ĐÁNH GIÁ ĐỘ AN TOÀN CỦA VACCINE THỬ NGHIỆM PHÒNG BỆNH GAN THẬN MỦ TRÊN CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus)

Đề tài được thực hiện để đánh giá độ an toàn của vaccine thử nghiệm đối với cá tra bột và cá tra giống bằng phương pháp ngâm ở các nồng độ khác nhau kết hợp với cho ăn và đánh giá khả nă

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ĐÁNH GIÁ ĐỘ AN TOÀN CỦA VACCINE THỬ NGHIỆM

PHÒNG BỆNH GAN THẬN MỦ TRÊN CÁ TRA

(Pangasianodon hypophthalmus)

Họ và tên sinh viên: ĐẶNG KHOA NGUYÊN Ngành: NUÔI TRỒNG THỦY SẢN

Chuyên ngành: NGƯ Y Niên khóa: 2005-2009

Tháng 9/2009

ĐÁNH GIÁ ĐỘ AN TOÀN CỦA VACCINE THỬ NGHIỆM PHÒNG BỆNH

GAN THẬN MỦ TRÊN CÁ TRA

(Pangasianodon hypophthalmus)

Tác giả

ĐẶNG KHOA NGUYÊN

Khóa luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp bằng Kỹ sư

ngành Nuôi Trồng Thủy Sản, chuyên ngành Ngư Y

Giáo viên hướng dẫn:

TS NGUYỄN HỮU THỊNH

CẢM TẠ

Tôi xin cảm ơn:

Gia đình và những người thân đã luôn ủng hộ và động viên tôi cả về vật chất và tinh thần trong suốt quá trình học tập

Ban giám hiệu Trường Đại Học Nông Lâm Tp.HCM

Ban chủ nhiệm khoa thủy sản cùng toàn thể quý thầy cô đã giảng dạy và cung cấp kiến thức cho tôi trong quá trình học tập

Và đặc biệt là thầy Nguyễn Hữu Thịnh người đã cung cấp kiến thức và trực tiếp hướng dẫn để tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp

Thầy Trần Hữu Lộc, anh Nguyễn Viết Phương và bạn Vũ Thị Mộng Huyền những người đã giúp tôi hoàn thành đề tài

Đồng thời tôi xin gửi lời cảm ơn đến các bạn lớp DH05NY và các bạn khóa 31

đã động viên và giúp đỡ chúng tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Dù đã cố gắng nhưng do hạn chế về thời gian cũng như về mặt kiến thức nên luận văn này không tránh khỏi những thiếu sót Tôi rất mong nhận được những ý kiến

đóng góp của quý thầy cô và các bạn để luận văn được hoàn chỉnh hơn

TÓM TẮT

Đề tài “Đánh giá độ an toàn của vaccine thử nghiệm phòng bệnh gan thận mủ

trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus)” được thực hiện từ ngày 10/04/2009 -

10/08/2009 tại trại thực nghiệm Khoa Thủy Sản và phòng thí nghiệm Bệnh Học Thủy Sản, Khoa Thủy Sản, Trường Đại Học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh

Đề tài được thực hiện để đánh giá độ an toàn của vaccine thử nghiệm đối với cá tra bột và cá tra giống bằng phương pháp ngâm ở các nồng độ khác nhau kết hợp với cho ăn và đánh giá khả năng bảo hộ miễn dịch đối với bệnh gan thận mủ trên cá tra Chúng tôi đã tiến hành thử nghiệm 2 lần

Lần 1: để xác định nồng độ an toàn của vaccine thử nghiệm đối với cá bột 4

và 5 ngày tuổi Cá tra bột 4 và 5 ngày tuổi sẽ được ngâm vaccine pha loãng trong nước với tỉ lệ 1:9 ở mỗi nghiệm thức có 300 cá tra bột và được lập lại 3 lần Cá ở nghiệm thức cấp vaccine sẽ được ngâm vaccine trong 3 giờ, theo dõi và quan sát biểu hiện của

cá thử nghiệm liên tục trong 3 giờ và ghi nhận kết quả và so sánh với cá ở nghiệm thức đối chứng Kết quả cho thấy ngâm ở tỉ lệ 1 : 9 trong 3 giờ vaccine thử nghiệm có ảnh hưởng tới cá bột 4 và 5 ngày tuổi với tỉ lệ chết cao 86,5% và 93,8 % trong khi ở nghiệm thức đối chứng tỉ lệ chết là 0,9% và 0% trong cùng điều kiện

Lần 2: xác định độ an toàn của vacccine thử nghiệm trên cá tra giống 5g

Cá tra giống 5g sẽ được ngâm vaccine pha loãng trong nước với tỉ lệ 1 : 90 ở mỗi nghiệm thức có 100 con với 3 lần lập lại Cá được ngâm trong 15 phút và thực hiện liên tục trong 3 ngày Sau đó cá ở các nghiệm thức ngâm vaccine sẽ được cho ăn thức

ăn có trộn vaccine thử nghiệm dạng cho ăn liên tục trong 4 tuần rồi ngưng trộn vaccine, cho cá ăn thức ăn bình thường thêm 2 tuần Tiến hành gây bệnh để đánh giá khả năng bảo hộ miễn dịch của vaccine thử nghiệm Kết quả cho thấy vaccine thử nghiệm hoàn toàn an toàn với cá 5g và khả năng bảo hộ miễn dịch trung bình là 45,7%

MỤC LỤC

Trang

Trang tựa i

Cảm tạ ii

Tóm tắt iii

Mục lục iv

Danh sách các chữ viết tắt ix

Danh sách các bảng x

Danh sách các hình xi

Danh sách các sơ đồ và đồ thị xii

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục Tiêu Đề Tài 2

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN 3

2.1 Tổng quan về việc sử dụng vaccine trong nuôi trồng thủy sản 3

2.1.1 Định nghĩa về vaccine 3

2.1.2 Lịch sử phát triển của vaccine trong nuôi trồng thủy sản 3

2.1.3 Phân loại vaccine 4

2.1.3.1 Vaccine vô hoạt (Inactivated) 4

2.1.3.2 Vaccine hỗn hợp 4

2.1.3.3 Vaccine sống (Live Attenuated) 4

2.1.3.4 Vaccine tiểu phần (recombinant) 4

2.1.3.5 DNA vaccine 5

2.1.4 Phương pháp sử dụng vaccine 5

2.1.4.1 Phương pháp ngâm 5

2.1.4.2 Phương pháp tiêm 6

2.1.4.3 Phương pháp cho ăn 6

2.1.4.4 Phương pháp nhúng 6

2.1.4.5 Bơm cao áp 6

2.1.4.6 Bơm vào đường ruột 6

2.1.5 Vai trò của việc sử dụng vaccine trong nuôi trồng thủy sản 7

2.1.6 Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả của vaccine dùng trong thủy sản 8

2.1.6.1 Yếu tố di truyền 8

2.1.6.2 Tình trạng của đối tượng được cấp vaccine 8

2.1.6.3 Các yếu tố môi trường 8

2.1.6.4 Trình độ kỹ thuật của người sử dụng 8

2.1.7 Nguyên tắc sử dụng vaccine 8

2.1.8 Đánh giá hiệu quả của sử dụng vaccine 9

2.2 Bệnh Gan Thận Mủ Trên Cá Tra 9

2.2.1 Lịch sử bệnh do Edwardsiella ictaluri 10

2.2.2 Tác nhân gây bệnh 10

2.2.2.1 phân loại 10

2.2.2.2 Đặc điểm sinh lý sinh hóa của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri 11

2.2.2.3 Đặc điểm gây bệnh 11

2.2.3 Đường lây truyền của E ictaluri 12

2.2.4 Chẩn đoán 12

2.2.6 Bệnh tích 13

2.2.7 Phòng và trị bệnh 13

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

3.1 Thời Gian và Địa Điểm Thực Hiện 14

3.2 Vật Liệu Nghiên Cứu 14

3.2.1 Dụng cụ 14

3.2.2 Hóa chất và môi trường 14

3.3 Đối Tượng Nghiên Cứu 14

3.3.1 Chế phẩm 14

3.3.2 Cá thí nghiệm 15

3.3.3 Vi khuẩn thí nghiệm 15

3.4 Phương Pháp Nghiên Cứu 15

3.4.1Phương pháp chuẩn bị để đánh giá độ an toàn của vaccine thử nghiệm 15

3.4.2 Phương pháp chuẩn bị huyền dịch vi khuẩn 16

3.4.3 Phương pháp xác định số lượng tế bào vi khuẩn sống 17

3.4.4 Phương pháp gây nhiễm thực nghiệm 17

3.4.5 Phương pháp theo dõi cá sau khi gây nhiễm 18

3.4.6 Phương pháp cấy phân lập vi khuẩn từ cá bệnh 18

3.4.7 Phương pháp cấy thuần 19

3.4.8 Phương pháp định danh 19

3.4.8.1 Phương pháp nhuộm Gram 20

3.4.8.2 Thử nghiệm về khả năng di động của vi khuẩn bằng cách xem trực tiếp dưới kính hiển vi 21

3.4.8.3 Thử nghiệm catalase 21

3.4.8.5 Thử nghiệm LDC và di động bằng kit định danh IDS 14 GNR 21

3.4.9 Phương pháp kiểm tra kí sinh trùng của cá 22

3.4.10 Phương pháp thí nghiệm 23

3.4.10.1 Đánh giá độ an toàn của vaccine thử nghiệm 23

3.4.10.2 Đánh giá khả năng bảo hộ miễn dịch của vaccine thử nghiệm đối với vi khuẩn Edwardsiela ictaluri 25

3.4.11 Phương pháp xử lí số liệu 26

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27

4.1 Các chỉ tiêu môi trường 27

4.1.1 Đối với cá bột 27

4.1.2 Đối với cá 5g 28

4.2 Kết quả kiểm tra để đánh giá độ an của vaccine thử nghiệm 29

4.2.1 Kết quả kiểm tra sức khỏe cá nuôi trong quá trình thí nghiệm 29

4.2.2 Kết quả tỷ lệ sống của cá trong quá trình cấp vaccine thử nghiệm 31

4.2.2.1 Đối với cá bột 31

4.2.2.2 Đối với cá 5g 33

4.2.3 Kết quả kiểm tra tăng trọng 34

4.2.4 Kết quả kiểm tra về lượng thức ăn 34

4.3 Kết quả đánh giá khả năng bảo hộ miễn dịch của vaccine thử nghiệm đối với bệnh gan thận mủ trên cá tra 35

4.3.1 Số lượng vi khuẩn có trong bình tăng sinh gốc và lượng vi khuẩn sống có trong dung dịch gây nhiễm cho cá 35

4.3.2 Kết quả quá trình phân lập và định danh vi khuẩn 35

4.3.3 Tỷ lệ cá chết ở các nghiệm thức 37

4.3.4 Hiệu quả bảo hộ miễn dịch của vaccine thử nghiệm ở các lô

nghiệm thức 42

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 44

5.1 Kết Luận 44

5.2 Đề Nghị 44

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

BHIA Brain Heart Infusion Agar

BHIB Brain Heart Infusion Broth

CFU Colony forming unit

ctv Cộng tác viên

FAO Food and Agriculture Organization

FKC Formaline Killed Cell

PAD Phenyl Alanin Deaminnase

PCA plate count Agar

RPS Relative Percent Survival

VP Voges – Poskauer

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng

Bảng 3.1: Số thứ tự các đĩa giấy trong các giếng 20 Bảng 4.1: Các chỉ tiêu môi trường trong bể ương 27 Bảng 4.2: Các chỉ tiêu môi trường trong quá trình nuôi thí nghiệm 28 Bảng 4.3: Các chỉ tiêu môi trường trong quá trình gây bệnh thực nghiệm trong phòng lạnh 29 Bảng 4.4: Bảng kiểm tra sức khỏe cá nuôi trong suốt quá trình thí nghiệm 30 Bảng 4.5: Số lượng và tỉ lệ cá chết trong quá trình cấp vaccine thử nghiệm ở

cá bột 4 ngày tuổi 31 Bảng 4.6: Số lượng và tỉ lệ cá chết trong quá trình cấp vaccine thử nghiệm ở

cá bột 5 ngày tuổi 31 Bảng 4.7 Số lượng cá chết trung bình trong quá trình cấp vaccine thử nghiệm dạng cho ăn 33 Bảng 4.8 Trọng lượng trung bình của cá trước và sau khi tiến hành

thí nghiệm 34 Bảng 4.9: Lượng thức ăn trung bình của cá ở các lô nghiệm thức

và đối chứng 34

Bảng 4.10: Kết quả các phản ứng sinh hóa của E ictaluri 37

Bảng 4.11: Tỷ lệ chết trung bình của các lô thí nghiệm khi gây nhiễm 41 Bảng 4.12: Khả năng bảo hộ miễn dịch RPS (%) của các nghiệm thức khi

gây nhiễm 43

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình

Hình 3.1: Đếm số lượng cá bột cho vào các vèo 16

Hình 3.2: Số lượng khuẩn lạc trên đĩa cấy phù hợp ở độ pha loãng 10-7 17

Hình 3.3: Gây bệnh cho cá bằng phương pháp ngâm 18

Hình 3.4: Vèo chứa cá bột 4 ngày tuổi 24

Hình 3.5: Cá được bố trí để chuẩn bị gây bệnh 26

Hình 4.1: Quá trình ngâm cá bột trong phòng lạnh 27

Hình 4.2: Hệ thống bể composite bố trí thí nghiệm 28

Hình 4.3: Sán lá đơn chủ kí sinh trên mang cá 29

Hình 4.4: Cá bột 4 ngày tuổi đang ngâm trong vaccine 32

Hình 4.5: Cấp vaccine thử nghiệm dạng ngâm cho cá 5g 33

Hình 4.6: Số lượng khuẩn lạc ở độ pha loãng 10-7 35

Hình 4.7: Khuẩn lạc Edwardsiella ictaluri trên môi trường BHIA sau 48 giờ ở 30oC 36

Hình 4.8: Gan, thận bị hoại tử của cá ở lô đối chứng vào ngày thứ 5 gây bệnh 39

Hình 4.9: Kết quả định danh vi khuẩn từ cá bệnh 39

Hình 4.10: Thận, gan của cá tra thí nghiệm bị hoại tử vào ngày thứ 7 ở lô NT2 40

Hình 4.11: Gan, thận, lách và tụy tạng cá tra bị hoại tử nặng vào ngày thứ 8 ở lô ĐC3 41

Chương 1

MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Thủy sản là ngành có nhiều thế mạnh ở nước ta hiện nay, và là một trong ba ngành có đóng góp lớn nhất cho kim ngạch xuất khẩu của Việt Nam Cùng với sự phát triển của ngành thủy sản, đóng góp của nuôi trồng thủy sản ngày càng tăng do sản lượng khai thác thủy sản trong những năm gần đây không tăng đáng kể Với các đối tượng xuất khẩu chính của nghề NTTS thì tôm sú vẫn là đối tượng có đóng góp cao nhất cho tổng giá trị xuất khẩu của Việt Nam, tiếp theo đó là cá tra và cá Basa với sản lượng 1,452 tỷ USD, chiếm 32,2 % tổng giá trị xuất khẩu thuỷ sản (4,509 tỷ USD) năm 2008

Bên cạnh sự phát triển nhanh chóng của nghề nuôi ven biển và nghề nuôi biển thì nghề nuôi cá nước ngọt vẫn khẳng định được vai trò của mình Với lịch sử lâu đời của nghề nuôi cá nước ngọt và những đối tượng nuôi có giá trị cao và nhu cầu lớn trên thị trường như cá tra và basa, nghề nuôi thủy sản nước ngọt vẫn là một trong những nghề mũi nhọn của NTTS tại Việt Nam

Cùng với sự phát triển của nhiều hình thức nuôi thì vấn đề dịch bệnh đã trở thành một trong những trở ngại chính cho sự phát triển bền vững của NTTS nước ngọt Việt Nam Ví dụ như bệnh gan thận mủ trên cá tra và basa đã gây thiệt hại không nhỏ cho

sự phát triển của đối tượng này Hiện nay việc phòng trị bệnh trên cá nước ngọt ở nước

ta vẫn chủ yếu dựa vào sử dụng thuốc kháng sinh và hóa chất Hiện chưa có một loại vaccine phòng bệnh cho cá được đưa vào sử dụng tại Việt Nam Việc phòng trị bệnh phụ thuộc vào các loại thuốc kháng sinh và hóa chất gần đây đã khiến cho việc xuất khẩu thủy sản của Việt Nam gặp nhiều khó khăn Ví dụ cụ thể đó là việc cấm sử dụng chloramphenicol, flomequine và xanh malachite đã ảnh hưởng lớn cho nghề xuất khẩu

cá tra và basa của Việt Nam Vì vậy việc nghiên cứu, phát triển các phương pháp

phòng bệnh có hiệu quả như sử dụng các loại thảo dược và vaccine cho cá nước ngọt

là cần thiết nhằm đảm bảo cho sự phát triển bền vững của nghề

Vì cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus) là đối tượng có sản lượng lớn nên

đã thu hút được nhiêu công ty sản xuất vaccine trên thế giới đầu tư nghiên cứu vào lĩnh vực này Nhưng ngoài việc đánh giá hiểu quả bảo hộ miễn dịch thì vaccine cần được đánh giá mức độ an toàn khi sử dụng Do đó chúng tôi đã tiến hành đề tài nghiên

cứu “Đánh giá độ an toàn của vaccine thử nghiệm phòng bệnh gan thận mủ trên

cá tra (Pangasianodon hypophthalmus)” để phát triển và ứng dụng trong sản xuất

1.2 Mục Tiêu Đề Tài

Đánh giá độ an toàn của vaccine thử nghiệm phòng bệnh gan thận mủ trên cá tra

(Pangasianodon hypophthalmus)

2.1.2 Lịch sử phát triển của vaccine trong nuôi trồng thủy sản

1936, Nybelin đã công bố nghiên cứu của mình về đáp ứng miễn dịch của cá đối

với vi khuẩn Vibrio angullarum Đến năm 1939, ông nghiên cứu đáp ứng miễn dịch của cá đối với Pseudomonas punctada

1940, Smith công bố nghiên cứu của mình về đáp ứng miễn dịch của cá đối với

Bacterium salmonicida (Aeromonas salmonicida)

1942, Duff chứng minh một cách rõ ràng cá có thể tạo ra kháng thể chống lại vi

khuẩn Bacterium salmonicida

Từ 1942 – 1946, các công trình nghiên cứu này bị gián đoạn bởi sự bùng nổ của chiến tranh thế giới

1966, khi nền công nghiệp nuôi cá hồi phát triển mạnh nhưng cá nuôi thường bị

bệnh đỏ miệng do vi khuẩn Vibrio anugillarum và V ordalli gây ra nên đã kích thích

sự phát triển vaccine phòng bệnh Và vaccine phòng bệnh trong nuôi trồng thủy sản được bắt đầu nghiên cứu và phát triển mạnh từ năm 1973 nhưng mãi đến cuối những năm 1987 mới được đưa vào sử dụng (Newman, 1993) Cho đến tháng 7 năm 2005, đã

có 35 loại vaccine phòng bệnh vi khuẩn và 2 loại vaccine phòng bệnh vi rút được đăng

ký bản quyền và sử dụng cho 6 đối tượng nuôi phổ biến trên 41 quốc gia trên thế giới bao gồm cá hồi, cá chẽm châu âu, cá chẽm châu á, cá rô phi và cá bơn đuôi vàng

2.1.3 Phân loại vaccine

2.1.3.1 Vaccine vô hoạt (Inactivated)

Vaccine vô hoạt là vaccine được sản xuất trực tiếp từ chủng vi khuẩn gây bệnh, sau khi nuôi cấy tăng sinh và diệt vi khuẩn bằng nhiệt hoặc hóa chất (formalin, glutaraldehyde) Loại vaccine này rẻ, công nghệ sản xuất đơn giản và có thể sản xuất với quy mô lớn phù hợp với điều kiện Việt Nam Tuy nhiên trong một số trường hợp hiệu quả của vaccine vô hoạt thấp nên các loại vaccine khác được phát triển và ứng dụng vào sản suất

2.1.3.2 Vaccine hỗn hợp

Vaccine hỗn hợp là loại vaccine có chứa nhiều hơn một chủng vi khuẩn gây bệnh

đã được bất hoạt nhằm gia tăng khả năng phòng cho một hoặc nhiều bệnh khác nhau

2.1.3.3 Vaccine sống (Live Attenuated)

Vaccine sống là loại vaccine được sản xuất dựa vào biến đổi gene của chủng vi

khuẩn gây bệnh Công việc quan trọng nhất của việc sản xuất được loại vaccine này là xác định được gen độc lực và loại bỏ gene độc lực trước khi sử dụng vi khuẩn vẫn còn sống Đây là loại vaccine đòi hỏi công nghệ cao để sản xuất và nguy cơ vi khuẩn không độc lực trở thành chủng gây bệnh do biến đổi gen hoặc thu nhập gen độc từ chủng vi khuẩn gây bệnh

2.1.3.4 Vaccine tiểu phần (recombinant)

Là loại vaccine được sản xuất từ tiểu phần kháng nguyên của tác nhân gây bệnh Thông thường tiểu phần kháng nguyên của vi khuẩn chiếm tỉ lệ rất nhỏ trong cấu trúc

tế bào như thành tế bào ở vi khuẩn hoặc một phần vỏ, protein, nội hoặc ngoại bào của

vi khuẩn cũng như vi rút

Vaccine có thể được sản suất theo 3 phương pháp dưới đây

Sản xuất vaccine tiểu phần bằng cách tách chiết trực tiếp tiểu phần kháng nguyên từ vi khuẩn sau khi nuôi cấy tăng sinh như làm vỡ tế bào, tách lọc protein nội hoặc ngoại bào tùy vào thành phần của kháng nguyên

Vaccine tiểu phần có thể sản xuất được bằng cách xác định gene độc lực của vi khuẩn sau đó đưa gene độc lực vào plasmid hoặc bacteriophage, trước khi đưa vào vi

khuẩn E.coli và nuôi cấy vi khuẩn này trong điều kiện đặc biệt nhằm sản suất ra tiểu

phần kháng nguyên cần thiết Sau đó tách lọc kháng nguyên và sử dụng như vaccine tiểu phần

Sau khi xác định được gene độc lực của chúng ta có thể tổng hợp protein nhân tạo bằng phương pháp phòng thí nghiệm Việc nghiên cứu và sản xuất loại vaccine này rất tốn kém, giá thành cao nên ít loại vaccine tiểu phần được sử dụng trong NTTS

2.1.3.5 DNA vaccine

Là loại vaccine có thành phần chính là gen độc lực của chủng vi khuẩn gây bệnh được tổng hợp và đưa trực tiếp vào cơ thể cá hoặc được nhân lên trong vi sinh vật mang nước trước khi đưa vào cơ thể cần được bảo vệ Đây là công nghệ sản xuất vaccine mới nhất và thường được áp dụng trong việc sản xuất vaccine phòng bệnh do virut gây ra Một nhược điểm lớn nhất của loại vaccine này đó là chi phí sản xuất rất cao vì vậy ít được áp dụng trong nuôi trồng thủy sản

2.1.4 Phương pháp sử dụng vaccine

Việc sử dụng vaccine trong thủy sản cũng có nhiều phương pháp khác nhau Tùy từng loại vaccine khác nhau mà phương pháp sử dụng cũng khác nhau Vì vậy tùy từng loại vaccine và khẳ năng áp dụng mà chúng ta có thể sử dụng bằng các phương pháp dưới đây

2.1.4.1 Phương pháp ngâm

Sử dụng vaccine theo phương pháp này bằng cách ngâm cá trực tiếp trong vaccine Nồng độ và thời gian xử lý phụ thuộc vào loại vaccine và dùng theo chỉ dẫn của nhà sản xuất Tuy nhiên để tăng hiệu quả sử dụng của vaccine thì tùy từng đối tượng nuôi và kích thước cá mà ta có thể thay đổi nồng độ ngâm nhằm gia tăng hiệu quả của vaccine Đây là phương pháp dễ áp dụng và có chi phí thấp

2.1.4.2 Phương pháp tiêm

Vaccine có thể được tiêm vào trong xoang bụng hay tiêm vào cơ Kích thước cá

và liều sử dụng theo chỉ dẫn của nhà sản xuất

Đây là phương pháp sử dụng cho hiệu quả vaccine cao nhất Tuy nhiên chi phí sử dụng và thời gian sử dụng là tốn kém nhất

2.1.4.3 Phương pháp cho ăn

Đây là phương pháp sử dụng vaccine đơn giản nhất và có chi phí sử dụng thấp nhất Tuy nhiên chỉ có vaccine tiểu phần mới áp dụng theo phương pháp này vì các loại vaccine khác khi sử dụng theo phương pháp này có hiệu quả rất thấp

Ngoài ra còn có thể cấp vaccine theo các cách sau như:

2.1.4.4 Phương pháp nhúng

Đây là phương pháp sử dụng vaccine với nồng độ cao và ngâm trực tiếp cá vào trong vaccine Đây là phương pháp sử dụng đơn giản và thời gian xử lý ngắn nhưng hiệu quả hạn chế và tốn nhiều vaccine

2.1.4.5 Bơm cao áp

Đây là phương pháp sử dụng vaccine giống với phương pháp tiêm, tuy nhiên chúng ta không sử dụng mũi kim thông thường mà sử dụng xilanh có áp xuất cao để đưa vaccine vào vật chủ mà không gây ra vết thương bên ngoài Chi phí sử dụng

vaccine cao phương pháp này cũng rất cao và đòi hỏi có trang thiết bị chuyên dụng

2.1.4.6 Bơm vào đường ruột

Tương tự với việc sử dụng vaccine bằng phương pháp tiêm nhưng thay vì tiêm

cơ hoặc tiêm xoang bụng phương pháp này sử dụng bằng cách tiêm vào đường ruột thông qua hậu môn Mặc dù việc sử dụng vaccine theo phương pháp này có hiệu quả tốt và không gây thương tổn cho cá tuy nhiên chi phí cao vì tốn nhiều công lao động

2.1.5 Vai trò của việc sử dụng vaccine trong nuôi trồng thủy sản

Trong nuôi trồng thủy sản một khi bệnh đã xảy ra thường gây hậu quả rất nghiêm trọng nên phòng bệnh bao giờ cũng tốt hơn chữa bệnh

Một trong những lợi thế lớn khác của việc sử dụng vaccine trong nuôi trồng thủy sản đó là làm giảm thiểu việc sử dụng thuốc kháng sinh và hóa chất, vừa tiết kiệm được tiền của vừa không làm ảnh hưởng xấu đến môi trường ao nuôi, vừa tăng năng suất cá nuôi nhưng vẫn đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm

Ta có thể lấy một ví dụ điển hình là ngành công nghiệp nuôi cá hồi trên thế giới Ngành công nghiệp nuôi cá hồi mới phát triển đầu những năm 1980 đến năm

2003 sản lượng trên thế giới đạt khoảng 700.000 tấn Tuy nhiên bệnh do vi khuẩn là một trong những trở ngại cho ngành công nghiệp này Lượng kháng sinh sử dụng trong nghề nuôi cá hồi tăng dần từ 0,3 - 0,9 kg/tấn sản phẩm vào năm 1987 (FAO, 2006) Sau đó lượng kháng sinh sử dụng giảm dần từ khi xuất hiện các loại vaccine có hiệu quả trong việc phòng bệnh do vi khuẩn gây ra trên đối tượng này từ những năm

90 của thế kỷ trước và cho đến nay hầu như không còn sử dụng kháng sinh trong nghề nuôi cá hồi thương phẩm Việc sử dụng vaccine không chỉ thay thế thuốc kháng sinh trong nghề nuôi cá hồi mà còn làm giảm chi phí sản xuất cá hồi trên thế giới Theo số liệu thống kê của FAO vào năm 2006 thì chi phí để sản xuất ra 1 kg cá hồi năm 1987

là 7 Euro, đến năm 2003 đã giảm xuống còn dưới 2 Euro/kg Có nhiều nguyên nhân giúp cho chi phí sản xuất cá hồi giảm như: cải tiến công nghệ nuôi, hoàn thiện thức ăn công nghiệp và đặc biệt là tăng tỉ lệ sống của cá nhờ vào việc sử dụng các loại vaccine phòng bệnh vi khuẩn trên đối tượng này Cũng theo FAO cho đến năm 2005 có đến 95% tổng số cá được tiêm vaccine trước khi đưa vào nuôi thương phẩm và tỉ lệ sống của cá nuôi thương phẩm đạt trên 90%

Một ưu điểm khác của việc sử dụng vaccine là giúp tránh được tình trạng kháng thuốc của vi khuẩn Đây là một trong những vấn đề đáng lo ngại

2.1.6 Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả của vaccine dùng trong thủy sản

2.1.6.1 Yếu tố di truyền

Đây là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hiệu quả của vaccine

vì mỗi loài cá khác nhau sẽ có khả năng đáp ứng miễn dịch khác nhau Do đó trước khi tiến hành sản xuất một loại vaccine nào đó cần nghiên cứu thật kỹ khả năng đáp ứng miễn dịch của đối tượng đó

2.1.6.2 Tình trạng của đối tượng được cấp vaccine

Cỡ cá (cá lớn sẽ có sức đề kháng tốt hơn cá nhỏ) Cá khỏe mạnh sẽ cho đáp ứng miễn dịch tốt hơn cá yếu Cá có điều kiện dinh dưỡng tốt sẽ cho đáp ứng miễn dịch tốt hơn những cá được nuôi trong điều kiện dinh dưỡng kém

2.1.6.3 Các yếu tố môi trường

Cá được nuôi trong điều kiện môi trường nước tốt, có các chỉ tiêu môi trường như pH, nhiệt độ, ôxy hòa tan, NH3 trong khoảng thích hợp sẽ cho đáp ứng tốt so với

cá sống trong môi trường bất lợi

2.1.6.4 Trình độ kỹ thuật của người sử dụng

Các thao tác trong quá trình cấp vaccine cần phải được chuẩn bị tốt, thao tác phải chính xác và đúng Tránh gây shock cho cá nuôi Phải có kiến thức trong việc bảo quản vaccine

Việc sử dụng các loại thuốc và hóa chất khác: các loại thuốc và kháng sinh sẽ ảnh hưởng đến khả năng đáp ứng miễn dịch của cá từ đó sẽ ảnh hưởng đến hiệu quả của vaccine Khi tiêm hồng cầu thỏ vào cơ của cá chép, đáp ứng miễn dịch dịch thể thứ phát có thể được phát hiện vào ngày thứ 9 Tuy nhiên nếu xử lí cá thí nghiệm với Oxytetracycline bằng cách tiêm (3 ngày tiêm một lần, trong 15 ngày trước khi tiêm hồng cầu thỏ hoặc cho ăn trong suốt thời gian thí nghiệm thì mức độ đáp ứng miễn dịch dịch thể của cá sẽ bị sụt giảm 90% so với cá đối chứng (Rijkers, 1980)

2.1.7 Nguyên tắc sử dụng vaccine

Chỉ sử dụng vaccine theo hướng dẫn của nhà sản xuất

Sẽ đạt được hiệu quả bảo hộ cao nếu ta cấp vaccine nhiều lần

Nên cấp vaccine cho cá trước khi sử dụng con giống nuôi thương phẩm

Chỉ nên cấp vaccine vào những khoảng thời gian có nhiệt độ, thời tiết ít thay đổi Không cấp vaccine khi cá đang bệnh

Tránh gây stress cho cá khi tiêm vaccine (3 tuần sau khi vận chuyển phân cỡ cá mới nên tiêm vaccine)

Những người có kỹ thuật và được huấn luyện mới đủ khả năng cấp vaccine cho

cá

Khi đang cấp vaccine mà cá chết thì ngưng ngay

Chỉ nên sử dụng vaccine có nguồn gốc xuất xứ rõ ràng

2.1.8 Đánh giá hiệu quả sử dụng vaccine

Muốn đánh giá hiệu quả của một loại vaccine người ta thường bố trí gây nhiễm trên hai nhóm cá Nhóm cá được gây miễn dịch bằng loại vaccine cần xác định và nhóm cá đối chứng không được gây miễn dịch rồi theo dõi tỉ lệ sống của các nhóm cá trong một khoảng thời gian định trước Thường là 14 ngày hoặc theo dõi cho đến khi không còn cá chết Đòi hỏi có một số tiêu chuẩn cơ bản như: mỗi nhóm phải có tối thiểu 25 cá thể với độ lặp lại tối thiểu là 2 Việc gây nhiễm với tác nhân gây bệnh phải đạt được tỉ lệ chết hoặc mắc bệnh trên 50% nhưng nhỏ hơn 90% đối với nhóm cá đối chứng Nguyên nhân tử vong của mọi cá thể trong thí nghiệm phải được xác minh với

số cá chết do nguyên nhân khác ngoài tác nhân gây bệnh không được vượt quá 10% đối với tất cả các nhóm

Khi đó hiệu quả bảo hộ RPS (Relative Percent Survival) sẽ được tính theo công thức sau:

RPS (%) = 100 x (1 – Tỷ lệ chết của lô cấp vaccine/ Tỷ lệ chết của lô không cấp vaccine)

Vaccine được xem là có hiệu quả bảo hộ cho cá, có thể đưa vào ứng dụng trong thực tế khi RPS ≥ 60% (Bader và ctv, 2004)

2.2 Bệnh Gan Thận Mủ Trên Cá Tra

2.2.1 Lịch sử bệnh do Edwardsiella ictaluri

1976 bệnh được ghi nhận trên cá da nheo (Ictalurus punctatus) là một loại cá da

trơn của Mỹ 1979 bệnh bắt đầu được mô tả

1981 lần đầu tiên mô tả nguyên nhân do vi khuẩn gây bệnh và được định danh với tên bệnh là bệnh nhiễm trùng huyết và viêm ruột (Enteric Septicemia of catfish: ECS)

Tên gọi khác: bệnh lỗ đầu (hole in the head disease) vì sau khi sống sót cá chuyển sang mãn tính và trên đầu có một vết loét

Là một trong những bệnh nguy hiểm nhất ảnh hưởng ảnh đến công nghiệp nuôi cá

da trơn tại Mỹ Tại khu vực Đông Nam Á bệnh được phát hiện trên cá da trơn Thái Lan vào năm 1987 Bệnh xuất hiện trên cá Tra và Ba Sa nuôi ao bè ở Việt Nam vào năm

1992 đến năm 2001 thì bệnh được gọi là bệnh mủ gan và bệnh bắt đầu được lưu ý khi nghề nuôi cá tra và basa phát triển Năm 2002 bệnh được định danh chính xác là do

Edwardsiella ictaluri gây bệnh trên cá tra nuôi tại Việt Nam Bệnh xảy ra trên mô hình

nuôi cá bè, ao đất, bể xi măng và kể cả cá nuôi trên bể kính

Những khu vực bị ảnh hưởng chủ yếu là những vùng có nghề nuôi cá tra phát triển mạnh, mang tính chất công nghiệp như: An Giang, Đồng Tháp, Cần Thơ và Vĩnh Long, sau đó lây lan sang các vùng lân cận Đặc biệt những năm gần đây bệnh này cũng xuất hiện ở một số tỉnh mới phát triển nghề nuôi cá tra như Trà Vinh, Bến Tre và Sóc Trăng (Từ Thanh Dung và ctv, 2004)

Loài: Edwardsiella ictaluri (Bùi Quang Tề, 2006)

2.2.2.2 Đặc điểm sinh lý sinh hóa của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri

+ Edwardsiella ictaluri thuộc họ vi khuẩn Enterobacteriaceae, là trực khuẩn

gram âm kích thước 1 x 2 – 3 μm, không sinh bào tử, là vi khuẩn yếm khí tùy nghi, phản ứng catalase dương tính, oxidase âm tính, không oxy hoá, lên men trong môi

trường glucose E ictaluri có từ 1 - 3 plasmid (Speyerer và Boyle 1987, Newton và

ctv, 1988) Chức năng của chúng vẫn chưa được làm rõ, nhưng có giả thuyết cho rằng

chúng quan trọng trong việc nâng cao tính kháng đối với kháng sinh của E ictaluri Vi

khuẩn phát triển chậm trên môi trường nuôi cấy, cần mất 36 - 48 giờ để hình thành những khuẩn lạc nhỏ li ti trên thạch BHIA tại 28 – 300C (Valerie và ctv, 1994), phát triển yếu hoặc không phát triển ở 370C Khi trong môi trường nuôi cấy có sự hiện diện

của một loài vi khuẩn phát triển nhanh hơn E ictaluri (như Aeromonas) thì khi đó chúng sẽ ức chế hoặc làm cho E ictaluri phát triển rất chậm (Shotts và Walman,

1990)

2.2.2.3 Đặc điểm gây bệnh

Vi khuẩn thuộc nhóm vi khuẩn gây bệnh bắt buộc, chỉ tồn tại trong nước được trong một thời gian ngắn khoảng 8 ngày (Hawke, 1979), tuy nhiên chúng có thể tồn tại trong bùn đến 95 ngày ở 25oC (Plumb và Quinlan, 1986)

Vi khuẩn có khả năng tồn tại trong gan, thận, não vài tháng sau khi cá khỏi bệnh

Vì cá luôn ở trạng thái mang trùng và bài thải vi khuẩn ra môi trường nước nên có thể

sẽ gây bệnh cho các cá khác ở điều kiện môi trường thuận lợi cho sự phát triển của vi khuẩn Vi khuẩn có thể xâm nhập trực tiếp từ ruột, mũi, mang vào cơ thể cá Vi khuẩn trong nước có thể qua đường mũi của cá xâm nhập vào cơ quan khứu giác và di chuyển vào dây thần kinh khứu giác, sau đó vào não (Miyazaki và Plumb, 1985; Shott

và ctv, 1986) E ictaluri cũng có thể theo thức ăn vào bên trong cơ thể cá qua niêm

mạc ruột vào máu gây nhiễm trùng máu (Shott và ctv, 1986) Bằng đường này thì vi khuẩn vào mao mạch trong biểu bì gây hoại tử và mất sắc tố da Vi khuẩn được bài thải từ phân xác cá chết vào nước

Bệnh bộc phát mạnh ở nhiệt độ 20-28oC đặc biệt trong khoảng 24-28oC vi khuẩn

có độc lực mạnh nhất Khi nhiệt độ trên 30oC tỉ lệ cá chết giảm dần

2.2.3 Đường lây truyền của E ictaluri

Bệnh do Edwardsiella ictaluri có khả năng lây lan mạnh với tỉ lệ chết cao bệnh

có thể lây lan trực tiếp từ cá này sang cá khác trong môi trường nước qua chất thải như phân cá bệnh hoặc do cá khỏe ăn cá bệnh chết

Chim và các dụng cụ như: lưới, vợt … dùng chung cho các ao có thể làm lây lan mầm bệnh Tuy nhiên dụng cụ dùng chung giữa các ao nếu được khử trùng hoặc phơi nắng thì có thể giết được vi khuẩn

2.2.4 Chẩn đoán

Khó quan sát dưới kính hiển vi quang học vì vi khuẩn là trực khuẩn

Vi khuẩn được phân lập ở gan, thận, lách vi khuẩn gây bệnh với độc lực mạnh nhất ở 20-28oC gây chết cấp tính chết nhanh và nhiều Nên lấy mẫu cá lúc này để định danh vi khuẩn được chính xác

Phân lập nên sử dụng môi trường thạch không nên sử dụng môi trường canh vì

vi khuẩn khác sẽ phát triển lấn át vi khuẩn mục tiêu Sử dụng môi trường BHIA là tốt nhất hoặc TSA+5% máu

Đĩa cấy nên giữ ở nhiệt độ 28-30oC trong 48 giờ Có thể dùng kit API 20E để định danh vi khuẩn

Chuẩn đoán bằng miễn dịch: phản ứng ngưng kết trên phiết kính (slide aglutination), phản ứng ELISA cho kết quả nhanh chính xác

Kỹ thuật PCR ít được sử dụng vì đòi hỏi kỹ thuật cao, máy móc phức tạp cũng như tay nghề cao

2.2.5 Triệu chứng

Cá bệnh có biểu hiện bỏ ăn, bơi lờ đờ trên mặt nước sau khi bị nhiễm khuẩn Cá thường treo lơ lửng cơ thể ở trên mặt nước và tụ tập thành một đám do cá yếu Cá bệnh cũng xuất hiện triệu chứng thần kinh thường là nhào lộn và bơi xoay tròn Khi bệnh nặng cá không phản ứng với tiếng động

Cá bệnh thường thấy xuất huyết quanh hậu môn, miệng, bụng, vây và gốc vây

Cá có thể xuất huyết điểm trên thân hoặc xuất huyết toàn thân Cá bị nhiễm E ictaluri

thường bị phù đầu do tích dịch ở dưới da vùng sọ Khi dịch quá nhiều sẽ chảy xuống

hốc mắt gây lồi mắt Quan sát mang cá thấy màu sắc nhợt nhạt do E ictaluri có khả

năng gây dung huyết làm mất máu

2.2.6 Bệnh tích

Gan và thận cá bệnh sưng rất to có hiện tượng nhũn biểu hiện rõ nhất là ở thận, lách sưng ít hơn Cá bệnh trên gan thận lách xuất hiện mảng trắng hoại tử Khi bệnh nặng, chúng phát triển thành đốm trắng tròn có chứa dịch hơi đặc (mủ), những đốm trắng xuất hiện trên khắp bề mặt và cả bên trong gan, thận, lách Các đốm trắng này có đường kính khoảng 1-3mm

Cá bị bệnh thường tích dịch viêm ở xoang bụng có màu hơi vàng và có thể lẫn

máu Cá nhiễm Edwardsiella ictaluri thường bỏ ăn do đó bên trong ruột cá bệnh trống

không chứa thức ăn, lòng ruột có chứa dịch lẫn máu Đồng thời còn thấy cá bị xuất huyết điểm trên ruột, cơ và mô mỡ

2.2.7 Phòng và trị bệnh

Khó phòng bệnh vì bệnh lưu hành thường xuyên trên cá tra nuôi công nghiệp Bệnh xảy ra hầu như suốt năm Nguồn nước lấy vào ao nuôi thường trực tiếp từ sông nên việc ngăn chặn mầm bệnh vào ao hầu như là không thể Vì vậy biện pháp ngăn chặn tốt nhất là nâng cao sức khỏe của cá tránh cá bị stress do mật độ nuôi cao và môi trường chất lượng nước kém

Không sử dụng các loại hóa chất diệt kí sinh trùng trong thời gian nhiệt độ nước thích hợp cho sự phát triển của vi khuẩn, trong quá trình cải tạo đáy ao cần phơi đáy hút bỏ bùn đáy ao, sát trùng đáy ao vì vi khuẩn tồn tại rất lâu trong bùn

Cá thải vi khuẩn vào môi trường nước theo phân nên khi thấy ao có bệnh nên ngưng cho ăn để giảm khả năng lây lan đồng thời vớt bỏ cá bệnh cá yếu

Dụng cụ cần được tiệt trùng và dung riêng cho mỗi ao nên phơi nắng sau khi sử dụng

Chọn con giống khỏe mạnh, không nhiễm bệnh

Chương 3

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời Gian Và Địa Điểm Thực Hiện

Đề tài được thực hiện từ ngày 10/04 - 10/08/2009 tại trại thực nghiệm Khoa Thủy Sản và phòng thí nghiệm Bệnh Học Thủy Sản, Khoa Thủy Sản, Trường Đại Học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh

3.2 Vật Liệu Nghiên Cứu

3.2.1 Dụng cụ

Bể composite, hệ thống sục khí, vèo, vợt, kính hiển vi, cân điện tử, bộ đồ tiểu phẫu, votex, tủ cấy vi sinh, tủ ủ, tủ đông, bộ test Sera (kiểm tra pH, NH3, DO), nhiệt kế…

Ống đong, bình tam giác, kim tiêm 1 mL, đĩa petri, que cấy vòng, que cấy thẳng, đèn cồn, lame, lamelle, bông thấm và một số dụng cụ thí nghiệm cần thiết khác

3.2.2 Hóa chất và môi trường

Môi trường canh Brain Heart Infusion Broth (BHIB) dùng tăng sinh vi khuẩn Môi trường thạch Brain Heart Infusion Agar (BHIA) cấy và phân lập vi khuẩn Môi trường PCA dùng để cấy trang đếm số lượng khuẩn lạc

Hóa chất nhuộm gram: crystal violet, fuchsin, lugol, dung dịch tẩy màu, nước cất, dầu soi kính

Hóa chất nhuộm mẫu mô phết: giemsa, cồn 700

3.3 Đối Tượng Nghiên Cứu

3.3.1 Chế phẩm

Vaccine thử nghiệm dạng ngâm: liều dùng 1L/90L nước ngâm trong 15 phút đối

Liều dùng 1L/9L nước đối với cá bột được 4 và 5 ngày tuổi

Vaccine thử nghiệm dạng cho ăn : liều dùng 1mL/100g thức ăn

3.3.2 Cá thí nghiệm

Cá bột vừa mới nở được đưa từ trại giống ở Đồng Tháp về ương tại trại thực nghiệm Cá được cho vào các bể composite có thể tích 600 lít đã được chuẩn bị sẵn hệ thống sục khí và gây màu Sau khi tiêu hết noãn hoàn cá được cho ăn moina và thức ăn tomboy số 0 đến khi cá bột được 3 ngày tuổi sẽ đếm và cho vào các vèo có kích thước 45*45*45 cm với số lượng 300 con mỗi vèo Chuẩn bị các chậu có thể tích 2 lít để tiến hành thí nghiệm

Cá tra giống khỏe mạnh sạch bệnh, trọng lượng từ 4-5g, sau khi đưa về cá được trữ trong các vèo cắm ở ao Mỗi ngày cho cá ăn 2 lần, cho cá ăn ở mức tối đa Một ngày trước khi tiến hành chuyển cá ta không cho cá ăn Cá được chuyển vào các bể composite có thể tích 600 lít trước 3-4 ngày để thích ứng với các điều kiện môi trường

Cá được ngâm trong nước muối với nồng độ 15-20ppt trong 10 phút để diệt bớt kí sinh trùng trước khi cho vào bể

3.3.3 Vi khuẩn thí nghiệm

Chủng E ictaluri VL33 phân lập từ cá tra bị bệnh gan thận mủ vào tháng

6/2008 tại Vĩnh Long được bảo quản ở nhiệt độ -200C tại phòng thí nghiệm Bệnh Học Thủy Sản, Khoa Thủy Sản, Trường Đại Học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh

3.4 Phương Pháp Nghiên Cứu

3.4.1 Phương pháp chuẩn bị để đánh giá độ an toàn của vaccine thử nghiệm

Cá bột 4 và 5 ngày tuổi chứa trong các vèo sẽ được chuyển vào phòng lạnh có nhiệt độ thích hợp để tránh gây stress cho cá Sau đó đếm số lượng và cho vào các chậu có thể tích 2 lít đã chuẩn bị sẵn 900mL nước, cho moina vào trong các chậu để tránh cho cá bột ăn nhau Cho vào mỗi chậu 100mL vaccine thử nghiệm dạng ngâm ở các lô nghiệm thức theo dõi biểu hiện của cá trong 3 giờ để đánh giá độ an toàn của vaccine đối với cá Trong quá trình ngâm nước trong các chậu được sục khí liên tục

Hình 3.1: Đếm số lượng cá bột cho vào các vèo

Đối với cá 5g lượng nước trong các bể composite trong quá trình trữ cá được xả

bỏ toàn bộ Sau đó cho vào bể 10 lít nước và 110 mL vaccine thử nghiệm dạng ngâm ở các lô nghiệm thức, theo dõi 15 phút để đánh giá độ an toàn của vaccine thử nghiệm đối với cá và thực hiện liên tục trong 3 ngày Trong quá trình ngâm, nước trong bể được sục khí liên tục

Đối với vaccine thử nghiệm dạng cho ăn sau khi cá đươc ngâm vaccine vào ngày thứ 4 tiến hành trộn 1mL vaccine với 100g thức ăn để khô trong 30 phút sau đó cho cá ăn Ngày cho ăn 2 lần và cho ăn tối đa Cho cá ăn liên tục trong 30 ngày để đánh giá độ an toàn của vaccine đối với cá

3.4.2 Phương pháp chuẩn bị huyền dịch vi khuẩn

Làm thuần vi khuẩn: vi khuẩn từ ống giữ giống được cấy ria trên các đĩa môi trường BHIA bên trong tủ cấy vô trùng Sau đó đem ủ ở nhiệt độ 300C trong 48 giờ

Từ đĩa cấy chọn những khuẩn lạc đặc trưng đem cấy thuần trên môi trường BHIA và đem ủ ở nhiệt độ 300C trong 48 giờ

Tăng sinh vi khuẩn: sau khi vi khuẩn tạo thành các khuẩn lạc trên các đĩa môi trường BHIA đã cấy Ta chọn những khuẩn lạc rời, đặc trưng dùng que cấy vòng chuyển vài khuẩn lạc đã chọn vào bình tam giác chứa 300 mL môi trường BHIB Sau

đó cho bình dung dịch tăng sinh lên máy lắc, lắc trong khoảng 18 giờ ở điều kiện nhiệt

độ 25 - 280C

3.4.3 Phương pháp xác định số lượng tế bào vi khuẩn sống

Để xác định số lượng tế bào vi khuẩn có trong môi trường sau khi tăng sinh ta tiến hành pha loãng môi trường theo hệ số 10 để tạo thành các dung dịch có độ pha loãng từ 10-1 - 10-9

Từ mỗi độ pha loãng hút 0,1 mL dung dịch nhỏ lên đĩa thạch PCA (ở mỗi độ pha loãng lặp lại 2 lần), sau đó dùng que cấy trang, trang đều dung dịch trên thạch, đem ủ

ở 300C trong 48 giờ

Từ số khuẩn lạc tại mỗi nồng độ tương ứng ta suy ra số tế bào vi khuẩn có trong dung dịch tăng sinh (chỉ đếm ở các đĩa có số khuẩn lạc từ 25 - 250)

Hình 3.2: Số lượng khuẩn lạc trên đĩa cấy phù hợp ở độ pha loãng 10-7

3.4.4 Phương pháp gây nhiễm thực nghiệm

Cho cá vào xô có chứa 10 lít nước, cho tiếp vào xô 50 mL huyền dịch vi khuẩn

đã tăng sinh Ngâm cá trong thời gian 1 giờ Trong suốt quá trình gây nhiễm có sử dụng hệ thống sục khí

Hình 3.3: Gây bệnh cho cá bằng phương pháp ngâm

3.4.5 Phương pháp theo dõi cá sau khi gây nhiễm

Sau khi gây nhiễm, ghi nhận các biểu hiện của cá trong bể Ghi nhận tỷ lệ cá chết

ở mỗi bể Khi cá chết ghi nhận các biểu hiện bên ngoài của cá sau đó giải phẩu ghi nhận các biểu hiện bên trong Đối với cá mới chết ta cấy phân lập vi khuẩn từ gan, thận, lách Những cá hấp hối được tính như cá chết

3.4.6 Phương pháp cấy phân lập vi khuẩn từ cá bệnh

Phân lập vi khuẩn từ não, gan, thận, và lách

Cách tiến hành:

Dùng kéo và kẹp mổ xoang bụng của cá bằng 3 đường cắt (1 đường xuất phát

từ lỗ hậu môn cắt song song với đường bụng và 1 đường xuất phát từ lỗ hậu môn song song với đường bên Đường thứ 3 song song rìa nắp mang và cắt 2 đường bên) Khi

mổ cần phải cẩn thận tránh mũi kéo gây tổn hại các cơ quan bên trong Sau khi cắt xong tách rời 1 bên xoang bụng cho thấy nội tạng bên trong

Dùng 1 miếng bông gòn đã tẩm cồn lau sạch phần máu và dịch xoang bụng (nếu có)

Quan sát và ghi nhận biểu hiện của các nội quan

Tách lấy cơ quan cần phân lập Đặt lên 1 miếng bông gòn đã tẩm cồn, sau đó sát trùng mặt ngoài của cơ quan này

Cắt ngang 1 phần của cơ quan này Chấm cơ quan này lên môi trường thạch đã được chuẩn bị sao cho mặt vừa mới cắt tiếp xúc với mặt thạch Thao tác này phải được tiến hành nhanh và gần ngọn lửa đèn cồn để hạn chế việc tạp nhiễm

Từ vết chấm cấy ria trên thạch Sau đó đem đĩa thạch đã được cấy đi ủ trong tủ

ủ với nhiệt độ 300C trong 48 giờ

3.4.7 Phương pháp cấy thuần

Từ các khuẩn lạc thu được sau khi cấy phân lập từ cá bệnh ta tiến hành việc cấy thuần

Mục đích của việc cấy thuần là để định danh vi khuẩn nhằm xác định chính xác tác nhân gây bệnh

Cách tiến hành:

Chọn khuẩn lạc đặc trưng Sau đó, cấy ria trên môi trường BHIA đã được chuẩn

bị sẵn Thao tác này phải tiến hành nhanh tránh tạp nhiễm Sau đó đặt các đĩa thạch đã cấy xong vào tủ ủ ở 300C trong 48 giờ

3.4.8 Phương pháp định danh

Trong đề tài này do vi khuẩn dùng để gây bệnh là E ictaluri là một loại trực

khuẩn gram âm nên chúng tôi tiến hành định danh các chủng vi khuẩn nghi ngờ bằng

bộ kit định danh Nam Khoa (IDS 14 GNR) Đây là một hệ thống bao gồm 14 thử nghiệm sinh hóa dùng để định danh các trực khuẩn gram âm, bằng cách sử dụng mã định danh Bộ định danh này bao gồm các phản ứng: Oxidase, lên men Glucose, khử Nitrate, thử nghiệm ONPG, sinh Urease, PAD, Citrate, thủy giải Esculin, sinh H2S, sinh Indol, Voges-poskauer (VP), Malonate, LDC, di động Trong bộ định danh này có một ống thạch mềm để thử tính di động và phản ứng LDC, một lọ chứa các đĩa giấy để thử phản ứng Oxidase Một bảng nhựa gồm 10 giếng có chứa các đĩa giấy đã được tẩm hóa chất dùng để thử các phản ứng sinh hóa còn lại Các giếng này được đánh số từ 1 –

10 và được xếp theo thứ tự được trình bày ở bảng 3.1

Bảng 3.1: Số thứ tự các đĩa giấy trong các giếng

1 Lên men Glucose

7 Thủy giải Esculin

8 Sinh Indol và sinh H2S

10 Sử dụng Malonate

3.4.8.1 Phương pháp nhuộm Gram

Phương pháp thực hiện:

Nhỏ 1 giọt nước muối sinh lí lên lame Dùng que cấy vòng đã khử trùng để

nguội, chọn lấy một khuẩn lạc riêng lẽ Chuyển khuẩn lạc sang lame nơi có nước muối

sinh lí Dùng que cấy vòng trang đều tạo thành vết bôi để khô tự nhiên trong không

khí

Sau khi vết bôi đã khô ta cố định mẫu bằng cách hơ thật nhanh mẫu qua ngọn

lửa đèn cồn 3 – 4 lần Không được hơ quá nóng vì sẽ làm các tế bào co lại

Phủ dung dịch crystal violet lên vết phết, để 1 phút Rửa bằng nước và nghiêng

lame cho ráo nước

Phủ dung dịch lugol lên vết phết, để 1 phút Rửa bằng nước

Nhúng lame vào cồn 95% khoảng 30 giây Rửa bằng nước

Phủ dung dịch fuschin lên vết phết, để 30 giây Rửa nước Để khô và quan sát

dưới vật kính dầu

3.4.8.5 Thử nghiệm LDC và di động bằng kit định danh IDS 14 GNR

Trong bộ định danh này thử nghiệm LDC và di động được xác định trên môi trường thạch mềm

Cách tiến hành: dùng que cấy thẳng đã được tiệt trùng lấy một khuẩn lạc rời có thời gian phát triển từ 18 – 24 giờ, mở nắp môi trường LDC và cấy đâm thẳng xuống

đáy lọ môi trường, không cho que cấy chạm đáy của ống môi trường, đóng nắp môi trường lại và để trong tủ ấm có nhiệt độ 300C Thao tác này phải tiến hành nhanh và gần ngọn lửa đèn cồn để không bị tạp nhiễm

Đọc kết quả:

LDC: (+) vi khuẩn mọc, môi trường giữ màu tím hoặc vàng nhạt

(-) vi khuẩn mọc, môi trường chuyển màu vàng

Di động: (+) vi khuẩn mọc và lan nhòe đường cấy

(-) vi khuẩn chỉ mọc trên đường cấy

3.4.9 Phương pháp kiểm tra kí sinh trùng của cá

Để đánh giá tình trạng sức khỏe tổng quát ban đầu của cá và trong quá trình nuôi Việc kiểm tra kí sinh trùng được tiến hành định kỳ 2 tuần 1 lần

Cách tiến hành:

Cá được làm chết và đặt trong khay mổ sạch

Quan sát hình dạng ngoài của cá ở da mang gốc vây Cần lưu ý các biểu hiện khác thường bên ngoài như xuất huyết, nổi u hạt trên da, màu sắc của mang

Kiểm tra ngoại kí sinh: dùng lame cạo lấy nhớt ở nhiều vị trí khác nhau trên cơ thể cá: da, vây,… Sau đó gạt nhẹ nhớt cạo được lên một lame khác, nhỏ lên đó 1 hoặc

2 giọt nước sạch rồi dàn mỏng lớp nhớt trên lame, đậy lamelle lên và quan sát dưới kính hiển vi

Kiểm tra kí sinh trùng ở cung mang: dùng kéo cắt bỏ nắp mang Cắt riêng từng cung mang, nhúng sơ qua một đĩa nước đã chuẩn bị trước để rửa bớt máu Đặt từng cung mang lên lame, quan sát dưới kính hiển vi từ bội giác nhỏ đến bội giác lớn

Xử lý dạng ngâm Xử lý dạng cho ăn

Gây bệnh thực nghiệm

NT 1 90 ~60 ngày Vào ngày 1,2,3 Từ ngày 4-34 30 cá

NT 2 90 ~60 ngày Vào ngày 1,2,3 Từ ngày 4-34 30 cá

NT 3 90 ~60 ngày Vào ngày 1,2,3 Từ ngày 4-34 30 cá

3.4.10.1 Đánh giá độ an toàn của vaccine thử nghiệm

Đối với cá bột 5 ngày tuổi

Cá được đếm và cho vào các vèo có kích thước 45*45*45 cm đặt trong các bể composite có thể tích 600 lít đã được chuẩn bị sẵn Số lượng cá ở mỗi nghiệm thức là

300 con Cá được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên vào 6 vèo với nghiệm thức cấp vaccine

3 lần lập lại và nghiệm thức đối chứng 3 lần lập lại

Hình 3.4: Vèo chứa cá bột 4 ngày tuổi

Cá ở 3 bể nghiệm thức cấp vaccine: ngâm cá trong dung dịch vaccine thử nghiệm với liều lượng 1L/ 9L nước ngâm trong 3 giờ

Cho vào mỗi chậu 900mL nước cho cá vào sau đó cho vào mỗi chậu 100mL vaccine thử nghiệm ở các lô nghiệm thức Quan sát biểu hiện của cá trong 3 giờ, quá trình tiến hành thí nghiệm có sục khí

Cá ở nghiệm thức đối chứng: tiến hành tương tự tất cả các thao tác nhưng không sử dụng vaccine thử nghiệm

Đối với cá có trọng lượng 5g

Cá được bố trí ngẫu nhiên vào 6 bể composite có thể tích 600 lít số lượng cá ở mỗi bể là 90 con

Cá ở các bể nghiệm thức cấp vaccine: ngâm trong vaccine thử nghiệm với liều lượng 1L/90L nước ngâm trong 15 phút cá được sục khí liên tục trong suốt quá trình ngâm Tiến hành liên tục như vậy trong 3 ngày Sau đó cá được cho ăn thức ăn có trộn vaccine liên tục trong 30 ngày ngày ăn 2 lần với lượng ăn tối đa sử dụng thức ăn Cargill (Aquaxcel-7424) thích hợp với cỡ cá

Từ ngày thứ 30-45 cho cá ăn thức ăn không có sử dụng vaccine

Nguồn nước dùng trong thí nghiệm là nước máy đã được trữ trong các bể chứa nước trước khi sử dụng

Lượng nước thay mỗi ngày từ 10 – 20% lượng nước của bể nuôi

Trước khi tiến hành bố trí vào các bể nuôi, cá được kiểm tra kí sinh trùng đảm bảo cá thí nghiệm là hoàn toàn khỏe mạnh Bên cạnh đó cá vẫn được kiểm tra kí sinh trùng 2 tuần 1 lần

Cá ở các bể nghiệm thức đối chứng không sử dụng vaccine thử nghiệm

3.4.10.2 Đánh giá khả năng bảo hộ miễn dịch của vaccine thử nghiệm đối với vi

khuẩn Edwardsiela ictaluri

Cá sau khi ngưng cho ăn thức ăn có trộn vaccine 15 ngày được tiến hành gây bệnh để đánh giá khả năng bảo hộ miễn dịch của vaccine thử nghiệm

Cá tiến hành thí nghiệm được chuyển vào phòng thí nghiệm trong các bể composite có thể tích 90 lít mỗi bể 30 con Với nghiệm thức cấp vaccine 3 lần lập lại

và nghiệm thức đối chứng 3 lần lập lại

Hình 3.5: Cá được bố trí để chuẩn bị gây bệnh

Vào ngày thứ 5 từ lúc chuyển cá chúng tôi bắt đầu tiến hành gây nhiễm bằng cách ngâm cá trong 10 lít nước chứa 50 mL vi khuẩn đã tăng sinh trong BHIB ở 25 -

280C trong 18 giờ, trong các xô nhựa có thể tích 16 lít Thời gian ngâm cá gây nhiễm

là 1 giờ và cá được sục khí liên tục trong suốt thời gian gây nhiễm Theo dõi và ghi nhận tỉ lệ cá chết trong 14 ngày, biểu hiện và bệnh tích của cá chết đồng thời cấy phân lập và định danh lại tác nhân gây bệnh

3.4.11 Phương pháp xử lí số liệu

Xử lí các số liệu thu được bằng phần mềm Minitab