KHẢO SÁT TÌNH HÌNH BỆNH GAN THẬN MỦ VÀ KHẢ NĂNG KHÁNG FLORFENICOL CỦA Edwardsiella ictaluri PHÂN LẬP TRÊN CÁ TRA TẠI MỘT VÀI TRẠI NUÔI Ở HUYỆN CHÂU THÀNH TỈNH AN GIANG

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT TÌNH HÌNH BỆNH GAN THẬN MỦ VÀ KHẢ NĂNG KHÁNG FLORFENICOL CỦA Edwardsiella ictaluri P

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT TÌNH HÌNH BỆNH GAN THẬN MỦ VÀ KHẢ

NĂNG KHÁNG FLORFENICOL CỦA Edwardsiella ictaluri

PHÂN LẬP TRÊN CÁ TRA TẠI MỘT VÀI TRẠI NUÔI Ở

HUYỆN CHÂU THÀNH TỈNH AN GIANG

Họ và tên sinh viên: ĐÀO NGỌC THỦY

ĐINH THỊ TƯỜNG VÂN

Ngành:NUÔI TRỒNG THỦY SẢN CHUYÊN NGÀNH NGƯ Y Niên khóa: 2005 – 2009

Tháng 9/2009

KHẢO SÁT TÌNH HÌNH BỆNH GAN THẬN MỦ VÀ KHẢ NĂNG

KHÁNG FLORFENICOL CỦA Edwardsiella ictaluri PHÂN LẬP TRÊN

CÁ TRA TẠI MỘT VÀI TRẠI NUÔI Ở HUYỆN CHÂU THÀNH TỈNH

AN GIANG

Tác giả

ĐÀO NGỌC THỦY ĐINH THỊ TƯỜNG VÂN

Khóa luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu

cấp bằng Kỹ sư ngành Nuôi Trồng Thủy Sản chuyên ngành Ngư y

Giáo viên hướng dẫn:

ThS HỒ THỊ TRƯỜNG THY

Tháng 9 năm 2009

CẢM TẠ

Chúng tôi kính gửi lòng biết ơn chân thành đến:

Ban Giám Hiệu Trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh

Ban Chủ Nhiệm Khoa Thủy Sản cùng toàn thể quý thầy cô đã tận tình giảng dạy, cung cấp và truyền đạt cho chúng tôi những kiến thức quý báu trong suốt quá trình học tập

Đặc biệt chúng tôi xin gửi lòng biết ơn sâu sắc đến cô Hồ Thị Trường Thy đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ chúng tôi hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp này

Xin gửi lời cảm ơn đến tất cả bạn bè và tập thể lớp Ngư Y 31 đã giúp đỡ, chia

sẻ và động viên chúng tôi trong suốt thời gian qua

Cảm ơn cha mẹ và gia đình đã luôn ở bên cạnh, động viên và hỗ trợ về tinh thần lẫn vật chất cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài

Do hạn chế về thời gian cũng như về mặt kiến thức nên luận văn này không tránh khỏi những thiếu sót Chúng tôi rất mong nhận được sự đóng góp ý kiến của quý thầy

cô và các bạn để luận văn được hoàn chỉnh hơn

TÓM TẮT

Đề tài: “Khảo sát tình hình bệnh gan thận mủ và khả năng kháng Florfenicol

của Edwardsiella ictaluri phân lập trên cá tra tại một vài trại nuôi ở huyện Châu

Thành tỉnh An Giang” được thực hiện từ ngày 19/03/2009 đến ngày 19/07/2009 tại

huyện Châu Thành, tỉnh An Giang và phòng thí nghiệm Bệnh Học Thuỷ Sản, Khoa Thuỷ Sản, trường Đại học Nông Lâm, Thành Phố Hồ Chí Minh

Đề tài chia làm 2 quá trình:

Quá trình thu mẫu được thực hiện vào từng đợt khác nhau, khảo sát tình hình bệnh gan thận mủ trên cá tra tại một vài trại nuôi ở huyện Châu Thành, tỉnh An Giang

Quá trình tiến hành làm MIC tại phòng thí nghiệm Bệnh Học Thuỷ Sản, Khoa Thuỷ Sản, trường Đại học Nông Lâm, Thành Phố Hồ Chí Minh để xác định khả năng

kháng Florfenicol của Edwardsiella ictaluri phân lập từ quá trình thu mẫu

Kết quả thu được:

Bệnh gan thận mủ tăng dần theo từng tháng, bệnh thường xảy ra trên cá giống,

cỡ cá từ 0,2 – 300 gam Qua kết quả thu mẫu ở 4 tháng liên tiếp, cho thấy bệnh xảy ra cao nhất vào tháng 5 và tháng 6, bởi vì lúc này thời tiết thay đổi, hay có mưa nên làm cho cá yếu đi, do đó cá rất dễ bị bệnh nhưng tỷ lệ tăng không đáng kể vì đợt chúng tôi thu mẫu chưa vào mùa cao điểm xảy ra bệnh, cùng với công tác quản lý tốt ở một số trại nuôi

Giá trị nồng độ ức chế tối thiểu của sản phẩm AQUAFEN® chứa Florfenicol giữa các đợt thu mẫu (các tháng khác nhau) thì có sự khác nhau đáng kể Giá trị MIC thấp nhất thu được là 1,0 µg/ml (đợt 1), giá trị MIC cao nhất thu được là 32 µg/ml (đợt 4) Điều này cho thấy chủng vi khuẩn phân lập của đợt thu mẫu lần 4 có tính kháng Florfenicol cao hơn hẳn so với chủng vi khuẩn được phân lập của 3 đợt thu mẫu trước Giá trị MIC tăng dần theo từng tháng Sử dụng kháng sinh chữa trị cho cá diễn ra thường xuyên, dùng với liều lượng cao hơn liều khuyến cáo đã gây ra hiện tượng

kháng kháng sinh Càng về sau khả năng kháng florfenicol của E ictaluri càng cao với

tỷ lệ tăng khá nhanh so với những năm trước Và có thể nhận định rằng vi khuẩn E

ictaluri đang dần kháng thuốc đối với kháng sinh Florfenicol

MỤC LỤC

Trang

Trang tựa i Cảm tạ ii Tóm tắt iii Mục lục iv Danh sách các chữ viết tắt viii

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1.2 Phân bố 3 2.1.3 Môi trường sống 4

2.1.4 Đặc điểm dinh dưỡng 4

2.1.5 Đặc điểm sinh trưởng 4

2.2.7 Một số nghiên cứu bệnh do E.ictaluri gây ra 13

2.3 Tình Hình Nuôi Cá Tra Tại Tỉnh An Giang 14

2.3.1 Tình hình nuôi 14

2.4 Sơ Lược Về Nồng Độ Ức Chế Tối Thiểu (Minimal Inhibitory Concentration) 15

2.4.1 Định nghĩa 15 2.4.2 Mục đích 15 2.4.3 Nguyên tắc 15

2.5.3 Nguyên tắc sử dụng kháng sinh trong nuôi trồng thuỷ sản 17

2.5.5 Cơ chế kháng kháng sinh của vi khuẩn 19

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

3.1 Thời Gian Và Địa Điểm 21

3.3.1 Phương pháp thu mẫu 23

3.3.2 Thu thập thông tin tại vùng thu mẫu (Huyện Châu Thành, Tỉnh An Giang) 23

3.3.3 Đánh giá cảm quan tình trạng sức khỏe cá nuôi 23

3.4 Phương Pháp Phân Lập Vi Khuẩn 23

3.4.1 Các thao tác vô trùng khi lấy mẫu 23

3.4.2 Phân lập, làm thuần vi khuẩn 24

3.5 Phương Pháp Định Danh Vi Khuẩn 24

4.1 Các Thông Số Môi Trường 31

4.3 Kết Quả Khảo Sát Tình Hình Bệnh Gan Thận Mủ Tại Trại Thu Mẫu 35

4.3.1 Dấu hiệu bệnh tích các mẫu cá nghi ngờ bị nhiễm gan thận mủ 35

4.3.2 Kết quả phân lập và định danh vi khuẩn 36

4.3.3 Tỷ lệ mắc bệnh gan thận mủ tại các trại nuôi qua các đợt thu mẫu 40

4.4 Khảo Sát Giá Trị MIC Của Sản Phẩm AQUAFEN® Trên Mẫu

Cá Bệnh Gan Thận Mủ Của Quá Trình Thu Mẫu 44

4.4.1 Kết quả giá trị MIC của Florfenicol trên các mẫu cá bệnh gan thận mủ 44

4.4.3 So sánh với những kết quả nghiên cứu trước đây 52

5.1 Kết Luận 54 5.2 Đề Nghị 54

TÀI LIỆU THAM KHẢO 56 Tài liệu Tiếng Việt

Tài liệu Tiếng Anh

PHỤ LỤC

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ĐBSCL : Đồng Bằng Sông Cửu Long

E ictaluri : Edwardsiella ictaluri

SECFDL : Southeastern Cooperative Fish Disease Laboratory BHIA : Brain Heart Infusion Agar

BHIB : Brain Heart Infusion Broth

IDS 14 GNR : Indentification System with 14 biochemical reationsfor

Indentification of non fastidious Gram Negative Rods EIA : Edwardsiella ictaluri agar

MIC : Minimal Inhibitory Concentration

MHB : Miller Hilton Broth

MHA : Miller Hilton Agar

ESC : Enteric Septicemia of Catfish

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Trang

Bảng 3.1: Thứ tự các đĩa giấy sinh hoá cho vào các giếng 26

Bảng 3.2: Kết quả phản ứng sinh hoá trong các giếng 28

Bảng 3.3: Bảng tính điểm để có code định danh vi khuẩn 28

Bảng 3.4: Nồng độ Florfenicol được pha loãng từ dung dịch gốc 29

Bảng 4.2: Mật độ thả cá ở các trại 33

Bảng 4.3: Loại thức ăn sử dụng ở các trại 34

Bảng 4.4: Tỷ lệ cá nghi ngờ bị nhiễm bệnh so với số cá thu mẫu ngẫu nhiên 35

Bảng 4.5: Kết quả định danh bằng test kit IDS 14 GNR 37

Bảng 4.6: Bảng ghi kết quả của bộ định danh IDS 14 GNR 38

Bảng 4.7: Bảng tỷ lệ cá khoẻ và tỷ lệ cá bệnh gan thận mũ (đã định danh được) 39

Bảng 4.8: Tỷ lệ cá mắc bệnh và tỷ lệ cá khỏe tại trại Bình Thạnh

Bảng 4.9: Tỷ lệ cá mắc bệnh và tỷ lệ cá khỏe tại trại Anh Tuấn

qua các đợt thu mẫu 41

Bảng 4.10: Tỷ lệ cá mắc bệnh và tỷ lệ cá khỏe tại trại Anh Bé

Bảng 4.11: Kết quả giá trị MIC của Florfenicol trên các mẫu

Bảng 4.16: Tỷ lệ số mẫu kháng và nhạy với Florfenicol

ở tỉnh An Giang qua năm 2007 và năm 2009 52 Bảng 4.17: Tỷ lệ (%) số mẫu kháng và nhạy với Florfenicol ở huyện Châu Thành tỉnh An Giang năm 2009, ở thị xã Trà Lách tỉnh Bến Tre năm 2007, và ở thị xã

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Hình 2.1: Gan có đốm trắng dưới kính hiển vi 10

Hình 2.2: Cấu trúc vi thể của thận 11 Hình 2.3: Gan (L), thận (K) và tụy tạng (S) cá tra bệnh gan thận mủ 12

Hình 2.4: Cấu trúc hoá học của Florfenicol 18

Hình 4.1: Cá nghi ngờ bị nhiễm gan thận mủ (gan xuất huyết, có đốm trắng) 35

Hình 4.2: Khuẩn lạc vi khuẩn E ictaluri trên môi trường BHIA 36

Hình 4.3: Vi khuẩn E ictaluri khi nhuộm Gram 37

Hình 4.4: Kết quả định danh E ictaluri bằng test IDS 14 GNR 38

Hình 4.5:Vi khuẩn E ictaluri (mẫu M1C1 của đợt 1) bị ức chế ở nồng độ 1 µg/mL 49

Hình 4.6:Vi khuẩn E ictaluri (mẫu M6C1 của đợt 2) bị ức chế ở nồng độ 2 µg/mL 49

Hình 4.7:Vi khuẩn E ictaluri (mẫu M3A của đợt 3) bị ức chế ở nồng độ 8 µg/mL 50

Hình 4.8:Vi khuẩn E ictaluri (mẫu M2B của đợt 4) bị ức chế ở nồng độ 16 µg/mL 50

DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ VÀ BIỂU ĐỒ

Trang

Sơ đồ 3.1: Các bước thực hiện thí nghiệm 22 Biểu đồ 4.1: Các thông số môi trường qua 4 tháng thu mẫu 31 Biểu đồ 4.2: Tỷ lệ cá khoẻ và tỷ lệ cá bệnh gan thận mũ (đã định danh được) 39 Biểu đồ 4.3: Tỷ lệ cá bệnh và cá khỏe tại trại Bình Thạnh qua các đợt thu mẫu 40 Biểu đồ 4.4: Tỷ lệ cá bệnh và cá khỏe tại trại Anh Tuấn qua các đợt thu mẫu 41 Biểu đồ 4.5: Tỷ lệ cá bệnh và cá khỏe tại trại Anh Bé qua các tháng thu mẫu 42

Biểu đồ 4.6: Tỷ lệ cá mắc bệnh gan thận mủ giữa các trại khảo sát 43

Biểu đồ 4.7: Giá trị MIC trên các mẫu của đợt thu mẫu lần 1 44

Biểu đồ 4.8: Giá trị MIC trên các mẫu của đợt thu mẫu lần 2 45

Biểu đồ 4.9: Giá trị MIC trên các mẫu của đợt thu mẫu lần 3 46

Biểu đồ 4.10: Giá trị MIC trên các mẫu của đợt thu mẫu lần 4 48 Biểu đồ 4.11: Tỷ lệ kháng Florfenicol của các trại nuôi qua 4 đợt thu mẫu 51

cá tra, basa, sản lượng chiếm gần 50 % tổng sản lượng thuỷ sản của khu vực Trong đó

An Giang là tỉnh có sản lượng cá tra lớn nhất Đồng Bằng Sông Cửu Long Diện tích nuôi tập trung ở các huyện: Châu Thành, Tân Châu, Châu Phú và Thị xã Châu Đốc Việc tăng sức sản xuất bằng các biện pháp kỹ thuật như nuôi thâm canh mật độ cao đã phát sinh dịch bệnh Trong số những bệnh do virus, vi khuẩn, nấm, ký sinh trùng thì bệnh do vi khuẩn rất thường gặp, gây thiệt hại đáng kể cho người nuôi cá Đặc biệt, bệnh do vi khuẩn gây bệnh gan thận mủ trên cá tra nuôi, nguyên nhân là do vi khuẩn

Edwardsiella ictaluri gây ra

Đây là một bệnh gây thiệt hại nghiêm trọng cho các hộ nuôi cá tra ở Đồng Bằng Sông Cửu Long Qua các đợt khảo sát về tình hình nuôi dịch bệnh trên cá tra, basa khu vực ĐBSCL năm 2007 cho thấy cá bệnh thường xảy ra và gây thiệt hại cho người nuôi

là bệnh gan thận mủ với tần suất xuất hiện cao nhất (52,8 %), kế đến là bệnh xuất huyết (42,5 %), phù đầu – phù mắt (20,7 %), vàng da và thân (21,6 %) Riêng bệnh gan thận mủ thì An Giang chiếm tỷ lệ cao nhất đạt 66,7 % (Lý Thị Thanh Loan, 2007)

Trước tình hình đó, trên thị trường xuất hiện nhiều sản phẩm với thương hiệu khác nhau Hầu hết thuốc có thành phần Florfenicol vì các loại kháng sinh khác không

còn nhạy cảm với Edwardsiella ictaluri ở vùng nuôi cá ĐBSCL Florfenicol là kháng

sinh có tác dụng kháng khuẩn trên phạm vi rộng tương đương Chloramphenicol

(kháng sinh đang cấm sử dụng), nhưng Florfenicol không làm giảm khả năng tái tạo máu khi sử dụng như Chloramphenicol.

Tuy nhiên, hiện nay việc dùng Florfenicol trị bệnh gan thận mủ không còn hiệu

quả như trước Điều này cho thấy Edwardsiella ictaluri đã tăng nhanh tính kháng đối

với Florfenicol Có nhiều nguyên nhân được đưa ra do tính thích ứng và tính chọn lọc của vi khuẩn, sử dụng kháng sinh không đúng cách, kết hợp nhiều loại kháng sinh không theo nguyên tắc, đặc biệt là sử dụng kháng sinh không đúng liều lượng (Trần Thị Uyên Trang, 2008)

Để tìm hiểu tình hình bệnh gan thận mủ và tính kháng Florfenicol của

Edwardsiella ictaluri qua các tháng trong năm ở một số hộ nuôi, huyện Châu Thành

tỉnh An Giang, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Khảo sát tình hình bệnh gan

thận mủ và khả năng kháng Florfenicol của Edwardsiella ictaluri phân lập trên cá

tra tại một vài trại nuôi ở huyện Châu Thành tỉnh An Giang” dưới sự đồng ý của

khoa Thuỷ Sản Trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh qua sự hướng

dẫn của Ths Hồ Thị Trường Thy.

1.2 Mục Tiêu Đề Tài

Khảo sát tình hình bệnh gan thận mũ trên cá tra ở một số hộ nuôi tại huyện Châu Thành, tỉnh An Giang qua việc thu mẫu ngẫu nhiên

Khảo sát nồng độ ức chế tối thiểu MIC của Florfenicol đối với vi khuẩn

Edwardsiella ictaluriđược phân lập trong khoảng thời gian thu mẫu từ tháng 03/2009

đến tháng 06/2009 Từ đó nhận định tính kháng của Edwardsiella ictaluri đối với

Florfenicol làm cơ sở xem xét lựa chọn giải pháp mới, phù hợp hơn trong công tác phòng chống bệnh gan thận mủ trên cá tra

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Đặc Điểm Sinh Học Của Cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus)

2.1.1 Phân loại và hình thái

da nên chịu đựng được môi trường nước thiếu oxy hoà tan Tiêu hao oxy và ngưỡng oxy của cá tra thấp hơn 3 lần so với cá mè trắng(Ngô Văn Ngọc, 2006)

ngược dòng từ tháng 10 đến tháng 5 và di cư về hạ lưu từ tháng 5 đến tháng 9 hàng

năm (Phạm Quốc Phong, 2008)

2.1.4 Đặc điểm dinh dưỡng

Đây là loài cá ăn tạp thiên về động vật và cũng dễ dàng chuyển đổi loại thức ăn Khi tiêu hết noãn hoàng thì thức ăn yêu thích là động vật phù du (Cladocera, Copepoda, Chiromidae…) Ngoài ra cá còn có đặc điểm ăn nhau bắt đầu từ thời điểm

20 – 30 giờ sau khi nở và phát triển mạnh vào thời điểm 2 – 4 ngày sau khi nở (Ngô Văn Ngọc, 2006)

Khi phân tích thức ăn trong đường ruột cá đánh bắt ngoài tự nhiên thành phần thức ăn được tìm thấy như sau:

Giáp xác: 2,3 % (Shotts và Blazer, 1986)

Trong điều kiện nuôi ao, cá tra có khả năng thích nghi với nhiều loại thức ăn khác nhau như mùn bả hữu cơ, cám, rau, thức ăn hỗn hợp, phân (Phạm Thị Kiều Oanh, 2005)

2.1.5 Đặc điểm sinh trưởng

Cá tra sau khi tiêu hết noãn hoàng có chiều dài từ 1,0 – 1,1 cm Cá tra có tốc độ tăng trưởng tương đối nhanh, còn nhỏ cá tăng nhanh về chiều dài Cá ương trong ao sau hai tháng đã đạt chiều dài 10 – 12 cm (14 – 15 gram) Từ khoảng 2,5 kg trở đi, mức tăng trọng lượng nhanh hơn so với tăng chiều dài cơ thể Cỡ cá trên 10 tuổi trong

tự nhiên (ở Campuchia) tăng trọng rất ít Cá tra trong tự nhiên có thể sống trên 20 năm

Đã gặp cỡ cá trong tự nhiên 18 kg hoặc có mẫu cá dài tới 1,8 m Trong ao nuôi vỗ, cá

bố mẹ cho đẻ đạt tới 25 kg ở cá 10 năm tuổi Nuôi trong ao 1 năm cá đạt

1 – 1,5 kg/con (năm đầu tiên), những năm về sau cá tăng trọng nhanh hơn, có khi đạt tới 5 – 6 kg/năm tuỳ thuộc môi trường sống và sự cung cấp thức ăn cũng như loại thức

ăn có hàm lượng đạm nhiều hay ít (Phạm Quốc Phong, 2008)

Nhìn chung cá tra có tốc độ tăng trưởng nhanh nhưng tốc độ tăng trưởng của cá tùy thuộc vào mật độ nuôi, chất lượng thức ăn và chế độ chăm sóc

2.1.6 Đặc điểm sinh sản

Tuổi thành thục của cá đực là 2 tuổi và cá cái 3 tuổi, trọng lượng cá thành thục lần đầu từ 2,5 – 3 kg Cá tra không có cơ quan sinh dục phụ (sinh dục thứ cấp), nên nếu chỉ nhìn hình dáng bên ngoài thì khó phân biệt được cá đực, cái Ở thời kỳ thành thục, tuyến sinh dục ở cá đực phát triển lớn gọi là buồng tinh hay tinh sào, ở cá cái gọi

là buồng trứng hay noãn sào Tuyến sinh dục của cá tra bắt đầu phân biệt được đực cái

từ giai đoạn II tuy màu sắc chưa khác nhau nhiều Các giai đoạn sau, buồng trứng tăng

về kích thước, hạt trứng màu vàng, tinh sào có hình dạng phân nhánh, màu hồng chuyển dần qua màu trắng sữa Hệ số thành thục của cá tra khảo sát được trong tự nhiên từ 1,76 – 12,94 (cá cái) và từ 0,83 – 2,1 (cá đực) ở cá đánh bắt tự nhiên trên sông

cỡ từ 8 – 11 kg Trong ao nuôi vỗ, hệ số thành thục cá tra cái có thể đạt tới 19,5 % (Phạm Quốc Phong, 2008)

Mùa vụ thành thục của cá trong tự nhiên bắt đầu từ tháng 5 – 6 dương lịch, cá

có tập tính di cư đẻ tự nhiên trên những khúc sông có điều kiện sinh thái phù hợp thuộc địa phận Campuchia và Thái Lan, không đẻ tự nhiên ở phần sông của Việt Nam

Cá đẻ trứng dính vào giá thể thường là rễ của loài cây sống ven sông Gimenila asiatica, sau 24 giờ thì trứng nở thành cá bột và trôi về hạ nguồn Trong sinh sản nhân tạo, ta có thể nuôi thành thục sớm và cho đẻ sớm hơn trong tự nhiên (từ tháng 3 dương

lịch hàng năm), cá tra có thể tái phát dục 1 – 3 lần trong một năm (Phạm Quốc Phong, 2008)

Số lượng trứng đếm được trong buồng trứng của cá gọi là sức sinh sản tuyệt đối Sức sinh sản tuyệt đối của cá tra từ 200 ngàn đến vài triệu trứng Sức sinh sản tuyệt đối có thể tới 135 ngàn trứng/ kg cá cái Kích thước của trứng cá tra tương đối nhỏ và có tính dính Trứng sắp đẻ có đường kính trung bình 1 mm Sau khi đẻ ra và hút nước đường kính trứng khi trương nước có thể tới 1,5 – 1,6 mm (Trương Ngọc Loan, 2007)

2.2 Bệnh Gan Thận Mủ Trên Cá Tra

2.2.1 Lịch sử bệnh

Năm 1976, bệnh đã được ghi nhận lần đầu tiên trên cá da trơn nuôi trong ao tại

Mỹ Mẫu cá bệnh được lấy từ Alabama và Georgia để kiểm tra bởi tổ chức SECFDL (Southeastern Cooperative Fish Disease Laboratory), trường Đại học Auburn Bệnh này tương tự như một bệnh khác trên cá da trơn do một loài vi khuẩn Gram âm là

Edwardsiella tarda nhưng đặc điểm lại khác nhau Năm 1979, các nhà khoa học đã mô

tả bệnh với các dấu hiệu đặc trưng, tuy nhiên vẫn chưa biết được nguyên nhân gây bệnh (Hawke, 1979) Cho đến năm 1981, lần đầu tiên bệnh được xác định nguyên

nhân là do vi khuẩn gây nên, được định danh là do Edwardsiella ictaluri Và lúc này,

bệnh được gọi tên là bệnh nhiễm trùng huyết và viêm ruột, được viết tắt là ESC (Enteric Septicemia of Catfish) hay còn có tên gọi khác là “Hole in the head disease”

(bệnh lỗ đầu) do cá bệnh hay có vết thương trên đầu (Shotts và Blazer, 1986)

Năm 1987, ở Thái Lan đã xảy ra dịch bệnh do Edwardsiella ictaluri trên cá trê (Clarias bactrachus) Cho đến năm 1992, bệnh được phát hiện trên cá tra, cá basa nuôi

ao, bè ở Việt Nam Vào cuối năm 1998, bệnh xuất hiện lần đầu tiên trên cá tra nuôi ở Đồng Bằng Sông Cửu Long (Ferguson và ctv, 2001) Và đến năm 2001, bệnh được gọi

là bệnh mủ gan hay bệnh gan thận mủ, bệnh thường gây thiệt hại đối với cá tra cỡ từ

4 – 6 cm đến khi cá được 5 – 6 tháng tuổi Tỷ lệ tử vong của cá khi mắc bệnh trong giai đoạn này rất cao, từ 60 – 70 %, có trường hợp lên đến 100 % (Nguyễn Hữu Thịnh, 2007)

Loài: Edwardsiella ictaluri (Bùi Quang Tề, 2006)

2.2.2.2 Đặc điểm sinh lý và sinh hóa

E ictaluri là vi khuẩn yếm khí tùy nghi, gây bệnh bắt buộc Nó có khả năng gây

bệnh cho cá khoẻ, đây là vi khuẩn kén vật chủ, trực khuẩn gram âm, kích thước 0,75 x 1,25 µm, di động yếu, hình que mảnh, không sinh bào tử, chuyển động nhờ

vành tiêm mao E.ictaluri cho phản ứng catalase dương tính, oxidase âm và lên men

trong môi trường O/F glucose, H2S (-) tính, Indol (-) tính Có từ 1 – 3 plasmid liên kết

với E.ictaluri, những plasmid có thể đóng vai trò quan trọng trong việc đề kháng với

kháng sinh (Speyerer và Boyle, 1987; Newton và ctv, 1988) Thành phần Guanin và Cytozin trong AND là 55 – 59 % (Bùi Quang Tề, 2006)

E.ictaluri là một trong những loài khó phát triển thuộc giống Edwardsiella Vi

khuẩn phát triển chậm trong môi trường nuôi cấy, cần từ 36 – 48 giờ mới phát triển thành những khuẩn lạc nhỏ trong môi trường thạch BHIA (Brain Heart Infusion Agar)

ở 28 – 30 oC và tăng trưởng chậm hoặc không tăng trưởng ở nhiệt độ 37 oC (Valerie và ctv, 1994)

Vi khuẩn có thể phân lập từ mẫu cá bệnh (gan, thận, lách) trên môi trường BHIA, NA hay TSA + 5 % máu Tuy nhiên, môi trường BHIA giúp vi khuẩn phát

triển tốt hơn Khuẩn lạc của E.ictaluri có hình tròn nhỏ, màu trắng đục, ở tâm khuẩn

lạc có màu hơi vàng, rìa có răng cưa (Bùi Quang Tề, 2006)

2.2.2.3 Đặc điểm gây bệnh

E ictaluri thuộc nhóm vi khuẩn gây bệnh bắt buộc, có thể gây bệnh ngay cả

trên cá khỏe mạnh Vi khuẩn tồn tại trong gan, thận, não cá sau khi khỏi bệnh được vài tháng (trên 200 ngày) Chính vì vậy mà có sự kích thích tạo thành đáp ứng miễn dịch

có thể giúp cá vượt qua được các sự nhiễm trùng và các dịch bệnh xảy ra sau này Khả

năng tồn tại của E ictaluri trong môi trường nước không cao, khoảng 8 ngày (Hawke,

1979) Tuy nhiên, nó có thể tồn tại trong bùn đến 95 ngày ở 18 oC và 25 o C (Plumb và Quinlan, 1986) Bị giết chết bởi ethanol hoặc isopropanol 70 %, ammonia bậc 4, aldehyde, acid mạnh và bazơ, thuốc tẩy rửa (Chlorine 540 mg/l và các hợp chất của Iod 250 ppm) trong 30 phút (Baxa D.V và ctv, 1990)

Vi khuẩn ký sinh tùy nghi trong tế bào của cá, có khả năng xâm nhập trực tiếp vào cơ thể cá qua ruột, mũi, mang Nó được bài thải ra môi trường nước từ phân và xác cá chết Bệnh thường xảy ra nhiều vào mùa mưa lũ kéo dài đến mùa khô Thời điểm phát triển bệnh và mức độ thiệt hại khác nhau theo từng năm Ở nhiệt độ 20 – 28

oC, bệnh bộc phát mạnh, nhưng khi nhiệt độ lên tới 30 0C, ta thấy tỷ lệ chết giảm dần (Nguyễn Hữu Thịnh, 2007)

Những nghiên cứu bệnh học cho thấy vi khuẩn E.ictaluri xâm nhập trực tiếp

vào cơ thể cá qua ruột, mũi và có thể là qua mang Vi khuẩn trong nước có thể qua đường mũi của cá xâm nhập vào cơ quan khứu giác và di chuyển vào dây thần kinh khứu giác, sau đó vào não (Miyazaki và Plumb, 1985; Shotts và ctv, 1986) Bệnh lan

rộng từ màng não đến sọ và da E.ictaluri cũng có thể xâm nhiễm qua đường tiêu hoá

và niêm mạc ruột vào máu gây nhiễm trùng máu (Shotts và ctv, 1986) Bằng đường này thì vi khuẩn vào mao mạch trong biểu bì gây hoại tử và mất sắc tố của da Cá da

trơn còn nhiễm E.ictaluri qua đường miệng gây nhiễm khuẩn ruột Bệnh tiến triển gây

viêm ruột, viêm gan và viêm cầu thận trong vòng 2 tuần sau khi nhiễm bệnh

Tóm lại, vi khuẩn E.ictaluri có thể xâm nhập vào cơ thể cá từ môi trường nước

qua da, qua mang cá và qua miệng bằng đường thức ăn gây bệnh mủ gan cho cá (Shotts và ctv, 1986)

Mùa vụ xuất hiện bệnh tháng 7 – 12, đặc biệt sau khi kết thúc mùa lũ Cao điểm xuất hiện bệnh thường xảy ra từ tháng 9 – 12 hàng năm (Nguyễn Hữu Thịnh và Trương Thanh Loan, 2007)

2.2.3 Đường lây truyền

Bệnh do E.ictaluri có khả năng lây lan mạnh với tỷ lệ chết cao Bệnh có thể lây

trực tiếp từ cá sang cá trong môi trường nước qua chất thải như phân cá bệnh hoặc do

cá khỏe ăn cá bệnh, cá chết

Nếu ta sử dụng chung các dụng cụ như lưới, vợt giữa các ao thì sẽ là một trong những nguyên nhân dẫn đến lay lan mầm bệnh từ ao này sang ao khác Tuy nhiên, nếu các dụng cụ này được phơi nắng trực tiếp thì có khả năng giết chết vi khuẩn Ngoài ra, chim, cò, vật nuôi (chó, mèo…) và người tham quan cũng góp phần làm lây lan mầm bệnh (Nguyễn Hữu Thịnh, 2007)

2.2.4 Dấu hiệu bệnh lý

Cỡ cá mắc bệnh thường từ 0,2 g đến 300 g (cá giống và cá thịt) Đối với cá giống, tỷ lệ chết cao có thể lên đến 100 % sau 5 ngày phát hiện bệnh Cá lớn có tỷ lệ chết thấp hơn so với cá giống (50 – 60 %) Đối với cá nuôi thương phẩm có thể chết đến 30 – 50 % trong một đợi dịch bệnh Khi đã nhiễm bệnh cá có biểu hiện bơi xoay vòng, treo lơ lững cơ thể ở trên mặt nước, bỏ ăn ngay sau khi bị nhiễm khuẩn

Triệu chứng bên ngoài: cá bệnh thường thấy xuất huyết quanh hậu môn, miệng, bụng, vây và gốc vây Cá có thể xuất huyết điểm trên thân hoặc xuất huyết trên toàn

thân Cá bị nhiễm E.ictaluri hay bị phù đầu do tích dịch ở dưới da vùng sọ Khi dịch

quá nhiều sẽ chảy xuống hốc mắt và gây lồi mắt Quan sát mang cá thấy màu sắc nhợt nhạt do vi khuẩn có khả năng gây dung huyết làm mất máu (Nguyễn Hữu Thịnh, 2007)

Bệnh tích bên trong

¾ Bệnh tích đại thể

Gan, thận cá bệnh sưng rất to, thận có hiện tượng nhũn, lách sưng ít hơn Trên gan, thận, lách xuất hiện mảng trắng hoại tử Khi bệnh nặng, chúng phát triển thành đốm trắng tròn có chứa dịch hơi đặc (mủ), đường kính khoảng 1 – 3 mm khắp bề mặt

và cả bên trong gan, thận, lách

Cá bị bệnh thường tích dịch viêm ở xoang bụng có màu hơi vàng và có thể lẫn

máu Cá nhiễm E.ictaluri thường bỏ ăn do đó ruột trống không chứa thức ăn, lòng ruột

có chứa dịch lẫn máu Đồng thời còn thấy cá bị xuất huyết điểm trên ruột, cơ và mô

mỡ (Nguyễn Hữu Thịnh, 2007)

¾Bệnh tích vi thể

Gan: quan sát tiêu bản ở gan có đốm trắng dưới kính hiển vi cho thấy đây là vùng hoại tử Các tế bào gan không còn sát nhau như ở mô thường mà tách rời ra từng

tế bào hoặc thoái hóa thành một vùng không còn nhận ra được cấu trúc với nhiều mức

độ Giai đoạn đầu có hiện tượng sung huyết động mạch và tĩnh mạch gan, đặc biệt là

hệ thống xoang mao mạch giữa các dãy tế bào gan làm cho toàn bộ tổ chức gan bị sưng to Sau đó, do quá trình sung huyết kéo dài dẫn đến vỡ mạch máu và giải thoát nhiều enzyme (protease, lipase,…) làm các tế bào ở vùng viêm bị hoại tử dẫn đến hoại

tử Lúc nào quan sát thấy những tế bào đã tách rời nhau, nhân tế bào co lại và vỡ vụn, cuối cùng những tế bào này bị tiêu hủy Khi cá bệnh nặng, những tổn thương lan rộng làm gan không còn chức năng khử độc và lọc máu, làm chất độc tích tụ trong cơ thể kết hợp với những yếu tố khác làm cá chết Ngoài ra, do tổ chức gan bị hư hại làm mất khả năng tiết mật của gan Một số cá mới chết khi mổ ra thấy túi mật bị vỡ, dịch mật lan tràn khắp nội quan Điều này có thể do khi gan bị hoại tử đồng thời hoại tử ống dẫn mật và túi mật làm túi mật vỡ, dịch mật thoát ra ngoài(Từ Thanh Dung, 2005)

Hình 2.1: Gan có đốm trắng dưới kính hiển vi

(http://www.thuysan.com/lifescience/phar/gan.htm)

Thận: cấu trúc vi thể của thận bị hủy hoại trầm trọng, các phản ứng sưng viêm xảy ra ở toàn bộ tổ chức Thận sưng to đồng thời bị nhũn do sung huyết, một phần có thể do tích tụ nước trong thận mà không đào thải được do hệ thống tiểu cần thận và ống thận bị hư hại Phản ứng viêm kéo dài gây hoại tử và làm mất chức năng các đơn

vị cấu tạo nên thận Mô tạo máu nằm xen kẻ với các tế bào nội tiết của thận cũng bị hoại tử làm cho máu trong cơ thể bị giảm sút Khi thận bị hoại tử, chức năng bài tiết chất thải trong quá trình trao đổi chất bị ngưng trệ Trong khi đó quá trình trao đổi chất lại đặc biệt tăng mạnh do cơ thể cá huy động các tổ chức nhằm đào thải các tác nhân gây bệnh Ngoài ra, hai loại hormone tuyến thượng thận là adrenalin và noradrenalin không được sản xuất khi thận bị hoại tử cũng góp phần làm rối loạn chức năng sinh lý của cá (Huỳnh Ngọc Châu, 2007)

Hình 2.2: Cấu trúc vi thể của thận

(http://www.thuysan.com/lifescience/phar/than.htm)

Lách: cùng với gan và thận, lách cũng là cơ quan bị hủy hoại nặng khi cá bị bệnh mủ gan Những đốm trắng trên lách là những vùng mô hoại tử với nhiều mức độ khác nhau Đối với cá bệnh nặng, nhiều vùng hoại tử dạng hạt lan rộng, phá hủy các tiểu thể hình elip là vùng chức năng của lách, nơi tiêu hủy các vật lạ và vi khuẩn xâm nhập vào cơ thể Khi tác nhân gây bệnh xâm nhập quá nhiều sẽ gây ra tình trạng quá tải đến một lúc nào đó tế bào sẽ mất chức năng và thoái hóa Quá trình hoại tử ở lách bắt đầu từ quá trình thoái hóa và hoại tử các tiểu thể lách làm mất chức năng tạo hồng cầu mới và phá hủy hồng cầu già cũng như không thể sản xuất các tế bào lympho và bạch cầu bảo vệ cơ thể chống các tác nhân gây bệnh Cũng như thận, mô tạo máu bị phá hủy nên lách mất chức năng cung cấp máu cho cơ thể (Mai Thị Bích Hạnh, 2008)

A

B

Hình 2.3: Gan (L), thận (K) và tụy tạng (S) cá tra bệnh gan thận mủ

(Từ Thanh Dung và ctv, 2003)

2.2.5 Chẩn đoán

Việc điều trị chỉ có hiệu quả khi phát hiện bệnh sớm Do đó, trong quá trình nuôi cần thường xuyên quan sát những biểu hiện của cá để phát hiện bệnh và xử lý kịp thời Giai đoạn đầu vài con tách đàn bơi lờ đờ ở đầu bè hoặc dạt về gốc bè, dọc bờ ao đôi lúc cá giảm ăn Bắt khoảng 5 – 10 con kiểm tra các đốm trắng ở gan, thận, và tỳ

tạng (Trần Mai Hải Yến, 2005)

Phân lập vi khuẩn từ gan, thận, lách Nuôi cấy trên môi trường BHIA, đem ủ ở nhiệt độ 28 – 30 0C trong vòng 48 giờ Sau 48 giờ, ta cấy thuần trở lại

Chúng ta có thể sử dụng các phương pháp chẩn đoán như: dùng bộ test kit API 20E, hay test IDS 14 GNR để định danh Dùng phương pháp miễn dịch như phản ứng ngưng kết trên phiến kính, phản ứng ELISA, và phương pháp PCR (Nguyễn Hữu

Thịnh, 2007)

2.2.6 Phòng bệnh

Chúng ta nên chọn con giống khoẻ mạnh, không nhiễm bệnh, thường xuyên chú

ý đến vấn đề chăm sóc sức khoẻ cá để giảm bệnh, giảm tình trạng stress, phải quản lý môi trường nước tốt, tránh làm cá sây xát Vào mùa dịch bệnh, nhất là về mùa lũ không nên cho cá tra ăn cá tạp tươi sống Thức ăn cần được nấu chín, tốt nhất nên sử

Phải sát trùng ao nuôi, cải tạo ao nuôi đúng quy trình Sau mỗi vụ nuôi hút bùn đáy ao, để lại khoảng 10 cm để loại mầm bệnh Khi thấy ao bắt đầu có bệnh thì ngưng cho ăn hoàn toàn Tránh dùng chung dụng cụ, sau khi sử dụng xong đem đi phơi nắng

để cho khô ráo và tiêu diệt mầm bệnh Tiệt trùng các dụng cụ như lưới, vợt, ống, sọt dây bằng Chlorine 10 – 15 g/m3 trong 30 phút, rửa nước sạch và phơi khô Cá chết nên vớt ra khỏi ao, bè càng sớm càng tốt Không vứt cá chết bừa bải ra sông, rạch, trên mặt đất, cần được chôn vào các hố cách ly có rải vôi sống (CaO) để tiệt trùng (Bùi Quang

Tề, 2006)

2.2.7 Một số nghiên cứu bệnh do E.ictaluri gây ra

Năm 1983, Areechon và Plumb đã chứng minh được hầu hết các tổn thương lớn

do E.ictaluri là ở gan, thận và lách cá

Jarboe et al (1984); Miyazaki et al (1985) và Shotts et al (1986) đã có những

nghiên cứu về mô học bệnh tích Năm 1986, Waltman đã mô tả đặc điểm sinh lý, sinh

hóa của vi khuẩn E.ictaluri

Plumb và Vinitnantharat (1989) đã tìm thấy một vài đặc điểm hóa sinh học và tính đa dạng về huyết thanh giữa các loài

Ainsworth et al (1986) định danh E.ictaluri thông qua những đặc điểm sinh hóa

và huyết thanh của chúng bằng phản ứng ngưng kết huyết thanh chuyên biệt, hoặc dùng kháng thể phát huỳnh quang (fluoresent antibody – FA)

Shotts và Waltman (1990) đã nghiên cứu ra một môi trường có tính chọn lọc

cho E.ictaluri, Edwardsiella ictaluri agar (EIA) giúp tăng tính chính xác khi phán đoán sự có mặt của E.ictaluri trong lần phân lập vi khuẩn đầu tiên

Theo Wolter và Johnson (1994) khi gây cảm nhiễm bằng phương pháp tiêm

trên cá nheo Mỹ (từ 15 – 20 cm) với mật độ vi khuẩn E.ictaluri là 1,2x106 cfu/0,1 ml ở

25 oC, tốc độ nước chảy 1 lít/phút, cho ăn 3 % trọng lượng thân/ngày Tỷ lệ chết dao động từ 38 – 95,3 % trong thời gian thí nghiệm là 7 ngày (trích dẫn từ Mai Thị Bích Hạnh, 2004)

Theo Ferguson và ctv (2001) thì sau khi phân lập và định danh vi khuẩn gây bệnh đốm trắng ở nội tạng cá tra rồi tiến hành gây cảm nhiễm Kết quả vi khuẩn có khả năng tạo hoại tử trong 7 ngày (trích dẫn từ Lê Thị Bé, 2002)

2.3 Tình Hình Nuôi Cá Tra Tại Tỉnh An Giang

2.3.1 Tình hình nuôi

Nghề nuôi cá ở An Giang hình thành từ lúc những người khai phá vùng đất này biết bắt những con cá tự nhiên trong mùa lũ thả lại trong ao hầm, trong rộng tre để những tháng khô hạn còn có cá mà ăn; muốn cá không chết; phải cho cá ăn và người ta

đã biết nuôi dưỡng cá thế nào để nó sống và lớn nhanh Qua nhiều thăng trầm nghề nuôi cá ở An Giang vẫn tồn tại và phát triển dưới hai hình thức chính là nuôi cá trong

ao hầm và trong lồng bè Từ năm 1993, An Giang có 1.469 bè và 288 ha ao hầm cùng với 337 ha chân ruộng có nuôi cá và đã thu hoạch với sản lượng 21.670 tấn/ năm Năm

2002, An Giang đã có 3.300bè và gần 1.500 ha ao hầm, sản lượng trên 90.000 tấn Đến năm 2008 diện tích nuôi cá tra đạt gần 6.000 ha

Người dân An Giang đã biết xây dựng trại ương giống, nghiên cứu thành công việc cho cá tra sinh sản nhân tạo với 32 trại sản xuất và trung chuyển cá giống phục vụ thừa nhu cầu cá giống cho người chăn nuôi không chỉ riêng của tỉnh mà cả khu vực đồng bằng sông Cửu Long Lo được con giống, ngư dân An Giang còn biết chế biến thức ăn cho cá từ những phụ phẩm tận thu trong sản xuất nông nghiệp như tấm, cám

và nguồn cá đồng, cua, ốc, cá biển thứ phẩm Đồng thời người nuôi cá An Giang còn tích cực cải tiến phương pháp và ứng dụng khoa học kỹ thuật, sử dụng thiết bị máy móc để chăm sóc cá, giảm được giá thành nuôi cá Bên cạnh đó, nhờ sự ưu đãi của thiên nhiên với hai con sông Tiền và sông Hậu có thể phát triển nghề nuôi cá bằng những lồng, bè, mật độ nuôi cá trong bè đạt 120 – 150 kg/m3 có bè đạt sản lượng trên

100 tấn

Đến nay, An Giang có các đơn vị chế biến xuất khẩu thủy sản đã tiếp nhận công nghệ hiện đại, sắp xếp lao động hợp lý, giá nhân công rẽ, còn biết tận dụng thu thứ phẩm qua quá trình chế biến để làm thức ăn gia súc, nên giá thành sản phẩm đông lạnh xuất khẩu thấp mà chất lượng bảo đảm đủ sức cạnh tranh trên thị trường quốc tế (Nguyễn Tấn Đức, 2008)

2.3.2 Tình hình bệnh

Trong vài năm trở lại đây, phong trào nuôi cá tra xuất khẩu ở ĐBSCL tăng rất nhanh, đem về cho đất nước một nguồn ngoại tệ rất lớn Càng ngày tốc độ của nghề nuôi phát triển càng nhanh.Thế nhưng, do phát triển quá nhanh không theo quy hoạch, như việc tăng sức sản xuất bằng các biện pháp kỹ thuật như nuôi thâm canh mật độ cao

đã phát sinh dịch bệnh Trong số những bệnh do virus, vi khuẩn, nấm, ký sinh trùng thì bệnh do vi khuẩn rất thường gặp, gây thiệt hại đáng kể cho người nuôi cá Đặc biệt, bệnh do vi khuẩn gây bệnh gan thận mủ trên cá tra nuôi, nguyên nhân là do vi khuẩn

Edwardsiella ictaluri gây ra, bệnh chiếm tỷ lệ cao nhất đạt 66,7 % Và việc điều trị

kém hiệu quả đang là vấn đề quan tâm hàng đầu của người nuôi cá và các nhà chuyên

môn (Trần Thị Uyên Trang, 2008)

2.4 Sơ Lược Về Nồng Độ Ức Chế Tối Thiểu (Minimal Inhibitory Concentration) 2.4.1 Định nghĩa

MIC (Minimal Inhibitory Concentration) - nồng độ tối thiểu ức chế sự phát triển của vi khuẩn sau khi pha loãng kháng sinh nhiều lần khác nhau (Andrews J.M,

2001)

2.4.2 Mục đích

Xác định nồng độ tối thiểu của kháng sinh (µg/ml) ức chế được vi khuẩn.Trị số này là tích số của nồng độ kháng sinh lúc ban đầu với tỷ lệ pha loãng của kháng sinh

trong dãy ống nghiệm (Vương Thị Việt Hoa, 2008)

MIC có ý nghĩa quan trọng trong việc xác định sức đề kháng của vi khuẩn đối với các loại kháng sinh mới MIC có thể được xác định bằng phương pháp pha loãng kháng sinh trên môi trường dinh dưỡng lỏng MHB (Miller Hilton Broth) hay trên môi

trường thạch MHA (Miller Hilton Agar) (Vương Thị Việt Hoa, 2008)

2.4.3 Nguyên tắc

Dựa trên sự liên quan giữa nồng độ pha loãng của kháng sinh đối với sự tăng trưởng của vi khuẩn trong mỗi nồng độ kháng sinh khác nhau mà ta xác định được sự nhạy cảm hay đối kháng của vi khuẩn đối với kháng sinh (Vương Thi Việt Hoa, 2008)

Giá trị MIC thật sự khi cả hai lần lặp lại giống nhau Nếu hai lần lặp lại khác nhau thì lấy giá trị trung bình (National Committee for Clinical Laboratory Standards, 2002)

2.4.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến MIC

Mỗi loại thuốc khác nhau thì có giá trị MIC khác nhau Nồng độ ức chế tối thiểu MIC giữa các sinh vật khác nhau cũng khác nhau

Kháng sinh sử dụng chữa bệnh cho cá lặp lại nhiều lần sẽ gây hiện tượng kháng thuốc, và lúc này giá trị MIC sẽ có sự thay đổi rất lớn so với cá chưa sử dụng kháng sinh hay đã sử dụng kháng sinh ít lần

Giá trị MIC phụ thuộc vào thời gian, địa điểm ta thu mẫu và phân lập mẫu Phụ thuộc vào tình hình sử dụng thuốc (Nguyễn Tấn Đức, 2008)

2.4.5 Một số nghiên cứu về MIC đối với vi khuẩn E ictaluri

Đã có nhiều nghiên cứu thử nghiệm tính kháng của E.ictaluri đối với các loại

kháng sinh Năm 2001, một báo cáo về sự nhạy cảm tự nhiên đối với 71 loại kháng

sinh của 102 chủng Edwardsiella, trong đó có 41 chủng E.ictaluri Nồng độ ức chế tối

thiểu MIC được xác định bằng phương pháp pha loãng theo tiêu chuẩn NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standarda) và Germany Kết quả cho

thấy E.ictaluri nhạy cảm tốt với các loại kháng sinh thuộc nhóm tetracycline và β -

lactams (Ingo Stock and Bernd Wiedemann, 2001)

Patricia A Gaunt (2005) đã tiến hành khảo sát tính kháng của E.ictaluri đối với

Florfenicol nhằm phục vụ cho quá trình điều trị bệnh gan thận mủ một cách hợp lý

Ông đã tiến hành trên 97 chủng E.ictaluri (được phân lập từ 1998 – 2001) và kết quả

đều cho nồng độ ức chế tối thiểu MIC là 0,25 µg/ml (áp dụng kỹ thuật Kirby Bauer)

Nghiên cứu của Trần Thị Uyên Trang (2008) về việc khảo sát nồng độ ức chế tối thiểu của Florfenicol trong một số kháng sinh thủy sản và sự thay đổi tính kháng

của E.ictaluri đã cho kết quả là chủng vi khuẩn được phân lập năm 2008 có tính kháng

Forfenicol cao hơn so với chủng vi khuẩn được phân lập năm 2007

2.5 Sơ Lược Về Kháng Sinh

2.5.1 Định nghĩa về kháng sinh

Kháng sinh là hợp chất hữu cơ có nguồn gốc sinh học, bán tổng hợp hay tổng hợp có tác dụng ức chế sự phát triển hoặc tiêu diệt vi khuẩn trên cơ sở kết hợp với một điểm tiếp nhận (receptor) trong quá trình biến dưỡng, dẫn đến sự ngưng trệ quá trình sống của vi khuẩn bên trong cơ thể Vì vậy kháng sinh thường dùng để điều trị trên cơ

thể đã bị nhiễm trùng (Nguyễn Như Trí, 2008)

Tế bào động vật đa bào, tế bào virus không có điểm tiếp nhận kháng sinh, do đó

dùng kháng sinh không có tác dụng đối với chúng (Nguyễn Như Trí, 2008)

2.5.2 Phân loại kháng sinh

Kháng sinh gồm kháng sinh tác dụng tĩnh khuẩn, kháng sinh tác dụng sát

khuẩn

Kháng sinh tác dụng tĩnh khuẩn: làm ngưng sự phát triển của vi khuẩn, không cho vi khuẩn tiếp tục sinh sản chứ không tiêu diệt vi khuẩn Kháng sinh tĩnh khuẩn chỉ dùng khi cơ thể người hay động vật còn đủ sức, hệ thống miễn dịch còn đủ mạnh để tiêu diệt vi khuẩn đã bị thuốc làm yếu Khi dùng kháng sinh tĩnh khuẩn thì bạch cầu và đại thực bào đều tham gia diệt khuẩn, có nghĩa là cơ thể cùng tham gia diệt khuẩn với kháng sinh, nhờ đó bệnh tái phát sau khi ngưng sử dụng kháng sinh Kháng sinh này thích hợp đối với các bệnh có diễn biến chậm, các trường hợp phòng bệnh Ví dụ như các kháng sinh thuộc nhóm Tetracycline, Macrolides, Phenicol…(Nguyễn Như Trí,

2008)

Kháng sinh tác dụng sát khuẩn: là kháng sinh có tác dụng giết chết vi khuẩn

Do cơ thể không tham gia chống bệnh nên bệnh dễ tái phát sau khi ngưng sử dụng kháng sinh Kháng sinh này thích hợp đối với các bệnh nhiễm trùng cấp tính Ví dụ

như các kháng sinh thuộc nhóm Aminosides, Polypeptides… (Nguyễn Như Trí, 2008) 2.5.3 Nguyên tắc sử dụng kháng sinh trong nuôi trồng thuỷ sản

Theo bộ Thuỷ Sản năm 2005 trích bởi Bùi Quang Tề, nguyên tắc sử dụng kháng sinh như sau:

- Chỉ dùng kháng sinh để trị các bệnh nhiễm khuẩn ở động vật thuỷ sản Dùng kháng sinh khi biết chắc chắn rằng bệnh đó do vi khuẩn gây ra

- Kháng sinh được sử dụng phải nhạy cảm với vi khuẩn gây bệnh và phải phân

thuốc của vi khuẩn gây bệnh, làm công tác trị bệnh trở nên khó khăn và tốn kém hơn

- Không nên dùng kháng sinh để phòng bệnh, chỉ nên dùng để trị bệnh, khi bệnh đã bùng phát

- Không nên dùng kháng sinh của người để trị bệnh cho động vật thuỷ sản, vì sẽ không có các hướng dẫn về nồng độ, cách dùng và chưa biết được tác động của các

yếu tố thuỷ lý, thuỷ hoá nước ảnh hưởng thế nào đến tác dụng của thuốc

- Dùng kháng sinh phải đúng nồng độ, thời gian theo chỉ dẫn của nhà sản xuất

- Chấm dứt dùng kháng sinh 14 ngày trước khi thu hoạch để giảm lượng lượng

kháng sinh tồn đọng trong cơ thể vật nuôi

- Chỉ nên dùng kháng sinh khi thật sự cần thiết (Bùi Quang Tề, 2006)

2.5.4 Kháng sinh Florfenicol

Công thức phân tử của Florfenicol là C12H14Cl2FNO4S

Hình 2.4: Cấu trúc hoá học của Florfenicol

(http://www.chemicalland21.com/lifescience/phar/FLORFENICOL.htm)

Florfenicol là kháng sinh mới, phổ rộng, hiệu quả cao trên nhiều loại vi khuẩn

đã lờn với các loại kháng sinh khác Điều trị rất hiệu quả các bệnh phổ biến trên cá như: bệnh gan - thận có mủ, xuất huyết, đốm đỏ, lở loét, trắng da - tuột nhớt, thối đuôi,

thối vây,… gây ra bởi các vi khuẩn: Edwardsiella, Aeromonas, Pseudomonas, Vibrio,

Flexibacter,… thường gặp trên cá tra, cá basa, cá trê, cá lóc (Bùi Quang Tề, 2006)

Kháng sinh này có phổ kháng khuẩn trên vi khuẩn Gram (+) lẫn Gram (-) Florfenicol rất bền, ở nhiệt độ đun nấu vẫn còn Có khả năng khuếch tán vào tất cả các

mô, xoang khi dùng qua đường uống, không có vị đắng như Chloramphenicol Florfenicol được chỉ định trong hầu hết các bệnh nhiễm trùng của tôm, cá, có thể kết

hợp với Doxycyclin Liều lượng sử dụng: 10 mg/kg thể trọng/ngày (Nguyễn Hữu Thịnh, 2007)

Theo các nghiên cứu năm 2007 vi khuẩn E ictaluri gây bệnh mủ gan cá tra,

basa, cá trê rất nhạy với Florphenicol Đây là loại kháng sinh mới được phép sử dụng

để điều trị bệnh cá của nhiều quốc gia trên thế giới kể cả Hoa Kỳ, thị trường xuất khẩu

cá tra, basa lớn nhất của Việt Nam

Florfenicol có hoạt tính chống lại sự phát triển của vi khuẩn bằng cách kết dính với tiểu đơn vị 50S của ribosom, ngăn chặn cầu nối peptid giữa các acid amin vì vậy

ức chế sự tổng hợp protein làm cho vi khuẩn này không còn khả năng phát triển và tồn tại (Từ Thanh Dung, 2005) Đầu năm 2006, Khoa Thủy Sản trường Đại học Cần Thơ công bố kết quả nghiên cứu tìm kiếm các loại thuốc kháng sinh thay thế các loại thuốc cấm, đã công nhận Florfenicol là kháng sinh đặc trị bệnh này Sử dụng thuốc từ 7 - 10 ngày sẽ cho hiệu quả tốt, cá sẽ hồi phục nhanh khi người nuôi thực hiện tốt khâu vệ sinh diệt mầm bệnh trong khu vực nuôi và trong môi trường nước

Florfenicol có độ tồn dư thấp trong mô cơ Dùng thuốc liều 10mg/kg thể trọng liên tục 12 ngày, khi ngưng sử dụng 7 ngày mức tồn dư trong cơ cá tra còn 0,222 - 0,109 ppm (mức cho phép của Việt Nam và Mỹ là 1ppm) (Schering - Plough Animal Health Comporation, 2005)

2.5.5 Cơ chế kháng kháng sinh của vi khuẩn

Một số loài vi sinh vật có sẵn khả năng chịu được một số loại kháng sinh nhất định Sự kháng thuốc kháng sinh có thể coi như là đặc tính vốn có hoặc có thể được hình thành của các vi sinh vật này Có nhiều cách khác nhau gây ra sự kháng thuốc của

vi sinh vật

- Một số loại kháng sinh nhất định, chẳng hạn như penicillin chỉ tác dụng lên lớp vỏ tế bào nên có thể không có hiệu quả đối với những vi sinh vật không có vỏ tế bào (ví dụ như Mycoplasm không có một lớp vỏ tế bào đặc trưng)

- Những sinh vật không cho phép một số loại kháng sinh nhất định ngấm vào bên trong, do vậy làm mất tác dụng của kháng sinh đó (ví dụ như một số vi khuẩn Gram âm không cho phép penicillin ngấm vào nên chúng có khả năng kháng penicillin)

- Một số vi sinh vật có khả năng làm biến đổi thuốc kháng sinh làm cho nó mất hoạt tính (Ví dụ : vi khuẩn Staphylococcus sinh b - lactum làm gãy vòng b - lactum của hầu hết các penicillin và làm chúng mất hoạt tính)

- Các vi sinh vật có thể thay đổi cách thức trao đổi chất bị một loại kháng sinh kiềm chế, do vậy chúng có thể kháng lại loại kháng sinh đó

- Các vi sinh vật cũng có thể đào thải một loại kháng sinh ra khỏi tế bào, do vậy

nó trở nên có khả năng kháng loại kháng sinh đó

- Sử dụng kháng sinh trị bệnh trong một thời gian, sử dụng nhiều lần với liều lượng cao hơn liều khuyến cáo gây nên hiện tượng kháng kháng sinh

- Việc sử dụng kháng sinh liều thấp trong qua trình nuôi (sử dụng không đúng cách trong điều trị, phòng bệnh và dùng trong thức ăn chăn nuôi như chất kích thích sinh trưởng) đã dẫn đến một hậu quả rất nghiêm trọng làm gia tăng hiện tượng kháng kháng sinh của các loài vi khuẩn

- Sự kháng thuốc kháng sinh gián tiếp trong vi sinh vật có thể hình thành thông qua các gen nhiễm sắc thể hoặc thông qua các plasmit (cấu trúc tự sao chép mang gen trong tế bào chất) (Phạm Thị Kiều Oanh, 2005)

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời Gian Và Địa Điểm

Ống nghiệm và giá ống nghiệm

Pipette thuỷ tinh, đũa thuỷ tinh

Micropipette các loại

Bình tam giác, đĩa Petri

Đèn cồn, que cấy vòng, que cấy nhọn

Ống đong, con cá từ

Bộ định danh vi khuẩn IDS 14 GNR của công ty Nam Khoa

3.2.3 Hoá chất và môi trường

Cồn 95 %, cồn 70 %

Môi trường nuôi cấy vi khuẩn: BHIA (Brain Heart Infusion Agar)

Môi trường canh: BHIB (Brain Heart Infusion Broth)

Glycerol, Parafin, nước muối sinh lý

Hoá chất: Crystal violet, Lugol, Fushin, test chất lượng nước

Cấy thuần vi khuẩn

Mổ khám Ghi nhận bệnh tích Phân lập vi khuẩn

Làm MIC Trữ giống

3.3.1 Phương pháp thu mẫu

Mẫu được thu ngẫu nhiên, mỗi tháng sẽ tiến hành thu mẫu 1 lần ở trại cá Tra huyện Châu Thành, tỉnh An Giang Chúng tôi thu trung bình 10 con/1 ao Tổng số mẫu cho mỗi đợt thu 50 - 60 con

3.3.2 Thu thập thông tin tại vùng thu mẫu (Huyện Châu Thành, Tỉnh An Giang)

Đo các chỉ tiêu chất lượng nước bằng test chất lượng nước (test Sera): DO, nhiệt độ, pH, NH3 Đánh giá tình trạng môi trường nước xung quanh

Kiểm tra nguồn nước cấp, quan sát hệ thống cấp thoát nước, hình thức nuôi,

mật độ, thời gian cho cá ăn cũng như kiểm tra bờ ao, cống, thức ăn,

Đánh giá khả năng gây bệnh, yếu tố stress, điều kiện thời tiết

Hiện tượng cá chết do môi trường hay do bệnh truyền nhiễm, thuốc và hóa chất

mà trại đã sử dụng

Điền các thông tin cần thiết trong bảng thu mẫu bệnh cá

3.3.3 Đánh giá cảm quan tình trạng sức khỏe cá nuôi

Mẫu thu được có thể là cá sống, sắp chết hoặc mới chết và tiến hành ghi nhận

các biểu hiện bất thường

Quan sát các dấu hiệu bệnh lý bên ngoài và bên trong

Mổ cá và phân lập trên môi trường BHIA

3.4 Phương Pháp Phân Lập Vi Khuẩn

3.4.1 Các thao tác vô trùng khi lấy mẫu

Để có những chủng vi khuẩn thuần không bị tạp bởi các vi khuẩn khác thì bước quan trọng nhất trong quá trình phân lập là tất cả các thao tác phải được tiến hành ở

điều kiện vô trùng Các thao tác cần phải thực hiện như sau:

Tạo không gian vô trùng bằng ngọn lửa đèn cồn Để tránh việc gây nhiễm thông qua tiếp xúc, người thực hiện thao tác cần mang găng tay hoặc tiến hành sát trùng tay bằng cồn 70 % hoặc các dung dịch diệt khuẩn, tương tự như vậy ta tiến hành sát trùng

mặt bàn thao tác trước khi làm

Tất cả dụng cụ giải phẫu phải được tiệt trùng bằng cồn 95 % và được hơ trên

ngọn lửa đèn cồn

Khử trùng bề mặt cơ thể cá bằng cồn 70 % tại những vị trí cần giải phẫu Tiến hành mổ cá và ghi nhận các dấu hiệu khác thường trên nội tạng (gan, thận, lách)

3.4.2 Phân lập, làm thuần vi khuẩn

Chúng tôi tiến hành khử trùng bề mặt của gan, thận, lách Sau đó, dùng kéo cắt một mẫu mô nhỏ tại vùng có dấu hiệu viêm nhiễm, chấm lên đĩa thạch, sử dụng que cấy vòng cấy ria lên bề mặt đĩa môi trường, và đem đi ủ trong vòng 24 – 48 giờ ở

30 0C Quan sát, ghi nhận hình dạng, màu sắc và kích thước của khuẩn lạc

Vi khuẩn sau khi được phân lập thì tiếp tục được làm thuần bằng cách lựa chọn những khuẩn lạc riêng rẽ và tiến hành cấy ria chúng vào 1 đĩa petri khác với môi trường nuôi cấy, tiến hành ít nhất 2 lần đến khi ta quan sát thấy không còn khuẩn lạc khác biệt về hình dạng, kích cỡ, màu sắc

Hình 3.1: Thao tác phân lập vi khuẩn 3.5 Phương Pháp Định Danh Vi Khuẩn

- Ghi tên mẫu, ngày thử nghiệm trên lame

- Nhỏ 1 giọt nước cất vô trùng lên lame

- Dùng que cấy lấy 1 lượng nhỏ khuẩn lạc từ 1 khuẩn lạc đơn, riêng lẻ trong đĩa petri ta đã cấy thuần, dàn mỏng dưới giọt nước cất

- Để vết bôi khô hoàn toàn

- Cố định vết bôi bằng cách hơ dưới ngọn lửa đèn cồn

Các bước nhuộm Gram

- Phủ crystal violet lên vết bôi trong 30 giây

- Đổ bỏ crystal violet, rửa lại với nước cất

- Phủ dung dịch lugol cố định màu crystal violet trong 1 phút

- Đổ bỏ lugol, rửa với nước cất

- Nghiêng lame, nhỏ dung dịch tẩy (cồn 95%), đến khi giọt dung dịch tẩy màu

chảy xuống không còn màu và tiếp tục rửa nước

- Phủ dung dịch safranin lên vết bôi trong 60-80 giây

- Đổ bỏ dung dịch, rửa nước và để khô lame

- Nhỏ một giọt dầu kính lên phết nhuộm và xem ở vật kính x100

+ Vi khuẩn Gram (+) bắt màu tím

+ Vi khuẩn Gram (-) bắt màu hồng

3.5.4 Thử nghiệm về khả năng di động của vi khuẩn

Nhỏ một giọt nước muối sinh lý lên lame, dùng que cấy tiệt trùng chạm vào khuẩn lạc riêng lẽ rồi hoà với giọt nước muối sinh lý, đậy lamelle lên giọt nước và

quan sát di động ở vật kính x100

3.5.5 Sử dụng bộ Test IDS 14GNR

3.5.5.1 Sơ lược về bộ test IDS 14GNR

Bộ test định danh IDS 14GNR dùng cho trực khuẩn Gram âm của công ty Nam Khoa Đây là hệ thống bao gồm 14 thử nghiệm sinh hóa dùng để định danh các trực khuẩn Gram âm bằng cách sử dụng hệ thống mã định danh và phần mềm định danh

Bộ định danh này bao gồm các phản ứng: Oxidase, lên men Glucose, khử Nitrate, thử nghiệm ONPG, sinh Urease, PAD, Citrate, thuỷ giải Esculin, sinh H2S, sinh Indol, Voges-poskauer (VP), Malonate, LDC, di động (Bảng 3.1) Thử nghiệm Oxidase được thực hiện trên các miếng giấy thử được bảo quản trong lọ có hạt hút ẩm Thử nghiệm LDC và di động được thực hiện trong chai môi trường LDC-Motility

(Hình 3.2)

Bảng 3.1: Thứ tự các đĩa giấy sinh hoá cho vào các giếng

Số thứ tự giếng Đĩa giấy cho phản ứng sinh hoá

1 Lên men glucose

7 Thuỷ giải Esculin

8 Sinh Indol và sinh H2S

9 Voges-Proskauer (VP)

10 Sử dụng Malonate

Hình 3.2: Bộ test Nam Khoa

3.5.5.2 Cách thực hiện

Dùng que cấy thẳng đã được tiệt trùng lấy một khuẩn lạc rời rạc có thời gian phát triển từ 24 – 48 giờ, cấy đâm thẳng đứng vào chính giữa chai môi trường LDC,

sau đó đậy chặt nắp chai

Làm huyền dịch vi khuẩn trong 3 – 5 ml nước muối sinh lý vô trùng, pha càng đục càng tốt Dùng pipet với đầu tips vô trùng, hút cho vào khoảng 2/3 giếng Đậy nắp

bảng nhựa lại

Bảng nhựa đã nhỏ huyền dịch vi khuẩn và chai môi trường LDC được ủ trong

tủ ấm ở 28 – 30 0C trong vòng 12 – 16 giờ

3.5.5.3 Đọc kết quả

Kết quả LDC và di động được đọc trên chai môi trường LDC

- LDC: (+) vi khuẩn mọc và môi trường có màu tím hay nhạt màu

(-) vi khuẩn mọc và môi trường có màu vàng

- Di động: (+) vi khuẩn mọc làm nhoè đường cấy

(-) vi khuẩn mọc không nhoè đường cấy