến ROS[39]

Tương tự, trong nghiên cứu của Gallardo và cs (2006) bằng cách giải trình tự toàn bộ hệ gen ty thể của 13 dòng tế bào ung thư, họ đã tìm thấy biến đổi G6267A

là biến đổi sai nghĩa trên gen MT-CO1, thay đổi axit amin Ala122Th Alanin tại vị

trí 122 của protein MT-CO1 được đánh giá là có tính bảo thủ cao trong quá trình tiến hóa, nó nằm ở chuỗi xoắn α xuyên màng ty thể, vì vậy có thể ảnh hưởng đến chức năng của phân tử Sàng lọc biến đổi này bằng phương pháp RFLP cho thấy biến đổi G6267A ở dạng dị tế bào chất ở dòng tế bào Capan-2(94%) và dạng đồng

tế bào chất ở hai dòng tế bào A431 và 143B Họ phát hiện rằng trong ba dòng tế bào mang biến đổi G6267A có sự chuyển hóa galactose chậm cho thấy đột biến này có liên quan đến hoạt tính của COX Ngoài ra, biến đổi G6267A còn tìm thấy trong 1/63 mẫu ung thư vú, 1/64 mẫu UTĐTT, 1/260 mẫu ung thư tuyến tiền liệt và 1/15 dòng ung thư tuyến tụy Điều đặc biệt là đột biến được tìm thấy với tần số cực thấp trong dân số (1/2264) và không thấy trong một số bệnh lý khác Điều đó cho thấy G6267A có thể là biến đổi có liên quan với ung thư[23]

1.3.4 Các phương pháp phát hiện biến đổimtDNA

Phương pháp PCR-RFLP

Phương pháp cơ bản và được sử dụng phổ biến nhất để xác định đột biến điểm của mtDNA: PCR-RFLP Đây là sự kết hợp kỹ thuật PCR với kỹ thuật xác định đa hình độ dài các đoạn cắt giới hạn(RFLP) Đầu tiên, đoạn mtDNA có chứa đột biến được nhân lên bằng PCR với cặp mồi đặc hiệu Sản phẩm PCR sau đó

được cắt bởi enzyme giới hạn thích hợp Cuối cùng, các đột biến sẽ được nhận biết qua phổ băng điện di Phương pháp PCR-RFLP giúp phát hiện các đột biến và không đòi hỏi trang thiết bị đắt tiền Tuy nhiên, chúng có nhược nhiểm độ nhạy thấp

và kém chính xác[22]

Phương pháp Real-time PCR

Realtime PCR sử dụng phân tử phát huỳnh quang để ghi lại quá trình tăng lượng ADN được nhân lên trong phản ứng PCR tỷ lệ thuận với sự tăng tín hiệu huỳnh quang PCR định lượng cho phép xác định số bản sao ADN ty thể ban đầu có trong mẫu với độ chính xác và độ nhạy cao Có hai loại phương pháp phân tích hay được sử dụng: Phương pháp sử dụng chất nhuộm màu gắn với ADN: Chất nhuộm này có ái lực rất cao khi có sự hiện diện của sợi đôi ADN, làm cho sợi đôi ADN phát được ánh sáng huỳnh quang khi nhận được nguồn sáng kích thích[45]

Phương pháp PCR/ASO (An allele-specific oligonucleotide): Phương pháp

sử dụng đầu dò oligonucleotide có gắn phân tử huỳnh quang hoặc phóng xạ Với sựcó mặt sản phẩm khuếch đại đặc hiệu trong ống phản ứng và có sự bắt cặp của đầu dò lên trình tự đặc hiệu của sản phẩm khuếch đại, khi đó sẽ có sự phát huỳnh quang từ ống phản ứng nếu nó nhận được nguồn sáng kích thích, hay là tín hiệu nhận biết đồng vị phóng xạ Phương pháp realtime PCR có độ nhạy cao, cho phép định lượng đột biến[45]

Phương pháp định lượng DHPLC

Phương pháp DHPLC sử dụng cột sắc ký kỵ nước trên cơ sở sắc ký lỏng pha đảo để phân tách ADN dị sợi kép (heteroduplex) với đồng sợi kép (homoduplex) tại nhiệt độ tối ưu Các mạch ADN được phân tách ở nhiệt độ cao, sau khi hạ nhiệt độ xuống, chúng liên kết với nhau và hình thành ADN dị sợi kép chứa các cặp ghép đôi không chính xác Các phân tử dị sợi kép này có thời gian di chuyển khác biệt so với sợi kép bình thường Nhiều nghiên cứu đã sử dụng phương pháp này để sàng lọc toàn bộ genome ty thể, hoặc một vùng nhất định của ADN ty thể để xác định đột biến[36]

Phương pháp ImageJ

ImageJ là phần mềm xử lý ảnh, ImageJ có thể hiển thị, chỉnh sửa, phân tích,

xử lý, lưu lại và in ảnh theo 8-bit, 16-bit và 32-bit Bên cạnh đó, phần mềm này còn

có thể đọc bất kì định dạng ảnh nào, bao gồm TIFF, GIF, JPEG, BMP, DICOM, FITS Nó cũng có thể xác định khu vực và thông số giá trị pixel của một lựa chọn nào đó do người dùng xác nhận; tính toán diện tích, độ sáng tối để tạo biểu đồ mật

độ điểm ảnh Trong lĩnh vực sinh học, ImageJ thường được sử dụng để phân tích các băng protein hay các băng ADN

1.4 Tình hình nghiên cứu biến đổi gen ty thể và gen MT-CO1ở Việt Nam

Tại Việt Nam, các nghiên cứu về đột biến ADN ty thể vẫn chưa nhiều, số liệu còn ít và chưa có tính hệ thống:

Năm 2006 Phan Văn Chi và cs khi nghiên cứu giải mã genome ty thể các tộc người Việt Nam đã tìm thấy một số biến đổi của ADN ty thể ở người Việt Nam thuộc

vùng D-loop, các gen ND1, ND2, ND5, ND6, cytochrome b, rARN 12S, rARN 16S, COX1, COX2, COX3, ATP6, ATP8 Ngoài ra, trong nghiên cứu này đã tìm thấy đột

biến A3243G ở bệnh nhân mắc bệnh MELAS (2/34 bệnh nhân mang đột biến)[2] Năm 2009, Chu Văn Mẫn và cs đã sử dụng phương pháp PCR-RFLP kết hợp

giải trình tự ADN và đã xác định thấy đột biến A3243G có mặt ở bệnh nhân và mẹ

bệnh nhân trong một gia đình có người mắc hội chứng MELAS[5]

Phạm Hùng Vân và cs (2010) đã sử dụng phương pháp giải trình tự trực tiếp ADN ty thể tách chiết từ máu bệnh nhân mang bệnh LEBER, và đã xác định thấy 9/12 ca có đột biến ADN ty thể, 7/9 ca này mang đột biến G11778A là đột biến nặng và thường gặp nhất, 2 ca còn lại mang đột biến T14484C[7]

Năm 2015, Nguyễn Thị Tú Linh và cs nghiên cứu biến đổi A10398G thuộc gen

ND3 ty thể trên đối tượng bệnh nhân ung thư vú Biến đổi A10398G được xác định

bằng phương pháp PCR-RFLP kết hợp với giải trình tự thu được kết quả: tần suất xuất hiện 10398A và 10398G trên các mẫu tương ứng là 40% và 60% Tần suất xuất

hiện biến đổi A10398G có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với mức độ biệt hóa khối u (p<0.05) Tuy nhiên, không có mối liên quan giữa biến đổi này với độ tuổi của bệnh nhân, vị trí mô và giai đoạn phát triển khối u[3]

Năm 2014, Phạm Thị Bích và cs đã sử kỹ thuật PCR-RFLP và giải trình tự

ADN phân tích biến đổi A4164G của gen MT-ND1 ty thể ở nhóm bệnh nhân

UTĐTT người Việt Nam Biến đổi A4164G trên ADN ty thể đã được tìm thấy với 14,95 % mẫu mô, 10,53% mẫu máu của bệnh nhân UTĐTT và 9% mẫu máu của người bình thường Phân bố A4164G ở ADN ty thể không phụ thuộc vào các đặc điểm bệnh học của bệnh nhân như tuổi, giới tính, kích thước khối u (p>0,05), nhưng phụ thuộc vào vị trí khối u và các giai đoạn phát triển UTĐTT theo hệ thống TNM (p<0,05)[1]

Tóm lại, những nghiên cứu về ADN ty thể cũng như gen MT-CO1 ở bệnh nhân

ung thư người Việt Nam còn rất ít Cho đến nay, chúng tôi chưa tìm thấy một công

bố nào nghiên cứu về biến đổi gen MT-CO1 trên bệnh nhân UTĐTT ở Việt Nam

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Mẫu nghiên cứu là 106 cặp mẫu mô, 9 mẫu máu của cùng bệnh nhân ung thư đại trực tràng Mẫu mô của mỗi bệnh nhân gồm: mẫu mô u được lấy tại vị trí khối u

và mẫu mô lân cận u được lấy tại vị trí không có khối u (cách khối u 5 - 10cm) do Khoa Tế bào - Giải phẫu bệnh, bệnh viện K và Khoa Giải phẫu bệnh, bệnh viện Việt Đức - Hà Nội cung cấp Mẫu mô được đựng trong ống eppendorf 1,5 ml, được vận chuyển từ bệnh viện về phòng thí nghiệm trong nitơ lỏng và bảo quản trong tủ lạnh sâu -80oC và đã được tách chiết ADN tổng số từ các nghiên cứu trước

Mẫu đối chứng là 99 mẫu máu của người khỏe mạnh do Viện Huyết học và Truyền máu Trung ương cung cấp được dùng làm đối chứng Mẫu máu được đựng trong ống đựng máu chuyên dụng có chứa chất chống đông và đã được tách chiết ADN tổng số từ các nghiên cứu trước

2.1.2 Các hóa chất sử dụng

Các hóa chất chính sử dụng được liệt kê trong Bảng 2.1

Bảng 2.1 Các hóa chất chính sử dụng trong nghiên cứu

Hóa chất Hãng cung cấp Mục đích

PCR Các mồi: 5851F, 7445R,

6221F, 6381R

IDT (Mỹ)

Các hóa chất khác như: acid boric, Tris - base, EDTA, kali phosphate, ethanol, natri carbonat, bạc nitrat… được sử dụng đều có độ sạch phân tích

2.1.3 Thiết bị sử dụng trong nghiên cứu

Các thiết bị và máy móc của phòng thí nghiệm Proteomics và Sinh học cấu trúc thuộc Phòng thí nghiệm Trọng điểm Cộng nghệ Enzyme và Protein và Phòng thí nghiệm Sinh học người, Bộ môn Sinh lý học và Sinh học người, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên được sử dụng trong nghiên cứu (Bảng 2.2)

Bảng 2.2 Tên thiết bị sử dụng trong nghiên cứu STT Tên thiết bị Hãng sản xuất

3 Bể điện di Mini-Sub Cell GT, Mini- Protean

3 cell

Bio-rad (Mỹ)

Ngoài ra, còn các thiết bị khác phục vụ cho quá trình nghiên cứu như cân phân tích, cân kỹ thuật, máy trộn, máy minispin, lò vi sóng…

2.2 Phương pháp nghiên cứu

Để xác định biến đổi trên gen MT-CO1, chúng tôi sử dụng phương pháp giải

trình tự ADN trực tiếp từ sản phẩm PCR và phương pháp PCR-RFLP Trước tiên,

thiết kế cặp mồi nhân gen MT-CO1, sau đó, sử dụng ADN tổng số từ mẫu mô đại trực tràng của bệnh nhân UTĐTT và nhân toàn bộ đoạn gen MT-CO1 với cặp mồi

đặc hiệu đã được thiết kế Kết quả PCR được kiểm tra bằng phương pháp điện di Tiếp theo, chúng tôi sử dụng phương pháp giải trình tự ADN trực tiếp từ sản phẩm

PCR và đọc kết quả giải trình tự bằng phần mềm Bioedit So sánh trình tự ADN thu được với trình tự ADN ty thể chuẩn (mã NC_012920.1) bằng chương trình BLAST trên NCBI để xác định các vị trí biến đổi

Sau khi xác định được các biến đổi trên gen MT-CO1, chúng tôi tiến hành

tìm hiểu vai trò của các biến đổi đó và lựa chọn một vị trí biến đổi có ý nghĩa (là biến đổi làm thay đổi trình tự acid amin, xảy ra với tần suất cao) để thiết kế mồi theo phương pháp PCR-RFLP Cuối cùng, những mẫu có biến đổi ở dạng dị tế bào chất được định lượng bằng phần mềm ImageJ

2.2.1 Khuếch đại đoạn gen MT-CO1 ty thể bằng phương pháp PCR

Cặp mồi khuếch đại đoạn gen MT-CO1 đã được thiết kế dựa trên trình tự

ADN ty thể (mã NC_012920.1) và phần mềm thiết kế mồi Primer-BLAST Trong nghiên cứu này, sử dụng hai cặp mồi đã thiết kế là 5851F-7595R và 6221F-6381R

để khuếch đại đoạn gen MT-CO1(Bảng 2.3)

7595R 5’- CAT GTG CCA TTA AGA TAT

CTG CTA -3’

Thành phần phản ứng PCR với hai cặp mồi 5851F-7595R và 6221F-6381R đƣợc ghi trong Bảng 2.4

Bảng 2.4 Thành phần phản ứng PCR Thành phần Thể tích (µl) Nồng độ cuối cùng

Hình 2.1 Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR từ cặp mồi 5851F-7595R

Chu trình nhiệt của phản ứng PCR với cặp mồi 6221F-6381R nhƣ trongHình 2.2

Hình 2.2 Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR với cặp mồi 6221F-6381R

2.2.2 Tinh sạch sản phẩm PCR

Sản phẩm PCR trước khi giải trình tự được tinh sạch bằng kit tinh sạch USB®ExoSAP-IT®PCR của hãng Affymetrix (Mỹ) Quy trình tinh sạch đươc thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất gồm các bước sau:

- Cho 2µl sản phẩm PCR vào 5µl hỗn hợp ExoSAP-IT

- Ủ trong bể ổn nhiệt ở 37oC trong 15 phút

- Bất hoạt enzyme bằng cách ủ trong bể ổn nhiệt ở 80oC trong 15 phút Sản phẩm sau khi tinh sạch được gửi đi giải trình tự trực tiếp

2.2.4 Phân tích PCR-RFLP

Dựa trên kết quả giải trình tự đoạn gen MT-CO1, chúng tôi đã xác định được

các vị trí biến đổi trên gen Tìm hiểu vai trò của các biến đổi đó và lựa chọn những biến đổi có ý nghĩa nhất Hai biến đổi được lựa chọn trong số các biến đổi xác định

được trên gen MT-CO1 là biến đổi 6340T>C và 6253C>T để phân tích PCR-RFLP

Kích thước sản phẩm cắt của các enzyme giới hạn được tính toán phù hợp cho việc phát hiện các đột biến qua phổ băng điện di Bảng 2.5 trình bày kích thước sản

phẩm cắt với enzyme giới hạn BccI và TaaI lần lượt để nhận biết các biến đổi T6340C và C6253T trên gen MT-CO1

Bảng 2.5 Trình tự nhận biết của cacs enzyme cắt giới hạn

Tên

enzyme Vị trí nhận biết

Kích thước sản phẩm cắt Không có biến

đổi Có biến đổi

Sau khi được nhân lên với cặp mồi 6221F-6381R, sản phẩm PCR được tiến hành

phản ứng cắt với enzyme cắt giới hạn BccI và TaaI theo đúng hướng dẫn của nhà

sản xuất

 Thành phần phản ứng cắt bằng enzyme cắt giới hạn được mô tả trong Bảng 2.6

Bảng 2.6 Thành phần phản ứng cắt với enzyne BccI, TaaI

Thành phần Enzyme BccI(µl) Enzyme TaaI(µl)

Phản ứng cắt bởi enzyme BccI được tiến hành theo các bước sau:

 Bước 1: Trộn các thành phần phản ứng với nhau theo đúng tỷ lệ trong Bảng 2.6

 Bước 2: Ủ hỗn hợp ở 37oC trong 16 tiếng để phản ứng cắt diễn ra

 Bước 3: Ủ hỗn hợp ở 65oC trong 20 phút để bất hoạt enzyme

Các bước tiến hành phản ứng cắt bởi enzyme TaaI thực hiện tương tự đến bước 2,

chỉ thay đổi nhiệt độ ủ hỗn hợp là 65oC trong 5 phút

2.2.5 Điện di sản phẩm PCR và sản phẩm cắt bằng enzyme giới hạn

Điện di là kỹ thuật dùng để phân tách, đôi khi là tinh sạch các đại phân tử mà chủ yếu là axit nucleic và protein trên cơ sở kích thước, khối lượng, điện tích và cấu hình của chúng Khi các phân tử tích điện được đặt trong một điện trường, tùy theo điện tích mà chúng sẽ di chuyển từ cực âm sang cực dương hoặc ngược lại Các axit nucleic mang điện tích âm nên chúng di chuyển từ cực âm sang cực dương Tốc độ

di chuyển của các phân tử này phụ thuộc chủ yếu vào kích thước phân tử axit nucleic, nhờ đó mà những đoạn ADN hay ARN khác nhau có khả năng phân biệt với nhau trên gel điện di Gel điện di thường sử dụng là agarose và polyacrylamide Tùy vào kích thước đoạn ADN muốn phân tách người ta sẽ sử dụng chúng ở những nồng độ khác nhau

Điện di trên gel Agarose

Điện di gel agarose được thực hiện với chất nền là agarose Nồng độ agarose dùng trong điện di nằm trong khoảng 0,5- 2,5% Việc hiển thị các băng ADN trong gel agarose sau quá trình chạy điện di được thực hiện bằng cách nhuộm gel ở nồng

độ thấp của thuốc nhuộm huỳnh quang ethidium bromide (EtBr) (ủ gel trong dung dịch nhuộm chứa 200-300 ng EtBr/ml khoảng 30 phút) và phát hiện dưới ánh sáng

Điện di sản phẩm PCR mồi 6221F-6381R

Thành

phần

Quy trình chuẩn bị gel Agarose và điện di sản phẩm PCR :

- Cân Agarose dạng bột (Invitrogen), bổ sung 100ml đệm chạy TBE 1X pH 8,3 (Tris-base 0,09M; axit boric 0,09M; EDTA 4mM)

- Làm nóng chảy gel bằng cách đun trong lò vi sóng cho đến khi agarose tan hết (khoảng vài phút)

- Làm nguội gel đến khoảng 50-55oC, đổ agarose vào khuôn điện di đã cài lược để tạo giếng

- Để gel đông ở nhiệt độ phòng (20-30 phút)

- Sản phẩm PCR được trộn với loading dye (glycerol 30% v/v, bromphenol blue dạng vết) và nạp lên giếng điện di Điện di với dòng điện 110 V trong khoảng

30 phút

- Bản gel sau điện di được nhuộm ethidium bromide và quan sát dưới tia tử ngoại (UV)

Điện di gel polyacrylamide

Điện di trên gel polyacrylamide Gel polyacrylamide được trùnghợp ngay trướckhi dùng ở nhiệt độ phòng gồm 2 thành phần chính là acrylamide và bis-acrylamide Quá trình trùng hợp nhờ xúc tác của Ammonim persulfate (APS) và TEMED Khi trùng hợp từ hai thành phần chính trên sẽ hình thành một polymer dạng mạng lưới Tùy theo nồng độ của các chất thành phần mà gel tạo thành sẽ có

hệ thống lỗ nhỏ, vừa hay lớn Tương tự, tùy hàm lượng của bis-acrylamide mà gel

có mức độ liên kết chéo cao hay thấp

Chuẩn bị bản gel polyacylamide 10% dùng để điện di kiểm tra sản phẩm PCR được

cắt bằng enzym BccI (Bảng 2.8)