NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT DỊCH ĐẠM TỪ TRÙN QUẾ (Perionyx excavatus) VÀ SỬ DỤNG NUÔI THỬ NGHIỆM TRÊN CÁ RÔ PHI (Oreochromis niloticus)

27 4.2 Kết Quả Của Nồng Độ Muối Đến Quá Trình Thủy Phân 28 4.3 Kết Quả Ảnh Hưởng Của Hoạt Độ Enzyme Lên Quá Trình Thủy Phân 29 4.4 Kết quả khảo sát thời gian thủy phân 30 4.5 Bước Đầu Đá

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA THỦY SẢN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT DỊCH ĐẠM TỪ

TRÙN QUẾ (Perionyx excavatus) VÀ SỬ DỤNG

NUÔI THỬ NGHIỆM TRÊN CÁ RÔ PHI (Oreochromis niloticus)

Sinh viên thực hiện: HỒ TẤN CƯỜNG Ngành: CHẾ BIẾN THỦY SẢN

Niên Khóa: 2005 - 2009

Tháng 9/2009

NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT DỊCH ĐẠM TỪ

TRÙN QUẾ (Perionyx excavatus) VÀ SỬ DỤNG NUÔI THỬ NGHIỆM TRÊN CÁ RÔ PHI (Oreochromis niloticus)

Tháng 9/2009

LỜI CẢM ƠN

Xin được gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc đến ba mẹ và các anh chị em trong gia đình đã luôn quan tâm, chăm sóc và động viên tôi trong suốt thời gian tôi học tập xa nhà

Xin cảm ơn Ban Giám Hiệu trường, Ban Chủ Nhiệm Khoa Thủy Sản, cùng quý thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt thời gian học tập tại trường

Xin được gởi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến TS Nguyễn Phú Hòa và ThS

Trương Phước Thiên Hoàng đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, động viên và tạo mọi

điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành khóa luận này

Cảm ơn những người bạn thân thiết đã luôn gắn bó, chia sẽ và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập vừa qua

TÓM TẮT

Đề tài “Nghiên cứu sản xuất dịch đạm từ trùn quế (Perionyx excavatus) và

sử dụng nuôi thử nghiệm trên cá rô phi (Oreochromis niloticus)”, được tiến hành

tại Viện Công Nghệ Sinh học và Môi trường và Trại thực nghiệm khoa Thủy Sản Trường Đại Học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh từ ngày 20/04/2009 đến 31/08/2009 Thí nghiệm được tiến hành nhằm thủy phân thu nhận dịch đạm trùn quế, thay thế đạm bột cá trong khẩu phần ăn của cá rô phi Bao gồm khảo sát sự ảnh hưởng của

tỷ lệ nước, nồng độ muối, hoạt độ enzyme và thời gian thủy phân, chia thành 4 nghiệm thức khác nhau, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần NT ĐC không thay thế bột cá, NT I thay thế 25% trọng lượng bột cá bằng dịch trùn, NT II thay thế 50% trọng lượng bột cá bằng dịch trùn, NT III thay thế 75% trọng lượng bột cá bằng dịch trùn

Kết quả nghiên cứu cho thấy dịch đạm trùn quế tối ưu nhất khi thủy phân với các điều kiện sau là hàm lượng nước 50% nồng độ muối 2%, hoạt độ enzyme 60 UI, thời gian thủy phân là 20 giờ Khi bổ sung thay thế bột cá bằng dịch trùn quế, kết quả thu được tốt nhất là ở NT I, tăng trưởng giảm dần ở các nghiệm thức II, III) Tỷ lệ sống tại các NT ĐC, NT I, NT II không có sự sai khác về mặt thống kê Hệ số chuyển hóa thức ăn đạt tốt nhất tại nghiệm thức I (FCR = 1,72) Chứng tỏ khi bổ sung một phần nhỏ trùn quế vào trong khẩu phần thức ăn thì có ý nghĩa tích cực trong sự phát triển của cá Qua đó, bước đầu có thể đánh giá được khả năng thay thế 25% trùn quế là đạt được kết quả tốt nhất

MỤC LỤC

Trang tựa i Cảm tạ ii Tóm tắt iii Mục lục iv Danh sách các bảng vi

2.1 Giới Thiệu Về Trùn Quế 3

2.1.1 Phân loại sinh học 3

2.1.2 Đặc điểm cấu tạo 3

2.1.3 Một số ứng dụng của trùn 5

2.2.1 Sơ lược lịch sử 7

2.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự hoạt động của protease 10

2.2.4 Ứng dụng của enzyme protease 11

2.4 Giới Thiệu Về Cá Rô Phi 14

2.4.1 Vị trí phân loại 14

2.4.2 Đặc điểm cấu tạo của cá rô phi 14

2.5 Nhu Cầu Dinh Dưỡng Cho Cá Rô Phi 18

CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

3.1 Thời Gian Và Địa Điểm Thực Hiện 20

3.2 Đối Tượng Nghiên Cứu 20

3.3 Dụng Cụ Thí Nghiệm, Thiết Bị Và Hóa Chất 20

3.3.1 Dụng cụ, thiết bị 20

3.4.2 Hệ thống bể composite dùng trong thí nghiệm 21

3.3.3 Hóa chất: 21

3.5 Khảo Sát Quá Trình Thủy Phân Trùn Quế 21

3.6 Thức Ăn 22 3.7 Phương Pháp Bố Trí Thí Nghiệm 24

3.7.1 Bố trí thí nghiệm 24

3.7.2 Các chỉ tiêu trên cá cần theo dõi 25

3.7.3 Các chỉ tiêu chất lượng nước cần được theo dõi 25

3.7.5 Phương pháp thu thập và xử lý số liệu 26

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27

4.1 Kết Quả Ảnh Hưởng Tỷ Lệ Nước Bổ Sung Lên Quá Trình Thủy Phân 27

4.2 Kết Quả Của Nồng Độ Muối Đến Quá Trình Thủy Phân 28

4.3 Kết Quả Ảnh Hưởng Của Hoạt Độ Enzyme Lên Quá Trình Thủy Phân 29

4.4 Kết quả khảo sát thời gian thủy phân 30

4.5 Bước Đầu Đánh Giá Tăng Trưởng Của Cá Rô Phi Trong Khẩu Phần Thức Ăn

Được Thay Thế Bằng Dịch Trùn Quế 32

4.5.1 Các thông số môi trường 32

4.6 Tỷ Lệ Sống Và Tăng Trưởng Của Cá Thí Nghiệm 33

4.6.1 Tỷ lệ sống của cá thí nghiệm 33

4.6.2 Tăng trưởng của cá thí nghiệm 34

4.6.3 Hệ số biến đổi thức ăn 37

4.7 Đề Xuất Quy Trình Thủy Phân Trùn Quế 39

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỂ NGHỊ 40

5.1 Kết luận 40 5.2 Đề nghị 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO 41

PHỤ LỤC

DANH SÁCH CÁC BẢNG

BẢNG NỘI DUNG TRANG

Bảng 2.1 Thành phần amino acid của trùn quế 5 Bảng 2.2 Các yêu cầu chất lượng nước của cá rô phi 16 Bảng 2.3 Nhu cầu protein điển hình của cá rô phi 18 Bảng 3.1 Công thức tổ hợp thức ăn của 4 nghiệm thức 24 Bảng 4.1 Kết quả HSTP và HSTNđht do ảnh hưởng của nước 28 Bảng 4.2 Kết quả HSTP và HSTNđht do ảnh hưởng của muối 29 Bảng 4.3 Kết quả HSTP và HSTNđht do ảnh hưởng của enzyme 30 Bảng 4.4 Kết quả HSTP và HSTNđht do ảnh hưởng của thời gian 31 Bảng 4.5 Thành phần hóa học của thức ăn 32 Bảng 4.6 Các thông số nhiệt độ và DO trung bình trong quá trình

thí nghiệm

33

Bảng 4.7 Các thông số về pH và NH3 trong quá trình thí nghiệm 33 Bảng 4.8 Tỷ lệ sống của cá thí nghiệm 34 Bảng 4.9 Tăng trưởng của cá thí nghiệm 35 Bảng 4.10 Hệ số chuyển đổi thức ăn 38

DANH SÁCH CÁ BIỂU ĐỒ VÀ HÌNH

DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 4.1 Tỷ lệ sống của cá thí nghiệm 34

Biểu đồ 4.2 Trọng lượng trung bình của cá qua các giai đoạn 36

Biểu đồ 4.3 Tăng trọng trung bình của cá thí nghiệm 37

Biểu đồ 4.4 Biến thiên hệ số chuyển đổi thức ăn (FCR) giữa các NT 38

Hình 3.2 Máy ép thức ăn viên 22

Hình 3.4 Dụng cụ đo các chỉ tiêu môi trường 25

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

HSTP Hiệu suất thủy phân

HSTNđht Hiệu suất thu nhận đạm hòa tan

TP Thủy phân

FCR Feed conversion ratio

SEAFDEC Southeast Asian Fisheries Development Center

AQD Aquaculture Department

NTĐC Nghiệm thức đối chứng

DWG Daily weight gain

HSHC Hệ số hiệu chỉnh

Hiện nay, “nguồn thực phẩm cho thủy - hải sản, gia súc, gia cầm có hàm lượng protein dễ tan đang ngày càng khan hiếm” (Đặng Bửu Long, 2007), nhu cầu sử dụng bột cá trong thức ăn thủy sản ngày càng cao do nó dẫn dụ tốt, mùi vị hấp dẫn và có giá trị dinh dưỡng cao (Lim và ctv, 1989, trích bởi Phạm Ngọc Tịnh, 2005) Tuy nhiên cá

là thực phẩm phổ biến dùng cho con người, có thể cho gia súc, thủy sản, như vậy gây nên tình trạng đánh bắt nhiều làm giảm sản lượng cá hằng năm gây nên việc không ổn định về nguyên liệu, đẩy giá bán lên cao, chi phí sản xuất lớn

Do đó, vấn đề đặt ra là phải làm sao phải có nhiều nguồn protein thay thế cho bột cá, làm đa dạng thêm nguồn protein động vật cung cấp trong nuôi trồng thủy sản

Trùn quế là một trong những loài có hàm lượng đạm khá cao có dùng để thay thế bột cá Trong trùn quế không những có protein còn có nhiều chất dinh dưỡng khác như các acid amin thiết yếu rất tốt cho cá

Chính vì vậy, được sự chấp thuận của Khoa Thủy Sản chúng tôi đã thực hiện

đề tài: “Nghiên cứu sản xuất dịch đạm từ trùn quế (Perionyx excavatus) và sử

dụng nuôi thử nghiệm trên cá rô phi (Oreochromis niloticus)”

1.2 Mục Tiêu Đề Tài

- Đánh giá ảnh hưởng tỷ lệ nước trong quá trình thủy phân

- Xác định nồng độ muối trong quá trình thủy phân

- Đánh giá ảnh hưởng hoạt độ enzyme trong quá trình thủy phân

- Xác định thời gian thủy phân

- Bước đầu đánh giá tăng trưởng của cá rô phi trong khẩu phần thức ăn được thay thế bằng dịch trùn quế

Chương 2

TỔNG QUAN

2.1 Giới Thiệu Về Trùn Quế

2.1.1 Phân loại sinh học

Trùn quế còn được gọi là trùn đỏ hay giun đỏ

Ngành: Annelida

Lớp: Oligochaeta

Bộ: Opisthopora Họ: Megascolecidae

Cơ thể hình thon dài, hai đầu hơi nhọn và bao gồm nhiều đốt

Trùn nuốt thức ăn bằng môi ở lỗ miệng, sau khi qua hệ thống tiêu hóa với nhiều

vi sinh vật cộng sinh được thải ra ngoài dưới dạng phân rất giàu dinh dưỡng

- Đặc điểm sinh lý sinh thái

Trùn quế rất ít hoạt động, chúng phản ứng mạnh trước ánh sáng, có thể thích nghi nhiệt độ cao, độ mặn và điều kiện khô hạn, nhiệt độ thích hợp là 25 – 300C, độ

ẩm 70 - 80%, pH từ 7 – 7,5

Hình 2.1: Trùn quế

Trùn quế thích nghi với phổ thức ăn khá rộng Tuy nhiên, những thức ăn có hàm lượng dinh dưỡng cao và tỷ lệ C/N thấp thì hấp dẫn hơn Vì thế chúng không tiêu hóa nguồn rác có tỷ lệ C/N cao như rơm rạ, bã mục, mạt cưa, các hợp chất hóa học có gốc polyphenol, tanin, benzen, tinh dầu sẽ gây độc cho trùn

Trùn quế thuộc nhóm trùn đất chuyên chuyển hóa hợp chất hữu cơ trên lớp mặt Trong tự nhiên trùn quế thích sống nơi ẩm thấp, gần cống rãnh, nơi có nhiều chất hữu

cơ thối rữa, hiện diện ở các cánh đồng canh tác, vì thế chúng không có khả năng cải tạo đất một cách trực tiếp như những loài khác (theo http://www.thuvienkhoahoc.com /tusach/K%E1%BB%B9_thu%E1%BA%ADt_nu%C3%B4i_Tr%C3%B9n_qu%E1%BA%BF)

- Đặc điểm sinh sản

Khi trưởng thành, cơ thể trùn quế hình thành đai sinh dục và lỗ sinh dục nằm phần trước cơ thể Trùn đất lưỡng tính nhưng phải giao phối chéo Sau khi giao phối 2 – 3 ngày, đai sinh dục rơi ra khỏi cơ thể, bít hai đầu tạo thành kén Kén trùn quế có màu nâu vàng hay xanh, kích thước 0,85mm x 1,6mm Mỗi kén mang từ 2 – 20 trứng, khoảng 14 – 21 ngày sau sẽ nở Trùn non mới nở có màu trắng, dài khoảng 2 – 3 mm, sau 15 – 20 ngày trưởng thành, sau 2,5 tháng bắt đầu sinh sản

Trùn quế thành thục sớm (3 – 4 tháng), tái sản xuất nhanh (2 – 3 thế hệ trong một năm), cho sinh khối cao (nuôi đúng kỹ thuật năng suất có thể đạt trung bình từ 1 –

5 kg/m2/tháng hay 120 – 180 tấn tươi/ha/năm, khả năng chịu đựng chuyên chở tốt, đóng gói đơn giản

Trùn quế sinh sản rất nhanh bình quân 1 lần/tuần, trong điều kiện khí hậu nhiệt đới tương đối ổn định và có độ ẩm cao như điều kiện của khu vực phía Nam Việt Nam

từ 1 cặp trùn ban đầu tạo ra từ 1000 – 1500 cá thể trong 1 năm

- Thành phần amino acid trong trùn quế

Bảng 2.1: Thành phần amino acid trong trùn quế

Hàm lượng amino

acid

Bột đạm trùn quế thủy phân (%)

Hàm lượng amino

acid

Bột đạm trùn quế thủy phân (%)

+ Trong những năm gần đây, nuôi trùn đã trở thành một ngành sản xuất kinh

doanh quy mô ở nhiều nước trên thế giới

+ Nhật Bản là nước tiêu thụ trùn đất với số lượng lớn, họ dùng trùn đất làm

nguyên liệu chế biến mỹ phẩm, thức ăn cho thủy hải sản, gia súc và gia cầm Đặc biệt

là dùng thịt trùn làm bánh biscuit dinh dưỡng cho người, rất được ưa chuộng

- Tại Việt Nam

+ “Có một loại thuốc là một enzym có thể làm tan các khối máu cục trong bệnh tim mạch do Nhật Bản, Hàn Quốc, Trung Quốc sản xuất bằng cách khai thác từ một

loại trùn đất có tên khoa học là Lumbricus rubellus” (theo http://www.trunque.net /Vietnam_files/thuocchuabenhtutrunque.htm)

Theo Nguyễn Thị Ngọc Dao, 2006 thì tại Việt Nam có một loại có đặc tính

tương tự như loài trên đó là trùn quế (Peryonix escavatus)

+ Chế tạo ra các chế phẩm từ trùn quế: làm thức ăn trong chăn nuôi, thủy sản, phân của nó dùng làm phân bón cho cây trồng

- Phân trùn là loại phân hữu cơ 100%, được tạo thành từ phân trùn nguyên chất, là một loại phân thiên nhiên giàu dinh dưỡng nhất

- Phân trùn chứa đựng một hỗn hợp vi sinh có hoạt tính cao, là chất xúc tác sinh học, phần cặn bã của cây trồng và phân động vật cũng như kén trùn rất giàu chất dinh dưỡng, dễ hòa tan trong nước, chứa hơn 50% chất mùn Do đó, phân trùn không chỉ kích thích tăng trưởng cây trồng mà còn tăng khả năng cải tạo đất và còn có thể ngăn ngừa các bệnh về rễ

- Phân trùn còn chứa các khoáng chất cho cây như: Nitrat, Photpho, Magne, Kali, Calci, Nitơ Đặc biệt là các khoáng chất này lại được cây trồng hấp thụ một cách trực tiếp; không như những lọai phân hữu cơ khác phải được phân hủy trong đất trước khi cây hấp thụ, sẽ không có bất cứ rủi ro, cháy cây nào xảy ra khi bón phân trùn

+ Hiện nay các nhà khoa học ở Viện Sinh học nhiệt đới đã tạo ra 3 chế phẩm sinh học từ trùn quế làm thức ăn cho thủy sản gia súc gia cầm và phân bón

- Chế phẩm đầu tiên là BIO-T, dùng làm thức ăn cho tôm sú, cá tra, gà lương phượng và vịt xiêm BIO-T được sản xuất bằng cách sử dụng trùn quế tươi phối trộn với hỗn hợp vi khuẩn hữu ích và enzyme tiêu hóa dùng trong chăn nuôi, lên men tạo sản phẩm có mùi trùn, giàu dinh dưỡng (đạm protein và amin cao), enzyme tiêu hóa,

vi khuẩn hữu ích và các chất kháng sinh

- Chế phẩm thứ hai là BIO-BL, đã được dùng để bón cho cây trà ô long và một

số cây hoa màu, cây kiểng BIO-BL được tạo thành từ trùn quế tươi phối trộn với hỗn hợp vi sinh vật hữu ích và enzyme dùng trong trồng trọt, lên men tạo sản phẩm có mùi trùn, giàu đạm protein và amin cao, enzyme tiêu hóa có hoạt lực cao, vi khuẩn hữu ích

- Chế phẩm BIO-PT được tạo ra bằng cách dùng phân trùn ủ lên men, sản phẩm làm ra có mùi thơm, độ ẩm 40%, đạm tổng 2%, chất hữu cơ, kháng sinh và hỗn hợp vi khuẩn hữu ích BIO-PT dùng để gây màu và xử lý nước ao nuôi tôm dùng trong nuôi trồng thủy sản (http://www.khoahoc.com.vn/doisong/ung-dung/23615_Che_pham _sinh_hoc_tu_ trun _que.aspx)

2.2 Giới Thiệu Về Protease

Trong các enzym của hệ tiêu hóa, protease được nghiên cứu sớm hơn cả:

+ Từ thế kỷ 18, nhà tự nhiên học người Pháp là Reomur đã làm thí nghiệm và phát hiện được rằng dịch dạ dày của chim ăn thịt có khả năng tiêu hóa thịt

+ Năm 1836, Schwann đã quan sát được hoạt động phân giải protein của dịch

vị Tuy nhiên, 30 năm sau mới tách được enzym này

+ Năm 1857, Corvisart tách được trypsin từ dịch tụy, đó là protease đầu tiên nhận được dưới dạng chế phẩm, nhưng chế phẩm này còn lẫn nhiều enzym và protein khác

+ Năm 1862, Danilevxki dùng phương pháp hấp thụ trên colodion đã tách được trypsin với amylase tụy tạng Phương pháp hấp thụ chọn lọc của Danilevxki có ý nghĩa lớn trong nghiên cứu tinh chế enzym cũng như protein

+ Năm 1961, Brucke cũng tách được pepsin từ dạ dày chó ở dạng tương đối tinh khiết

+ Năm 1872, Hommarsten đã tách được chế phẩm Chymozin (renin)

Ngoài ra các enzyme tiêu hóa, người ta cũng có những nghiên cứu bước đầu về các protease trong máu Schmidt (1869 - 1872) đã nêu ra giả thuyết rằng trong máu có enzyme fibren (ngày nay gọi là frombin) tham gia trong quá trình làm đông máu Tác giả đã tách enzyme này và kết tủa bằng cồn, chế phẩm nhận được có tác dụng làm cho dung dịch fibrinogen đông lại nhanh chóng

Các protease thực vật được phát hiện muộn hơn so với các protease động vật: + Năm 1874, Group Besannez công bố đã thu nhận được protease từ một số loại hạt đậu (hạt đại mạch, bông) đều có hoạt động phân giải protein

+ Năm 1879, Wurtz được xem là người đầu tiên tách được protease thực vật Ông nêu rằng các phần khác nhau của cây đu đủ có chứa protease, khi dùng cồn để kết tủa sẽ nhận được chế phẩm không tinh khiết (100g/cây) gọi là papain

Đến nửa đầu thế kỷ 20, người ta mới phát hiện thêm các peptide hydrolase khác như:

+ Bromeline protease có trong các phần khác nhau của cây dứa

+ Cathepsxin protease của mô cơ động vật

+ Calierein peptidyl peptide hydrolase của tuyến tụy, nước bọt

+ Ficin protease có trong các cây thuộc giống Ficus

Từ 1930 đến nay, sau khi Sumner (1926) kết tinh được urease từ đậu tương, người ta đã kết tinh được hàng loạt các protease Nhờ kết tinh được enzyme, nhận được enzyme có độ tinh khiết cao nên người ta đã nghiên cứu được cấu trúc phân tử, cấu trúc trung tâm hoạt động, tính chất lý hóa và tính chất đặc hiệu của các protease Đến nay người ta đã nghiên cứu được khá đầy đủ về cấu trúc phân tử của nhiều protease như: papain, trypsin, chymotrypsin, subtilizin Tuy nhiên còn nhiều vấn đề chưa rõ ràng về tính chất đặc hiệu của các protease Vì vậy, việc phân loại và xác định tên hệ thống của chúng cũng đang còn có những khó khăn nhất định

Từ 1950 đến nay, nhờ sử dụng một số phương pháp mới để tinh chế protein và enzyme nên người ta đã tách được các dạng khác nhau của nhiều protease Ví dụ như:

+ Năm 1959, Ryle và Porter dùng phương pháp sắc ký trao đổi ion trên DEAE – cellulose đã tách được hai phần trong chế phẩm pepsin lợn là pepsin B và pepsin C Năm 1965, Ryle đã dùng phương pháp điện di trên gel tinh bột đã phát hiện được tính không đồng nhất của pepsin B Năm 1967, Ryle và Lee đã tách được pepsin D ra khỏi pepsin B

+ Trước 1950, người ta đã phát hiện ra cathepsin B (Fruton và Bergmann, 1939); Cathepsin C (Gutmann và Fruton, 1948) từ thận và lá lách bò Nhưng mãi đến năm 1960 mới tinh chế được enzyme này Keilova và Keil (1969) đã hoàn thiện phương pháp tinh chế cathepsin B khi sử dụng phương pháp sắc ký trao đổi ion trên CMC và DEAE – cephadex lọc qua gel cephadex, Metrione Neves và Fruton (1966) dùng phương pháp lọc qua gel cephadex kết hợp với sắc ký trao đổi ion nhận được chế phẩm cathepsin C khá đồng nhất

Các protease của vi sinh vật mới được chú ý nghiên cứu nhiều nhất từ năm

1950, mặc dù từ 1918 đến 1919, Waksmann đã phát hiện được khả năng phân giải protein của xạ khuẩn Trong những năm gần đây, số công trình nghiên cứu vi sinh vật tăng lên đáng kể nhiều hơn các công trình nghiên cứu protease động vật và thực vật Những kết quả đạt được trong lĩnh vực nghiên cứu protease vi sinh vật đã góp phần

mở rộng quy mô sản xuất chế phẩm enzyme và ứng dụng của enzyme trong thực tế Trong thời gian gần đây, người ta cũng đã có những phương pháp thích hợp để nhận được các chế phẩm không tan của protease

2.2.2 Phân loại protease

Căn cứ vào cơ chế phản ứng, dựa vào đặc trưng của các trung tâm hoạt động,

pH hoạt động thích hợp (Hartley, 1960, trích bởi Phạm Ngọc Tịnh, 2005) đã phân loại protease của vi sinh vật thành 4 nhóm sau:

Serine protease

Gồm có 2 họ protease chính:

+ Họ chymotrypsin: bao gồm các enzyme của động vật có vú như: chymotrypsin, trypsin, elastase

+ Họ substilisin: bao gồm các enzyme vi khuẩn như substilizin

Hai amino acid tham gia vào trung tâm hoạt động là serine và histidine

Cơ chế thủy giải gồm hai giai đoạn: acyl hóa và deacyl hóa

Cysteine protease

+ Bao gồm các protease thực vật như: papain, bromelin

+ Trung tâm hoạt động có hai amino acid: cysteine và histidine

+ Cơ chế thủy giải gồm hai giai đoạn: acyl hóa và deacyl hóa

Aspartic protease

+ Hầu hết thuộc họ pepsin gồm: pepsin, chymosin và protease của vi nấm + Trung tâm hoạt động có 3 amino acid: 2 aspartic và 1 tyrosine

Metallo protease

+ Bao gồm các họ protease của vi khuẩn, vi nấm

+ Trung tâm hoạt động có chứa nguyên tố kim loại như: Zn, Mg, Co

Tuy nhiên theo một số tác giả: Burgum, Prescott (1965), Moriha (1967)…có nhiều protease mang tính chất trung gian giữa các nhóm kể trên, nhất là giữa nhóm 1

2.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự hoạt động của protease

+ pH

Hoạt độ của protease phụ thuộc rất nhiều vào pH của môi trường Đó là vì pH môi trường ảnh hưởng đến mức độ ion hóa của cơ chất, trung tâm hoạt động của protease, phức chất protease – cơ chất và ảnh hưởng đến độ bền của protease

Đa số các protease vi khuẩn bền ở pH trung tính 6,2 – 7,4 pH thích hợp cho hoạt động của nhiều protease gần bằng 7 Điều đáng lưu ý là pH thích hợp cho các hoạt động của protease ở ngoài không nhất thiết phải trùng với môi trường pH ở bên trong tế bào

+ Nhiệt độ

Nhiệt độ hoạt động thích hợp của protease vi khuẩn trong khoảng 300C – 500C Nhiệt độ hoạt động của các protease vi khuẩn không cố định mà có thể thay đổi tùy thuộc theo cơ chất, thời gian

Hoạt động của protease sẽ giảm ở nhiệt độ cao, do bị phá vỡ các cấu trúc enzyme Ở nhiệt độ quá cao enzyme sẽ mất hoạt độ, ngược lại ở nhiệt độ quá thấp thì enzyme ngưng hoạt động nhưng không bị mất hoạt độ

+ Bản chất của protease

Các protease cố định thường hoạt độ cao hơn protease tự do vì các protease cố định ít chịu ảnh hưởng của các chất khác trong dung dịch môi trường cấy Tóm lại, protease cố định bền với các yếu tố gây biến tính hơn protease hòa tan

+ Thời gian hoạt động của enzyme

Thời gian hoạt động của protease vi khuẩn phụ thuộc độ bền hoạt tính của protease Thông thường hoạt tính protease có thể giữ được trong khoảng từ 60 – 82 giờ tuy nhiên hoạt tính của protease sẽ giảm dần Hoạt động của các protease chỉ mạnh trong thời gian xác định tùy theo loài

2.2.4 Ứng dụng của enzyme protease

Theo http://phobachkhoa.com/@pbk/showthread.php?t=26869 thì hiện nay protease được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực: xử lý rác, công nghiệp, nông nghiệp, y dược, nghiên cứu khoa học

- Trong xử lý rác

Một trong những vấn đề cấp bách đặt ra cho các đô thị lớn là vấn đề các chất hữu cơ và rác thải Phần lớn rác thải hằng ngày được trút xuống đường phố, đây cũng chính là nguồn gốc của sự lây lan bệnh Trong rác thì các vi khuẩn thương hàn có thể tồn tại 115 ngày Các hợp chất của ngành công nghiệp độc thấm vào đất gây ảnh hưởng đến sinh hoạt và sức khỏe của người dân

Một trong những biện pháp tốt nhất để xử lý rác có hiệu quả kinh tế là biến chúng thành phân bón, giá thể trồng nấm, nuôi giun Việc sản xuất phân hữu cơ từ rác nhờ vi sinh vật là một giải pháp có thể thực hiện ở nước ta hiện nay

Người ta vận dụng quá trình phân hủy chất hữu cơ dưới tác dụng của vi sinh vật Nguồn vi sinh vật có hoạt tính protease hiện hữu khá phong phú trong tự nhiên Ta

có thể sử dụng các vi sinh vật này để phân hủy nguồn protein có trong rác thải

Một số vi sinh vật có khả năng phân hủy triệt để protein tạo các sản phẩm đơn giản có chứa nitrgen hoặc không chứa nitrogen: indole, scatole, phenol, acid béo, NH3

Tóm lại, protease vi khuẩn giữ vai trò quan trọng trong cuộc sống con người Công dụng của protease ngày càng được các nhà khoa học khám phá nhiều, nó góp phần cung cấp dưỡng chất rất lớn cho đất, chủ yếu là chất đạm mà thực vật dễ sử dụng

Là nhân tố quan trọng tham gia giải quyết nạn ô nhiễm môi trường của toàn cầu

- Trong công nghiệp thực phẩm

Protease được sử dụng trong quá trình chế biến cá Ở mang cá, đặc biệt ở ruột

cá, hệ vi sinh vật rất phong phú Khi làm nước mắm, muối cá, sản phẩm bột cá, protease có sẵn trong ruột cá thủy phân một phần protein của cá Trong nhiều trường hợp, protease còn làm tăng thêm hương vị của sản phẩm

Protease được sử dụng để làm mềm thịt và tăng hương vị thịt sau chế biến Nếu thủy phân một phần protein của thịt rồi mới chế biến sẽ làm tăng rõ rệt hương vị của sản phẩm

Phương pháp thủy phân protein bằng protease không phá hủy các vitamin có trong nguyên liệu, không làm sậm màu dịch thủy phân và không tạo thành các sản phẩm phụ khác

Người ta cũng sử dụng protease để sản xuất các dịch đạm thủy phân từ các phế liệu giàu protein như thịt vụn, đầu cá, da, và để sản xuất các thức ăn kiêng

Một số protease có khả năng làm đông sữa trong sản xuất phomát Protease làm phomát mau chín, nâng cao chất lượng và có thể tạo ra nhiều loại phomát khác nhau Protease của vi khuẩn có thể thay thế một phần renin Vì thế, ta có thể giảm giá

thành sản xuất phomát Protease này có thể thu từ B mesentericus

Ngoài ra, người ta còn dùng protease vi khuẩn để thu casein dùng trong các ngành kỹ thuật khác nhau như: vecni, chất màu, hương liệu Protease cũng được dùng trong sản xuất chao và các dịch thủy phân

- Trong công nghiệp nước giải khát

Protease được sử dụng để làm bia và nước củ quả Ngoài ra, protease cũng dùng trong sản xuất rượu Ở đây nó sẽ phân giải các protein có tác dụng kìm hãm amylase

do đó làm tăng quá trình đường hóa tinh bột

- Trong công nghiệp thuộc da

Protease còn được sử dụng để làm mềm da, tăng cường khả năng tách lông ra khỏi da mà không làm ảnh hưởng đến chất lượng của da Vì vậy da thu được sẽ mềm

và sạch lông hơn Tại Việt Nam, chế phẩm bromelin đã được ứng dụng trong thuộc da tại nhà máy da Thụy Khê – Hà Nội, kết quả sử dụng bromelin cho thấy hiệu quả sử dụng rất tốt

- Trong nông nghiệp

Protease được sử dụng để xử lý nhằm tận dụng các phế liệu giàu protein làm thức ăn trong chăn nuôi, nhằm tăng khả năng tiêu hóa thức ăn và hệ số tiêu hóa thức

ăn, có thể tiến hành bằng các thêm trực tiếp protease vào thức ăn trước khi dùng hoặc dùng protease để xử lý sơ bộ thức ăn

- Trong công nghiệp dược phẩm và y học

Sản xuất các chất hoạt hóa và kìm hãm protease để điều trị các bệnh đặc trưng Protease được sử dụng để sản xuất các thuốc tăng khả năng tiêu hóa protein của những người bị tiêu hóa kém do dạ dày, tụy tạng hoạt động không bình thường, thiếu enzyme Protease được dùng để phân hủy các cục máu đông trong cơ thể, chữa bệnh, nghẽn tĩnh mạch Protease được dùng để làm tiêu mủ các vết thương, các ổ viêm làm thông đường hô hấp

2.3 Sự Thủy Phân Protein

Phản ứng thủy phân là phản ứng phân giải các chất có sự tham gia của nước Trong quá trình thủy phân protein, các phân tử protein hút nước và các liên kết peptide

bị phá hủy Trong giai đoạn đầu các peptide có phân tử thấp, các phân tử này lại tiếp

tục được phân giải đến các amino acid (amino acid là sản phẩm cuối cùng của sự thủy phân protein)

Có nhiều phương pháp khác nhau để thủy phân protein như sử dụng acid, kiềm hoặc enzyme Mỗi tác nhân có ưu nhược điểm khác nhau

2.4 Giới Thiệu Về Cá Rô Phi

Cá rô phi vằn toàn thân phủ vảy, ở phần lưng có màu xanh xám nhạt, phần bụng

có màu trắng ngà hay xanh nhạt Trên thân có từ 7 - 9 vạch chạy từ phía lưng xuống bụng Các vạch đậm dọc theo vây đuôi ở từ phía lưng xuống bụng rất rõ (xem Hình 2.1) Cá rô phi vằn là loài có kích thước thương phẩm lớn, tốc độ tăng trưởng nhanh,

đẻ thưa hơn cá rô phi đen, đây là loài được nuôi phổ biến nhất trên thế giới và ở Việt Nam hiện nay

- Đặc điểm môi trường sống

Cá rô phi có khả năng chịu đựng tốt hơn so với cá nước ngọt khác nuôi phổ biến hiện nay về sự thay đổi độ mặn, nhiệt độ cao, hàm lượng oxy hòa tan thấp và nồng độ NH3 cao

- Độ mặn

Tất cả các loài cá rô phi đều có khả năng chịu đựng đối với môi trường nước lợ

Cá rô phi vằn là loài có khả năng chịu đựng độ mặn kém nhất trong những loài cá thương mại quan trọng, nhưng sự tăng trưởng của cá rô phi vằn tốt nhất ở độ mặn nhỏ hơn 150/00 (Popma và Masser, 1999; trích bởi Phạm Ngọc Tịnh, 2005) Trong khi đó

Hình 2.2: Hình dạng ngoài cá rô phi

cá rô phi xanh phát triển tốt nhất trong môi trường nước lợ có độ mặn nhỏ hơn 200/00,

cá rô phi đen thì phát triển tốt nhất ở độ mặn gần hay bằng độ mặn của nước biển

- Nhiệt độ

Giới hạn nhiệt độ cho sự sinh trưởng bình thường của các loài cá rô phi là 10 -

310C, nhiệt độ tối hảo là từ 29 - 310C Ngưỡng nhiệt độ thấp nhất gây chết cho cá là 10

- 110C, phần lớn các loài cá rô phi sẽ ngừng ăn hay sinh trưởng ở nhiệt độ dưới 16 -

170C và không sinh sản ở nhiệt độ dưới 200C Giới hạn nhiệt độ tối hảo cho sự sinh sản của cá rô phi là từ 26 - 290C cho hầu hết các loài cá rô phi Khả năng chịu đựng nhiệt độ cao thay đổi tùy theo loài, thường từ 37 - 420C

- Hàm lượng oxy hòa tan

Cá rô phi dường như có một khả năng để lấy oxygen hòa tan từ lớp nước bão hòa ở tầng mặt trong những thời điểm mà lớp nước sâu bị thiếu oxy, cá có thể nổi lên tầng mặt để đưa nước bão hòa oxygen qua mang

Các loài cá rô phi có thể tồn tại ở những nơi có hàm lượng thấp oxy hòa tan Hàm lượng oxygen thấp nhất mà cá có thể tồn tại là 0,1 mg/l được ghi nhận cho cả cá rô phi đen và rô phi vằn Tuy nhiên, sự vận chuyển thức ăn và sự trao đổi chất của cá rô phi đen và rô phi vằn sẽ giảm khi oxygen hòa tan nhỏ hơn 2 - 3 mg/l, cá ngừng ăn khi oxygen nhỏ hơn 1,5 mg/l và chết khi oxygen hòa tan ở ao là 0,1 mg/l

- pH

Cá rô phi có thể chịu đựng được một giới hạn rộng của độ pH, từ 4 - 11 Tuy nhiên, pH < 5 thì tác động xấu đến sự kết hợp của máu và oxygen, cá bỏ ăn, ảnh hưởng đến sự phát triển Khi pH tăng cao có thể kích thích cá ăn Cá rô phi đen sẽ chết khi

pH tăng đến 12

- Amonia (NH 3 - N) và nitrite (NO 2 - N)

Amonia rất độc cho cá, nhưng một số công trình nghiên cứu cho thấy cá rô phi

có thể chịu đựng amonia tốt hơn nhiều so với các loài cá khác Hiện tượng cá chết có thể bắt đầu khi hàm lượng amonia bằng 0,2 mg/l Hàm lượng amonia bắt đầu gây bỏ

ăn ở các rô phi là 0,08 mg/l

Nitrite là chất độc đối với nhiều loài cá bởi vì nó làm giảm khả năng vận chuyển oxygen của hemoglobin Cá rô phi có khả năng chịu đựng tốt hơn các loài cá

nước ngọt khác với nitrite (Popma và Masser, 1999; trích bởi Tịnh, 2005) Trong hệ thống tuần hoàn các rô phi có thể tồn tại ở 0,6 mg/l nitrite

Baralin và Haller (1982, trích bởi Nguyễn Văn Tư, 2000) đã tổng kết yêu cầu của các yếu tố môi trường của cá rô phi được so sánh với các cá khác (xem Bảng 2.2)

Bảng 2.2: Các yêu cầu chất lượng nước của cá rô phi

4 - 11

> 20 2,3 (0,5)*

> 73,0

* Nồng độ bắt đầu ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của cá

- Đặc điểm dinh dưỡng

Một trong những thuận lợi của nuôi cá rô phi là chúng có thể nuôi được với một

chế độ dinh dưỡng thấp Những loài của giống Oreochromis đều là những loài ăn tạp,

chúng ăn một lượng lớn thức ăn trong tự nhiên như: tảo, động vật phù du, những động vật không xương sống nhỏ, nhưng mảnh vụn hữu cơ, ấu trùng cá Những loại thức ăn này bổ sung 30 - 50% thức ăn trong sự phát triển của cá rô phi, trong khi ở cá da trơn thì lượng thức ăn này chỉ chiếm từ 5 - 10% ( Fitzsimmons, 2004; trích bởi Phạm Ngọc Tịnh, 2005)

Cá rô phi thường ăn lọc thức ăn bởi vì chúng có thể sử dụng rất có hiệu quả những phiêu sinh thực vật trong nước tuy nhiên, cá rô phi không sử dụng mang để lọc thức ăn như là một công cụ lọc thức ăn thực sự như ở loài cá mòi chấm (Gizzad Shad)

và cá mè trắng (Silver Carp) Mang cá rô phi tiết ra một chất nhầy để bẫy những phiêu sinh thực vật Những phiêu sinh thực vật bị dính vào chất nhầy sẽ tạo thành cục và được cá rô phi nuốt vào bụng

Sự tiêu hóa thực vật xảy ra dọc theo chiều dài của ống tiêu hóa (thường mất ít nhất là 6 giờ trong tổng chiều dài của ruột cá) Cá rô phi đen có khả năng sử dụng

phiêu sinh thực vật kém hiệu quả hơn cá rô phi vằn và cá rô phi xanh (Popma và Masser, 1999, trích bởi Phạm Ngọc Tịnh, 2005)

Hai cơ quan giúp cá rô phi tiêu hóa những mảnh vụn hữu cơ, tảo và những thủy sinh thực vật trong nước là:

• Sự cắt cà nghiền những chuỗi thực vật giữa hai miếng hầu và những cái răng sắc

• Dạ dày có pH < 2, nơi sẽ cắt đứt những tế bào của tảo và vi khuẩn (tảo lục được tiêu hóa tốt hơn các loài tảo khác)

Khi cho ăn, cá rô phi không gây xáo trộn đáy ao như cá chép Cá rô phi cũng ăn những động vật không xương sống ở tầng giữa Cá rô phi dường như không ăn cá con, nhưng những cá chưa trưởng thành cũng có thể ăn ấu trùng cá Cá rô phi có thể sử dụng rất hiệu quả thức ăn tự nhiên trong môi trường ao nuôi Giá trị dinh dưỡng của thức ăn tự nhiên được cung cấp trong ao là rất quan trọng, đặc biệt là trong những môi trường không có sự thay nước Thức ăn tự nhiên có thể cung cấp 1/3 hay nhiều hơn tổng dinh dưỡng cho sự phát triển của cá

Ngoài ra cá rô phi cũng có khả năng thích nghi cao với những loại thức ăn chế biến do con người làm ra Cá rô phi có thể sử dụng tất cả các loại thức ăn khi chúng có thể Đây là một lợi thế cho người nông dân bởi vì cá rô phi có thể nuôi quảng canh dựa trên nguồn thức ăn tự nhiên dồi dào trong môi trường nước hay trong hệ thống thâm canh mà vẫn mang lại hiệu quả với chi phí đầu tư thấp

Trong nuôi quảng canh cá rô phi sẽ phát triển bằng cách sử dụng tảo, thực vật phù du, những mảnh vụn hữu cơ và người nông dân có thể nuôi ở mật độ cao hơn với

sự bổ sung những thực phẩm dư thừa của con người

Trong nuôi thâm canh cá rô phi có thể sử sụng thức ăn nhân tạo bao gồm một khẩu phần cao protein thực vật Trong khi những loài cá ăn thịt đòi hỏi nhiều bột cá hay protein động vật trong những khẩu phần ăn của chúng trong khi nguồn protein động vật đắt hơn rất nhiều so với protein có nguồn gốc từ thực vật Phương pháp nghiên cứu sự thay thế một phần prorein động vật bằng protein thực vật với sự bổ sung các amino acid thiết yếu sẽ làm hạ chi phí sản xuất nhưng vẫn đảm bảo sự tăng trưởng tốt của cá rô phi (Fitzsimmon, 2004)

Nhìn chung cá rô phi là loài ăn tạp nghiêng về thực vật, ở giai đoạn cá bột đến

giai đoạn cá hương, thức ăn chủ yếu là động vật phù du và một ít thực vật phù du Từ

giai đoạn cá hương đến trưởng thành thức ăn chủ yếu là mùn bã hữu cơ và thực vật

phù du Cá rô phi có khả năng tiêu hóa tốt các loài tảo lam, tảo lục Ngoài ra, cá rô phi

còn có khả năng sử dụng rất hiệu quả thức ăn bổ sung: cám gạo, bột ngô, phụ phẩm

nông nghiệp

- Khả năng sinh trưởng

Cá rô phi vằn là loài thích hợp nhất cho nuôi thịt bởi cả cường độ tăng trưởng

nhanh và khả năng sử dụng tốt thức ăn tự nhiên và thức ăn nhân tạo Cá rô phi vằn đòi

hỏi hàm lượng đạm trong khẩu phần ăn từ 20 - 50% tùy theo kích thước Không có sự

khác biệt về tốc độ tăng trưởng của cá rô phi vằn và rô phi xanh

2.5 Nhu Cầu Dinh Dưỡng Cho Cá Rô Phi

Trong sự sống, động vật nói chung rất cần protein Protein được hấp thụ,

chuyển hóa thành các amino acid và được sử dụng bởi các mô, cơ quan để làm thành

những protein mới (phát triển chức năng) hay thay thế những protein đã già cỗi (duy

trì chức năng) Ngoài ra, protein còn được sử dụng để cung cấp nguồn năng lượng cho

cơ thể cá hoạt động (SEAFDEC/AQD, 1994)

Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra khẩu phần cho cá rô phi vằn khoảng 30 % trong ao

nuôi cá thịt (Omar, 1994a; Siddiqui và ctv, 1982) và hơn 45 % trong ao nuôi cá hương

lên cá giống (Omar, 1994b; El- Sayed và Teshima, 1992) Ngoài ra, những cá trong

thời kỳ sinh sản đòi hỏi một hàm lượng protein cao để tăng quá trình tái sản xuất có

hiệu quả (Santiago và ctv, 1985; Chang và ctv, 1988)

Bảng 2.3: Nhu cầu protein điển hình của cá rô phi (Fitzsimmons, 2004)

< 0,02 gam 45 – 50%

0,02 – 2,0 gam 40%

> 35 gam 30 – 32%

Nhu cầu về protein thật sự là nhu cầu về các amino acid Trong 20 amino acid

thì có khoảng 10 amino acid thiết yếu, là những amino acid không tự tổng hợp được

bởi cá hay không thể tổng hợp với số lượng đủ để cung cấp cho nhu cầu của cá Cá rô phi cũng có nhu cầu về 10 amino acid thiết yếu giống như những loài cá khác

Nhu cầu protein của cá phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: năng lượng trong thức

ăn, chất lượng và loại thức ăn sử dụng, trạng thái sinh lý cá, môi trường nuôi dưỡng và lượng thức ăn hằng ngày của cá Nhu cầu protein cho sự tăng trưởng lớn nhất tùy thuộc vào chất lượng protein, kích cỡ của cá và chiếm tới 50% trong khẩu phần ăn của

cá giống nhỏ Tuy nhiên trong nuôi cá với mục đích thương mại thì hàm lượng protein thô của thức ăn thường từ 26 – 30% (Popma và Masser,1999)

Nhìn chung, cá rô phi có khả năng tiêu hóa protein động vật giống như cá da trơn nhưng hiệu quả hơn trong tiêu hóa protein thực vật, đặc biệt là những protein thực vật có chuỗi sợi dài Năng lượng tiêu hóa đòi hỏi cho sự tăng trưởng tốt nhất của cá rô phi thì giống những cá da trơn và ước lượng khoảng 8,2 – 9,4 kcal trên 1 gram của

khẩu phần protein

Chương 3

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời Gian Và Địa Điểm Thực Hiện

+ Thời gian: Đề tài được thực hiện từ tháng 4 năm 2009 đến tháng 9 năm 2009 + Địa điểm:

- Trùn quế tại Viện Công Nghệ Sinh Học - Môi Trường trường Đại Học Nông Lâm Tp HCM

- Nuôi cá tại trại thực nghiệm Khoa Thủy Sản trường Đại Học Nông Lâm Tp HCM

3.2 Đối Tượng Nghiên Cứu

- Trùn quế (được mua tại trại thực nghiệm khoa Chăn Nuôi Thú y trường Đại Học Nông Lâm Tp HCM), sau khi mua về được rửa bằng cồn cho sạch và hết nhớt, sau đó rửa qua bằng nước, đem xay nhuyễn để thủy phân

- Cá rô phi được mua tại trại cá giống sau đó được nuôi dưỡng và tuyển chọn những con có kích thước và trọng lượng tương đối đồng đều nhau để tiến hành bố trí thí nghiệm

- Enzyme protease được cung cấp bởi Viện công nghệ sinh học và môi trường trường Đại Học Nông Lâm Tp HCM

3.3 Dụng Cụ Thí Nghiệm, Thiết Bị Và Hóa Chất

3.4.2 Hệ thống bể composite dùng trong thí nghiệm

Thí nghiệm được bố trí trên 12 bể composite Hệ thống bể được vệ sinh sạch sẽ trước khi tiến hành bố trí thí nghiệm

Hình 3.1: Hệ thống bể bố trí thí nghiệm 3.3.3 Hóa chất:

Trong quá trình thực hiện đề tài chúng tôi đã sử dụng một số hóa chất sau: NaCl, NaOH, Formol, Phenolphtalein, Nước cất, H2SO4đặc, HCl, H3BO3, K2SO4, CuSO4, bộ test đo hàm lượng amonia

3.4 Phương Pháp Phân Tích

+ Xác định nitrogen formol theo phương pháp Sorensen

+ Định lượng nitơ tổng số bằng phương pháp Kjeldhal

3.5 Khảo Sát Quá Trình Thủy Phân Trùn Quế

Để thu được dịch trùn Quế tốt nhất chúng tôi tiến hành khảo sát và chọn lọc những điều kiện thích hợp trong quá trình thủy phân bằng enzyme protease

Trước khi quá trình thủy phân chúng tôi đã tiến hành xác định một số thành phần của trùn quế:

+ Nitrogen tổng số (g/100g NL)

+ Nitrogen formol (g/100g NL)

Chỉ tiêu theo dõi quá trình thủy phân:

+ Khảo sát thời gian thủy phân

Sau quá trình khảo sát và chọn được những điều kiện tốt nhất chúng tôi tiến hành khảo sát thời gian thủy phân là: 4 giờ, 8 giờ, 12 giờ, 16 giờ, 20 giờ, 24 giờ

Sau mỗi lần thủy phân dịch thu được đều đo đạm tổng số, và đạm formol nhằm tính hiệu suất thủy phân để chọn dịch đạm tốt nhất

3.6 Thức Ăn

Thức ăn được sử dụng trong thí nghiệm được chế biến từ các nguồn nguyên liệu chủ yếu như: bột cá, bột đậu nành, cám gạo, tinh bột khoai mì, bột bắp và premix khoáng

Các nguyên liệu được tính toán theo trọng lượng khô, trộn đều, thêm nước và cho vào máy ép đùn Sau đó cho vào máy sấy thức ăn ở nhiệt độ 600C Sau 24h, thức

ăn đã khô được cho vào bao nylon kín, bảo quản nơi khô ráo

Hình 3.2: Máy ép thức ăn

Hình 3.3: Máy sấy thức ăn

NT ĐC: không thay thế bột cá

NT I: thay thế 25% trọng lượng bột cá bằng dịch trùn

NT II: thay thế 50% trọng lượng bột cá bằng dịch trùn

NT III: thay thế 75% trọng lượng bột cá bằng dịch trùn

Bảng 3.1: Công thức tổ hợp thức ăn của 4 nghiệm thức thức ăn (gam)

Trước khi bố trí thí nghiệm, cá được tiến hành cân trọng lượng ban đầu, sau đó

cá được bố trí ngẫu nhiên vào các bể, mỗi bể 30 con

Sơ đồ bố trí bể thí nghiệm:

NT III.2 NT III.3 NT ĐC3

NT II.2 NT III.1 NT II.1

NT I.1 NT II.3 NT I.3

NT ĐC2 NT I.2 NT ĐC1

3.7.2 Các chỉ tiêu trên cá cần theo dõi

- Tỷ lệ sống của cá thí nghiệm (%):

- Chỉ tiêu tăng trưởng

- Hệ số biến đổi thức ăn (FCR: Feed conversion ratio)

3.7.3 Các chỉ tiêu chất lượng nước cần được theo dõi

- Nhiệt độ nước (oC) sẽ được đo mỗi ngày bằng máy đo

- Oxy hòa tan sẽ được đo mỗi ngày

- Hàm lượng NH3 sẽ được đo mỗi tuần một lần

- pH sẽ được đo mỗi tuần một lần

Ghi chú: các chỉ tiêu được đo vào lúc 7 giờ 45 phút sáng và 16 giờ 15 phút chiều

mỗi ngày bằng máy đo, trong đó máy HANNA Oxy - Check đo yếu tố nhiệt độ và oxy hòa tan và EZODO MP103 đo yếu tố pH

Hình 3.4: Dụng cụ đo các chỉ tiêu môi trường

3.7.4 Chăm sóc và quản lý

Mỗi ngày cho ăn 2 lần vào lúc 8h00 sáng và 16h30 với khẩu phần ăn bằng khoảng 5% trọng lượng của cá trong bể

Trong quá trình nuôi tiến hành định kỳ đo các chỉ tiêu nước và tiến hành thay nước trong các bể

3.7.5 Phương pháp thu thập và xử lý số liệu

Trong quá trình thí nghiệm, cá được tiến hành cân trọng lượng hai tuần một lần

Cá được cho nhịn ăn một buổi trước khi tiến hành cân trọng lượng Trọng lượng được cân bằng cân điện tử

Các phần tính toán, vẽ đồ thị, biểu đồ được thực hiện trên phần mềm Excel

2003, số liệu được xử lý bằng phần mềm Stagrapics 7.0

Chương 4

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Kết Quả Khảo Sát Ảnh Hưởng Tỷ Lệ Nước Bổ Sung Lên Quá Trình Thủy Phân

Để xác định được ảnh hưởng của nước trong

quá trình thủy phân chúng tôi đã tiến hành thủy phân

trong điều kiện như sau:

Đối với tỷ lệ nước: quá trình ảnh hưởng của

nước trong quá trình thủy phân chúng tôi tiến hành

Nhiệt độ 500C

Thời gian thủy phân 20 giờ

Hoạt độ enzyme tương ứng 35 UI

Nguyên liệu 100 g

Hình 4.1: Dịch trùn quế

Bảng 4.1: Kết quả của HSTP (%) và HSTNđht (%) do ảnh hưởng của nước

(⎯X ± SE: hiệu suất trung bình ± sai số chuẩn; các giá trị theo sau các chữ cái ( a,b, …)

trong cùng một cột khác nhau thì sai khác nhau có ý nghĩa về mặt thống kê)

Dựa vào kết quả phân tích và thống kê (Bảng 4.1) cho thấy được hiệu suất thủy

phân và hiệu suất thu nhận đạm hòa tan (HSTNđht) của các mẫu có tỷ lệ nước khác

nhau thì khác nhau Quá trình thủy phân được tiến hành trong 20 giờ Kết quả về

HSTP cho được cao nhất là mẫu H1 (49 %), nhưng xét về hiệu quả kinh tế thì không

phù hợp, nên chúng tôi chọn mẫu H3 (47,49%) hiệu suất thủy phân khá cao và có lợi

về mặt kinh tế Do đó chúng tôi chọn tỷ lệ nước là 50% để thực hiện các nghiên cứu

tiếp theo

4.2 Kết Quả Khảo Sát Của Nồng Độ Muối Đến Quá Trình Thủy Phân

Sau khi chọn được tỷ lệ nước tối ưu (50%) chúng tôi tiến hành khảo sát ảnh

hưởng của nồng độ muối lên quá trình thủy phân

Chúng tôi tiến hành khảo sát muối với các nồng độ như sau: M1 (1%), M2 (2%),

M3 (3%), M4 (4%), M5 (5%), ở mỗi tỷ lệ khác nhau nguyên liệu được chứa trong

Nhiệt độ 500C

Thời gian thủy phân 20 giờ Hoạt độ enzyme tương ứng 35 UI Nguyên liệu 100 g

những bình tam giác khác nhau mỗi bình 100g nguyên liệu, 50% nước, hoạt độ enzyme là 35 UI

Bảng 4.2: Kết quả HSTP (%) và HSTNđht (%) do ảnh hưởng của muối

Từ kết quả thu được (Bảng 4.2) nhận thấy HSTP tại mẫu 2 là cao nhất (75,6 %),

có sự khác biệt đối với những mẫu còn lại Khi tăng nồng độ muối NaCl thì hiệu suất thủy phân có dấu hiệu giảm dần và thấp nhất tại điểm M5 là 58,8% Mẫu M2 và M3 là sai khác có ý nghĩa về mặt thống kê (p < 0,05) So sánh giữa mẫu 2 và các mẫu còn lại cũng có sự sai khác

4.3 Kết Quả Khảo Sát Ảnh Hưởng Của Hoạt Độ Enzyme Lên Quá Trình Thủy Phân

Enzyme protease được thu nhận từ nấm mốc Aspergillus oryzae với hoạt độ là

35 UI/g

Sau khi chọn nồng độ muối, và tỷ lệ nước tối ưu chúng tôi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của hoạt độ enzyme bổ sung vào quá trình thủy lần lượt là: E1 (10 UI), E2

(35 UI), E3 (60 UI), E4 (85 UI), E5 (110 UI)

Quá trình thủy phân được tiến hành trong 20 giờ Nguyên liệu được chứa trong

5 bình tam giác khác nhau, mỗi bình có hoạt độ enzyme khác nhau, dịch thu được sau thủy phân cũng được tiến hành đo đạm tổng số và đạm formol để tính hiệu suất thủy phân