TẬN DỤNG PHỤ PHẨM CÁ TRA BẰNG ENZYME PROTEASE TỪ VI KHUẨN Bacillus subtilis

Tuy nhiên mức độ đặc hiệu của các enzyme rất khác nhau và được phân biệt thành các mức sau: Đặc hiệu tuyệt đối: khả năng tác động của enzyme lên một cơ chất nhất định, ngoài cơ chất này

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA THỦY SẢN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

TẬN DỤNG PHỤ PHẨM CÁ TRA BẰNG ENZYME

PROTEASE TỪ VI KHUẨN Bacillus subtilis

Họ và tên sinh viên: TRẦN THỊ HỒNG NGHI Ngành: CHẾ BIẾN THỦY SẢN

Niên khóa: 2005 – 2009

Tháng 09/2009

TẬN DỤNG PHỤ PHẨM CÁ TRA BẰNG ENZYME PROTEASE TỪ VI

KHUẨN Bacillus subtilis

Tháng 09 năm 2009

LỜI CẢM ƠN

Xin chân thành cảm ơn:

Ban Giám Hiệu trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt thời gian học tập

Các thầy cô trong khoa Thủy sản cùng các thầy cô đã trực tiếp giảng dạy trong suốt bốn năm qua

PGS.TS Lê Thanh Hùng và Th.S Trương Quang Bình đã tận tình hướng dẫn và động viên trong thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp

Th.S Trương Phước Thiên Hoàng và các anh chị phụ trách phòng CNSH thuộc Trung tâm phân tích thí nghiệm Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh

Cùng tất cả các bạn đã hỗ trợ, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian làm

đề tài

Thành kính ghi ơn ba mẹ cùng những người thân trong gia đình luôn tạo điều kiện và động viên con trong suốt quá trình học tập tại trường

TÓM TẮT

Đề tài “Tận dụng phụ phẩm cá Tra bằng enzyme protease từ vi khuẩn

Bacillus subtilis” được tiến hành trong thời gian từ 04/2009 đến 09/2009 với mục đích

khảo sát các điều kiện thích hợp cho quá trình thủy phân để tạo ra dịch đạm cao Đồng thời, khảo sát tỷ lệ mỡ thu được trong quá trình thủy phân Sau đó, chúng tôi tiến hành

ủ dịch đạm này qua bã chượp cá cơm để gây hương nước mắm

Qua kết quả nghiên cứu, chúng tôi kết luận như sau:

Quá trình thủy phân thích hợp ở tỷ lệ nước là 30%, nồng độ muối 2%, tỷ lệ enzyme 4% và thời gian thủy phân 18 giờ sẽ cho hiệu suất thủy phân cao nhất là 81,75%, nitrogen formol 14,3 g/l, nitrogen tổng số 16,75 g/l và nitrogen NH3 1,22 g/l Dịch đạm thủy phân này phù hợp làm nước mắm

Tỷ lệ nước và tỷ lệ enzyme không ảnh hưởng đến tỷ lệ thu hồi mỡ, thời gian thu hồi mỡ là 20 giờ

Mỡ thu được sau thủy phân có hàm lượng chất béo chiếm 95,8%, đạt chỉ số acid 0,41 mg KOH/g, chỉ số Iod 29,24 g I2/100g và chỉ số peroxyt 0,47 ml Na2S2O3

Khi tiến hành ủ dịch đạm thủy phân thu được qua bã chượp để gây hương nước mắm thì thời gian ủ là 10 ngày với tỷ lệ bã chượp thích hợp 20% Nước mắm đạt loại khá với hàm lượng acid amin 13,01 g/l, nitrogen tổng số 16 g/l và nitrogen NH3 1,49 g/l và không có vi sinh vật gây hại

MỤC LỤC

Đề mục Trang

Trang tựa i

Lời cảm ơn ii

Tóm tắt iii

Mục lục iv

Danh sách các chữ viết tắt vii

Danh sách các bảng viii

Danh sách biểu đồ và hình x

Chương 1 GIỚI THIỆU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 2

1.3 Nội dung nghiên cứu 2

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Khái quát chung về enzyme 3

2.1.1 Khái niệm về enzyme 3

2.1.2 Cấu tạo, tính chất và cơ chế tác dụng của enzyme 4

2.1.3 Ứng dụng của enzyme 8

2.2 Tổng quan enzyme protease 8

2.2.1 Khái quát chung về enzyme protease 8

2.1.2 Nguồn nguyên liệu thu nhận protease 10

2.1.3 Ứng dụng của enzyme protease 11

2.3 Tổng quan Bacillus subtilis 13

2.4 Tổng quan về cá Tra 15

2.4.1 Phân loại 15

2.4.2 Đặc điểm sinh học 15

2.4.3 Sản lượng, giá trị kinh tế cá Tra 15

2.4.4 Một số nghiên cứu về thủy phân phụ phẩm cá trong và ngoài nước 17

2.4.5 Giới thiệu phụ phẩm cá Tra 18

2.4.6 Thành phần hóa học của cá Tra 19

2.4.7 Thành phần thể trọng của cá Tra 20

2.4.8 Muối 21

2.4.9 Quá trình amôn hóa protein 22

2.4.10 Quá trình thủy phân của protein cá 23

2.5 Giới thiệu về nước mắm 27

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 29

3.2 Vật liệu và dụng cụ 29

3.2.1 Vật liệu 29

3.2.2 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất 29

3.3 Nội dung nghiên cứu 30

3.3.1 Phương pháp tinh sạch enzyme protease 30

3.3.2 Thí nghiệm 1: Khảo sát thành phần của cơ chất dùng để thủy phân 30

3.3.3 Thí nghiệm 2: Khảo sát tỷ lệ nước ảnh hưởng đến quá trình thủy phân 30

3.3.4 Thí nghiệm 3: Khảo sát nồng độ muối ảnh hưởng đến quá trình thủy phân30 3.3.5 Thí nghiệm 4: Khảo sát tỷ lệ enzyme thủy phân 31

3.3.6 Thí nghiệm 5: Khảo sát thời gian thủy phân 31

3.3.7 Các chỉ tiêu khảo sát hiệu quả của quá trình thủy phân 31

3.3.8 Thí nghiệm 6: Ứng dụng thủy phân nguyên liệu với các điều kiện đã được chọn 32

3.3.9 Phương pháp đánh giá cảm quan 32

3.3.10 Phương pháp xử lý số liệu 32

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33

4.1 Quy trình tinh sạch enzyme protease 33

4.2 Kết quả khảo sát thành phần của cơ chất dùng để thủy phân 34

4.3 Kết quả khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ nước đến quá trình thủy phân 35

4.4 Kết quả khảo sát nồng độ muối bổ sung vào quá trình thủy phân 36

4.5 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme bổ sung vào quá trình thủy phân 37

4.6 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến quá trình thủy phân 38 4.7 Ứng dụng chế phẩm protease trong thủy phân phụ phẩm cá với các điều

kiện tối ưu đã được chọn 40

4.8 Kết quả đánh giá cảm quan của sản phẩm nước mắm sau ủ chượp 42

4.9 Quy trình sản xuất thử nghiệm nước mắm 45

4.10 Thời gian và chi phí sản xuất 49

4.10.1 Thời gian 49

4.10.2 Chi phí sản xuất 49

4.11 Thiết kế nhãn 50

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 51

5.1 Kết luận 51

5.2 Đề nghị 52

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

HSTNdht Hiệu suất thu nhận đạm hòa tan

HSTP Hiệu suất thủy phân

VASEP Viet Nam Association of Seafood Exporters and Producers

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Một số nguồn protease động vật và thực vật 10

Bảng 2.2 Thị trường xuất khẩu cá Tra và Basa của Việt Nam năm 2007 17

Bảng 2.3 Thành phần thể trọng của cá Tra nuôi bè 20

Bảng 2.4 Thành phần thể trọng của cá Tra nuôi ao 20

Bảng 2.5 Thành phần hóa học trung bình của fillet cá Tra nuôi bè 20

Bảng 2.6 Thành phần hóa học trung bình của fillet cá Tra nuôi ao 21

Bảng 2.7 Nồng độ muối làm vi sinh vật ngừng phát triển 24

Bảng 4.1 Thành phần khối lượng của phụ phẩm cá dùng để thủy phân 34

Bảng 4.2 Thành phần các loại đạm có trong phụ phẩm cá 34

Bảng 4.3 Ảnh hưởng của tỷ lệ nước đến quá trình thủy phân phụ phẩm cá Tra 35

Bảng 4.4 Ảnh hưởng của tỷ lệ nước đến tỷ lệ thu hồi mỡ 36

Bảng 4.5 Ảnh hưởng của nồng độ muối đến quá trình thủy phân phụ phẩm cá Tra36 Bảng 4.6 Ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme đến quá trình thủy phân phụ phẩm cá Tra 37

Bảng 4.7 Ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme đến tỷ lệ thu hồi mỡ 38

Bảng 4.8 Ảnh hưởng của thời gian đến quá trình thủy phân phụ phẩm cá Tra 39

Bảng 4.9 Ảnh hưởng của thời gian đến tỷ lệ thu hồi mỡ 40

Bảng 4.10 Thành phần dịch thủy phân 41

Bảng 4.11 Thành phần khối lượng sau khi thủy phân một kg phụ phẩm 41

Bảng 4.12 Chỉ tiêu mỡ cá sau thủy phân 42

Bảng 4.13 Ảnh hưởng của phương pháp thu hồi mỡ đến chất lượng mỡ thô 42

Bảng 4.14 Kết quả đánh giá các chỉ tiêu cảm quan của nước mắm có tỷ lệ bã chượp 10% 42

Bảng 4.15 Kết quả đánh giá các chỉ tiêu cảm quan của nước mắm có tỷ lệ bã chượp 20% 43

Bảng 4.16 Kết quả đánh giá các chỉ tiêu cảm quan của nước mắm có tỷ lệ bã chượp 30% 43

Bảng 4.17 Thành phần nước mắm sau khi ủ bã chượp cá 48

Bảng 4.18 Chi phí để thủy phân một kg phụ phẩm cá 49 Bảng 4.19 Giá bán của một số sản phẩm trên thị trường 50

DANH SÁCH BIỂU ĐỒ VÀ HÌNH

Biểu đồ

Biểu đồ 2.1 Sản lượng và giá trị xuất khẩu cá Tra và Basa 2003 – 2007 16

Hình Hình 2.1 Cấu trúc enzyme 4

Hình 2.2 Bacillus subtilis 13

Hình 2.3 Cá Tra 15

Hình 4.1 Phụ phẩm cá Tra 48

Hình 4.2 Cá xay nhỏ 48

Hình 4.3 Trước thủy phân .49

Hình 4.4 Sau thủy phân 49

Hình 4.5 Ủ chượp cá 49

Hình 4.6 Xương cá Tra 50

Hình 4.7 Bã cá Tra 50

Hình 4.8 Dịch sau thủy phân 50

Hình 4.9 Mỡ cá 50

Hình 4.10 Sản phẩm nước mắm 51

Theo hiệp hội thủy sản Việt Nam (VASEP) ở Đồng Bằng Sông Cửu Long hiện

có trên 70 nhà máy chế biến mặt hàng fillet cá Tra trong năm 2006 Năm 2007, nếu sản lượng cá nguyên liệu đạt 1 triệu tấn thì các nhà máy chế biến phải thải ra thị trường hơn 600.000 tấn phụ phẩm cá Tra Với nguồn phụ phẩm vô cùng lớn như vậy nếu không có cách giải quyết thì lượng phụ phẩm này sẽ trở thành một gánh nặng cho các doanh nghiệp, đặc biệt là trong việc bảo vệ môi trường Thực tế khoảng 5 năm trở lại đây, phụ phẩm cá Tra (đầu, xương sống, ruột, kỳ vi) được tận dụng tối đa chế biến thành thức ăn công nghiệp phục vụ chăn nuôi sau khi đã nấu lấy mỡ Bong bóng cá bán cho những đại lý chuyên thu mua sấy khô cung cấp cho các nhà hàng nấu súp Bao

tử cá làm sạch bán cho các quán ăn đặc sản Da cá xuất khẩu sang Châu Âu phục vụ công nghiệp dược phẩm, mỹ phẩm Riêng mỡ cá chiếm từ 15 – 20% trọng lượng được các cơ sở chế biến nấu thành mỡ nước cung ứng cho thị trường (Lê Hùng Anh, 2007)

Từ thực tế nguồn phụ phẩm cá Tra dồi dào có quanh năm việc xử lý phụ phẩm

cá Tra hiệu quả và thân thiện với môi trường càng trở nên cần thiết Do đó, việc xử lý nguồn phụ phẩm này bằng biện pháp sinh học là một lựa chọn hàng đầu Trong đó, enzyme thủy phân là một lựa chọn có thể để thu hồi protein và được nhận thấy sử dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm do tạo ra những sản phẩm có nhiều công dụng

và giá trị dinh dưỡng cao (Min-Tian Gao và ctv, 2005)

Từ thực tế trên để tận dụng và đa dạng hóa sản phẩm chế biến từ nguồn phụ

phẩm cá Tra của các nhà máy chế biến thủy sản, chúng tôi thực hiện đề tài “Tận dụng

phụ phẩm cá Tra bằng enzyme protease từ vi khuẩn Bacillus subtilis” nhằm làm

cho các nhà máy đông lạnh thủy sản chế biến phụ phẩm cá Tra khắc phục được những trở ngại trong việc hạn chế sự tổn thất hàm lượng đạm thải ra ngoài gây ô nhiễm môi trường, đồng thời giúp gia tăng hiệu quả kinh tế cho nhà máy

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Thủy phân protein cá trong điều kiện tốt nhất với sự tham gia của enzyme

protease từ vi khuẩn Bacillus subtilis

Thử nghiệm sản xuất nước mắm và thu hồi mỡ cá từ phụ phẩm cá Tra

1.3 Nội dung nghiên cứu

Khảo sát các nhân tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân của enzyme protease như nồng độ muối, tỷ lệ nước, nồng độ enzyme và thời gian thủy phân cần thiết cho quá trình thủy phân Đồng thời, khảo sát tỷ lệ mỡ thu được trong quá trình thủy phân

Xây dựng qui trình thủy phân phụ phẩm cá Tra có thể áp dụng trong sản xuất dịch đạm phục vụ cho sản xuất nước nắm

Tìm tỷ lệ giữa chượp cá và dịch đạm thích hợp để sản xuất nước mắm

Chương 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Khái quát chung về enzyme

Hiện nay, ngành khoa học nghiên cứu về enzyme đã trở thành một ngành khoa học mũi nhọn, phát triển rất nhanh trên thế giới, phân nhánh rất nhiều và liên quan chặt chẽ tới các ngành như hóa lý, hóa sinh, vi khuẩn, vi sinh học, sinh lý, y học Hàng năm trên thế giới xuất hiện hàng chục nghìn công trình nghiên cứu về cơ chế tác dụng của enzyme, các phương pháp tách chiết và tinh chế enzyme, sự điều hòa rối loạn hoạt động của cơ thể ở trạng thái sinh lý và bệnh lý của enzyme

2.1.1 Khái niệm về enzyme

Enzyme là chất xúc tác sinh học có bản chất protein, nó được cơ thể sinh vật tổng hợp nên và tham gia xúc tác cho tất cả các phản ứng sinh hóa trong cơ thể (Nguyễn Đức Lượng, 2001)

Ưu điểm cơ bản của enzyme khi tham gia phản ứng sinh hóa:

Enzyme có thể tham gia hàng loạt các phản ứng trong chuỗi phản ứng sinh hóa để giải phóng hoàn toàn năng lượng hóa học có trong vật chất

Enzyme có thể tham gia các phản ứng độc lập nhờ khả năng chuyển hóa rất cao

Enzyme có thể tạo ra những phản ứng dây chuyền, khi đó sản phẩm phản ứng đầu sẽ là nguyên liệu hay cơ chất cho những phản ứng tiếp theo

Trong các phản ứng enzyme, sự tiêu hao năng lượng thường rất ít

Enzyme luôn luôn được tổng hợp trong tế bào của sinh vật Số lượng enzyme được tổng hợp rất lớn và luôn luôn tương ứng với số lượng các phản ứng xảy

ra trong cơ thể Các phản ứng xảy ra trong cơ thể luôn luôn có sự tham gia xúc tác bởi enzyme

Enzyme không bị mất đi trong phản ứng, do đó sau khi kết thúc một phản ứng, các enzyme hoàn toàn được tự do và lại tham gia xúc tác phản ứng mới (trong điều kiện không bị tác động bởi các yếu tố có hại đến cấu trúc của chúng như nhiệt độ, pH)

Những ưu điểm cơ bản trên tạo cho enzyme đặc tính hoàn hảo khi tham gia các phản ứng sinh hóa trong tế bào (Nguyễn Đức Lượng, 2001)

2.1.2 Cấu tạo, tính chất và cơ chế của enzyme

Các enzyme trong tế bào thường là các protein có cấu trúc bậc bốn (hình 2.1)

Vì thế, nếu chúng bị tác động bởi một số yếu tố nhất định thì chúng sẽ phân ly để tạo thành các phần dưới đơn vị (protome), lúc này hoạt tính của enzyme sẽ bị mất hoàn toàn Khi gặp điều kiện thuận lợi các protome này lại có khả năng kết hợp với nhau, khi đó hoạt tính của enzyme lại được phục hồi

Hình 2.1: Cấu trúc của enzyme

Cấu trúc bậc 1 Cấu trúc bậc 2 Cấu trúc bậc 3 Cấu trúc bậc 4

Trong quá trình xúc tác không phải toàn bộ tất cả các phần của enzyme tham gia mà chỉ có một vùng giới hạn của phân tử enzyme tham gia phản ứng Vùng giới hạn tham gia phản ứng này được gọi là trung tâm hoạt động Trung tâm hoạt động của enzyme do một số acid amin đảm trách, cụ thể:

Ở enzyme đơn cấu tử, trung tâm hoạt động thường bao gồm một tổ hợp các nhóm định chức của acid amin không tham gia vào trục chính của sợi polypeptide Các nhóm này có thể ở xa nhau trong mạch polypeptide nhưng chúng lại gần nhau trong không gian, khoảng cách giữa chúng được xác định sao cho chúng có thể tương tác với nhau trong quá trình xúc tác

Ở enzyme đa cấu tử, trung tâm hoạt động của chúng là nhóm ngoại và nhóm định chức của acid amin nằm ở apoenzyme

Điểm đặc biệt của trung tâm hoạt động là chúng có cấu hình không gian rất tương ứng với cấu trúc của cơ chất Cấu hình không gian này của enzyme được hình thành trong quá trình enzyme tiếp xúc với cơ chất Khi enzyme tương tác với cơ chất, các nhóm chức ở phần trung tâm hoạt động của phân tử enzyme sẽ thay đổi vị trí không gian tạo thành hình thể khớp với hình thể cơ chất

Ở tế bào động vật tồn tại một loại enzyme không tham gia phản ứng ngay, muốn có khả năng hoạt động chúng phải được hoạt hóa Trung tâm hoạt động của loại enzyme này tồn tại ở dạng chưa được hoạt hóa và được gọi là zymogen hay proenzyme, ví dụ như enzyme pepxinogen, tripxinogen, kimotripxinogen hay protrombin Các enzyme này có thể tự hoạt hóa hoặc nhờ tác dụng của một enzyme nào đó hoặc một yếu tố nào đó, khi đó một số liên kết peptide trong phân tử zymogen

bị mất, enzyme sẽ được hoạt hóa Trong một số trường hợp khác có sự sắp xếp lại các nhóm chức trong phân tử enzyme, khi đó sẽ hình thành trung tâm hoạt động của enzyme ở trạng thái hoạt hóa

Ở những enzyme dị lập thể (enzyme điều hòa) còn có trung tâm dị lập thể (trung tâm điều hòa), các trung tâm này có khả năng tương tác với cơ chất khác, các cơ chất tương tác với trung tâm này gọi là chất điều hòa Khi trung tâm điều hòa tương tác với chất điều hòa, chúng sẽ làm thay đổi cấu trúc không gian của trung tâm hoạt động, khi đó tốc độ phản ứng enzyme sẽ bị thay đổi Nếu tốc độ phản ứng enzyme được tăng lên khi chất điều hòa tương tác với trung tâm điều hòa thì chất điều hòa này

được gọi là chất điều hòa dương, ngược lại nếu tốc độ phản ứng enzyme giảm xuống thì chất điều hòa được gọi là chất điều hòa âm Các chất điều hòa hoàn toàn không biến đổi khi chúng tương tác với enzyme (Nguyễn Đức Lượng, 2004)

2.1.2.2 Tính chất của enzyme

a Cường lực xúc tác

Enzyme là chất xúc tác sinh học, nó có đầy đủ các tính chất của một chất xúc tác Tuy nhiên so với chất xúc tác thường thì enzyme có cường lực xúc tác mạnh hơn nhiều (Lê Ngọc Tú và ctv, 2005)

b Tính đặc hiệu của enzyme

Tính đặc hiệu của enzyme là khả năng xúc tác chọn lọc, xúc tác cho sự chuyển hóa một hay một số chất nhất định theo một kiểu phản ứng nhất định, đây là tính chất quan trọng nhất của enzyme

Tính đặc hiệu của enzyme có liên quan đến cấu trúc không gian ba chiều của enzyme Vì enzyme là một protein có cấu trúc không gian ba chiều nên việc tương tác giữa enzyme và cơ chất xảy ra chỉ khi enzyme và cơ chất tương ứng với nhau về cấu trúc không gian (cụ thể là hình dạng và các nhóm tích điện) và cơ chất có khả năng lấp đầy bề mặt của enzyme đó

Tính đặc hiệu của enzyme được biểu hiện như sau:

™ Đặc hiệu phản ứng: tính đặc hiệu này thể hiện ở chỗ mỗi enzyme chỉ có thể xúc tác cho một trong các kiểu phản ứng chuyển hóa một chất nhất định

™ Đặc hiệu cơ chất: mỗi một cơ chất có một loại enzyme tương tác tương ứng Các enzyme có thể phân biệt được những cơ chất mà nó sẽ tác dụng Khả năng này còn thấy rất rõ khi trong quá trình phản ứng tồn tại các dạng đồng phân Tuy nhiên mức độ đặc hiệu của các enzyme rất khác nhau và được phân biệt thành các mức sau:

Đặc hiệu tuyệt đối: khả năng tác động của enzyme lên một cơ chất nhất định, ngoài cơ chất này ra enzyme hoàn toàn không có khả năng tác dụng lên một loại

cơ chất nào khác

Đặc hiệu tương đối: khả năng của enzyme tác động lên một kiểu liên kết hóa học nhất định của phân tử cơ chất mà không phụ thuộc vào cấu tạo của các phần tham gia tạo thành các mối liên kết đó

Đặc hiệu nhóm: khả năng của enzyme tác động lên một kiểu liên kết hóa học với điều kiện một trong hai phần tham gia tạo thành liên kết phải có cấu tạo xác định

Đặc hiệu quang học: nếu có hai dạng đồng phân quang học thì enzyme chỉ tác dụng lên một trong hai dạng đồng phân quang học đó (Lê Ngọc Tú và ctv, 2005)

2.1.2.3 Cơ chế tác dụng của enzyme

Bản chất của cơ chế tác dụng bởi enzyme trong các phản ứng hóa học là khả năng hoạt hóa cơ chất để các cơ chất tham gia phản ứng mạnh hơn

Trong phản ứng có xúc tác enzyme nhờ sự tạo thành phức hợp trung gian enzyme – cơ chất mà cơ chất được hoạt hóa, khi cơ chất kết hợp vào enzyme do kết quả của sự cực hóa, sự chuyển dịch của các electron và sự biến dạng của các liên kết tham gia trực tiếp vào phản ứng dẫn tới làm thay đổi động năng cũng như thế năng, kết quả làm cho phân tử cơ chất trở nên hoạt động hơn nhờ đó tham gia phản ứng dễ dàng

Điểm đặc biệt là khi enzyme tham gia xúc tác thì năng lượng cần cho phản ứng xảy ra không những nhỏ hơn rất nhiều so với trường hợp không có xúc tác mà còn nhỏ hơn so với trường hợp có chất xúc tác thông thường

Quá trình xúc tác của enzyme xảy ra qua ba giai đoạn:

E + S → ES → P + E

Trong đó:

E: enzyme S: cơ chất P: sản phẩm Giai đoạn thứ nhất: enzyme kết hợp với cơ chất bằng liên kết yếu tạo thành phức ES không bền, phản ứng này xảy ra rất nhanh và đòi hỏi năng lượng hoạt hóa thấp

Giai đoạn thứ hai: xảy ra sự biến đổi cơ chất dẫn tới sự kéo căng và phá vỡ các liên kết đồng hóa trị tham gia phản ứng

Giai đoạn thứ ba: sản phẩm được tạo thành, enzyme được giải phóng và trở lại trạng thái tự do

Các loại liên kết chủ yếu được tạo thành giữa E và S trong phức ES: liên kết hydro, tương tác tĩnh điện, tương tác Vanderwaals Mỗi loại liên kết đòi hỏi những

điều kiện khác nhau và chịu ảnh hưởng khác nhau khi có nước (Nguyễn Phước Nhuận

và ctv, 2003)

2.1.3 Ứng dụng của enzyme

Trong khoảng hai mươi năm trở lại đây, enzyme được ứng dụng rất rộng rãi trong nhiều ngành khác nhau của nền kinh tế quốc dân: trong hóa học, trong y học, trong công nghiệp nhẹ và đặc biệt là trong công nghiệp thực phẩm Do đó ở nhiều nước trên thế giới, việc sản xuất các chế phẩm enzyme đã trở thành một ngành công nghiệp lớn

Hiện nay có hai hướng ứng dụng enzyme:

Hướng thứ nhất: sử dụng có định hướng các enzyme có trong tế bào sống của

vi sinh vật Theo hướng này việc sử dụng enzyme đồng nghĩa với việc sử dụng tế bào

vi sinh vật trong quá trình sản xuất Ứng dụng này chỉ có ý nghĩa khi sản phẩm của sự tham gia phản ứng là sản phẩm không tinh khiết Đây là hỗn hợp các sản phẩm được tạo thành trên cơ sở có sự tham gia của hàng loạt enzyme vì trong tế bào vi sinh vật sống tồn tại hàng loạt các enzyme tham gia những phản ứng sinh hóa khác nhau, sản phẩm của phản ứng này là nguyên liệu hay cơ chất cho phản ứng kế tiếp

Hướng thứ hai: sử dụng enzyme này hoàn toàn không liên quan gì đến tế bào sống của vi sinh vật Ở đây, các loại enzyme được tách ra khỏi tế bào và được tinh chế hoặc không tinh chế Sử dụng enzyme theo hướng này người ta không quan tâm đến tế bào vi sinh vật đó sống hay chết mà quan tâm đến khối lượng sinh khối vi sinh vật chứa nhiều enzyme và có hoạt tính cao Công việc ứng dụng chỉ bao gồm việc tạo điều kiện thuận lợi cho enzyme hoạt động chứ không phải tạo điều kiện cho vi sinh vật phát triển Theo hướng này sản phẩm của sự tham gia phản ứng hầu như là sản phẩm tinh khiết (Nguyễn Đức Lượng, 2002)

2.2 Tổng quan enzyme protease

2.2.1 Khái quát chung về enzyme protease

Protease là loại enzyme tham gia phân giải protein để tạo thành các peptide ngắn và cuối cùng là tạo thành các acid amin và NH3

Enzyme protease được các nhà khoa học nghiên cứu đầu tiên không phải là các protease của vi sinh vật mà là các protease của động vật, chủ yếu là protease trong hệ tiêu hóa của động vật Năm 1936, Schwann đã quan sát khả năng phân giải của

protease của dịch vị, sau 30 năm (1857) Corvisart mới tách được enzyme này Đây được coi như protease ở dạng chế phẩm đầu tiên trên thế giới về enzyme protease Các loại protease của thực vật được nghiên cứu chậm hơn các nghiên cứu protease động vật, mãi đến năm 1874 Besaner mới công bố kết quả nghiên cứu protease từ đậu Năm

1879 Wurtz nghiên cứu nhựa quả đu đủ cho thấy chúng có khả năng thủy phân protein, sau đó là hàng loạt nghiên cứu của Wilstaller, Gnassmam, Ambnos về bromelin, protease ở mô động vật

Từ những năm 1950, sau khi hoàn thiện phương pháp tinh sạch protease người

ta đã thu nhận được những chế phẩm protease tinh khiết hơn và cũng từ đây các nhà khoa học bắt đầu những nghiên cứu protease của vi sinh vật Khác với protease của thực vật (ficin, papain, bromelin) và động vật (trypsine, pepsine, rennet), protease của

vi sinh vật là những enzyme ngoại bào và có tính đặc hiệu rộng rãi Dựa vào đặc trưng của trung tâm hoạt động, người ta cũng có thể phân protease của vi sinh vật thành protease serin, protease thiol, protease kim loại và protease acid; nếu dựa vào pH tác dụng tối ưu thì người ta chia protease của vi sinh vật thành protease acid, protease trung tính, protease kiềm

Ngày nay, các loại enzyme protease từ vi sinh vật được sản xuất rất nhiều và được ứng dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp vì chúng có ưu điểm lớn là rất phong phú về chủng loại Các chế phẩm protease ứng dụng trong công nghiệp đều thu

được từ canh trường nấm mốc (Aspergillus oryzae, Aspergillus flavus, Aspergillus

sojae, Aspergilus fumigatus), vi khuẩn (Bacillus subtilis, Bacillus mesentericus, Bacillus circulans, Bacillus thermophilus) và xạ khuẩn (Actinomyces fradiae, Actinomyces rimosus, Actinomyces griseus)

Chế phẩm protease tinh khiết từ vi khuẩn Bacillus có thể thủy phân hoàn toàn

protein, chế phẩm này có tên gọi subtilisine Khi tác dụng trên casein thì hoạt độ sẽ

cực đại khi pH trung hòa Chế phẩm protease từ Bacillus mesentericus cũng thủy phân

được các protein của động vật và thực vật đến acid amin và peptide Điều đáng lưu ý

là các chế phẩm protease từ những vi khuẩn này còn có khả năng làm đông sữa Do đó trong sản xuất fromage người ta thay thế một phần rennin động vật bằng chế phẩm từ

Bacillus mesentericus này

Ngoài ra một số chế phẩm protease của vi khuẩn còn có hoạt độ elastase, nghĩa là chỉ có thể thủy phân các liên kết peptide kề liền bên gốc acid amin trung tính, đây cũng là điểm khác với protease của nấm mốc (Nguyễn Đức Lượng, 2004)

2.2.2 Nguồn nguyên liệu thu nhận protease

Protease có ở tất cả động vật, thực vật và vi sinh vật Tuy nhiên, sự phân bố của chúng không đồng đều ở các loài, các mô và các cơ quan Một số loài, cơ quan và mô của động thực vật có chứa một hoặc một số protease nhất định có thể dùng làm nguyên liệu để tách các enzyme tương ứng

Sau khi được tổng hợp, protease có thể được tiết ra ngoài tế bào gọi là enzyme ngoại bào hoặc tồn tại trong các dịch của cơ thể, dịch môi trường gọi là enzyme nội bào và chỉ có thể nhận được các enzyme này sau khi đã phá vỡ tế bào

Một số protease ngoại bào đã được sản xuất ở quy mô công nghiệp và được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau trong nông nghiệp và y học Một số vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm mốc có thể được dùng để sản xuất protease

cơ lá lách, tim, cơ thận, dạ

non (mô cơ)

- Cathepsin A, B, C và D

- Leucinaminopeptidase

- Enzyme nội bào

- Huyết tương (máu)

(Nguyễn Đức Lượng, 2004)

2.2.3 Ứng dụng của enzyme protease

Các chế phẩm protease được ứng dụng rộng rãi trong trong các lĩnh vực: công nghiệp thịt, công nghiệp chế biến cá, công nghiệp chế biến sữa, công nghiệp bánh mì

và bánh kẹo

Trong công nghiệp thịt:

Trong công nghiệp thịt protease được sử dụng để làm mềm thịt Ngoài papain

có thể dùng chế phẩm protease của vi sinh vật để thủy phân một phần nào đó các protein tham gia trong thành phần của thịt Kết quả là chất lượng của các loại thịt được tăng cao, có thể chuyển thịt loại thấp thành phần thành thịt có phẩm chất cao Không những thế, thời gian chín của thịt sẽ rút xuống nhiều lần (nếu để thịt nhiệt độ 0 – 2oC

để cho tự các enzyme trong thịt thủy phân thì phải mất 10 – 14 ngày)

Trong công nghiệp sữa:

Protease không những có khả năng phân ly protein mà còn có khả năng làm đông tụ sữa Protease của nấm mốc và vi khuẩn cũng thể hiện khả năng đó Tuy nhiên, tất cả protease của vi sinh vật đều khác với rennet của động vật ở chỗ chúng không những làm đông tụ được sữa mà còn có thể thủy phân sâu casein, do đó có ảnh hưởng xấu đến chất lượng của fromage Bởi vậy trong quá trình làm fromage, rennet vẫn chiếm một vị trí đặc biệt so với các protease khác

Trong sản xuất fromage, người ta cố gắng tìm những chủng vi sinh vật tạo ra được enzyme có tính chất tương tự rennin hoặc thay thế một phần rennet (25 – 50%) bằng protease của vi sinh vật

Trong công nghiệp da:

Trong công nghiệp da, protease của vi sinh vật cũng có tầm quan trọng trên hai quá trình: làm mềm và tách lông Về mặt này, chế phẩm protease như là một phương tiện có hiệu quả để hoàn thiện kỹ thuật chế biến da

Trong da có thành phần quan trọng nhất là collagen Phân tử của nó gồm những acid amin kết lại với nhau thành mạch dài Dưới tác dụng của protease, các chất nhờn

bị tách ra và một số liên kết trong sợi collagen bị phá hủy Kết quả là da thu được có

độ mềm nhất định và trong quá trình thuộc da, tính chất này lại được củng cố thêm

Điểm thuận lợi là các chế phẩm protease dùng cho công nghiệp da chỉ cần hòa tan tốt, không chứa các hợp chất không tan và không đòi hỏi phải tinh chế cẩn thận

Chế phẩm enzyme có thể dưới dạng nước chiết từ canh trường bề mặt của nấm mốc,

thường phải cô đặc lại đến trên 50% chất khô Aspergillus oryzae, Aspergillus flavus,

Aspergillus parasitucus, Bacillus subtilis, Bacillus mesentericus, Actinomyces fradiae, Streptomyces rimosus là những nguồn để thu chế phẩm protease

Trong sản xuất tơ tằm:

Quá trình làm sạch các sợi tơ tự nhiên tương đối phức tạp và khó khăn Sợi tơ gồm hai sợi fibroin sơ cấp dính lại với nhau nhờ lớp vỏ bằng xerixin Sau khi tách hết xerixin thì sẽ được sợi fibroin rất tinh khiết

Sợi thu được khi kéo ở kén ra thường có chứa 30% xerixin Muốn tách xerixin thì phải nấu tơ trong dung dịch xà phòng trong thời gian từ 1,5 – 2 giờ Chỉ sau khi có

sự gia công này, tơ mới bắt đầu kéo chỉ Một lượng nhỏ xerixin nằm lại ở trên lụa sẽ làm giảm độ đàn hồi của lụa, làm cho lụa bắt màu không đồng đều và khó trang trí trên lụa Để tách lượng xerixin còn lại đó người ta thường dùng chế phẩm protease từ nấm mốc và đặc biệt là từ vi khuẩn

Trong mỹ phẩm:

Các mỹ phẩm thường có tác dụng hồi phục các da già và trong một chừng mực nhất định cũng có tác dụng sát trùng Còn các enzyme kiểu keratinase thì lại có tác dụng làm mềm lông, tóc vì phân ly được keratin Vì vậy, hiện nay ở một số nước người ta đã sản xuất những loại kem có chứa enzym dùng để xoa mặt, xoa tay và cạo râu Dưới tác dụng của protease trong kem, các biểu bì của da đã chết sẽ được tách ra,

da non và mới sẽ xuất hiện trên bề mặt, đồng thời sự phát triển của lông, tóc cũng bị chậm lại

Trong công nghiệp y học:

Trong công nghiệp y học, các chế phẩm protease cũng được sử dụng để sản xuất các môi trường dinh dưỡng hỗn hợp có protein dùng trong nuôi cấy vi khuẩn và các vi sinh vật khác Chẳng hạn môi trường dinh dưỡng để nuôi các vi sinh vật sản xuất ra các kháng sinh, chất kháng độc Dĩ nhiên, các protein có trong môi trường phải

ở dạng dễ đồng hóa đối với vi sinh vật Do đó phải thủy phân sơ bộ các protein bằng protease của động vật hoặc của vi sinh vật

Ngoài ra người ta còn dùng các chế phẩm protease để cô đặc và tinh chế các huyết thanh kháng độc để chữa bệnh (huyết thanh miễn dịch) (Lê Ngọc Tú và ctv, 2005)

2 3 Tổng quan Bacillus subtilis

™ Phân loại

Giới: Bacteria

Ngành: Firmicutes

Lớp: Bacilli Bộ: Bacillales

Họ: Bacillaceae Giống: Bacillus Hình 2.2: Bacillus subtilis Loài: Bacillus subtilis

™ Đặc điểm của loài Bacillus subtilis

Bacillus subtilis là trực khuẩn, Gram (+), có khả năng sinh catalase, hiếu khí

hay kị khí tùy ý, thường được tìm thấy trong đất

Có khả năng di động, sinh nội bào tử Tế bào sinh dưỡng có dạng hình que, kích thước chiều rộng từ 0,7 đến 0,8 µm, chiều dài từ 2,0 đến 3,0 µm Không kết thành chuỗi, bắt phẩm nhuộm đều, không tạo bao nang (Lương Đức Phẩm, 2001)

Khi nhuộm sơ, thấy được nguyên sinh chất của những tế bào non Bacillus

subtilis không có không bào khi phát triển trên môi trường thạch chứa glucose cũng tốt

như trên môi trường thạch không có chứa glucose và phát triển tốt nhất trên môi trường chứa bột đậu nành (Tiêu Thị Ngọc Thảo, 2008)

Nang bào tử hẹp, trụ tròn, nằm trong khoảng trung tâm đến gần cuối tế bào Bào

tử rộng 0,6 – 0,9 µm, dài 1,0 – 1,5 µm, có dạng hình elip hay hình cầu, vách bào tử mỏng, phần nhiều được tạo thành trong vòng 48 giờ Mỗi cá thể chỉ tạo được một bào

tử, bào tử này có khả năng chịu nhiệt, tia bức xạ, chất sát khuẩn, chất hút ẩm

Những đặc điểm của loài trực khuẩn này cho phép chúng sống được trong nhiều sinh cảnh, bao gồm nhiều kiểu giới hạn như cát, sa mạc, những con suối có nhiệt độ cao, môi trường đất ở Bắc Cực Ngoài ra, trong nhóm này có thể có loài ưa nóng, ưa lạnh, ưa kiềm, ưa acid, ưa muối hay có thể phát triển ở những môi trường có pH, nhiệt

độ và nồng độ muối mà ít sinh vật nào có thể chịu được (Lương Đức Phẩm, 2001)

Đặc điểm biến dị: sự tạo thành bào tử tốt hơn nếu trên môi trường thạch thô hay thạch tinh bột có bổ sung chất chiết từ đất

Khi cấy sâu dưới mặt gelatin, thường hóa lỏng gelatin thành dạng chén hay

phân tầng

Khi cấy ria trên mặt thạch đĩa, thường tạo thành vùng thủy phân rộng Khuẩn

lạc trên mặt thạch có dạng gồ ghề, sần sùi, đục, trải rộng Các đặc điểm biến dị: trơn

nhẵn, có chất nhầy mỏng, trong, mờ, màu vàng hay cam (vài giống có màu xanh lục

đến vàng), sắc tố bị khuyếch tán khi ủ ở 45oC

Khi cấy trên mặt thạch nghiêng có glucose, khuẩn lạc mịn, phát triển đều hơn ở

môi trường thạch không có glucose, đôi khi có màu hồng nhạt hay nâu

Trong môi trường thạch nghiêng có bột đậu nành, khuẩn lạc mọc tốt, đều, mịn và mật

độ nhiều hơn trong môi trường không có bột đậu nành

Khi nuôi Bacillus subtilis trong môi trường có sữa, xảy ra hiện tượng peptone

hóa một cách chậm chạp và làm pH môi trường chuyển sang kiềm Khi cấy ria trên

mặt thạch sữa sẽ tạo vùng thủy phân casein rộng

Trong môi trường lỏng có NaCl, Bacillus subtilis phát triển tốt ở nồng độ NaCl

7%, một vài trường hợp phát triển tốt ở môi trường có 10 – 12% NaCl

Trong môi trường có khoai tây, khuẩn lạc mọc khá phong phú, uốn nếp hay gấp

thô, trải rộng, màu vàng hoặc hồng nâu Đặc điểm biến dị: mỏng, mềm, mịn, có vài nốt

sần

Sinh acid từ xylose, arabinose, glucose, sucrose và manitol nhưng không tạo khí

(sử dụng nguồn nitrogen là muối ammonium) Thường không sinh acid từ lactose

Thủy phân tinh bột tạo acetylmethyl carbinol Khi ủ ở 37oC cho kết quả tốt hơn khi ủ ở

32oC Có khả năng phân giải nitrate, sinh nitrite từ nitrate Trong điều kiện kị khí,

không sinh khí từ môi trường lỏng chứa nitrate

Các yếu tố về nhiệt độ: nhiệt độ tối thích vào khoảng 28 – 40oC Nhiệt độ cao

nhất mà Bacillus subtilis có thể tồn tài là 50oC Tuy nhiên nhiều giống chỉ chịu được

nhiệt độ 40oC Không cần bổ sung các yếu tố phụ khác trong quá trình tăng trưởng

Bacillus subtilis có thể tổng hợp được nhiều loại enzyme cần thiết cho quá

trình sống để thích ứng với hoàn cảnh và điều kiện môi trường như: amylase,

hemicellulase, glucanase, xylanase, protease…(Tiêu Thị Ngọc Thảo, 2008)

Giống: Pangasianodon Hình 2.3: Cá Tra

Loài: Pangasianodon hypophthalmus (Sauvage, 1878)

Tên tiếng Anh: Sutchi catfish

2.4.2 Đặc điểm sinh học

Cá Tra có thân dài, không vẩy, màu sắc đen xám, bụng hơi bạc, miệng rộng và

có đôi râu dài Vây ngực và vây lưng có một tia vây cứng Cá sống chủ yếu ở nước ngọt, chịu đựng được nước lợ (dưới 10%), chịu được nước phèn có pH > 4 Cá Tra có

cơ quan hô hấp phụ nên có thể sống ở những thủy vực chật hẹp, thiếu oxy nên nuôi được ở mật độ cao Đây là loài cá nhiệt đới nên có thể sinh trưởng và phát triển ở nhiệt

độ 25 – 37oC và khoảng tốt nhất là 25 – 30oC

Cá có tính ăn tạp thiên về động vật, phổ thức ăn rộng, thích ăn mồi có nguồn gốc động vật và cũng dễ chuyển đổi thức ăn Giai đoạn cá bột hết noãn hoàn thì thích

ăn mồi tươi sống, ăn các loài động vật phù du có kích thước vừa cỡ miệng Thậm chí

cá Tra bột còn ăn thịt lẫn nhau trong bể nuôi Trong nuôi thương phẩm có thể dùng thức ăn tự nhiên, thức ăn công nghiệp và thức ăn chế biến

Cá có tốc độ tăng trưởng rất nhanh và có thể sống trên 20 năm Cá nuôi ao sau một năm thành thục lần đầu là 3 – 4 kg/con Vào mùa thành thục (tháng thứ 5 trở đi)

cá có tập tính bơi ngược dòng nước đến các vùng ngập nước ở Campuchia và xuôi theo sông MeKong về Việt Nam Ngư dân với nghề vớt cá bột truyền thống đã vớt hàng trăm triệu cá giống hàng năm (Trịnh Hoài Đức, 2006)

2.4.3 Sản lượng, giá trị kinh tế cá Tra

Hiện nay, ở các tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long, cá Tra và Basa là một trong những loài thủy sản có giá trị xuất khẩu cao nhất Trữ lượng của cá da trơn mà chủ yếu

là cá Tra và Basa trong những năm 2003 – 2007 tăng lên rất nhanh ở các tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long:

Biểu đồ 2.1: Sản lượng và giá trị xuất khẩu cá Tra và Basa 2003 – 2007

(Nguồn: Trung tâm tin học thủy sản, 2007) Qua biểu đồ trên, sản lượng và giá trị xuất khẩu cá Tra và Basa liên lục tăng từ năm 2003 đến 2007 Năm 2007, sản lượng cá Tra và Basa xuất khẩu đạt 383,2 nghìn tấn, giá trị 974,12 triệu USD Năm 2008, sản lượng cá Tra và Basa ở ĐBSCL đạt 1,1 triệu tấn (tăng hơn 40% so năm 2007), giá trị xuất khẩu đạt trên 1,4 tỷ USD Tính đến giữa tháng 8 năm 2009, sản lượng thu hoạch là 457 nghìn tấn, gấp 8,2 lần so với đầu năm 2009 Sản lượng cá Tra thu hoạch trong 8 tháng đầu năm 2009 liên tục tăng với tốc độ trung bình đạt 13,5%/tháng, đạt giá trị trên 737,1 triệu USD Tuy nhiên, tình hình tiêu thụ cá Tra và Basa của Việt Nam do ảnh hưởng của suy thoái kinh tế thế giới

và những rào cản thương mại cũng như thuế quan trong thời gian vừa qua đã ảnh hưởng đến sản lượng và giá trị xuất khẩu cá Tra của nước ta, khối lượng và giá trị xuất khẩu 7 tháng đầu năm 2009 thấp hơn so với cùng kỳ năm 2008 Theo dự báo của các nhà kinh tế và VASEP thì xuất khẩu cá Tra và Basa của Việt Nam tại các thị trường chính dự báo sẽ khởi sắc trở lại vào những tháng cuối năm 2009 Như vậy, khả năng phấn đấu đạt giá trị xuất khẩu tương đương với năm 2008, với giá trị 1,4 tỷ USD là có khả năng

Bảng 2.2: Thị trường xuất khẩu cá Tra và Basa của Việt Nam 2007

Xuất khẩu cá Tra và Basa của Việt Nam sang các thị trường

1000 tấn Triệu USD Khối lượng Giá trị

EU 125,7 348,1 42 42 Nga 27,8 54,1 -1 -2

và Basa lớn nhất của Việt Nam Trong đó, EU chiếm 42,2% về sản lượng và 40,13%

về giá trị, kế đến là Nga với 11,17% về sản lượng và 8,28% về giá trị Năm 2008 các

thị trường chính vẫn tăng nhưng có thêm một số thị trường ASEAN và Ucraina là

những thị trường đạt được tốc độ tăng trưởng khá cao

2.4.4 Một số nghiên cứu về thủy phân phụ phẩm cá trong và ngoài nước

Ở nước ta đã có một số công trình công bố về việc sử dụng protease từ vi khuẩn

Bacillus subtilis để thủy phân protein của phụ phẩm cá

Theo Vũ Ngọc Bội (2004), tỷ lệ enzyme protease từ Bacillus subtilis S5 sử

dụng để thủy phân với cơ chất là cá mối đạt hiệu quả cao là 0,3% chế phẩm protease

Bacillus subtilis S5, 20% nước, nhiệt độ 50oC và pH tự nhiên của thịt cá trong 16 giờ

dùng để sản xuất bột cá Đối với cơ chất cá cơm thì tỷ lệ muối bổ sung 5%, tỷ lệ

protease (% so với cá nguyên liệu) 0,2%, nhiệt độ thủy phân 50oC, thời gian là 21 ngày

để sản xuất nước mắm

Theo Nguyễn Thị Nếp (2005), tỷ lệ enzyme protease từ Bacillus subtilis S5 sử

dụng để thủy phân với cơ chất là phụ phẩm đầu xương cá Tra đạt hiệu quả cao là 2,5 –

3% , nhiệt độ thủy phân thích hợp là 50oC, pH = 8,0 và trong thời gian là 10 giờ, hiệu

suất thủy phân cao nhất là 25,68%

Theo Đặng Thị Mộng Quyên (2006) và Trần Thị Xô (2006), để thủy phân cá phèn, cá ngân dạng cá phế liệu thu được sau công đoạn fillet bằng phương pháp thủy phân kết hợp, thủy phân bằng enzyme trước, thủy phân bằng acid sau Trong đó, sử

dụng chế phẩm enzyme protease từ vi khuẩn Bacillus subtilis C10 (chủng vi khuẩn này

đã được xác định đặc tính và định tên tại Bỉ) Kết quả với điều kiện thủy phân bằng enzyme: tỷ lệ muối 3%, tỷ lệ dịch chiết enzyme 20% (dạng lỏng), tỷ lệ nước 30%, nhiệt độ 50oC, điều kiện thủy phân bằng acid: tỷ lệ muối 3%, nhiệt độ thủy phân 90oC, thể tích HCl 7 N là 20%, trung hòa bằng Na2CO3 20% cho hiệu quả thủy phân cao Dịch đạm thu được có hàm lượng nitrogen tổng số 39 g/l, acid amin 21,6 g/l, đạm amoniac 3,95 g/l

Theo Min-Tian Gao và ctv (2005), thủy phân phụ phẩm cá gồm đầu và xương

cá đã được xử lý sơ bộ với nước ở 121oC trong 20 phút bằng dung dịch acid được pha lỏng và pH dịch thủy phân được điều chỉnh về 1,0 Bằng cách này, thu được nguồn đạm dùng cho lên men sản xuất acid lactic với giá thành thấp và làm tăng hiệu suất sản xuất acid lactic gần 22% so với việc dùng dịch chiết nấm men

Theo Trần Thanh Dũng (2008), thủy phân phụ phẩm cá Tra với tỷ lệ tối ưu giữa

các thành phần bổ sung chế phẩm vi khuẩn Bacillus subtilis S5 là 1,4%, muối 7%,

pH = 5,2, thời gian thủy phân là 10 ngày và dịch đạm thu được dùng làm phân bón cho cây hẹ

2.4.5 Giới thiệu phụ phẩm cá Tra

Cá Tra sau khi fillet lấy phần thịt chế biến (chiếm từ 30 – 35%), còn lại đầu, xương, nội tạng, một phần mỡ cá và thịt vụn (chiếm 65 – 70%) so với cá nguyên liệu Phần phụ phẩm lớn như vậy nếu bỏ đi sẽ lãng phí và gây ô nhiễm môi trường Hiện nay, ở Đồng Bằng Sông Cửu Long có nhiều nhà máy đã sử dụng nguồn phụ phẩm này

để chế biến thành các sản phẩm có giá trị gia tăng Vĩnh Hoàn là một trong những nhà máy chế biến cá Tra philê đông lạnh tại tỉnh Đồng Tháp, với công suất 250 tấn nguyên liệu/ngày, lượng phụ phẩm mà công ty Vĩnh Hoàn có được từ 160 – 170 tấn, tất cả các phụ phẩm này được công ty đem vào sử dụng để chế biến thành các sản phẩm khác nhau hoặc bán cho các thương lái

2.4.6 Thành phần hóa học của cá Tra

Theo Nguyễn Trọng Cẩn và Đỗ Minh Phụng (1990), thành phần hóa học của cơ thịt cá gồm: nước, protein, lipid, glucid, muối vô cơ, vitamin, enzyme, hormone

Với thành phần hóa học của da cá: nước 60 – 70%, một ít chất vô cơ còn chủ yếu là protein và chất béo Protein của da cá chủ yếu là collagen, elastin, keratin, rutin, globulin và albulmin Công dụng của da cá chủ yếu là nấu keo, loại da dày như cá voi,

cá nhám dùng trong công nghiệp thuộc da

Thành phần hóa học của vây cá: tương tự như xương sụn, protein trong vây cá chủ yếu là chondromucoid, collagen, chondroalbumin, đối với vây cá sau khi chế biến các chất tan phân ly thành arginin, histidin và lysine chiếm 1/3 tổng lượng acid amin Thường lấy vây đuôi, bụng, ngực của một số loài cá nhám để đem chế biến thành sản phẩm vây cá

Thành phần hóa học của xương cá: xương cá được chia làm hai nhóm, đó là xương cứng và xương sụn

Xương sụn: thành phần chủ yếu là protein phức tạp, keo và albumin; chất vô cơ nhiều nhất là Na, Ca, K, Mg, Fe Các acid amin cấu tạo thành protein trong xương sụn chủ yếu là acid amin tính bazơ như arginin, histidin, lysin

Xương cứng: lượng chất hữu cơ và vô cơ tương đương, muối vô cơ chủ yếu là

Ca3(PO4)2 ngoài ra còn có CaCO3, Ca(OH)2 So với xương động vật trên cạn thì trong xương cá có nhiều phosphat canxi và ít carbonat canxi còn xương động vật trên cạn thì ngược lại

Thành phần hóa học của bong bóng cá: chủ yếu là collagen, dùng để nấu keo hoặc phơi khô làm dược phẩm

Nội tạng cá: chủ yếu là collagen, mỡ, protein, nước, trong nội tạng cá có nhiều

hệ men: hệ men metalo – proteaza, hệ men serin – proteaza, hệ men acid proteaza

Dầu mỡ: thành phần chủ yếu của chất béo trong động vật thủy sản là triglyxerit

do acid béo bậc cao hòa hợp với glyxerin tạo thành Acid béo của động vật thủy sản thuộc loại mạch thẳng có gốc cacboxin, chuỗi carbon trong chất béo dài từ 12 – 26 carbon, có một số đến 28 carbon Gồm có acid béo bão hòa (CnH2n+1COOH), acid béo không bão hòa (CnH2n-2O2), acid béo không bão hòa cao độ (C18 – C24) (CnH2n-8O2;

CnH2n-10O2) Ngoài ra còn có một số thành phần phụ như: photphatid, sterol, sắc tố, sinh tố Trong dầu cá hàm lượng acid béo không bão hòa chứa nhiều nối đôi chiếm

84% Vì vậy chỉ số Iod cao hơn các loại dầu khác, do đó dễ bị oxy hóa còn sản sinh rất nhiều chất thuộc loại aldehyt, ceton, các acid béo cấp thấp làm cho dầu cá có mùi khó chịu

Da Thịt bụng Mỡ lá Nội

tạng

Đầu, xương, vây, đuôi

550 – 1.060

1.105 – 1.925

1.985 – 3.650

39,2 38,1 38,0

4,75 5,0 5,25

10,05 10,45 10,8

1,5 3,9 5,1

5,45 6,2 6,7

38,45 35,7 33,6 Trung bình 38,52 4,98 10,34 3,28 6,02 36,17

(Theo Nguyễn Thị Lê Diệu, 2000)

Bảng 2.4: Thành phần thể trọng của cá Tra nuôi ao

Trọng lượng

cá (g)

Fillet không da Da Thịt bụng Mỡ lá

Nội tạng

Đầu, xương, vây, đuôi

460 – 1.960

2.100 – 2.910

2.930 – 3.710

40,05 40,3 40,0

4,75 5,05 5,8

10,9 11,35 11,55

2,85 3,0 3,2

5,8 5,8 5,9

35,6 34,45 33,7 Trung bình 40,1 5,15 11,21 2,94 5,84 34,61

(Theo Nguyễn Thị Lê Diệu, 2000)

Bảng 2.5: Thành phần hóa học trung bình của fillet cá Tra nuôi bè

6,08 7,98 9,5

16,05 16,0 16,0

1,35 1,60 1,45

(Theo Nguyễn Thị Lê Diệu, 2000)

Bảng 2.6: Thành phần hóa học trung bình của fillet cá Tra nuôi ao

8,35 10,6 11,17

16,0 16,0 15,9

1,17 1,31 1,21

(Theo Nguyễn Thị Lê Diệu, 2000)

Từ các bảng thống kê trên cho thấy tỷ lệ mô mỡ và hàm lượng lipid trong cá khá cao, đặc biệt cá có trọng lượng lớn

2.4.8 Muối

Muối hạn chế sức hoạt động của enzyme thủy phân nhưng đồng thời muối cũng giữ cho việc thủy phân tiến hành đều đặn, ngăn chặn sự phá hoại của vi khuẩn thối rữa (Lương Hữu Đồng, 1975)

Qua nhiều nghiên cứu khoa học, người ta thấy muối ít có tác dụng giết chết vi khuẩn, mà có khả năng phòng thối là chủ yếu Muối có tác dụng phòng thối vì: muối

ăn thẩm thấu vào nguyên liệu làm cho nước thoát ra, vi khuẩn thiếu nước không thể phát triển được NaCl hòa tan sẽ cho ion Cl-, do ion Cl- kết hợp với protein ở liên kết peptid làm cho các enzyme thủy phân protein không còn khả năng phá vỡ protein để vi khuẩn lấy chất dinh dưỡng sinh sống Cũng có thể do ion Cl- có độc tính làm cho vi khuẩn bị trúng độc

Nồng độ nước muối càng lớn thì áp suất thẩm thấu càng mạnh, vì vậy cũng có thể làm rách màng tế bào của vi khuẩn, gây cho chúng sát thương

Do có muối nên oxy ít hòa tan trong môi trường ướp muối vì vậy nhóm vi sinh vật hiếu khí không có điều kiện phát triển

Ngoài ra, trong môi trường nước muối quá trình tự thủy phân bị kiềm chế, sản phẩm thủy phân được tạo ra ít, do đó làm cho vi khuẩn phát triển chậm Nồng độ từ 4,4% trở lên có thể làm ngừng sự phát triển của các loại vi khuẩn gây bệnh và nói chung nồng độ nước muối đạt 10% thì có thể kiềm chế được sự phát triển của những vi khuẩn thông thường Tuy vậy, cũng có một số vi khuẩn gây thối rữa sống ở nồng độ

muối 12% vì vậy nồng độ nước muối đạt 10% không phải là giới hạn tuyệt đối vì các loài vi khuẩn khác nhau có khả năng chịu muối khác nhau Phần lớn loại cầu khuẩn chịu muối mạnh hơn trực khuẩn, trong họ trực khuẩn thì loại không gây bệnh chịu muối mạnh hơn loại gây bệnh Khuẩn lên men, lên mốc có khả năng chịu muối tương đối tốt

Giới hạn phát triển của khuẩn lên men ở nồng độ muối 15% và của khuẩn lên mốc là 20 – 30%

Ở nhiệt độ thấp nếu cho cá vào nước muối hay đem cá muối khô thì tác dụng ướp muối nhanh hơn tác dụng thối rữa, còn ở nhiệt độ cao thì tác dụng thủy phân nhanh hơn tác dụng thẩm thấu của muối, vì thế cá sẽ bị thối rữa Nồng độ của nước muối đạt đến 20% thì quá trình thủy phân của cá diễn ra rất chậm Nhưng cũng có loại

vi khuẩn phát triển được trong nước muối bão hòa: loại đó gọi là “vi khuẩn ưa muối” Người ta chia nhóm vi khuẩn chịu mặn ra làm hai loại:

Vi khuẩn hiếu muối: là vi khuẩn có thể phát triển được ở trong dung dịch muối đậm đặc còn ở trong môi trường ít muối thì khó phát triển

Vi khuẩn chịu muối: là vi khuẩn ở môi trường nhiều hay ít muối đều phát triển được Tất nhiên sự phân chia đó không phải là tuyệt đối Vi khuẩn trong muối ăn chủ yếu là hai loại trên Nguồn gốc đem vi khuẩn đến muối ăn là từ nước biển, sông và ruộng phơi muối (Nguyễn Trọng Cẩn và Đỗ Minh Phụng, 1990)

2.4.9 Quá trình amôn hóa protein

Quá trình amôn hóa là quá trình phân giải các hợp chất hữu cơ chứa nitơ và giải phóng amoniac Quá trình amôn hóa protein (còn gọi là quá trình lên men thối) là quá trình thủy phân protein thành NH3 và một số sản phẩm trung gian khác với sự tham gia của nhiều loài vi sinh vật hiếu khí và kị khí ở nhiệt độ tối ưu là 25 ÷ 30oC Muốn phân giải protein, vi sinh vật tiết ra enzyme protease ngoại bào làm chuyển hóa protein thành các hợp chất có phân tử nhỏ hơn (các polypeptid, oligopeptid và các acid amin) Một phần các acid amin này được vi sinh vật sử dụng trong quá trình sinh tổng hợp protein của chúng, một phần khác được tiếp tục thủy phân theo những con đường khác nhau để sinh ra NH3, H2S, CO2, indol (sản phẩm sinh ra khi acid amin có vòng benzen

bị thủy phân bởi vi sinh vật) và nhiều sản phẩm trung gian khác Ở điều kiện thoáng khí sự phân giải được tiến hành triệt để hơn ở điều kiện kị khí, hầu hết carbon được

chuyển thành CO2 Nhiều loại vi sinh vật khác nhau tham gia vào quá trình amôn hóa trong tự nhiên Đáng chú ý nhất là các loài sau đây:

Vi khuẩn: Bacillus mycoides, Bacillus subtilis, Proteus vulgaris,

Chromobacterium prodigiosum, Pseudomonas fluorescens, Escherichia coli, Clostridium Sporogenes

Xạ khuẩn: Streptomyces griseus, Streptomyces rimosus, Streptomyces fradiae Nấm mốc: Aspergillus oryzae, Aspergillus flavus, Aspergillus terricola,

Aspergillus niger, Penicilium camemberti, Cephalothecium, Rhizopus, Mucor, Gliocladium roseum (Nguyễn Trọng Cẩn và Đỗ Minh Phụng, 1990)

2.4.10 Quá trình thủy phân của protein cá

Là quá trình tác dụng của hệ enzyme protease trong bản thân cá (nếu chưa nấu chín) hoặc của vi sinh vật bên ngoài tác động vào thủy phân thịt cá từ dạng protein qua các dạng trung gian như pepton, polypeptid, peptid và cuối cùng là acid amin Bên cạnh quá trình thủy phân protein là chủ yếu còn có sự thủy phân của đường và chất béo thành các acid hữu cơ, rượu Quá trình thủy phân protein trong thịt cá chủ yếu là

do enzyme tác dụng nhưng cũng có thể có sự tham gia của vi sinh vật Những vi sinh vật hữu ích tiết ra protease thúc đẩy cho quá trình thủy phân nhưng các vi sinh vật gây thối thì có tác dụng làm rữa nát thịt cá có khi ở ngay giai đoạn đầu hay trong quá trình chế biến Quá trình thủy phân tiếp tục là quá trình thối rữa do vi sinh vật gây thối thủy phân acid amin thành các chất cấp thấp như: indol, phenol và các loại acid có đạm và acid béo thủy phân thành H2S, NH3, CO2 (Nguyễn Trọng Cẩn và Đỗ Minh Phụng, 1990)

2.4.10.1 Sự tham gia của vi sinh vật trong quá trình phân giải cơ chất

Vi sinh vật có mặt ngay từ đầu quá trình chế biến do nguyên liệu, dụng cụ mang theo từ ngoài môi trường nhiễm vào, nhưng do nồng độ muối quá cao nên chúng không hoạt động được Ngay trong giai đoạn ngắn đầu tiên khi muối chưa kịp tác dụng

có một số vi sinh vật gây thối hoạt động Khi độ mặn tăng dần lên đạt từ 12% trở lên thì các vi khuẩn gây thối hầu như ngừng hoạt động và các vi khuẩn khác bị ức chế cao

độ (Nguyễn Trọng Cẩn và Đỗ Minh Phụng, 1990)

Bảng 2.7: Nồng độ muối làm vi sinh vật ngừng phát triển

Vi sinh vật Nồng độ muối NaCl (%) Cầu khuẩn gây thối 25

( Lê Xuân Phương, 2001)

2.4.10.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân cá

™ Ảnh hưởng của nhiệt độ

Nhiệt độ dưới 3oC làm ngừng quá trình sinh trưởng, phát triển của vi sinh vật Ở

nhiệt độ cao hơn nhiệt độ thích hợp thì vi sinh vật bị kiềm chế mạnh hơn ở nhiệt độ

thấp hơn nhiệt độ thích hợp, trừ loại hiếu nhiệt còn đại bộ phận trên 60oC đều bị chết

Nhiệt độ hoạt động mạnh nhất của enzyme trong cá là từ 36 – 40oC Dưới 0oC các

enzyme và vi sinh vật bị kìm hãm không thể phát triển nhưng không chết Từ

0 – 40oC tác dụng phân giải của enzyme và vi sinh vật tăng tỷ lệ thuận với sự gia tăng

của nhiệt độ Nhưng enzyme mang bản chất protein nên chúng không chịu được nhiệt

độ cao Đa số enzyme ở trong cá đều mất hoạt tính ở nhiệt độ từ 70oC trở đi (Nguyễn

Trọng Cẩn và Đỗ Minh Phụng, 1990)

™ Ảnh hưởng của pH

Các giá trị pH (cực tiểu, tối ưu, cực đại) cần cho sinh trưởng và phát triển của vi

sinh vật tương ứng với các giá trị pH cần cho hoạt động của nhiều enzyme Giới hạn

pH hoạt động của vi sinh vật nằm trong khoảng 4,0 – 10, pH của môi trường còn tác

động sâu sắc lên các quá trình trao đổi chất Màng tế bào chất của vi sinh vật tương đối

ít thấm đối với các ion H+ và OH-, vì vậy dù pH của môi trường ngoài dao động trong

giới hạn rộng, nồng độ của chúng trong tế bào chất vẫn ổn định Ảnh hưởng của pH môi trường lên hoạt động của vi sinh vật phần lớn là do tác động qua lại giữa ion H+ và các enzyme chứa trong màng tế bào chất và tế bào (Trần Thanh Dũng, 2008)

pH ảnh hưởng rất lớn đến hoạt tính của vi khuẩn, do nó liên quan đến tương tác giữa enzyme và cơ chất Vi khuẩn rất nhạy cảm với sự thay đổi pH của môi trường Mỗi vi sinh vật chỉ có thể hoạt động được trong môi trường có pH giới hạn bởi pH thấp nhất và pH cao nhất Đồng thời, vi sinh vật hoạt động mạnh nhất trong môi trường có pH tối hảo Phần lớn môi trường bên ngoài thiên nhiên có pH = 2,5 ÷ 9,0 và phần lớn vi sinh vật có pH tối hảo trong khoảng này Có rất ít vi sinh vật có thể sống trong môi trường có pH nhỏ hơn 2,0 hoặc lớn hơn 10 (Lương Đức Phẩm, 2001)

™ Ảnh hưởng của vi khuẩn

Mật độ vi khuẩn khác nhau sẽ ảnh hưởng đến hiệu suất thủy phân Mật độ vi khuẩn cao sẽ thúc đẩy tốc độ thủy phân cơ chất nhanh hơn Khi mới đưa vào môi trường thủy phân, đây là giai đoạn vi khuẩn làm quen với môi trường và chuẩn bị cho

sự tăng trưởng, hoạt động vượt bậc sau đó Khi đã quen với môi trường mới, vi khuẩn bắt đầu nhân mật độ lên với tốc độ rất nhanh theo cấp số nhân Đến một lúc nào đó mật độ vi khuẩn không tăng thêm mà giữ ổn định ở một mức trong thời gian nhất định (Trần Thanh Dũng, 2008)

™ Ảnh hưởng của muối

Khả năng ức chế vi sinh vật của NaCl phụ thuộc vào một loạt các yếu tố khác nhau như pH, nhiệt độ, nồng độ NaCl, loài và số lượng, dạng thực phẩm, các muối khác nhau và thời gian bảo quản (Nguyễn Đức Lượng, 2002)

Muối được sử dụng để khống chế hoạt động của vi sinh vật gây thối rữa, còn khả năng chịu muối của enzyme thủy phân tốt hơn vi sinh vật cho nên trong phạm vi

độ mặn nhất định enzyme vẫn có tác dụng thủy phân protein, thậm chí trong môi trường muối bão hòa enzyme vẫn hoạt động được nhưng tác dụng thủy phân rất chậm (Nguyễn Trọng Cẩn và Đỗ Minh Phụng, 1990)

Màng tế bào của vi sinh vật là một màng bán thấm, nồng độ các chất hòa tan trong dung dịch mà vi sinh vật tồn tại quyết định áp suất thẩm thấu Ở môi trường nồng độ muối cao, môi trường ưu trương, nước trong tế bào vi sinh vật bị thấm ra

ngoài, gây teo nguyên sinh chất, tế bào bị khô sinh lý, kéo dài sẽ bị chết (Lương Đức Phẩm, 2001)

Muối trung tính có ảnh hưởng hai mặt lên tính tan của protein: khi thêm một lượng nhỏ muối có tác dụng làm tan đáng kể protein, kể cả protein khó tan hoặc hoàn toàn không tan trong nước nguyên chất Khi nồng độ muối cho vào thấp thì các ion muối kết hợp với các ion của protein có tác dụng làm tăng tính có cực, đưa đến làm tăng tính tan của protein Khi cho nồng độ muối cao, đa số protein kết tủa do xảy ra sự cạnh tranh dung môi giữa các phân tử muối và phân tử protein (Phan Thị Bích Trâm, 2003)

™ Ảnh hưởng của nước

Nước không những là môi trường để khuếch tán enzyme và cơ chất mà còn là tác nhân tham gia vào phản ứng Nước không những có ảnh hưởng đến vận tốc mà cả chiều hướng của phản ứng thủy phân bởi enzyme (Lê Ngọc Tú và ctv, 2005)

Nước làm nồng độ muối giảm xuống, tạo điều kiện thích hợp cho enzyme hoạt động và vi khuẩn phát triển nhanh chóng, enzyme protease chuyển protein thành các thể trung gian pepton, polypeptid đến các dạng amino acid Hệ enzyme protease hoạt động mạnh trong điều kiện muối nhạt Ngoài ra, nước còn làm cho nhiệt độ phân phối đều khối cá, thịt cá mau nát (Lương Hữu Đồng, 1975)

Tạo môi trường lỏng giúp cho enzyme và vi sinh vật hoạt động được dễ dàng, làm cho tế bào thịt cá chóng được thủy phân Lượng nước cho vào tùy thuộc vào đặc điểm của nguyên liệu, thông thường từ 20 – 30% có khi tới 40% so với cá (Nguyễn Trọng Cẩn và Đỗ Minh Phụng, 1990)

™ Ảnh hưởng của diện tích tiếp xúc

Trong quá trình thủy phân yếu tố quan trọng thúc đẩy quá trình thủy phân là diện tích tiếp xúc Để tạo điều kiện tốt hơn cho sự thủy phân của enzyme làm tăng khả năng tiếp xúc giữa enzyme và cơ chất, phải làm nhỏ kích thước cơ chất trước khi thủy phân (Nguyễn Xuân Dung, 2005)

™ Ảnh hưởng của thời gian thủy phân

Theo một số nghiên cứu thì mức độ thủy phân tăng vọt trong thời gian đầu của phản ứng, sau đó tốc độ phản ứng chậm lại Thời gian dài hơn và sử dụng lượng vi khuẩn lớn hơn thì mức độ thủy phân cao hơn (Nguyễn Xuân Dung, 2005)

™ Ảnh hưởng của nguyên liệu

Khi thủy phân hai loại cá gồm cá béo và cá không béo bằng enzyme thủy phân

là papain được bổ sung 5% so với lượng cá thì kết quả là các loại cá không hoặc ít béo

đã cho hàm lượng protein trong nước bổi cao hơn so với cá có mỡ và khi chế biến thì

mỡ thường nổi lên trên nên làm cho sản phẩm có mùi ôi khét (Nguyễn Đình Khôi,

2003 trích trong Mackie, 1982)

2.5 Giới thiệu về nước mắm

Nước mắm truyền thống là kết quả của quá trình thủy phân protein thịt cá dưới tác động của hệ protease nội tại trong điều kiện có muối theo cơ chế:

Protease Protease Protease

Protein Polypeptide Peptid Acid amin

Cùng với quá trình thủy phân protein thịt cá còn có hàng loạt các quá trình biến đổi sinh hóa do tác động của nhiệt độ và hệ vi sinh vật có trong đó mà hình thành màu sắc, hương vị đặc trưng của nước mắm Trong khoảng 24 giờ đầu tiên, dưới tác động của hệ protease nội tại của cá mà chủ yếu là các proteinase serine, proteinase kim loại

và proteinase aspartic một phần protein thịt cá bị thủy phân thành peptid, polypeptide hòa tan trong nước bổi (nước cá) Sau đó protein thịt cá, polypeptide và các peptid được tạo thành ở trên lại tiếp tục bị thủy phân mạnh mẽ bởi các proteinase kim loại tạo thành các acid amin tự do, các peptid ngắn và hình thành hương vị nước mắm Từ giai đoạn 3 – 6 tháng dưới tác động của các protease đặc biệt là các proteinase serine, các peptid, các protein, polypeptide còn lại tiếp tục bị thủy phân tạo thành các acid amin tự

do Khi đó chượp đã chín, nước mắm rút ra có màu và mùi vị đặc trưng của nước mắm Chất lượng của nước mắm phụ thuộc vào loại cá, tỷ lệ muối sử dụng, pH, nhiệt

độ, phương pháp chế biến Trong quá trình chế biến nếu biết phối hợp hài hòa các yếu

tố này thì nước mắm sẽ đạt chất lượng cao (Nguyễn Trọng Cẩn và Đỗ Minh Phụng, 1990)

Về nguyên tắc thì các loài cá biển đều có thể sử dụng để sản xuất nước mắm Nhưng để có thể sản xuất được nước mắm thơm ngon, độ đạm cao và mang lại hiệu quả kinh tế thì cần chọn cá có thịt mềm, hàm lượng protein cao, dễ thủy phân, tạo ra số lượng nước mắm nhiều với hương vị thơm ngon Các loại cá thường dùng để sản xuất nước mắm: cá cơm, cá nục, cá trích, cá liệt, cá bò, cá mối…trong đó chủ yếu là cá cơm

và cá nục

Nhìn chung, các phương pháp chế biến nước mắm truyền thống ở nước ta còn thô sơ, thời gian sản xuất dài từ 6 – 12 tháng Để rút ngắn thời gian sản xuất nước mắm đã có nhiều công trình nghiên cứu nhằm tăng cường hoạt động của hệ protease

có sẵn trong cá và hệ vi sinh vật tự nhiên bằng cách tiếp nhiệt, cho muối nhiều lần, náo đảo nhưng thời gian chế biến những phương pháp này còn dài Vì vậy đã có một số công trình nghiên cứu sử dụng protease bổ sung thêm từ bên ngoài vào để tăng cường khả năng thủy phân cá thành acid amin Phương pháp này có ưu điểm là thời gian chế biến ngắn, lượng mắm cốt nhiều hơn nhưng sản phẩm có mùi vị và màu sắc kém hơn nước mắm sản xuất theo phương pháp truyền thống Để khắc phục hiện tượng này thì người ta có thể cho chạy qua chượp tốt để lấy hương Vì vậy, việc nghiên cứu sản xuất nước mắm theo phương pháp sử dụng protease còn cần thiết để tiếp tục nghiên cứu

Chương 3

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Enzyme protease thô từ vi khuẩn Bacillus subtilis 43 được cung cấp bởi phòng

thí nghiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố

Hồ Chí Minh với một số đặc tính như: thích hợp ở nhiệt độ 50oC, pH = 7,6, tỷ lệ tủa giữa enzyme và cồn là 1 : 3, thời gian tủa là 30 phút, tỷ lệ giữa nước và enzyme là