Phân tích cấu trúc một số hợp chất trong cây xến mủ (garcinia mackeaniana) bằng các phương pháp hóa lý hiện đại

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC BÙI KIM DU PHÂN TÍCH CẤU TRÚC MỘT SỐ HỢP CHẤT TRONG CÂY XẾN MỦ Garcinia mackeaniana BẰNG CÁC PHƯƠNG PHÁP HÓA LÝ HIỆN ĐẠI LUẬN VĂN THẠC SĨ

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

BÙI KIM DU

PHÂN TÍCH CẤU TRÚC MỘT SỐ HỢP CHẤT

TRONG CÂY XẾN MỦ (Garcinia mackeaniana) BẰNG

CÁC PHƯƠNG PHÁP HÓA LÝ HIỆN ĐẠI

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

THÁI NGUYÊN - 2018

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

BÙI KIM DU

PHÂN TÍCH CẤU TRÚC MỘT SỐ HỢP CHẤT

TRONG CÂY XẾN MỦ (Garcinia mackeaniana) BẰNG

CÁC PHƯƠNG PHÁP HÓA LÝ HIỆN ĐẠI

Chuyên ngành: HÓA PHÂN TÍCH

Mã số: 8.44.01.18

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS NGUYỄN THỊ THU HÀ

THÁI NGUYÊN - 2018

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc nhất, tôi xin gửi lời cảm ơn tới TS Nguyễn Thị Thu Hà - người đã truyền cho tôi tri thức cũng như tâm huyết nghiên cứu khoa học, người đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành bản luận văn này

Tôi xin chân thành cảm ơn các cán bộ phòng Hóa sinh ứng dụng - Viện Hóa học đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình thực nghiệm và hoàn thành luận văn

Tôi cũng xin chân thành các thầy cô trong Ban giám hiệu; bạn bè đồng nghiệp tại Khoa Hóa học - Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian tôi tham gia nghiên cứu sinh

Cuối cùng tôi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, người thân và bạn

bè, đồng nghiệp đã luôn tin tưởng động viên, chia sẻ và tiếp sức cho tôi có thêm nghị lực để tôi vững bước và vượt qua khó khăn, hoàn thành bản luận văn này

Thái Nguyên, ngày tháng năm2018

Học viên

Bùi Kim Du

MỤC LỤC

Trang

LỜI CẢM ƠN i

MỤC LỤC ii

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT, KÝ HIỆU iv

DANH MỤC CÁC BẢNG vi

DANH MỤC CÁC HÌNH, ĐỒ THỊ vii

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ ix

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Một số phương pháp hóa lí dùng để phân tích cấu trúc hóa học các hợp chất tự nhiên 3

1.1.1 Phổ cộng hưởng từ hạt nhânNMR (Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy) 3

1.1.2 Phổ khối lượngMS (Mass spectrometry) 5

1.1.3 Phổ hồng ngoại IR (Infrared Spectroscopy) 6

1.2 Sơ lược về họ bứa (clusiaceae), chi bứa (garcinia) và loài xến mủ (Garcinia mackeaniana) 6

1.3 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của chi bứa 7

1.3.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước 7

1.3.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 14

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1 Vật liệu nghiên cứu 16

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 16

2.1.2 Hóa chất 17

2.1.3 Thiết bị nghiên cứu 17

2.2 Phương pháp nghiên cứu 17

2.2.1 Quy trìnhxử lý và ngâm chiết mẫu thực vật 17

2.2.2 Quy trình phân lập các hợp chất tự nhiên 18

2.2.3 Các phương pháp phân tích cấu trúc hoá học các hợp chất phân lập được 20

2.3 Kết quả phân tích các dữ kiện phổ của các chất phân lập được 21

2.3.1 Hợp chất GM1 21

2.3.2 Hợp chất GM3 21

2.3.3 Hợp chất GM5 22

2.3.4 Hợp chất GM10 22

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23

3.1 Hợp chất GM1: Bannaxanthone D 23

3.2 Hợp chất GM3: Calophinone 29

3.3 Hợp chất GM5: Garcinone E 35

3.4 Hợp chất GM10: Allanxanthone C 41

KẾT LUẬN 48

TÀI LIỆU THAM KHẢO 49 PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT, KÝ HIỆU

Kí hiệu

NMR Nuclear Magnetic Resonance Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

Quantum Coherence

Phổ tương tác trực tiếp H-C

ESI-MS Electron Inoniziation-Mass

Spectroscopy

Phổ khối phun sương mù điện tử

NOESY Nuclear Overhauser Effect

Spectroscopy

Phổ hiệu ứng hạt nhân Overhauser

ESI-MS Electrospray Ionisation Mass

Spectrometry

Phổ khối ion hoá bụi điện tử

HR-MS High Resolution Mass

Spectrometry

Phổ khối phân giải cao

IR Infrared spectroscopy Phổ hồng ngoại

FT-IR Fourier-transform infrared

spectroscopy

Quang phổ chuyển đổi hồng ngoại

BHT butylated hydroxytoluene butylat hydroxytoluen

DPPH

di(phenyl)-(2,4,6-trinitrophenyl)iminoazanium

1,1-điphenyl-2-picrylhydrazyl

TMS Tetramethylsilane Tetramethylsilan

AChE Acetylcholinesterase Acetylcholinesterat

CD 3 OD Deuterated methanol Đơtơri metanol

CDCl 3 Deuterated chloroform Đơtơri clorofom

DMSO Dimethyl sulfoxide Đimetyl sulfoxit

µM Micromoles per liter phần tỷ mol/l

và cacbon s: singlet

d: doublet t: triplet q: quartet

dd: doublet of doublets dt: doublet of triplets

dq: doublet of quartets

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Kết quả phân tích phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp

chất GM1 27 Bảng 3.2 Kết quả phân tích phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp

chất GM3 31 Bảng 3.3 Kết quả phân tích phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất

GM5 38

GM10 43

DANH MỤC CÁC HÌNH, ĐỒ THỊ

độc tế bào 9

Hình 1.2 Một số hợp chất có hoạt tính kháng vi sinh vật phân lập từ chi Garcinia 11

Hình 1.3 Một số hợp chất có hoạt tính chống oxy hóa phân lập từ chi Garcinia 12

Hình 1.4 Một số hợp chất phân lập từ chi Garcinia có các hoạt tính khác 13

Hình 1.5 Một số hợp chất phân lập được các loài chi Bứa thu hái tại Việt Nam có hoạt tính gây độc tế bào 15

Hình 2.1 Cây Xến Mủ (Garcinia mackeaniana) 16

Hình 2.2 Quả của Cây Xến Mủ (Garcinia mackeaniana) 16

Hình 3.1 Phổ khối của hợp chất GM1 24

Hình 3.2 Phổ IR của hợp chất GM1 24

Hình 3.3 Phổ 1H-NMR của hợp chất GM1 25

Hình 3.4 Phổ 13C-NMR của hợp chất GM1 26

Hình 3.5 Phổ HSQC của hợp chất GM1 26

Hình 3.6 Phổ HMBC của hợp chất GM1 28

Hình 3.7 Một số tương tác chính trên phổ HMBC của chất GM1 29

Hình 3.8 Phổ khối của hợp chất GM3 30

Hình 3.9 Phổ IR của hợp chất GM3 30

Hình 3.10 Phổ 13C-NMR của hợp chất GM3 32

Hình 3.11 Phổ 1H-NMR của hợp chất GM3 33

Hình 3.12 Phổ HSQC của hợp chất GM3 33

Hình 3.13 Phổ HMBC của hợp chất GM3 34

Hình 3.14 Một số tương tác chính trên phổ HMBC của chất

GM3 35

Hình 3.15 Phổ khối của hợp chất GM5 36

Hình 3.16 Phổ IR của hợp chất GM5 36

Hình 3.17 Phổ 13C-NMR của hợp chất GM5 37

Hình 3.18 Phổ 1H-NMR của hợp chất GM5 39

Hình 3.19 Phổ HSQC của hợp chất GM5 39

Hình 3.20 Phổ HMBC của hợp chất GM5 40

Hình 3.21 Một số tương tác chính trên phổ HMBC của chất GM5 41

Hình 3.22 Phổ khối của hợp chất GM10 42

Hình 3.23 Phổ IR của hợp chất GM10 42

Hình 3.24 Phổ 13C-NMR của hợp chất GM10 44

Hình 3.25 Phổ 1H-NMR của hợp chất GM10 45

Hình 3.26 Phổ HSQC của hợp chất GM10 45

Hình 3.27 Phổ COSY giãn rộng của hợp chất GM10 46

Hình 3.28 Phổ HMBC của hợp chất GM10 46

Hình 3.29 Một số tương tác chính trên phổ COSY và HMBC của chất GM10 47

Hình 3.30 Các hợp chất xanthon phân lập được từ dịch chiết EtOAc của lá cây Xến mủ (Garcinia mackeaniana) 47

MỞ ĐẦU

Thực vật đa dạng và phong phú không những là nguồn thức ăn hàng ngày

mà còn cung cấp nhiều sản phẩm hữu ích cho con người như hương liệu, phẩm màu, thuốc phòng trừ sâu bệnh và quan trọng hơn cả là thuốc chữa bệnh.Bằng kinh nghiệm của mình,từ xa xưa con người đã biết sử dụng và bào chế ra những phương thuốc từ cây cỏ để điều trị hiệu quả nhiều chứng bệnh và các kinh nghiệm này luôn được kế thừa, phát triển từ thế hệ này sang thế hệ khác Ngày nay cùng với sự phát triển của kỹ thuật tiên tiến và hiện đại, nhiều loại thuốc

đã được ra đời Tuy nhiên, đối với thuốc có nguồn gốc hóa dược, bên cạnh những ưu điểm nổi bật như hiệu quả điều trị cao, dễ sử dụng, thì vấn đề hạn chế lớn nhất cần phải quan tâm chính là những tác dụng phụ và độc tính kèm theo, đặc biệt trong trường hợp điều trị lâu dài đối với các bệnh mãn tính Vì vậy ngày nay người ta có xu hướng trở về với tự nhiên

Do Việt Nam nằm trong khu vực khí hậu nhiệt đới gió mùa, nóng và ẩm, được thiên nhiên ưu đãi có thảm thực vật phong phú và đa dạng, với khoảng hơn 14.000 loài thực vật bậc cao, trong đó có gần 4.000 loài được sử dụng làm thuốc trong Y học cổ truyền Việc nghiên cứu để khai thác và phát triển nguồn thực vật làm thuốc đã, đang và sẽ là vấn đề có ý nghĩa khoa học, kinh tế và xã

hội rất lớn ở nước ta.Chi Bứa (Garcina) thuộc họ Bứa (Clusiaceae) có khoảng

400 loài, nhiều loài được sử dụng làm thuốc chữa bệnh ở nhiều nước trên thế giới Kết quả nghiên cứu thành phần hóa học của chi này cho thấy chủ yếu là các hợp chất xanthones, flavonoid, benzophenon, lactones và axit phenolic với nhiều hoạt tính sinh học lý thú như khả năng chống ung thư, chống oxy hóa, kháng nấm, kháng khuẩn, kháng viêm và kháng virus Với thành phần hóa học phong phú, hoạt tính sinh học đa dạng và được sử dụng nhiều trong dân gian

để trị bệnh, việc nghiên cứu chi Garcinia ở Việt Nam là điều cần thiết Cho đến

nay, chưacó nghiên cứu nào về thành phần hóa học cũng như hoạt tính sinh học

của loài Xến Mủ (Garcinia mackeaniana) mọc ở Việt Nam cũng như trên thế

giới Do vậy, sự lựa chọn loài thực vật nàylàm đối tượng nghiên cứu của đề tài

“Phân tích cấu trúc một số hợp chất trong cây Xến Mủ (Garcinia

mackeaniana) bằng các phương pháp hóa lý hiện đại” được đặt ra với mục

tiêu và nội dung nghiên cứu như sau:

Mục tiêu nghiên cứu

1 Phân lập được một số hợp chất trong cây Xến Mủ (Garcinia mackeaniana) thuộc chi Bứa (Garcinia)

2 Phân tích cấu trúc các hợp chất phân lập được bằng các phương pháp hóa lí hiện đại như: phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D và 2D; phổ hồng ngoại IR; phổ khối lượng MS và đo điểm nóng chảy Mp

Nội dung nghiên cứu

- Thu thập mẫu lớn cây Xến Mủ (Garcinia mackeaniana) thuộc chi Bứa (Garcinia), thu hái ở Thuận Châu - Sơn La để tiến hành nghiên cứu

- Phân lập được một số hợp chất trong cây Xến Mủ (Garcinia

mackeaniana)

- Phân tích cấu trúc các hợp chất phân lập được bằng các phương pháp hóa lí hiện đại như: phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D và 2D; phổ hồng ngoại IR; phổ khối lượng MS và đo điểm nóng chảy Mp

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Một số phương pháp hóa lí dùng để phân tích cấu trúc hóa học các hợp chất tự nhiên [45]

Phương pháp chung để xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất là sự kết hợp giữa các phương pháp phổ như phổ hồng ngoại (IR), phổ cộng hưởng

từ hạt nhân (NMR), phổ khối lượng (MS) hoặc phổ khối lượng phân giải cao (HR-MS) với các thông số vật lí như độ quay cực, điểm nóng chảy

Các hợp chất sau khi được tinh chế bằng các phương pháp sắc kí sẽ được

và DEPT Với những hợp chất có cấu trúc đơn giản, hay gặp có thể xác định được

và DEPT) Với các chất phức tạp hơn thì cần tiến hành đo thêm các phổ NMR hai chiều (HSQC, HMBC, COSY, NOESY), phổ IR, phổ X-ray để cung cấp thêm thông tin cho việc xác định cấu trúc Hợp chất sau khi đã được xác định cấu trúc bằng các phương pháp phổ đã nêu sẽ được khẳng định công thức phân tử dựa trên kết quả phổ MS hoặc phổ HR-MS

1.1.1 Phổ cộng hưởng từ hạt nhânNMR (Nuclear Magnetic Resonance

spectroscopy)

Phổ NMR là phương pháp phân tích cấu trúc các hợp chất hiện đại và hữu hiệu nhất hiện nay Với việc sử dụng kết hợp các kỹ thuật phổ NMR một chiều và hai chiều, các nhà nghiên cứu có thể xác định chính xác cấu trúc của các hợp chất, dựa trên nguyên tắc cộng hưởng hạt nhân của các nguyên tử khi được đặt trong một từ trường Trong phổ NMR có hai thông số có đặc trưng liên quan đến cấu

- spin (J)

Phổ proton 1 H-NMR

định tùy thuộc vào mức độ lai hóa của các nguyên tử cũng như các đặc trưng riêng của từng phân tử Mỗi loại proton cộng hưởng ở một trường khác nhau, vì vậy chúng được biểu diễn bằng một độ dịch chuyển hóa học khác nhau Dựa vào

định cấu trúc hóa học của hợp chất

Phổ này cho tín hiệu vạch cacbon Mỗi nguyên tử cacbon sẽ cộng hưởng ở

C-NMR cũng được tính bằng ppm nhưng với dải đo rộng hơn phổ proton, từ

(Distortionless Enhancement by Polarization Transfer) Phổ này cho ta tín hiệu

phân loại cacbon khác nhau Trên phổ DEPT, tín hiệu của cacbon bậc 4 biến

ngược lại đối với phổ DEPT 135 Trên phổ DEPT 90 chỉ xuất hiện tín hiệu phổ của các nhóm CH

Phổ HSQC (Heteronuclear Single Quantum Coherence )

HSQC cho biết thông tin về liên kết trực tiếp giữa proton và cacbon

Phổ HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Correlation)

Đây là phổ thể hiện tương tác xa (2 liên kết và 3 liên kết) giữa cacbon và proton trong phân tử và nhờ đó mà từng phần của phân tử cũng như toàn bộ phân tử được xác định Phổ này đặc biệt thích hợp trong trường hợp phân tử

một số trường hợp là bốn liên kết

Phổ COSY (Correlation spectroscopy)

Phổ COSY biểu diễn các tương tác giữa proton - proton Các proton tương tác với nhau trong phổ COSY là các proton liên kết với cùng một cacbon hoặc với cacbon liền kề Nhờ phổ này mà các phần của phân tử được xác định

Phổ NOESY (Nuclear Overhauser Enhancement Spectroscopy)

Phổ NOESY biểu diễn các tương tác không gian của các proton không

kể đến độ dài các liên kết mà chỉ tính đến khoảng cách không gian của chúng

định cấu trúc không gian của phân tử

Phổ NMR được ghi trên máy Bruker Avance 500 với TMS làm chất nội chuẩn tại Viện Hóa học

1.1.2 Phổ khối lượngMS (Mass spectrometry)

Khối phổ là một trong các phương pháp thường được sử dụng để xác định khối lượng phân tử của chất nghiên cứu Cơ sở của phương pháp này là sự bắn phá các phân tử hợp chất hữu cơ thành ion phân tử hoặc các mảnh ion mang điện tích Phương pháp MS khác với các phương pháp phân tích phổ khác là nó không phụ thuộc vào độ hấp thụ của bức xạ điện từ mà dựa trên quá trình phân tử bị bắn phá bởi chùm electron mang năng lượng cao Dựa trên số khối của ion phân tử

Phổ khối EI-MSdựa vào sự phân mảnh ion dưới tác dụng của chùm ion bắn phá với năng lượng khác nhau, phổ biến là 70eV được đo trên máy MS-Engine-5989-HP tại Viện Hóa học - Viện Hàn lâm khoa học và Công nghệ Việt nam Phổ khối phân giải cao HR-MS được đo trên máy FT-ICR 910-MS tại Viện Hóa học các hợp chất tự nhiên - Cộng hòa Pháp

1.1.3 Phổ hồng ngoại IR (Infrared Spectroscopy)

Phương pháp phân tích theo phổ hồng ngoại là một trong những kỹ thuật phân tích rất hiệu quả, cung cấp thông tin nhanh về cấu trúc phân tử

mà không đòi hỏi các phương pháp tính toán phức tạp Kỹ thuật này dựa trên nguyên lí là các phân tử khác nhau sẽ hấp thụ ở các vùng bức xạ khác nhau Sau khi hấp thụ các bức xạ hồng ngoại, các phân tử ở trạng thái kích thích

sẽ dao động với nhiều vận tốc dao động và xuất hiện dải phổ hấp thụ gọi

là phổ hấp thụ bức xạ hồng ngoại Các đám phổ khác nhau có mặt trong phổ hồng ngoại tương ứng với các nhóm chức đặc trưng và các liên kết có trong phân tử

Phổ hồng ngoại được đo trên máy FTIR-Impact-410 bằng phương pháp viên nén KBr hoặc bao film - Viện Hóa học

1.2 Sơ lược về họ bứa (clusiaceae), chi bứa (garcinia) và loài xến mủ (Garcinia mackeaniana)

Họ Bứa có danh pháp khoa họclà Clusiaceaeđược Antoine Laurent de Jussieu đưa ra năm 1789, là một họ thực vật có hoa bao gồm khoảng 27-28 chi

và 1.050 loài Các cây trong họ này có thân gỗ hay cây bụi, thông thường có

Chi Bứa Garcinia là một chi lớn thuộc họ Bứa với hơn 400 loài, các loài

thuộc chi này thường có tán lá màu xanh đậm, lá có đường gân rõ ràng Hoa vàng nhạt hoặc hơi trắng xanh có bốn hoặc năm cánh Bao phấn không cuống hoặc đầu nhụy gồm nhiều thì Trái có nhiều cơm hoặc nước cốt Hạt có lớp mỏng bao bọc Chúng thường là đại mộc có chiều cao trung bình khoảng 8-

30m như bứa nhà (G cochinchinensis), sơn vé (G merguensis), bứa Bentham (G benthami) Một số ít là đại mộc nhỏ như bứa lửa (G fusca), bứa đồng (G

schomburgkiana) và cũng có thể là thân bụi như bứa ít hoa (G oligantha) [1]

Cây Xến Mủ có tên khoa học là Garcinia mackeaniana, là loại cây đại mộc cao cỡ 12m; nhánh ngang, lúc non vuông vuông, vàng, rồi tròn, đen Lá

có phiến ngang, ngược, to, dài đến 20cm, đáy chít buồm, mặt trên nâu đen,

mặt dưới nâu đỏ lúc khô, gân-phụ 12 cặp; cuống 1,5cm Chùm-tụ tán đực cao 4-7cm; lá đài 4; cánh hoa 4, vàng, cao 7,5mm; tiểu nhụy thành 4 lóng, mỗi lóng mang 10 bao phấn, nhị cái lép cao 1,8mm[1].Cây Xến Mủ là loại cây của vùng nhiệt đới, phân bố chủ yếu ở Châu Á, Châu Phi, New Caledonia và Polynesia Ở Việt Nam, cây Xến Mủ mọc hoang trong rừng thứ sinh, được tìm thấy ở vùng núi cao Sapa, Thuận Châu - Sơn La.Vỏ cây được thu hái quanh năm

1.3 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của chi bứa

1.3.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước

Chi Garcinia bao gồm nhiều cây thuốc đã được sử dụng trong Y học cổ

truyền ở nhiều nước trên thế giới, đặc biệt là châu Á và châu Phi Vỏ quả măng

cụt G mangostana được sử dụng trong một số nước ở khu vực Đông Nam Á

để điều trị nhiễm trùng da, vết thương, kiết lỵ, tiêu chảy, sốt, viêm khớp [2] Bộ

phận lá và hạt của loài G dulcis được sử dụng trong y học dân gian của

Indonesia để chữa trị viêm hệ bạch huyết, viêm tuyến mang tai và bệnh cường giáp, trong khi vỏ thân cây này được sử dụng ở Thái Lan như một chất khử trùng và nước ép trái cây như là một nguồn thực phẩm bổ xung vitamin và long đờm; ngoài ra, dịch chiết từ rễ của nó cũng được sử dụng như một thuốc hạ sốt

và có tác dụng chống độc [3,4]

Vỏ của cây G cowa cũng được sử dụng trong y học dân gian Thái Lan như một loại thuốc hạ sốt và kháng khuẩn [5] Tại Ấn Độ, quả của G indica

được sử dụng làm thuốc trừ giun sán, kiết lỵ, giảm đau và bệnh tim [6] Loài

G cambogia đã được sử dụng trong y học cổ truyền Ấn Độ để điều trị khối u,

vết loét, trĩ, tiêu chảy, kiết lỵ, sốt, lở loét và bệnh ký sinh trùng [7] Thành phần

nhựa của G hanburyii được sử dụng ở Thái Lan như loại thuốc giun và điều trị

các nhiễm khuẩn vết thương Nó cũng được dùng để điều trị viêm da mãn tính,

trĩ và các vết lở do nằm liệt lâu ngày Ở Trung Quốc, G hanburyii đã được phát

triển như là một thuốc kháng u [8,9]

Loài G xanthochymus được sử dụng rộng rãi trong y học cổ truyền Trung Quốc tẩy giun sán và loại bỏ độc tố thực phẩm [10] Loài G hombroniana,

được sử dụng ở Malaysia như thuốc chăm sóc trẻ sơ sinh và chữa bệnh dị ứng

da [11] Ở Châu Phi, G preussii được sử dụng lâu đời để điều trị bệnh đau dạ

dày và nước sắc lá của nó được dùng để trị đau răng [12]

Các cao chiết từ G kola được sử dụng trong y học dân tộc Nigeria chống

viêm thanh quản, ho và các bệnh về gan Hạt của nó được sử dụng ở châu Phi

như một thuốc giải độc [13] Bộ phận lá và hoa của G afzelii được sử dụng ở

Cameroon và Ghana như một tác nhân kháng khuẩn [14] Ở Fiji, chiết xuất lá

của loài G pseudoguttifera được trộn với dầu dừa để làm giảm đau [15]

Do có nhiều tác dụng dược lý quý báu mà chi Garcinia đã thu hút được

sự quan tâm của nhiều nhà khoa học trên thế giới Cho đến nay, có khoảng hơn

100 loài trong chi này đã được nghiên cứu về thành phần hóa học ở các bộ phận khác nhau như lá, vỏ cây, rễ, thân, cành, tâm gỗ, trái cây, hạt, hoa….Kết quả

nghiên cứu cho thấy chi Garcinia là một nguồn phong phú các hoạt chất bao

gồm xanthones, flavonoid, benzophenon, lactones và axit phenolic với nhiều hoạt tính sinh học lý thú như khả năng chống ung thư, chống oxy hóa, kháng nấm, kháng khuẩn, kháng viêm và kháng virus [16]

1.3.1.1 Hoạt tính chống ung thư

Hầu hết các loài thuộc chi Garcinia đều sinh tổng hợp xanthon Các hợp chất này là chất chỉ điểm đặc trưng của họ Bứa cũng như của chi Garcinia với

hơn 40 kiểu mẫu oxygenhóa đã được tìm thấy Các polyhydroxyxanthon đơn giản có thể mang hai, ba, bốn hay năm nhóm thế hydroxyl hay metoxyl với các

vị trí mang oxygen thường gặp là 1,5-; 1,7-; 1,3,5-; 1,3,7-; 1,3,5,6-; 1,3,6,7- và 1,3,5,8-

Từ loài G hanburyi hai hợp chất xanthon là axit gambogic (1) và axit

epigambogic (2) đã được phân lập và thử nghiệm khả năng gây độc trên dòng

tế bào ung thư bạch cầu K562/S và dòng kháng doxorubicin K562/R Kết quả

khoảng 1,32 - 0,89 µM [17] Trong một nghiên cứu của tác giả Shadid và cộng

sự năm 2007, hợp chất 7-hydroxyforbesione (3) từ lá loài G cantleyana thể

hiện hoạt tính gây độc với các dòng tế bào MDA-MB-231, CaOV-3, MCF-7 và

Hình 1.1: Một số hợp chất phân lập từ chi Garcinia có hoạt tính gây độc tế bào

Từ nhựa của loài G hanburyi, một triterpene 3-O-(4'- O-acetyl)

-α-L-arabinopyranosyloleanolic acid (4) đã được phân lập, hợp chất này thể hiện tác

dụng chống tăng sinh và khả năng cảm ứng apoptosis với bốn dòng tế bào bạch

2,42 và 4,15 µM [19]

Từ một số loài khác của chi Garcinia, một số hợp chất benzophenone và

biflavone đã được phân lập như guttiferone A (5) có tác dụng chống oxy hóa và

thể hiện hoạt tính mạnh kháng lại dòng tế bào ung thư HTC-116 và HT29 với

Hợp chất này cũng đã được báo cáo là có khả năng phòng chống bệnh ung thư

vú và bệnh đái tháo đường type II Morelloflavone (7), một biflavone khác, có

Hai hợp chất xanthon là α-mangostin (8) và γ-mangostin (9) được phân

lập từ loài G mangostana và hợp chất rubraxanthon (10) được phân lập từ nhựa cây G parvifolia [17-18] Kết quả nghiên cứu gần đây cho thấy γ-mangostin (9)

và rubraxanthon (10) có hoạt tính mạnh đối với dòng tế bào ung thư bạch cầu

subelliptenon F (11) đã được phân lập và xác định cấu trúc hóa học từ loài G

subelliptica có hoạt tính mạnh nhất kháng DNA topoisomeraz I và II Kết quả

nghiên cứu cũng chỉ rằng các hợp chất này là cấu trúc dẫn đường tiềm năng trong

thiết kế các loại thuốc chống lại bệnh ung thư

1.3.1.2 Hoạt tính kháng vi sinh vật

Hợp chất rubraxanthone (10) cũng được phân lập từ loài G dioica thể

hiện hoạt tính trên các chủng vi khuẩn tụ cầu Staphylococal với giá trị MIC

trong khoảng 0,31-1,25 µg/ml, mạnh hơn so với chất kháng sinh tham chiếu là vancomycin với giá trị MIC là 3,13-6,25 µg/ml [23]

Garcilivin A (12), một bisxanthone từ loài G livingstonei có hoạt tính

trên 2 chủng ký sinh trùng T brucei và T cruzi gây bệnh ngủ ở người với giá

µM [24] Xanthochymol (13), một benzophenone polyprenylated phân lập từ

loài G subelliptica, có tác dụng rất tốt đối với chủng vi khuẩn Staphylococcus

aureus kháng methicillin với giá trị MIC từ 3,1-12,5 µg/ml, gần tương đương

với vancomycin [25]

Guttiferone A (14), một polyisoprenylated benzophenone từ quả loài G

aristata, cho thấy khả năng chống lại ký sinh trùng Plasmodium falciparum với

thuốc sử dụng trong điều trị hoặc phòng ngừa bệnh sốt rét [26]

Amentoflavone (15), một biflavone từ một số loài Garcinia, được báo cáo là có

hoạt tính đối với vi khuẩn lao Mycobacterium smegmatis với giá trị MIC là 0,6 µg/ml,

cao hơn hoạt chất isoniazid là một loại thuốc sử dụng trong điều trị bệnh lao [27]

Kolaviron là một biflavonoid từ hạt G kola chứa các hoạt chất GB-1(6),

GB-2 (16) và kolaflavanone (17), thể hiện hoạt tính với chủng ký sinh trùng sốt

rét Plasmodium berghei ở chuột bạch tạng [28]

Hình 1.2: Một số hợp chất có hoạt tính kháng vi sinh vật phân lập

từ chi Garcinia

1.3.1.3 Hoạt tính chống oxy hóa

Theo tác giả Minami và cộng sự, hợp chất

1,8-dihydroxy-6-methoxyxanthone (18) từ phần gỗ của loài G subelliptica thể hiện khả năng

chống oxy hóa màng tế bào não chuột, khả năng bẫy gốc DPPH và gốc anion superoxide tại 5 µg/ml [29]

Hợp chất α-mangostin (8) từ vỏ quả măng cụt G mangostana có khả

năng ức chế tác nhân 7,12-dimethylbenz [α] anthracene gây tổn thương da

bigarcinenone A (19), một bisxanthone từ vỏ loài G xanthochymus, với giá trị

mạnh hơn chất tham chiếu butylated hydroxytoluene (BHT) trong thử nghiệm DPPH [31]

Hình 1.3: Một số hợp chất có hoạt tính chống oxy hóa phân lập

từ chi Garcinia 1.3.1.4 Một số hoạt tính khác

Axit (-)-hydroxycitric (20) được tìm thấy trong quả của ba loài G

cambogia, G indica và G atroviridis, thể hiện tác dụng ức chế in vitro về

chuyển đổi lactate, acetate và glucose thành axit béo trên mô mỡ của bò và

chuột [32] Trên mô hình in vivo, axit này còn thể hiện tác dụng làm giảm trọng

lượng cơ thể cũng như giảm sự viêm nhiễm, oxy hóa và kháng insulin trên

chuột thí nghiệm [33] Các hợp chất xanthones là axit morellic (21), axit

gambogic (1) và dihydroisomorellin (22) phân lập từ loài G hanburyi cho thấy

triterpen khung pronostane là garciosaterpenes A (23) và garciosaterpenes C

(24) từ loài G speciosa cũng được xác định có hoạt tính kháng virut HIV mạnh

Hợp chất α-mangostin (8) và γ-mangostin (9) từ vỏ quả măng cụt G

mangostana và hợp chất garcimultiflorone D (25) từ loài G multiflora còn thể

hiện hoạt tính kháng viêm ở nồng độ đáng quan tâm [36-37]

Hợp chất 1,5-dihydroxy-3-methoxyxanthon (26) phân lập từ loài G

xanthochymus là chất ức chế enzym MAO, đây là enzym đóng vai trò quan trọng

trong việc điều hòa các amin hoạt động sinh lý thần kinh như serotonin, dopamin

và adrenalin Sự ức chế hoạt động của enzym này sẽ hữu dụng trong việc điều trị các bệnh rối loạn tâm thần, trầm cảm và bệnh tâm thần phân liệt [38]

Hình 1.4: Một số hợp chất phân lập từ chi Garcinia có các hoạt tính khác

Hoạt tính ức chế hoạt động của enzym acetylcholinesterase (AChE) cũng được tìm thấy ở các hợp chất xanthon Sự hoạt động quá mức của enzym này cũng là một trong những nguyên nhân gây ra bệnh Alzheimer

và hiện các chất ức chế AChE đã được sử dụng trong điều trị bệnh này Một nghiên cứu sàng lọc hoạt tính ức chế hoạt động AChE trên 45 hợp chất phân lập được từ tự nhiên cho thấy 1,5-dihydroxy-6'-metyl-5'[(4"-metyl)-3"-

pentenyl] pyrano-xanthon (27) từ chi Garcinia có hoạt tính mạnh hơn

galanthamin, một alkaloid phân lập từ thực vật họ Loa kèn (Amaryllidaceae) dùng sản xuất thuốc điều trị Alzheimer hiện đã được cấp phép lưu hành ở Mỹ và Châu Âu [39]

1.3.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Theo tác giả Võ Văn Chi, ở Việt Nam, Garcinia là chi lớn nhất của họ

Bứa với 29 loài phân bố từ Bắc tới Nam Một số loài được sử dụng trong Y học

cổ truyền để điều trị các bệnh khác nhau Vỏ của loài G cochincinensis được

sử dụng để chữa bệnh dị ứng và các bệnh ngoài da Bột từ vỏ thân cây G oliveri

và G vilersiana dùng để làm thuốc chống bong gân Loài G pendunculata được sử dụng để điều trị táo bón và các bệnh về tiêu hóa Loài G

schomburgkiana được sử dụng để điều trị ho và rối loạn kinh nguyệt Vỏ của

G mangostana được sử dụng như là chất kháng sinh để điều trị bệnh lỵ, sốt và

viêm nhiễm [1,40]

Cho đến nay, ở Việt Nam có một số loài của chi Garcinia đã được nghiên

cứu về thành phần hóa học Các nghiên cứu chỉ ra rằng lớp chất chủ yếu bao gồm xanthone, benzophenon prenylated, dẫn xuất của phloroglucinol,

triterpenoids và depsidones Trên mô hình thử nghiệm in vitro, một số chất thể

hiện hoạt tính gây độc tế bào, kháng u, chống oxy hóa…

Hình 1.5: Một số hợp chất phân lập được các loài chi Bứa thu hái tại

Việt Nam có hoạt tính gây độc tế bào

Neoisobractatins A (41) và neoisobractatins B (42) là hai xanthone phân lập

từ lá của loài G bracteata, thể hiện hoạt tính gây độc với dòng tế bào biểu mô KB

polyisoprenylated benzophenone được phân lập từ vỏ quả của G cochinchinensis,

cho thấy khả năng gây độc mạnh chống lại các dòng tế bào MCF-7, HeLa và

Các hợp chất Oliveridepsidones A-D (44-47), phân lập từ vỏ của loài G

oliveri, thể hiện hoạt tính chống oxy hóa bắt giữ gốc tự do trên hệ DPPH [43]

Từ ba loài thực vật là bứa cọng (G pedunculata), sơn vé (G merguensis) và bứa đồng (G schomburgkiana), tác giả Võ Tấn Hậu đã phân lập được 25 hợp

chất trong đó có 7 hợp chất mới Các kết quả thử nghiệm hoạt tính gây độc trên hai dòng tế bào ung thư người là ung thu cổ tử cung HeLa và ung thư phổi NCI-

H460 cho thấy hoạt chất globuxanthon (48) có hoạt tính mạnh nhất, kế đến là dulxanthon A (49), pedunxanthon D (50) và griffipavixanthon (51) với giá trị

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Lá cây Xến Mủ (Garcinia mackeaniana) thuộc chi Bứa (Garcinia), thu

hái ở Thuận Châu - Sơn Lavào tháng 11 năm 2017 Mẫu tiêu bản được lưu giữ tại phòng Hóa sinh ứng dụng, viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học

và Công nghệ Việt Nam Giám định thực vật bởi TS Nguyễn Quốc Bình Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Hình 2.1: Cây Xến Mủ (Garcinia mackeaniana)

Hình 2.2: Quả của Cây Xến Mủ (Garcinia mackeaniana)

2.1.2 Hóa chất

- Các dung môi: n-hexane,dichloromethane, ethylacetate, acetone,

methanol

- Sắc ký lớp mỏng (TCL) được tiến hành trên bản mỏng tráng sẵn

tử ngoạiở 2 bước sóng λ= 254 nm và 365 nm

- Sắc ký cột (CC) sử dụng Silica gel Merck cỡ hạt 40-60 µm

- Sắc ký cột (CC) với pha tĩnh là Sephadex LH-20

2.1.3 Thiết bị nghiên cứu

- Điểm nóng chảy được đo trên máy HMK 70/3159

- Phổ hồng ngoại được ghi trên máy FTIR Impact-410

- Phổ khối khối phun mù điện tửESI-MS đo trên máy LTQ ORBITRAP

XL của hãng Thermo-Scientific

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) được ghi trên máy Bruker Avance

500 MHz với TMS là chất chuẩn nội

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Quy trìnhxử lý và ngâm chiết mẫu thực vật

Lá cây Xến Mủ sau khi thu hái, được phơi trong bóng mát cho khô tự

dưới áp suất giảm thu được cặn EtOAc(200 gram) Phần bã còn lại được chiết

phần dịch và cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được cặn MeOH(200

gram) Quy trình ngâm chiết mẫu được trình bày ở Sơ đồ 2.1

Sơ đồ 2.1 Quy trình ngâm chiết lá cây Xến Mủ (Garcinia mackeaniana)

2.2.2 Quy trình phân lập các hợp chất tự nhiên

Cặn chiết ethylacetat của lá cây Xến Mủ (100 g) được phân tách sơ bộ trên

cột silica gel (400 g) với hệ dung môi rửa giải là n-hexan/aceton gradient rồi đến

hệ aceton/MeOH gradient, thu được 17phân đoạn ký hiệu từ F1 đến F17

Từ phân đoạn F2 (3.3 g) được phân tách trên cột silica gel (50 g) với hệ

đoạn nhỏ kí hiệu từ F2.1-F2.10 Từ F2.6 (130 mg) rửa giải trên cột Sephadex

F2.6.1 - F2.6.4 Từ phân đoạn F2.6.3 thu được chất GM3 (12 mg) dưới dạng

tinh thể màu vàng nhạt

Phân đoạn F4 (5.4 g) được phân tách trên cột silicagel (80 g) với hệ dung

môi n-hexan/aceton gradient, thu được 10 phân đoạn nhỏ kí hiệu từ F4.1-F4.10

Từ phân đoạn F4.5 (180 mg), phân tách trên cột Sephadex LH-20 dung môi

Phân đoạn nhỏ F4.5.4 (30 mg) được tinh chế bằng sắc ký bản mỏng điều chế

Cặn MeOH (200 g)

với hệ dung môi n-hexan/CH2Cl2tỉ lệ 1/3 thu được 02 chất rắn màu vàng ký

hiệu GM1(10 mg) và GM5 (8 mg)

Sơ đồ 2.2 Quy trình phân lập các hợp chất từ cặn EtOAc của lá cây Xến Mủ

(Garcinia mackeaniana)

Phân đoạn F5 (14 g) được phân tách trên cột sillica gel (200 g) hệ

Tinh chế phân đoạn F5.3 (1.05 g) trên cột Sephadex LH-20 với dung môi

phân đoạn nhỏ F5.3.3 (250 mg) tinh chế tiếp trên cột Sephadex LH-20 thu được

5 phân đoạn nhỏ F5.3.3.1 - F5.3.3.5 Sắc ký bản mỏng điều chế phân đoạn

kí hiệu GM10 (10 mg)

Quá trình phân lập các chất từ cặn EtOAc của lá cây Xến Mủ được trình

bày trong Sơ đồ 2.2

2.2.3 Các phương pháp phân tích cấu trúc hoá học các hợp chất phân lập được

2.2.3.1 Phổ hồng ngoại (Infrared - IR)

Phổ hồng ngoại cho phép nhận biết sự có mặt của các nhóm chức có trong phân tử hợp chất nghiên cứu, dựa vào cực đại hấp thụ đặc trưng của các nhóm chức đó

Phổ hồng ngoại được đo trên máy FTIR Impact-410 tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam

2.2.3.2 Phổ khối lượng (Mass spectrometry - MS)

Khối phổ là một trong các phương pháp thường được sử dụng để xác định

Phổ khối lượng được đo bằng phương pháp ESI trên máy LTQ ORBITRAP XL của hãng Thermo-Scientifictại khoa Hóa học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc Gia Hà Nội

2.2.3.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR - Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy)

Phổ NMR là phương pháp hiện đại trong việc phân tích cấu trúc các hợp chất hóa học, dựa trên nguyên tắc cộng hưởng của các hạt nhân của các nguyên tử khi được đặt trong một từ trường Trong phổ NMR có hai thông số có đặc trưng liên quan đến cấu trúc hóa học của một phân tử là độ dịch chuyển hóa học δ và

hằng số tương tác spin - spin J Từ các dữ liệu phân tích các phổ 1D và 2D NMR

cho phép xây dựng cấu trúc phân tử của mẫu đo

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân được đo trên máy Bruker AM 500 FT-NMR Spectrometer, Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam với TMS là chất chuẩn nội

2.3 Kết quả phân tích các dữ kiện phổ của các chất phân lập được

FT-IR (KBr)ν max (cm -1):3479, 2917, 1649, 1619, 1594, 1569, 1450,

1438, 1295, 1238, 1191, 1161, 1118, 1058, 915, 835

1 H-NMR (CDCl3, 500 MHz)và 13 C-NMR (CDCl3, 125 MHz): xem bảng 3.2 trang 31

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Quy trình xử lý, ngâm chiết mẫu và phân lập các hợp chất từ dịch chiết

EtOAc của lá cây Xến Mủ (Garcinia mackeaniana) được trình bày chi tiết

trong Chương 2 Bằng cách sử dụng các phương pháp sắc ký, chúng tôi đã

phân lập được 4 hợp chất ký hiệu là GM1, GM3, GM5 và GM10 Cấu trúc

hóa học của các hợp chất này đã được xác định nhờ phân tích các dữ liệu phổ bao gồm phổ IR, MS, 1D và 2D NMR, đồng thời so sánh với các tài liệu đã công bố trước đây Việc phân tích cấu trúc của các hợp chất này được trình bày dưới đây

3.1 Hợp chất GM1: Bannaxanthone D

Hợp chất GM1 được phân lập dưới dạng chất rắn màu vàng, đnc:

m/z 463 [M+H]+ tương ứng với CTPT của GM1 là C28H30O6 Trên phổ IR

nhóm carbonyl

Hình 3.1 Phổ khối của hợp chất GM1

Hình 3.2 Phổ IR của hợp chất GM1

1195.35cm-1

1462.26cm-1

1648.63cm-1

1153.97cm-1 1359.91cm-1 1122.02cm-1

2914.60cm-1

2969.43cm-1

1057.90cm-1

838.61cm-1 3540.99cm-1

NMR còn có tín hiệu của 2 proton endocyclic olefinic ở H 6,68 (1H, d, J =

Các dữ liệu phổ trên đặc trưng cho một hợp chất xanthone chứa 2 nhóm thế methylbut-2-enyl và 1 vòng 2,2-dimethylpyran thường hay có mặt trong một

3-số loài thuộc chi Garcinia [46]

Hình 3.3 Phổ 1H-NMR của hợp chất GM1

GM1 có tín hiệu của 28 nguyên tử cacbon trong đó có 19 cacbon sp2 và 9

kết trực tiếp với hydro

Hình 3.4 Phổ 13C-NMR của hợp chất GM1

Hình 3.5 Phổ HSQC của hợp chất GM1

Bảng 3.1 Kết quả phân tích phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất GM1

Hình 3.6 Phổ HMBC của hợp chất GM1

2,2-dimethylpyran gắn ở vị trí C-2/C-3

gắn với khung xanthone lần lượt ở vị trí C-4 và C-8 (Hình 3.6 và 3.7)

và so sánh với tài liệu tham khảo [47] cho phép xác định GM1chính là

Bannaxanthone D Hợp chất này được Hung-Xi Xu và công sự phân lập từ thân

của cây Garcinia xipshuanbannaensis vào năm 2008 [47]

Hình 3.7 Một số tương tác chính trên phổ HMBC của chất GM1

3.2 Hợp chất GM3: Calophinone

Hợp chất GM3 được phân lập dưới dạng chất rắn màu vàng, đnc:

với hydro