ẢNH HƯỞNG CỦA AGAR VÀ MỘT SỐ CHẤT ĐIỀU HÒA SINH TRƯỞNG TRONG MÔI TRƯỜNG VI NHÂN GIỐNG ĐẾN SINH TRƯỞNG, PHÁT TRIỂN CÂY LAN GẤM (Anoectochilus formosanus Hayata)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ẢNH HƯỞNG CỦA AGAR VÀ MỘT SỐ CHẤT ĐIỀU HÒA SINH TRƯỞNG TRONG MÔI TRƯỜNG VI NHÂN GIỐNG ĐẾN SINH

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ẢNH HƯỞNG CỦA AGAR VÀ MỘT SỐ CHẤT ĐIỀU HÒA SINH TRƯỞNG TRONG MÔI TRƯỜNG VI NHÂN GIỐNG ĐẾN SINH TRƯỞNG, PHÁT TRIỂN CÂY LAN GẤM

(Anoectochilus formosanus Hayata)

Họ và tên sinh viên: LÊ THỊ MẬN Ngành: NÔNG HỌC

Niên khóa: 2005 - 2009

Tháng 8/2009

ẢNH HƯỞNG CỦA AGAR VÀ MỘT SỐ CHẤT ĐIỀU HÒA SINH TRƯỞNG TRONG MÔI TRƯỜNG VI NHÂN GIỐNG ĐẾN SINH

TRƯỞNG, PHÁT TRIỂN CÂY LAN GẤM

(Anoectochilus formosanus Hayata)

Tác giả

LÊ THỊ MẬN

Luận văn được đệ trình để hoàn thành yêu cầu cấp bằng kỹ sư nông nghiệp nghành Nông học

Giảng viên hướng dẫn:

1 PGS.TS PHAN THANH KIẾM

2 KS DƯƠNG THỊ LAN OANH

Tháng 8 năm 2009

LỜI CẢM ƠN

Trước tiên, em xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến:

- Thầy Phan Thanh Kiếm, đã tận tình giảng dạy, hướng dẫn, động viên và giúp

đỡ em trong suốt thời gian thực hiện đề tài và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp

- Các cô Dương Thị Lan Oanh, Nguyễn Ngọc Quang Tâm, những người đã tạo mọi điều kiện thuận lợi, trực tiếp hướng dẫn, giúp em thực hiện có kết quả các thí nghiệm trong quá trình thực hiện đề tài

Em cũng xin trân trọng cảm ơn các thầy Bộ môn Di truyền - Giống cây trồng, các thầy cô Khoa Nông học, trường Đại học Nông Lâm TP.HCM đã giúp đỡ em trong quá trình học tập và thực hiện khóa luận của mình

Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn ban lãnh đạo Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam, các cô chú trong phòng Di truyền và Chọn tạo giống cây trồng của Viện: chú Đỗ Khắc Thịnh, chị Nguyễn Thị Thanh Huyền, Chị Ngô Thị Bích đã cho tôi những kinh nghiệm, những ý kiến đóng góp quý báu trong suốt thời gian thực hiện đề tài này

Đặc biệt, con muốn giành sự biết ơn sâu sắc tới cha mẹ và gia đình cùng những người thân đã nuôi dạy, cổ vũ, động viên và giúp đỡ con trong suốt quá trình học tập

để hoàn thành chương trình học tập và thực hiện khóa luận tốt nghiệp

TP Hồ Chí Minh, tháng 7/2009

Lê Thị Mận

TÓM TẮT

Đề tài: “Ảnh hưởng của agar và một số chất điều hòa sinh trưởng trong môi trường vi nhân giống đến sinh trưởng, phát triển cây lan Gấm (Anoectochilus formosanus Hayata” được thực hiện tại Phòng Di truyền và Chọn giống cây trồng,

Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam từ tháng 2/2009 đến 6/2009 với mục đích tìm ra môi trường thích hợp để nhân nhanh chồi, tạo rễ lan Gấm Đề tài gồm ba thí nghiệm: Hai thí nghiệm nghiên cứu khả năng nhân chồi được bố trí trên môi trường nền MS có và không có agar được bổ sung BA hoặc TDZ với các liều khác nhau và một thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của NAA ở các liều khác nhau đến khả năng tạo

rễ của lan Gấm Các thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên

3 Có thể sử dụng các môi trường sau để nhân chồi lan Gấm:

- Môi trường MS + 30 g/l đường + 0,2 g/l than hoạt tính +100 ml/l nước dừa + 8,0 g/l agar + 2,0 mg/l BA

- Môi trường MS + 30 g/l đường + 0,2 g/l than hoạt tính +100 ml/l nước dừa + 2,0 mg/l BA

- Môi trường MS + 30 g/l đường + 0,2 g/l than hoạt tính +100 ml/l nước dừa + 8,0 g/l agar + 1,5 mg/l TDZ

4 Môi trường thích hợp cho sự phát triển của rễ lan Gấm:

Môi trường MS + 30g/l đường + 0,2g/l than hoạt tính +100 ml/l nước dừa + 8,0 g/l agar + 1,5 mg/l NAA

MỤC LỤC

Nội dung Trang

Lời cảm ơn ii

Tóm tắt iii

Bảng iv

Mục lục v

Danh sách các chữ viết tắt vi

Danh sách các bảng vii

Danh sách các biểu đồ và hình viii

CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu và yêu cầu 2

1.2.1 Mục tiêu nghiên cứu 2

1.2.2 Yêu cầu 2

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Khái niệm, cơ sở khoa học và ứng dụng của nuôi cấy mô tế bào thực vật 3

2.2 Tình hình nghiên cứu nuôi cấy mô 4

2.2.1 Trên thế giới 4

2.2.2 Ở Việt Nam 7

2.3 Các phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 9

2.3.1 Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng 9

2.3.2 Nuôi cấy mô sẹo 9

2.3.3 Nuôi cấy tế bào đơn 9

2.3.4 Nuôi cấy protoplast – chuyển gen 10

2.3.5 Nuôi cấy hạt phấn đơn bội 10

2.4 Quy trình nhân giống in vitro 10

2.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến nhân giống in vitro 11

2.5.1 Mẫu cấy 11

2.5.2 Môi trường nuôi cấy 11

2.5.3 Điều kiện nuôi cấy 12

2.6 Những tồn tại thường gặp trong nhân giống in vitro 12

2.6.1 Tính bất định về mặt di truyền 12

2.6.2 Sự nhiễm mẫu 13

2.6.3 Sự hóa nâu 13

2.6.4 Hiện tượng thủy tinh thể 13

2.7 Các chất ĐHSTTV trong nuôi cấy mô 14

2.8 Giới thiệu về cây lan Gấm và những nghiên cứu về nuôi cấy mô lan Gấm 15

2.8.1 Phân loại lan Gấm 15

2.8.2 Yêu cầu sinh thái 17

2.8.3 Đặc điểm thực vật học 17

2.8.4 Giá trị dược liệu và kinh tế 18

2.8.5 Nhân giống và bảo quản nguồn gen 19

2.8.6 Một số kết quả nghiên cứu về nuôi cấy mô lan Gấm 19

2.8.7 Những hạn chế trong nuôi cấy mô lan Gấm 21

CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 22

3.1 Nội dung, thời gian và địa điểm nghiên cứu 22

3.1.1 Nội dung nghiên cứu 22

3.1.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 22

3.2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 22

3.2.1 Vật liệu 22

3.2.2 Phương pháp nghiên cứu 23

3.2.3 Phân tích thống kê 27

CHUƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28

4.1 Ảnh hưởng của agar và BA trong môi trường MS đến khả năng nhân nhanh chồi của lan Gấm in vitro (Thí nghiệm 1) 28

4.1.1 Thời gian phát sinh chồi 28

4.1.2 Hệ số nhân chồi và chiều cao chồi 30

4.1.3 Số lá và kích thước lá 32

4.1.4 Số đốt thân 35

4.2 Ảnh hưởng của agar và TDZ trong môi trường MS đến khả năng nhân nhanh chồi của lan Gấm in vitro (Thí nghiệm 2) 37

4.2.1 Thời gian phát sinh chồi 37

4.2.2 Hệ số nhân chồi và chiều cao chồi 38

4.2.3 Số lá và kích thước lá 41

4.2.4 Số đốt thân 43

4.3 Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng hình thành và phát triển rễ của lan Gấm in vitro (Thí nghiệm 3) 46

4.3.1 Thời gian hình thành rễ 47

4.3.2 Số rễ và chiều dài rễ 48

CHƯƠNG 5 : KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 50

5.1 Kết luận 50

5.2 Đề nghị 50

TÀI LIỆU THAM KHẢO 51

PHỤ LỤC 54

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT STT Ký hiệu/ Chữ viết tắt Ý nghĩa/ Viết đủ

1 ANOVA Phân tích phương sai (Analysis of Variance)

4 CV Hệ số biến thiên (Coeffcient of Variation)

6 ĐHSTTV Điều hòa sinh trưởng thực vật

7 MS Môi trường Murashige and Skoog (1962)

14 TDZ Thidiazuron

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 4.1: Ảnh hưởng của BA đến thời gian phát sinh chồi của lan Gấm .28

Bảng 4.2: Ảnh hưởng của BA đến hệ số nhân chồi và chiều cao chồi của lan Gấm 30

Bảng 4.3: Ảnh hưởng của BA đến số lá và kích thước lá của lan Gấm trên nền có agar 33

Bảng 4.4: Ảnh hưởng của BA đến sự hình thành đốt của lan Gấm 35

Bảng 4.5: Ảnh hưởng của TDZ đến thời gian phát sinh chồi của lan Gấm 37

Bảng 4.6: Ảnh hưởng của TDZ đến hệ số nhân chồi và chiều cao chồi của lan Gấm 38

Bảng 4.7: Ảnh hưởng của TDZ đến số lá và kích thước lá của lan Gấm trên nền có agar 41

Bảng 4.8: Ảnh hưởng của TDZ đến sự hình thành đốt của lan Gấm 43

Bảng 4.9: Ảnh hưởng của NAA đến thời gian phát sinh rễ của lan Gấm 47

Bảng 4.10: Ảnh hưởng của NAA đến số rễ và chiều dài rễ của lan Gấm 48

DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ VÀ HÌNH

Biểu đồ 4.1: Ảnh hưởng của BA đến thời gian phát sinh chồi của lan Gấm 29

Biểu đồ 4.2: Ảnh hưởng của BA đến hệ số nhân chồi của lan Gấm 31

Biểu đồ 4.3: Ảnh hưởng của BA đến chiều cao chồi của lan Gấm 32

Biểu đồ 4.4: Ảnh hưởng của BA đến số lá của lan Gấm 34

Biểu đồ 4.5: Ảnh hưởng của BA đến chiều dài lá của lan Gấm 34

Biểu đồ 4.6: Ảnh hưởng của BA đến chiều rộng lá của lan Gấm 34

Biểu đồ 4.7: Ảnh hưởng của BA đến sự hình thành đốt của lan Gấm .36

Biểu đồ 4.8: Ảnh hưởng của TDZ đến thời gian phát sinh chồi mới của lan Gấm 38

Biểu đồ 4.9: Ảnh hưởng của TDZ đến hệ số nhân chồi của lan Gấm 40

Biểu đồ 4.10: Ảnh hưởng của TDZ đến chiều cao chồi của lan Gấm 40

Biểu đồ 4.11: Ảnh hưởng của TDZ đến số lá của lan Gấm .42

Biểu đồ 4.12: Ảnh hưởng của TDZ đến chiều dài lá của lan Gấm .42

Biểu đồ 4.13: Ảnh hưởng của TDZ đến chiều rộng lá của lan Gấm 42

Biểu đồ 4.14: Ảnh hưởng của TDZ đến sự hình thành đốt của lan Gấm .44

Biểu đồ 4.15: Ảnh hưởng của NAA đến thời gian phát sinh rễ của lan Gấm 47

Biểu đồ 4.16: Ảnh hưởng của NAA đến số rễ của lan Gấm 49

Biểu đồ 4 17: Ảnh hưởng của NAA đến chiều dài rễ của lan Gấm 49

Hình 4.1: Ảnh hưởng của nồng độ BA đến hệ số nhân chồi và chiều cao chồi của các nghiệm thức 32

Hình 4.2: Ảnh hưởng của nồng độ TDZ đến hệ số nhân chồi và chiều cao chồi của các nghiệm thức 40

Hình 4.3: Nhân chồi trên hai môi trường có agar và không có agar 46

Hình 4.4: Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến số rễ và chiều dài rễ của các nghiệm thức 49

Mặt khác, khi cuộc sống ngày càng nâng cao thì thưởng thức cái đẹp trở thành một nhu cầu không thể thiếu trong cuộc sống con người Hoa được coi là một trong những thứ tạo nên cái đẹp trong xã hội mà được nhiều người quan tâm Tuy nhiên thị trường hoa vẫn chưa đáp ứng được về cả số lượng cũng như chủng loại

Lan Gấm không chỉ được biết đến như là cây thuốc quý mà còn là cây hoa kiểng rất có giá trị

Lan Gấm là loại cây quý cần được bảo tồn Cùng với việc tiếp tục nghiên cứu

về cây lan Gấm, việc nghiên cứu các biện pháp để nhân nhanh cây quý này là rất cần thiết Một trong những phương pháp nhân giống, nuôi cấy mô được coi là phương pháp tốt, có hiệu quả nhất

Vì những lý do trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Ảnh hưởng của agar và một số chất điều hòa sinh trưởng trong môi trường vi nhân giống đến sinh trưởng, phát triển cây lan Gấm (Anoectochilus formosanus Hayata)”

1.2 Mục tiêu và yêu cầu

1.2.1 Mục tiêu nghiên cứu

- Tìm hiểu ảnh hưởng của agar trong môi trường MS được bổ sung BA hoặc

TDZ đến việc nhân giống in vitro cây lan Gấm

- Xác định nồng độ BA và TDZ thích hợp trong môi trường nhân chồi lan Gấm

- Xác định nồng độ NAA và môi trường thích hợp cho sự phát triển của rễ lan Gấm

- Nghiên cứu ảnh hưởng của các nồng độ NAA để xác định nồng độ thích hợp

cho sự ra rễ của lan Gấm in vitro

Chương 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Khái niệm, cơ sở khoa học và ứng dụng của nuôi cấy mô thực vật

Khái niệm: Nuôi cấy mô và tế bào thực vật (gọi tắt là nuôi cấy mô) là thuật ngữ

chung cho tất cả các loại nuôi cấy các nguyên liệu (tế bào, mô, phôi) thực vật trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo trong ống nghiệm để tạo ra cây hoàn chỉnh

Các vật liệu thường sử dụng trong nuôi cấy là:

- Các đỉnh sinh trưởng, chóp rễ nhằm nhân nhanh số lượng cây đồng nhất về mặt di truyền và sạch bệnh

- Nuôi cấy bầu, noãn, chưa thụ tinh hoặc bao phấn nhằm tạo ra cây đơn bội, tạo thể đồng hợp tử

- Nuôi cấy phôi nhằm mục đích cứu phôi khi lai xa

- Nuôi cấy mô sẹo (callus) nhằm tạo dòng vô tính, tạo dòng đơn bào và tạo cây biến dị soma

- Nuôi cấy tế bào để tạo dòng đơn bào, từ đó tạo ra tế bào trần để lai vô tính hoặc để chuyển gen

Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô:

- Do tế bào có tính toàn năng: Haberlandt (1902) đã đề cập đến tính toàn năng của tế bào Ông cho rằng, mỗi tế bào của bất kỳ cơ thể đa bào nào đều có khả năng phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh Theo quan điểm hiện đại: Mỗi tế bào hoàn chỉnh đều mang toàn bộ thông tin di truyền của cả cá thể Đó là tính toàn năng của tế bào

- Do sự phân hóa và phản phân hóa của tế bào, tức là từ tế bào ban đầu có thể tạo thành các tế bào chuyên hóa và chuyên biệt Các tế bào chuyên biệt ở các bộ phận thực vật lại có khả năng như một tế bào ban đầu Quá trình đó được gọi là sự phân hóa

và phản phân hóa của tế bào

Ưu điểm của nuôi cấy mô là:

- Tạo ra các cây con đồng nhất và giống cây mẹ

- Hệ số nhân giống cao, thời gian nhân giống ngắn

- Tạo ra các cây con sạch bệnh (nhờ chọn lọc tốt vật liệu nuôi cấy hoặc làm sạch vật liệu trước khi cấy)

- Không cần nhiều diện tích, không bị ảnh hưởng bởi điều kiện ngoại cảnh, thời tiết

- Nhân nhanh một số cây quý để phục vụ cho sản xuất

- Việc trao đổi giống dễ dàng

Ứng dụng của nuôi cấy mô: Ngày nay phương pháp nuôi cấy mô thực vật đã

được ứng dụng để:

- Tạo ra các sản phẩm với quy mô công nghiệp

- Nhân nhanh các giống cây trồng quý

- Tạo cây sạch bệnh

- Phục tráng giống

- Chọn lọc các đột biến tốt

- Giữ gìn ngân hàng gen

- Sử dụng trong công nghệ chuyển gen

Ngày nay cùng với công nghệ gen, nuôi cấy mô tế bào đã trở thành một phần quan trọng trong các nghiên cứu ứng dụng khoa học vào cuộc sống nhằm phát triển nền kinh tế Tại hội nghị công nghệ sinh học toàn quốc lần thứ III (Đà Lạt- 12/1995) Nguyễn Văn Uyển cũng đã nêu 2 nhiệm vụ lớn của công nghệ sinh học ở nước ta từ nay đến năm 2010 là: 1) Tạo các giống cây trồng mới bằng phương pháp công nghệ sinh học thực vật, đặc biệt là công nghệ gen; 2) Nhân nhanh các giống, dòng ưu việt bằng kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào thực vật

2.2 Tình hình nghiên cứu nuôi cấy mô

2.2.1 Trên thế giới

Năm 1838, hai nhà sinh vật Đức Schleiden và Schwann đã đề xướng thuyết tế bào và nêu rõ: Mọi cơ thể sinh vật phức tạp đều gồm những đơn vị nhỏ các tế bào hợp thành Các tế bào đã phân hóa đều mang các thông tin di truyền có trong các tế bào

đầu tiên, đó là trứng sau khi thụ tinh, là những đơn vị độc lập, từ đó có thể xây dựng toàn bộ cơ thể

Năm 1902, Haberlandt là người đầu tiên đưa các giả thuyết của Schleiden và Schwann vào thực nghiệm để chứng minh tính toàn thế của tế bào, nhưng ông đã thất bại trong nuôi cấy các tế bào đã phân hóa tách từ lá một số cây một lá mầm Ngày nay, chúng ta đã biết được nguyên nhân thất bại là vì cây một lá mầm là đối tượng rất khó nuôi cấy, hơn nữa, ông lại dùng các tế bào đã mất hết khả năng tái sinh

Năm 1934, bắt đầu giai đoạn thứ hai trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, khi White (người Mỹ), nuôi cấy thành công trong một thời gian dài đầu rễ cà chua

(Lycopersicum esculentum) Cũng trong thời gian này, ở Pháp đã tiến hành nuôi cấy

mô tế bào tượng tầng một số cây gỗ và xác nhận tác dụng kích thích sinh trưởng mô sẹo của acid – β – indolactic (IAA) và nhóm ba vitamin B do White đề nghị: Thiamin (B1), pyridoxin (B6), nicotinic acid Việc phát hiện IAA, NAA, 2,4-D và kinetin cùng với phát hiện vitamin và nước dừa là những bước tiến rất quan trọng trong gian đoạn thứ hai của nuôi cấy mô thực vật

Năm 1954, Skoog và Miller đã công bố kết quả nghiên cứu về ảnh hưởng của tỷ

lệ cytokinin/auxin Nếu tỷ lệ cytokinin/auxin thấp ảnh hưởng đến rễ và ngược lại Nếu

tỷ lệ này cao sẽ kích thích tạo chồi ở mô sẹo Thành công của Skoog và Miller dẫn đến những phát hiện quan trọng khác, mở đầu cho giai đoạn thứ ba cho lịch sử nuôi cấy

mô tế bào thực vật

Trong thời gian từ năm 1945 đến 1954, kỹ thuật tách và nuôi cấy tế bào đơn (các tế bào sống độc lập không dính với các tế bào khác) đã được phát triển Nuir, Hildebrandt và Riker đã tách các tế bào của mô sẹo thành một huyền phù các tế bào đơn bằng cách lắc trên máy lắc

Năm 1956, Nickell nuôi liên tục được một huyền phù tế bào đơn cây đậu

(Phaseolus vulgaris)

Năm 1959, Melchers và Beckman đã nuôi liên tục các tế bào đơn trong bình có dung tích khá lớn bằng cách sục khí liên tục và thỉnh thoảng thu hoạch tế bào, thêm dung dịch dinh dưỡng mới

Năm 1960, Morel đã nhận thấy các đỉnh sinh trưởng của các loài địa lan

(Cymbidium) khi đem nuôi cấy sẽ hình thành các protocorm Khi chia cắt các

protocorm và nuôi cấy tiếp thì được các protocorm mới Khi để trong các điều kiện nhất định thì protocorm có thể phát triển thành cây lan con Morel có thể phục tráng tạo các dòng vô tính không bị nhiễm virus Kỹ thuật này đặc biệt có giá trị đối với khoai tây, dâu tây, cây ăn quả và nhiều cây nhân giống vô tính khác

Cũng trong năm 1960, Bergman công bố có thể sử dụng phương pháp lọc đơn giản để thu được huyền phù không có các tế bào dính cụm Cùng với kỹ thuật gieo tế bào của Bergman, nhiều tác giả khác đã thành công trong việc tạo cây hoàn chỉnh từ một tế bào, chứng minh được tính toàn năng của tế bào thực vật

Sau đó, Cooking ở trường đại học Nottingham (Anh) công bố có thể dùng men cellulose để phân hủy vỏ cellulose của tế bào thực vật, kết quả thu được các tế bào tròn, không có vỏ bọc gọi là protoplast

Người ta thực sự chú ý đến triển vọng của protoplast vào đầu những năm 1970, khi tác giả Nhật Nagata và Takebe thành công trong việc làm cho các protoplast tách

từ mô thuốc lá tái tạo vỏ cellulose, phân chia và tạo nên một quần thể tế bào trong môi trường lỏng, các protolast có khả năng dung hợp với nhau trong các điều kiện nhất định và hấp thu các phân tử bên ngoài, các nhà nuôi cấy mô đặt hy vọng vào kỹ thuật này để nhân giống có kết quả hơn

Năm 1965, Ledoux và cộng tác viên đề xứng việc biến tính của tế bào thực vật Ông cho rằng các tế bào, thậm chí các hạt giống thực vật, đều có khả năng hấp thu DNA ngoại lai vào trong tế bào

Năm 1966, Guha và Maheswari công bố tạo thành công cây đơn bội từ nuôi cấy

túi phấn cây cà độc dược (Datura inoxia) Từ đó người ta bắt đầu chú ý đến kỹ thuật

nuôi cấy túi phấn

Năm 1967, nhóm Bourgin và Nisch tạo thành công cây đơn bội từ túi phấn cây thuốc lá Đến nay, việc tạo cây đơn bội thông qua nuôi cấy túi phấn và hạt phấn đã thành công ở nhiều loại cây trồng

Từ năm 1980 đến 1992 hàng loạt các thành công mới trong lĩnh vực công nghệ gene thực vật được công bố Nhờ các plasmid, phân tử DNA vòng thường có trong các

tế bào vi khuẩn, được lắp ghép, cấu trúc lại sao cho trong plasmid có gắn thêm một gene xác định và đã thực hiện thành công

Ngoài phương pháp chuyển gene thông qua vi khuẩn, còn có các phương pháp chuyển gene khác như: Kỹ thuật sử dụng xung điện (electroporation), kỹ thuật vi tiêm (micro injection), sử dụng siêu âm (ultrasonic gene transfer), súng bắn gene (gene gun) đang được các phòng thí nghiệm trên thế giới phát triển mạnh và đạt kết quả tốt

Chúng ta đang bắt đầu giai đoạn thứ tư của nuôi cấy mô tế bào thực vật Đó là giai đoạn nuôi cấy mô tế bào thực vật được ứng dụng mạnh mẽ vào thực tiễn chọn giống, nhân giống, sản xuất các chất thứ cấp có hoạt tính sinh học và vào nghiên cứu

lý luận di truyền bậc cao Các hiểu biết cơ bản về đời sống của mô, tế bào đơn độc trong môi trường nhân tạo, nhu cầu chất khoáng, vitamin, chất sinh trưởng, nguồn carbon của chúng Các kỹ thuật để tách, nuôi cấy, điều khiển sự phân hóa từ các biện pháp khác của chương trình là tiền đề được chuẩn bị trong các giai đoạn trước

2.2.2 Ở Việt Nam

Sau năm 1975, nước ta mới bắt đầu chú trọng đến kỹ thuật nuôi cấy mô thực vật Phòng thí nghiệm nuôi cấy mô tế bào đầu tiên được xây dựng tại Viện Sinh học, Viện Khoa học Việt Nam do tiến sĩ Lê Thị Muội khởi xướng Bước đầu phòng tập trung nghiên cứu các phương pháp nghiên cứu cơ bản trong điều kiện Việt Nam, như nuôi cấy bao phấn, nuôi cấy mô sẹo và protoplast Và đã thành công khi nuôi cấy bao phấn lúa và thuốc lá được công bố vào năm 1978 (Lê Thị Muội và ctv, 1978; Lê Thị Xuân và ctv, 1978) Tiếp đó là thành công nuôi cấy protoplast khoai tây (Lê Thị Muội

và Nguyễn Đức Thành, 1978; Nguyễn Đức Thành và Lê Thị Muội, 1980, 1981) Tiếp theo là Phân viện Khoa học Việt Nam ở Thành phố Hồ Chí Minh, sau đó Đại học Nông Nghiệp I Hà Nội, và Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Việt Nam và các phòng thí nghiệp nuôi cấy mô tế bào cũng được thành lập và chủ yếu tập trung vào vi nhân giống khoai tây Đến nay chúng ta đã có rất nhiều phòng thí nghiệm nuôi cấy mô không những ở các Viện nghiên cứu (Viện Di truyền Nông nghiệp, Viện Rau quả Trung Ương), mà có cả ở một số tỉnh và cơ sở sản xuất (Đà Lạt, Yên Bái, Hưng Yên, Thanh Hóa, Cần Thơ, Nghệ Tĩnh)

Từ giữa 1980 đến nay, hướng nghiên cứu ứng dụng nuôi cấy mô tế bào thực vật phát triển mạnh Những kết quả đáng khích lệ đã đạt được trong lĩnh vực vi nhân giống khoai tây (Viện Công nghệ Sinh học, Viện Di truyền Nông nghiệp, Viện Lâm

nghiệp) Một số kết quả bước đầu đã được ghi nhận trong lĩnh vực chọn dòng tế bào kháng bệnh (Lê Bích Thủy và ctv, 1994), chọn dòng chịu muối, chịu mất nước (Nguyễn Tường Vân và ctv, 1994; Đinh Thị Tòng và ctv, 1994) Các kết quả về dung hợp tế bào trần, chuyển gen lục lạp cũng thu được kết quả lý thú (Nguyễn Đức Thành

và ctv, 1993, 1997) Nuôi cấy bao phấn để tạo dòng thuần đã được ứng dụng nhiều tại Viện Công nghệ Sinh học và Di truyền Giống nông nghiệp Nuôi cấy các cây dược liệu quí để bảo tồn nguồn gen và tạo các dòng tế bào có hàm lượng sinh học quan trọng cũng đã và đang được phát triển (Phan Huy Bảo và Lê Thị Xuân, 1998; Phan Thị Bảy và ctv, 1995; Bùi Bá Bổng, 1995)

Theo Nguyễn Văn Uyển và ctv (1993) nghiên cứu nuôi cấy mô thực vật ở Việt Nam đã đạt được một số thành tựu như sau:

Nhân giống khoai tây (Solanum tuberosum L.) bằng nuôi cấy mô thực vật (Trần

Văn Ngọc, Trần Văn Minh, Nguyễn Văn Uyển)

Nhân giống vô tính cây cà phê (họ Rubiaceae) (Nguyễn Thị Quyền, Nguyễn Văn Uyển)

Ứng dụng nuôi cấy mô trong nhân giống cây cỏ ngọt (họ Compositae) (Bùi Tường Thu, Nguyễn Đức Minh Hùng, Nguyễn Văn Uyển)

Nhân giống chuối (Musa spp.) bằng phương pháp cấy mô (Đoàn Thị Thái Thuyền,

Nguyễn Thị Quyền, Trần Văn Minh, Nguyễn Đức Minh Hùng, Nguyễn Văn Uyển)

Ứng dụng nuôi cấy mô trong nhân giống cây Kiwi (Actinidia chinensis Planch)

(Đoàn Thị Thái Thuyền)

Nhân giống cây bắt ruồi (Nepenthes madagascariens) bằng phương pháp cấy

mô (Đoàn Thị Thái Thuyền)

Nhân giống dứa Cayen và Queen Long An bằng phương pháp nuôi cấy mô (Nguyễn Hữu Hổ, Vũ Mỹ Liên)

Ứng dụng nuôi cấy mô trong nhân giống cây mía đường (Saccharum offcinarum) (Nguyễn Đức Minh Hùng, Trần Văn Minh, Vũ Mỹ Liên, Thái Xuân Du)

Nhân giống cây Vani (Vanilla Sp.) bằng nuôi cấy mô (Vũ Thị Mỹ Liên)

Đặc biệt, theo tài liệu của trung tâm nghiên cứu giống cây rừng Bộ Nông nghiệp

và Phát triển Nông thôn vừa tổ chức Hội nghị Khoa học Công nghệ Lâm nghiệp 20 năm (1996 - 2005), một tiến bộ kỹ thuật nổi trội của nghiên cứu nuôi cấy mô thực vật trong

lĩnh vực Lâm Nghiệp là: "Ứng dụng công nghệ mô - hom trong nhân giống Trầm

Hương (Aquilaria crassna Pierre ex Lecomte)” (Phương Hà, 18/04/2005)

2.3 Các phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật

2.3.1 Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng

Một trong những phương thức để đạt được mục tiêu trong nuôi cấy mô tế bào

và mô thực vật là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng (bao gồm nuôi cấy chồi đỉnh và chồi bên)

Sau khi vô trùng, mẫu sẽ được nuôi cấy trên môi trường thích hợp chứa đầy đủ chất dinh dưỡng khoáng vô cơ và hữu cơ hoặc môi trường khoáng có bổ sung chất kích thích sinh trưởng thích hợp

Từ đỉnh sinh trưởng, sau một khoảng thời gian nuôi cấy nhất định mẫu sẽ phát triển thành một chồi hay nhiều chồi Chồi tiếp tục phát triển vươn thân, ra lá và rễ để trở thành

cây hoàn chỉnh Cây con được chuyển ra đất dần dần thích nghi và phát triển bình thường

2.3.2 Nuôi cấy mô sẹo

Mô sẹo là một khối tế bào phát triển vô tổ chức, hình thành do sự phản phân hóa của tế bào đã phân hóa Mô sẹo sẽ phát triển nhanh khi môi trường có sự hiện diện của auxin Khối mô sẹo có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh trong điều kiện môi trường không có chất khích thích tạo mô sẹo

2.3.3 Nuôi cấy tế bào đơn

Khối mô sẹo được nuôi cấy trong môi trường lỏng và được đặt trên máy lắc có tốc độ điều chỉnh thích hợp sẽ tách ra thành nhiều tế bào riêng lẽ gọi là tế bào đơn Tế bào đơn được lọc và nuôi cấy trên môi trường đặc biệt để tăng sinh khối

Sau một thời gian nuôi cấy kéo dài trong môi trường lỏng tế bào đơn được tách

ra và trải trên môi trường thạch Khi môi trường thạch có bổ sung auxin, tế bào đơn phát triển thành cụm tế bào mô sẹo Khi trên môi trường thạch có tỷ lệ cytokinin/auxin thích hợp, tế bào đơn có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh

2.3.4 Nuôi cấy protoplast - chuyển gen

Protoplast (tế bào trần) là tế bào đơn tách lớp vỏ cellulose, trong điều kiện nuôi cấy thích hợp, protoplast có khả năng tái sinh màng tế bào, tiếp tục phân chia và tái sinh thành cây hoàn chỉnh

Khi tế bào mất vách và tiến hành dung hợp, hai protoplast có khả năng dung hợp với nhau tạo ra tế bào lai, đặc tính này cho phép cải thiện giống cây trồng Quá trình dung hợp protoplast có thể được thực hiện trên hai đối tượng cùng loài hay khác loài

2.3.5 Nuôi cấy hạt phấn đơn bội

Hạt phấn ở thực vật được nuôi cấy trên những môi trường thích hợp tạo thành

mô sẹo Mô sẹo này được tái sinh thành cây hoàn chỉnh là cây đơn bội

2.4 Quy trình nhân giống in vitro

Trong kỹ thuật vi nhân giống có 4 bước:

Bước 1: Chọn vật liệu và khử trùng

Lấy mẫu từ cây có nhiều đặc điểm ưu việt Nuôi cấy mô sẹo, nuôi cấy phôi, có thể

sử dụng lá mầm, trụ lá mầm, thân lá phôi; để thu cây đơn bội phục vụ lai tạo giống thì dùng bao phấn hạt phấn; còn để phục vụ cho nhân giống thường chọn ngọn chồi, chồi bên

Khử trùng vật liệu nhân giống: Có thể trồng giữ vật liệu nuôi cấy trong nhà lưới

để giảm tỷ lệ nhiễm vi sinh vật

Bước 2: Nhân chồi

Có 3 cách:

- Tạo chồi bất định: Từ các bộ phận rễ, lá, đoạn thân

- Nhân chồi bên: Cấy đỉnh mầm nách lá trong môi trường cytokinin thích hợp, đỉnh chồi sẽ phát triển thành chồi, sau đó cắt nhỏ đỉnh chồi thành nhiều miếng

để nhân lên

- Nhân chồi qua giai đoạn mô sẹo

Bước 3 : Tạo rễ từ chồi

Khi chồi đạt chiều cao khoảng 2 cm thì chuyển sang môi trường tạo rễ (thường

chứa auxin)

Bước 4: Chuyển cây ra đất

Hoàn chỉnh cây con cho thích nghi trên điều kiện trồng trên hỗn hợp đất trong nhà kính để sau đó chuyển ra đồng ruộng

2.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến nhân giống in vitro

2.5.1 Mẫu cấy

Mẫu thường sử dụng là các mô non như chồi đỉnh, chồi nách hay chồi bất định

sẽ tái sinh tốt hơn mô già của cùng một cây Chồi hoa non hay cụm hoa non cũng thường có khả năng tái sinh rất tốt

Mẫu cấy thích hợp cho nuôi cấy in vitro phải có tỉ lệ lớn mô phân sinh hiện diện

hay những tế bào có khả năng biểu hiện tính toàn thể

2.5.2 Môi trường nuôi cấy

Lựa chọn môi trường nuôi cấy thích hợp trong nuôi cấy mô là rất cần thiết Vì mỗi loại cây trồng khác nhau, bộ phận nuôi cấy khác nhau, đều yêu cầu một hàm lượng dinh dưỡng khác nhau Mặt khác, môi trường còn thay đổi tùy thuộc sự phân hóa của mô cấy, tùy theo trường hợp duy trì mô ở trạng thái mô sẹo, tạo rễ, tạo mầm hay tái sinh cây hoàn chỉnh

Việc lựa chọn môi trường cần dựa vào các tài liệu đã cho cùng đối tượng nuôi cấy hoặc thăm dò qua một số môi trường đã cho để xác định môi trường thích hợp cho mẫu nuôi cấy

Các môi trường đều được thành lập từ một số thành phần chính với nguyên tắc

có sự cân bằng các yếu tố trong môi truờng

Các thành phần chính trong môi trường:

- Đường làm nguồn cacbon

- Các muối khoáng đa lượng

- Các muối khoáng vi lượng

- Các vitamin

- Các chất sinh trưởng

Ngoài ra các tác giả còn thêm một số chất hữu cơ: Nước dừa, dịch chiết nấm men

2.5.3 Điều kiện nuôi cấy

Ánh sáng

Ánh sáng đóng vai trò quan trọng trong phản ứng tạo hình cây in-vitro Trong giai đoạn một và hai của quá trình nhân giống in-vitro, việc nuôi cấy tốt nhất là ở

1.000 lux Khi cường độ ánh sáng tăng lên 3.000 – 10.000 lux rất thuận lợi cho giai

đoạn chuẩn bị cây in-vitro trước khi đem trồng

Nhiệt độ

Nhiệt độ ảnh hưởng rõ đến sự tạo hình của cây nuôi cấy Mỗi loại cây trồng có nhiệt độ tối ưu cho sự tạo hình, hầu hết thích hợp ở nhiệt độ 22 - 250C khi nuôi cấy (Dương Công Kiên, 2002)

2.6 Những tồn tại thường gặp trong nhân giống in vitro

2.6.1 Tính bất định về mặt di truyền

Mặc dù kỹ thuật nhân giống vô tính đã được sử dụng nhằm mục đích tạo ra quần thể cây trồng đồng nhất với số lượng lớn, nhưng phương pháp này cũng tạo ra biến dị soma qua nuôi cấy mô sẹo và nuôi cấy tế bào đơn Những biến dị này được nghiên cứu và vận dụng vào cải thiện đời sống cây trồng (Evans và Sharp, 1986, 1988; Larkin, 1987) Tần số biến dị thì hoàn toàn khác nhau và không lặp lại (Creissen và Karp, 1985; Fish và Karp, 1986) Nuôi cấy mô sẹo và tế bào đơn có biến dị nhiều hơn nuôi cấy chồi đỉnh

Nguyên nhân gây ra biến dị tế bào soma là:

- Kiểu di truyền: Tần số biến dị khác nhau do kiểu di truyền của các loại cây khác nhau

- Thể bội: Cây đa bội thể biến dị nhiều hơn cây nhị bội thể.

- Số lần cấy chuyền: Số lần cấy chuyền càng nhiều cho tần số biến dị càng cao Biến dị nhiễm thể nhiều khi nuôi cấy kéo dài (Amstrong và Phillips, 1988) Số lần cấy chuyền ít, thời gian giữa hai lần cấy chuyền ngắn làm giảm sự biến dị

- Sử dụng mẫu cấy nhỏ từ mô non, gây ít vết thương trên mẫu khi khử trùng

- Ngâm mẫu vào dung dịch asocorbic acid và citric acid vài giờ trước khi cấy

- Chuyển mẫu từ môi trường có chất kích thích sinh trưởng nồng độ thấp qua môi trường có nồng độ cao hơn

2.6.4 Hiện tượng thủy tinh thể

Đây là một dạng bệnh lý, được gọi bằng nhiều tên khác nhau như: Translucency, hyperhydration, hyperhydric (Paek và ctv, 1991) Dạng này được nhận thấy khi có sự trao đổi không khí thấp, quá trình thoát nơi nước tập trung trong cây

Biểu hiện của hiện tượng thuỷ tinh thể là thân, lá của cây chứa nước trong suốt Ngăn chặn hiện tượng thuỷ tinh thể bằng một số biện pháp như:

- Giảm sự hút nước của cây bằng cách tăng nồng độ đường trong môi trường

- Giảm sự gây thương tích trên mẫu khi khử trùng

- Giảm nồng độ đạm trong môi trường nuôi cấy

- Giảm khí ethylene trong bình nuôi cấy bằng cách thông gió tốt

- Tăng cường độ ánh sáng và giảm nhiệt độ phòng cấy

2.7 Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong nuôi cấy mô

Chất ĐHSTTV hay hormones sinh trưởng là các hợp chất hữu cơ (gồm các sản phẩm thiên nhiên của thực vật và các hợp chất tổng hợp nhân tạo) Chúng có tác dụng điều tiết các quá trình sinh trưởng và phát triển của thực vật Tuy nhiên, các chất ĐHSTTV chỉ làm tăng cường quá trình trao đổi chất mà không tham gia trực tiếp vào quá trình trao đổi chất Nó không thể dùng để thay thế chất dinh dưỡng Chất ĐHSTTV gây nên tác dụng mạnh mẽ với một lượng vô cùng bé lên trao đổi chất của tế bào, ở nồng độ cao chúng có thể hoạt động như chất kìm hãm Trong thành phần môi trường nuôi cấy, các chất ĐHSTTV làm việc như chiếc chìa khóa đóng mở sự hoạt động của gen, điều khiển sự phát sinh hình thái và tổng hợp hoạt chất Tác dụng của chất ĐHSTTV liên quan đến hiện tượng kìm hãm và cảm ứng tổng hợp enzym trong

cơ thể thực vật, hoạt hóa các bộ phận của phân tử DNA Mỗi một chất ĐHSTTV điều mang một chức năng riêng, nhưng trong cơ thể của thực vật, để điều khiển những hoạt động của thực vật, chúng tham gia vào thường không phải một mà là vài chất Tùy mỗi giai đoạn nuôi cấy, giai đoạn phát triển của thực vật, sự kết hợp các chất này có khác nhau Trong phạm vi nghiên cứu của đề tài chúng tôi sử dụng các chất thuộc các nhóm auxin, cytokinin

Auxin

Tác dụng sinh lý của auxin chủ yếu làm tăng thể tích của tế bào, kích thích sự hình thành rễ, kìm hãm sự sinh trưởng của chồi bên, kìm hãm sự rụng hoa, rụng quả Auxin hoạt hóa các hợp chất cao phân tử (protein, cellulose, pectin) và ngăn cản sự phân giải chúng Auxin được xem là hormone thực vật quan trọng nhất vì chúng có vai trò rất cơ bản trong quá trinh phối hợp sinh trưởng và biệt hóa tế bào cần thiết cho sự phát triển bình thường của thực vật Auxin cùng với một số chất điều chỉnh khác đảm bảo cho sự tạo thành khối các tế bào đang phân chia thành cơ thể thực vật hoàn chỉnh Trong nuôi cấy mô thường sử dụng các chất như:

- Indol acetic acid (IAA)

- Naphthyl acetic acid (NAA)

- 2,4-Dichlorphenol acetic acid (2,4D)

- Indol butyric acid (IBA)

Cytokinin

Cytokinin có tác dụng kích thích sự sinh trưởng của tế bào cấy mô và làm tăng tốc độ phân bào.khi ở nồng độ cao, nó có tác dụng kích thích sự tạo chồi, đồng thời ức chế sự phân hóa rễ của mô cấy

Cytokinin có hiệu quả rất rõ trên sự phân chia của tế bào, trong quá trình này cytokinin cần thiết nhưng chúng không có hiệu quả nếu vắng mặt auxin.Trong một tỷ lệ giữa cytokinin và auxin thì có kích thích tạo chồi hay tạo rễ, thông thường cytokinin cao hơn auxin thì kích thích tạo chồi còn ngược lại auxin cao hơn thì kích thích sự tạo rễ Trong cơ thể thực vật cyokinin có tác dụng rất lớn là tăng cường sự tổng hợp DNA và protein, kích thích quá trình trao đổi chất

Họ phụ : Spiranthoideae Chi : Anoectochilus Loài : Anoectochilus formosanus Hayata

Loài Anoectochilus formosanus có bộ nhiễm sắc thể 2n = 24, là loài cây đặc

hữu của Đài Loan và được người bản địa xem là "vua của các loài cây làm thuốc" vì những hiệu quả y dược tuyệt vời của chúng trong bảo vệ gan, ngăn ngừa ung thư, giảm

lượng đường trong máu đối với bệnh tiểu đường và trị các bệnh về tim mạch (Yil-Juh Shiau và ctv, 2001) Anoectochilus thuộc nhóm bán địa lan, chúng còn được gọi với cái tên "lan Gấm" nhờ có bộ lá hấp dẫn (Liu TS và Su HJ, 1978) Lan Gấm có bốn chi : Ludisia, Anoectochilus, Goodyera và Macodes Chi Anoectochilus có 30 - 40 loài tìm thấy ở Sri Lanka, Malaysia, Ấn Độ, Nhật Bản, miền Nam Trung Quốc, Australia và quần đảo Nam Thái Bình Dương (Liu and Su, 1978) Tên Anoectochilus đầu tiên được gọi bởi Carl von Blume vào năm 1810 xuất phát từ anoectos (open) và cheilos (lip) của tiếng Hy Lạp Ở Việt Nam, người ta đã ghi nhận được 10 loài:

1 Anoectochilus daoensis Gapnep ở Vĩnh Phú, đặc hữu của Việt Nam

2 Anoectochilus elwesii ở Lào Cai, Vĩnh Yên, Phú Thọ Phân bố ở Sikkim,

Bhutan, Assam, Myanmar

3 Anoectochilus lanceolatus Lindl ở Lào Cai, Hà Tây Phân bố ở Sikkim, Đông

bắc Ấn Độ, Thái Lan, Trung Quốc

4 Anoectochilus pomrangianus Seidenf ở Lâm Đồng (Lang Bian) Phân bố

Malaysia, Indonesia

5 Anoectochilus brevistylus (Hk.f.) Ridl ở Lào Cai Phân bố Thái Lan, Trung

Quốc, Malaysia

6 Anoectochilus roxburghii (Wall.) Lindl ở Lào Cai, Quảng Trị (Đồng Che), Vĩnh

Yên, Phú Thọ (Tam Đảo), Gia Lai, Kontum Phân bố Ấn Độ, Lào, Trung Quốc, Thái Lan

7 Anoectochilus siamensis Schlechter ở Mường Xen Phân bố ở Thái Lan

8 Anoectochilus lylei Rolfe ex Downie ở Lâm Đồng (Đà Lạt, núi Lang Biang,

Đức Trọng, Núi Voi, Đatanla, Đèo Prenn, Bảo Lộc), Daklak (Buôn Ma Thuộc) Phân

bố ở Thái Lan

9 Anoectochilus chapaensis Gapnep hiện diện ở Lào Cai, đặc hữu của Việt Nam

10 Anoectochilus tridentatus Seidenfaden hiện diện ở Vĩnh Yên, đặc hữu của

Việt Nam

A formosanus là một trong bốn loài của chi Anoectochilus ở Đài Loan (Liu TS

và ctv, 1987) Là loài đặc hữu, cao 20 - 30 cm, lá màu xanh đậm, bề mặt mượt như nhung tô điểm bằng những đường vân bạc ở mặt trên, mặt dưới lá có màu đỏ tía, do đó lan Gấm không chỉ làm dược liệu mà còn được dùng để trang trí như một loại cây cảnh

có giá trị

2.8.2 Yêu cầu sinh thái

A formosanus mọc ở độ cao 800 -

1500 m ở đảo Lanyu, Đài Loan hay đảo

Ryukyu, Nhật Bản và tỉnh Phúc Giang

(Trung Quốc) (Yil-Juh Shiau và ctv,

2001) Cây mọc sâu trong rừng nơi có lớp

mùn dầy, ẩm ướt hay cạnh các dòng suối

Lan Gấm thường mọc ở vùng có độ ẩm cao, dưới tán của những cây lớn hoặc phát triển nơi nước rỉ xuống bề mặt đá, chúng được xếp vào loại bán địa lan Lan Gấm cần độ ẩm

70 - 80 %, nhiệt độ 16 – 180C vào ban đêm, 21 – 270C vào ban ngày Vì loài lan này thích nhiệt độ thấp nên chúng cũng không đòi hỏi lượng phân bón cao Nếu có thể cung cấp đủ độ ẩm cần thiết thì chúng ta sẽ có những cây tuyệt đẹp trong nhà

2.8.3 Đặc điểm thực vật học

Lan Gấm là loại lan đa thân lúc đầu phát triển bằng cách bò trên mặt đất, rễ cắm sâu, sau đó lại phát triển thẳng đứng, giả hành mới mọc ở gần gốc của giả hành cũ và

phát triển giống giả hành trước

A formosanus là loại cây lưu niên chậm tăng

trưởng, cây con trưởng thành và sinh hạt sau 2 - 3 năm

tuổi Khi trưởng thành cây đạt chiều cao 20 - 30 cm và

ra hoa ở ngọn Hoa chỉ nở một lần trong năm vào mùa

đông khoảng giữa tháng 8 đến tháng 11 (Liu TS và ctv,

1987) Cành hoa có lông tơ, hoa mọc ngược hướng về

phía mặt đất và tương đối lớn so với kích cỡ toàn cây Số lượng hoa trên cành phụ thuộc vào kích thước và tình trạng cây, người ta thấy có mối liên quan chặt chẽ giữa sự tăng trưởng bên trong và số lượng hoa trên cành Lá đài và cánh tràng riêng biệt, cánh tràng và mặt lưng của lá đài tạo thành một dạng giống mũ trùm đầu, lớn hơn các lá đài Hoa có 3 cánh mọc như một bộ móng vuốt của động vật, trên bộ vuốt đó lại có các sợi râu thò ra như vuốt mèo, đánh dấu các đoạn hình chỉ ở mặt kia từ một mép nổi lên một vuốt bên dưới, mép đánh dấu cuộn lại, có túi chứa ống phấn, hai nhị, hai túi phấn

Trong tự nhiên, lan Gấm được thụ phấn nhờ côn trùng Cây nhạy cảm cao với bệnh và không chịu được nhiệt độ cao Việc thu thập không chọn lọc, thường là trước khi chúng có cơ hội nở hoa, đã đẩy loài này đến nguy cơ báo động Việc giảm kích thước

quần thể A formosanus có thể hạn chế giống lai và giảm tính thích nghi

Lá trơn hình trứng hay hình ê líp, mặt trên màu xanh đen, mượt như nhung, mặt dưới của lá màu tím đỏ Gân lá nhỏ màu vàng kim rất đẹp phân bổ như mạng nhện từ 5

chủ mạch gân chính

2.8.4 Giá trị dược liệu và kinh tế

Trong y học dân gian Đài Loan thì cây A formosanus tươi hoặc khô, nấu sôi

trong nước có thể trị đau ngực, đau bụng, tiểu đường, viêm thận, sốt, cao huyết áp, liệt dương, rối loạn gan, lách và chứng đau nhói ngực (Satish M Nalawade và ctv, 2003) Cây tươi dùng chữa bệnh ngoài như rắn cắn Người Trung Quốc làm chè từ lá và tin rằng chè này có lợi cho việc chữa các bệnh gan và phổi Trường Công nghệ y dược, Cao đẳng y học Quốc gia Dương Minh ở Đài Loan đã thiết kế thí nghiệm dùng

Anoectochilus formosanus làm tác nhân kháng sưng viêm, hạ sốt, giảm suy nhược

cũng như kháng virus cúm A

Qua nghiên cứu, người ta thấy rằng A formosanus có chứa hợp chất chuyển hoá

arachidonic acid, liên quan đến chức năng của hệ tim mạch (Du XM và ctv, 2001) Dịch

chiết của A formosanus có khả năng kháng virus, kháng sưng viêm và các chất bảo vệ

gan Chiết xuất của cây A formosanus khô có chứa 4 - hydroxycinnamic acid, β -

sitosterol β – D - glucopyranoside và butanoid glucosides acid Gần đây, một hợp chất 3

(R) – 3 – β – D – glucopyranosyloxy butanolide tên là kinsenoside chiết xuất từ A formosanus và A koshunensis cho thấy có hiệu quả chống tăng lipase huyết (Mak OT và

ctv, 1990) Một số bệnh nhân đã đăng kí tự nguyện thử nghiệm khả năng chống tiểu

đường và chứng tắc nghẽn động mạch của chất chiết xuất từ dịch trích cây A formosanus

Ung thư vú là một trong các loại ung thư khó trị nhất vì việc dùng hoá trị

không có hiệu quả A formosanus Hayata có thể làm ngưng sự tăng trưởng của các tế

bào ung thư bằng cách thay các tế bào này vào chu trình apoptosis Ngoài ra, chiết xuất

của A formosanus còn có hiệu quả chống tăng đường huyết và chống oxi hoá ở chuột

bị bệnh tiểu đường.

Do những tác dụng tuyệt vời của lan Gấm trong y học nên cây có giá trị kinh tế cao, giá thị trường hiện nay đối với cây tươi thu từ vùng tự nhiên là 320 USD/kg, còn cây khô là 3200 UDS/kg (Y.J Shiau và ctv, 2006)

2.8.5 Nhân giống và bảo quản nguồn gen

Việc phát triển hệ thống nhân nhanh in vitro A formosanus không những giúp

bảo quản cây mầm và tạo nhiều cơ hội mới cho việc trồng thương mại mà còn góp

phần làm dịu bớt áp lực về quần thể tự nhiên Ở Đài Loan, A formosanus được trồng

ở diện tích nhỏ do một số ít người dân Đây là loại cây khó trồng bởi vì thân và rễ yếu

và rất nhạy cảm với nấm Fusarium oxysporum (Lee SG và ctv, 1992) Vấn đề này có thể giải quyết bằng thụ phấn nhân tạo hoặc áp dụng kĩ thuật nhân giống in vitro, dùng các cây A formosanus khỏe mạnh, tạo cây con ít nhiễm bệnh, sinh trưởng tốt Có thể

nhân giống loài lan này từ các hạt nảy mầm bằng phương pháp cộng sinh hoặc không

cộng sinh với nấm Rhizoctonia spp Qua nghiên cứu, người ta thấy rằng Rhizoctonia

có tác dụng kích thích sự nảy mầm trên 80% hạt A formosanus trên môi trường OMA (bột yến mạch, dịch chiết nấm men và agar) A formosanus có thể nhân nhanh in vitro

bằng cách dùng chồi đỉnh, đốt thân và hạt thu từ cây tự nhiên (Ling-Chin Chou và Doris Chi-Ning Chang, 2003) Trong một báo cáo gần đây, người ta đã nhân giống

thành công hai loài Anoectochilus là A sikkimensis và A regalis bằng nuôi cấy đốt

thân (Gangaprasad A và ctv, 2000) Nhưng các tác giả cho rằng khó thu được quả nang

và thất bại khi nuôi cấy phôi đối với cả hai loài Hơn nữa, việc nhân giống bằng protocorm - một phương pháp thường dùng đối với các loài lan khác - không có kết quả với lan Gấm

2.8.6 Một số kết quả nghiên cứu về nuôi cấy mô lan Gấm

Theo nhóm các nhà nghiên cứu tại Viện nghiên cứu nông nghiệp Đài Loan và

Trường Đại học công nghệ Chaoyang (2001) thì phương pháp nhân giống A formosanus

tối ưu là thụ phấn nhân tạo và gieo hạt không cộng sinh Thành công của thụ phấn nhân tạo và tạo trái phụ thuộc vào giai đoạn phát triển của kiểu gen đực, cái Quả thu được

từ các cây thụ phấn là 86,7 % Các hạt từ quả 7 tuần tuổi được gieo trên môi trường ½

MS bổ sung 0,2 % than hoạt tính và 8 % dịch chuối đồng nhất, nuôi trong 4 tháng Các cây mầm được cấy trên môi trường ½ MS lỏng chứa 2 mg/l BA trong 2 tháng Khi cây mầm phát triển chúng được chuyển sang môi trường ½ MS rắn bổ sung 0,2 % than hoạt tính, 8 % dịch chuối đồng nhất, 2,0 mg/l BA và 0,5 mg/l NAA trong bốn tháng để phát triển thành cây con 90 % cây con sống sót sau hai tháng trồng ngoài vườn ươm

với giá thể là hỗn hợp rêu ẩm và vermiculite (tỉ lệ 1:1) dưới điều kiện ẩm độ cao

Kết quả nghiên cứu "Nuôi cấy mô và tạo tính thích nghi cho cây Anoectochilus formosanus" của Cheng-kuen Ho và ctv (1987) cho thấy: Quả nang A formosanus

Hayata thu từ Đài Trung (Đài Loan) được phân thành hạt trưởng thành và chưa trưởng thành gieo ở hai môi trường ½ MS và Knudson C Kết quả chỉ có những hạt chưa trưởng thành mới có thể phát triển thành cây con trong môi trường ½ MS, còn trong môi trường Knudson C chỉ tạo dạng protocorm-like body Cây con được cấy chuyền trên môi trường ½ MS và Knudson C không bổ sung chất điều hòa tăng trưởng thực vật trong 2 năm Sau đó, dùng các đốt thân từ cây này để nuôi cấy trên môi trường MS lỏng và rắn bổ sung 0,5 mg/l NAA và 0,1 - 5,0 mg/l BA MS rắn bổ sung 0,5 mg/l NAA + 3,0 mg/l BA và MS lỏng bổ sung 0,5 mg/l NAA + 0,1 mg/l BA, mỗi đốt trong môi trường nói trên hình thành nhiều chồi non (5,0 - 7,8 chồi), trọng lượng cây nặng hơn (từ ban đầu là 3,5 mg thành 3,4 g và 4,4 g)

Theo nhóm nghiên cứu của Nguyễn Văn Kết, Eun Joo Hahn và Kee Yoeup Paek cho biết họ đã thiết lập một qui trình nhân nhanh sinh khối cây Anoectochilus formosanus tự động giá rẻ thông qua hệ thống bioreactor Những nghiên cứu so sánh giữa phương pháp nuôi cấy trên môi trường đặc truyền thống với phương pháp nuôi cấy trong bioreactor (balloon type bubble bioreactor - BTBB) (dùng các đốt cũng như đỉnh chồi làm mẫu cấy) cho thấy hệ số nhân rất cao khi các mẫu đỉnh chồi nuôi cấy trong bioreactor Trong lúc đó các mẫu đốt cây nuôi cấy lại khác, hệ số nhân không cao Các mẫu mô ngọn phát triển trên môi trường bổ sung TDZ có hệ số nhân cao

nhưng cây phát triển chậm và lá nhỏ Để khắc phục hiện tượng này, các đỉnh chồi và các đốt được chuyển qua môi trường không có TDZ và đồng thời theo dõi so sánh giữa phương pháp truyền thống với hệ thống bioreactor nuôi cấy ngập không sục khí (Continuous immersion without air supply), nuôi cấy ngập có sục khí (Continuous immersion with air supply) cũng như phương phương pháp ngập chìm tạm thời

(Temporary immersion using ebb and flood) đã cho kết quả lá cây con sinh trưởng tốt nhất trong ngập có sục khí Các chồi tái sinh tái sinh rễ rất tốt và phát triển tốt khi chuyển ra vườn ươm

Kết quả nghiên cứu “ Vi nhân giống lan lạ Anoectochilus formosanus” của N.V

Ket và ctv (2004) cho thấy: Dùng đỉnh chồi lan Gấm cấy vào môi trường Hyponex (H3) bổ sung 1 mg dm-3 benzyladenine hoặc 1 - 2 mg dm-3 thidiazuron (TDZ) Cho thêm 1 g dm-3 than hoạt tính vào môi trường chứa TDZ đẩy mạnh sự nhân chồi (11,1 chồi trên 1 mẫu cấy) Tuy nhiên, chồi tái sinh phát triển chậm và mất sức, kéo dài lóng Vấn đề này được khắc phục bằng cách chuyển những cụm chồi sang môi trường H3 không có hormon với 2 % sucrose và 0,5 g dm-3 than hoạt tính Sự ra rễ được kích thích trong 100 % chồi tái sinh trong môi trường này Cây con thích nghi và phát triển tốt ngoài vườn ươm

2.8.7 Những hạn chế trong nuôi cấy mô lan Gấm

Lan Gấm rất khó nhân giống, sử dụng nuôi cấy mô là phương pháp hiệu quả

nhất cho nhân giống loại cây này Tuy nhiên, nghiên cứu về nuôi cấy mô cây lan Gấm

hiện nay còn rất ít Kết quả thu được từ những nghiên cứu còn nhiều vấn đề bàn cãi, nhiều tác giả đã tiến hành thử nghiệm nhân chồi trên nhiều loại môi trường và đưa ra nhiều công thức khác nhau Vì vậy, cần thiết phải tiến hành nhiều hơn nữa các nghiên

cứu để tìm được môi trường thích hợp nhất cho nhân nhanh lan Gấm in vitro

Chương 3

NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM

3.1 Nội dung, thời gian và địa điểm nghiên cứu

3.1.1 Nội dung nghiên cứu

- Ảnh hưởng của agar và BA trong môi trường MS đến khả năng nhân chồi

cây lan Gấm in vitro (Thí nghiệm 1)

- Ảnh hưởng của agar và TDZ trong môi trường MS đến khả năng nhân chồi

cây lan Gấm in vitro (Thí nghiệm 2)

- Ảnh hưởng của NAA đến khả năng tạo rễ của lan Gấm in vitro (Thí nghiệm 3)

3.1.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

3.2.2.1 Môi trường nuôi cấy

Môi trường nền là dung dịch khoáng MS +30 g/l đường + 0,2 g/l than hoạt tính

+100 ml/l nước dừa (pH= 5,7), được khử trùng ở áp suất 1 atm (nhiệt độ 121oC), trong

thời gian 20 phút

Thể tích môi trường trong chai: 60 ml/chai 500 ml

Thời gian chiếu sáng: 12 giờ, cường độ chiếu sáng 2000 lux

Nhiệt độ phòng: 25 ± 10C

Ẩm độ phòng: 70 – 80 %

Đối với môi trường lỏng sử dụng máy lắc: 80 vòng/phút

Thành phần môi trường MS (Murashige and Skoog, 1962):

3.2.2.2 Các thí nghiệm

1/ Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của agar và BA trong môi trường MS đến khả năng nhân

chồi cây lan Gấm in vitro

Mục tiêu:

- Tìm hiểu sự khác nhau khi nuôi trong môi trường có và không có agar

- Tìm hiểu nồng độ BA bổ sung thích hợp vào môi trường nền cho lan Gấm

- Tương tác (nếu có) giữa hai yếu tố này

Vật liệu: Chọn những cây con xanh tốt, đồng nhất, cắt đoạn thân ra từng đốt,

mỗi đốt dài khoảng 2cm, sau đó cấy truyền sang môi trường thử nghiệm

Môi trường nền (MTN): Môi trường MS + 30 g/l đường + 0,2 g/l than hoạt

tính +100 ml/l nước dừa (pH= 5,7)

Bố trí thí nghiệm:

Thí nghiệm có hai yếu tố:

- Yếu tố A: Môi trường có agar (8,0 g/l) và không agar, ký hiệu từ A1 đến A2

- Yếu tố B: 6 nồng độ BA (0 mg/l; 0,5 mg/l; 1,0 mg/l; 1,5 mg/l; 2,0 mg/l; 3,0 mg/l),

ký hiệu từ B1 đến B6

Phối hợp 2 yếu tố:

Yếu tố B (nồng độ BA, mg/l) Phối hợp hai yếu tố

12 nghiệm thức từ 1, 2, 3 đến 12 theo thứ tự sau:

Ký hiệu NT Phối hợp yếu tố Ký hiệu NT Phối hợp yếu tố

Số bình thí nghiệm/1 nghiệm thức/1lần lặp lại: 3

Số mẫu/1 bình thí nghiệm: 10 mẫu

Tổng số bình thí nghiệm cho 1 nghiệm thức: 3 x 3 = 9

Chỉ tiêu theo dõi:

- Thời gian hình thành chồi: Từ ngày cấy mẫu đến khi 50 % chồi mới xuất hiện

- Hệ số nhân chồi: Tổng số chồi hình thành/Tổng số chồi ban đầu

- Số đốt hình thành: Đếm số đốt hình thành trên một cây

- Chiều dài chồi

- Số lá: Tổng số lá đếm được

- Kích thước lá: Đo chiều dài, chiều rộng lá

- Thời gian thu thập số liệu: 50 NSC, 65 NSC, 80 NSC

2/ Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của agar và TDZ trong môi trường MS đến khả

năng nhân chồi cây lan Gấm in vitro

Mục tiêu:

- Tìm hiểu sự khác nhau khi nuôi trong môi trường có và không có agar

- Tìm hiểu nồng độ TDZ bổ sung thích hợp vào môi trường nền cho lan Gấm

- Tương tác (nếu có) giữa hai yếu tố này

Vật liệu: Chọn những cây con xanh tốt, đồng nhất, cắt đoạn thân ra từng đốt,

mỗi đốt dài khoảng 2cm, sau đó cấy truyền sang môi trường thử nghiệm

Môi trường nền (MTN): Môi trường MS + 30 g/l đường + 0,2 g/l than hoạt

tính +100 ml/l nước dừa (pH= 5,7)

Bố trí thí nghiệm:

Thí nghiệm có hai yếu tố:

- Yếu tố A: Môi trường có agar (8,0 g/l) và không agar, ký hiệu từ A1 đến A2

- Yếu tố B: 6 nồng độ TDZ (0 mg/l; 0,5 mg/l; 1,0 mg/l; 1,5 mg/l; 2 mg/l; 3 mg/l),

ký hiệu từ B1 đến B6

Phối hợp 2 yếu tố:

Yếu tố B (nồng độ TDZ, mg/l) Phối hợp hai yếu tố

12 nghiệm thức từ 1, 2, 3 đến 12 theo thứ tự sau:

Ký hiệu NT Phối hợp yếu tố Ký hiệu NT Phối hợp yếu tố

Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên

Số bình thí nghiệm/1 nghiệm thức/1lần lặp lại: 3

Số mẫu/1 bình thí nghiệm: 10 mẫu

Tổng số bình thí nghiệm cho 1 nghiệm thức: 3 x 3 = 9

Chỉ tiêu theo dõi:

- Thời gian hình thành chồi: Từ ngày cấy mẫu đến khi 50 % chồi mới xuất hiện

- Hệ số nhân chồi: Tổng số chồi hình thành/Tổng số chồi ban đầu

- Số đốt hình thành: Đếm số đốt hình thành trên một cây

- Chiều dài chồi

- Số lá: Tổng số lá đếm được

- Kích thước lá: Đo chiều dài, chiều rộng lá

- Thời gian thu thập số liệu: 50 NSC, 65 NSC, 80 NSC

3/ Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của NAA đến khả năng tạo rễ của lan Gấm

Mục tiêu:

Tìm nồng độ thích hợp của NAA cho sự hình thành và phát triển của rễ cây lan Gấm

Vật liệu: Chọn những cụm chồi xanh tốt, đồng nhất

Môi trường nền (MTN): Môi trường MS + 8,0 g/l agar + 30 g/l đường + 0,2

g/l than hoạt tính +100 ml/l nước dừa (pH= 5,7)

Số bình thí nghiệm/1 nghiệm thức/1lần lặp lại: 3

Số mẫu/1 bình thí nghiệm: 10 mẫu

Tổng số bình thí nghiệm cho 1 nghiệm thức: 3 x 3 = 9

Chỉ tiêu theo dõi:

- Thời gian hình thành rễ: Từ ngày cấy mẫu đến khi 50 % rễ xuất hiện

- Chiều dài rễ: Đo từ đầu rễ đến chóp rễ (cm)

Chương 4

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Trong môi trường nuôi cấy, mầm bên tăng trưởng tạo một chồi hoặc cụm chồi cao không đồng đều do tính ưu thế ngọn Muốn tạo một cụm chồi với các chồi có chiều cao gần bằng nhau thì phải làm mất tính ưu thế ngọn này bằng cách hủy đỉnh hoặc cho chất điều hòa sinh trưởng thực vật là cytokinin vào môi trường nuôi cấy Chúng tôi đã tiến hành thí nghiệm bổ sung BA, TDZ vào môi trường nuôi cấy lan Gấm

4.1 Ảnh hưởng của agar và BA trong môi trường MS đến khả năng nhân chồi

cây lan Gấm in vitro (Thí nghiệm 1)

4.1.1 Thời gian phát sinh chồi

Bảng 4.1: Ảnh hưởng của BA đến thời gian phát sinh chồi của lan Gấm

Yếu tố A (agar, g/l) Thời gian ra chồi (ngày)

Các số có cùng chữ số trong một cột có sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê

**: sự khác biệt rất có ý nghĩa thống kê ở mức α = 0,01

Kết quả phân tích thống kê (phụ lục 2) và Bảng 4.1 cho thấy:

Có sự khác biệt rất có ý nghĩa thống kê giữa môi trường có agar và không có agar (P < 0,01) và môi trường không có agar tốt hơn có agar (8,5 ngày; 17,5 ngày)

Có sự khác biệt rất có ý nghĩa thống kê giữa các nồng độ BA Trong đó, tốt nhất ở nồng độ 2,0 mg/l BA (9 ngày), thấp nhất ở nồng độ 0 mg/l (15,8 ngày)

Xét sự tương tác AB ta thấy, giữa các nghiệm thức có sự khác biệt rất có ý nghĩa thống kê (P < 0,01) Trong đó, nồng độ 2,0 mg/l BA trên nền không có agar cho kết quả tốt nhất (6 ngày) và có sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê so với nồng độ 1,5 mg/l BA (7 ngày) Thấp nhất ở nồng độ 0 mg/l BA ở nền có agar (20,7 ngày)

Tóm lại: Nồng độ 2,0 mg/l BA hoặc 1,5 mg/l trên nền môi trường không có agar thích hợp cho hình thành chồi mới của lan Gấm

Kết quả được thể hiện rõ ở Biểu đồ 4.1

4.1.2 Hệ số nhân chồi và chiều cao chồi

16,3 12,3

17,3

8,7 6,0

7,0

10,3 11,0

7,7

0 5 10 15 20 25

Biểu đồ 4.1: Ảnh hưởng của BA đến thời gian phát sinh chồi của lan Gấm

Bảng 4.2: Ảnh hưởng của BA đến hệ số nhân chồi và chiều cao chồi của lan Gấm

Yếu tố A (A1- có 8,0 g agar/l và A2- không có agar)

F(A) = 1176,5**; F(B) = 87,4**; F(AB) = 87,4**; CV (%) = 6,3

0 3,77c 2,10e 2,93c 4,10d 2,33g 3,21d

0,5 4,08bc 2,31e 3,20b 4,64bc 2,62fg 3,63c

1,0 4,29b 2,40e 3,35b 4,90b 2,74f 3,84bc1,5 4,31b 2,50e 3,38b 5,00b 2,94f 3,98b2,0 5,32a 3,00d 4,15a 6,25a 3,59e 4,92a

Các số có cùng chữ số trong một cột có sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê

**: sự khác biệt rất có ý nghĩa thống kê ở mức α = 0,01

*: sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức α = 0,05

Kết quả phân tích thống kê (phụ lục 2) và Bảng 4.2 cho thấy:

Chỉ tiêu hệ số nhân chồi

Trong môi trường có agar, tất cả các mức BA ở cả ba kỳ theo dõi có hệ số nhân chồi đều bằng 1

Có sự khác biệt rất có ý nghĩa thống kê giữa môi trường có agar và không

có agar (P < 0,01) và môi trường không agar cho kết quả tốt hơn (2,00 _ 65 NSC; 2,11 _ 80 NSC) trong môi trường có agar (1,00 _ 65 NSC; 1,00 _ 80 NSC)