TẬN DỤNG PHỤ PHẨM TRONG CHẾ BIẾN MỰC BẰNG CHẾ PHẨM ENZYME PROTEASE TỪ NẤM MỐC Aspergillus oryzae

Chính vì vậy, trong công nghiệp, protease có thể được bổ sung trực tiếp vào thức ăn nhằm tăng khả năng hấp thu chất dinh dưỡng của vật nuôi hoặc được sử dụng để thủy phân các loại protei

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA THỦY SẢN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

TẬN DỤNG PHỤ PHẨM TRONG CHẾ BIẾN MỰC BẰNG CHẾ PHẨM ENZYME PROTEASE

TẬN DỤNG PHỤ PHẨM TRONG CHẾ BIẾN THỦY SẢN BẰNG CHẾ PHẨM ENZYME PROTEASE

Tháng 9/2009

LỜI CẢM TẠ

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến:

Ban chủ nhiệm khoa cùng tất cả quý thầy cô trong Khoa Thủy Sản – Trường Đại Học Nông Lâm TPHCM đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt thời gian tôi học tập tại trường

PGS.TS Thầy Lê Thanh Hùng – Trưởng Khoa Thủy Sản đã luôn có sự hỗ trợ kịp thời để tôi hoàn thành tốt khóa luận này

ThS Trương Quang Bình – Giảng viên Khoa Thủy Sản đã luôn tận tình hướng dẫn, hỏi han động viên và giúp đỡ trong suốt quá trình tôi thực hiện đề tài

Các thầy cô và các anh chị làm việc tại Viện nghiên cứu công nghệ sinh học và môi trường – Trường Đại Học Nông Lâm TPHCM, đặc biệt là ThS Trương Phước Thiên Hoàng đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, động viên và tạo mọi điều kiện tốt nhất

để tôi hoàn thành khóa luận này

Do còn hạn chế về kiến thức và thời gian nghiên cứu nên khó tránh khỏi thiếu sót Rất mong nhận được ý kiến đóng góp của quý thầy cô cùng các bạn

Sinh viên thực hiện

VŨ HOÀNG HỘI

TÓM TẮT

Đề tài nghiên cứu: “Tận dụng phụ phẩm trong chế biến mực bằng chế phẩm

enzyme protease từ nấm mốc Aspergillus oryzae” được thực hiện tại phòng thí nghiệm

Khoa Thủy Sản và phòng thí nghiệm Viện nghiên cứu công nghệ sinh học và môi trường – Trường Đại học Nông Lâm TPHCM từ 4/2009 đến 8/2009

Chúng tôi đã sử dụng chế phẩm enzyme protease thu nhận từ nấm mốc

Aspergillus oryzae để thủy phân phụ phẩm thải ra từ quá trình chế biến mực Sau khi

xác định được các yếu tố tối ưu cho quá trình thủy phân, chúng tôi lấy dịch thủy phân

bổ sung thêm bã đậu nành rồi đem sấy để thu sản phẩm bột Ngoài ra, chúng tôi cũng nghiên cứu khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ bã đậu nành bổ sung đến chất lượng của sản phẩm thu được

Kết quả nghiên cứu thu được:

1 Khi bổ sung 3% muối (NaCl), 40ml nước, pH tự nhiên của phế phẩm mực, nồng độ enzyme là 3,57% sử dụng cho 100g phụ phẩm với thời gian thủy phân là 20 giờ thì sẽ thu được dịch thủy phân có hiệu suất thu nhận đạm hòa tan đạt 45% và hiệu suất thủy phân lên đến 82,83%

2 Khi bổ sung thêm 50% bột bã đậu nành và đem sấy thì thu được sản phẩm có hàm lượng đạm tổng số là 7,65 (g/100g NL) và hàm lượng ẩm

là 6,05%

MỤC LỤC

TRANG

CẢM TẠ ii TÓM TẮT iii MỤC LỤC iv DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT vii

2.1.3 Danh pháp – cấu tạo – phân loại 7

2.1.7 Các yếu tố ảnh hưởng tới tốc độ phản ứng của enzyme 12

2.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của protease 21

2.3.1 Trong thực phẩm 23

2.3.3 Trong công nghiệp sản xuất nước giải khát 24

2.5.6 Phụ phẩm từ chế biến mực 30

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 33

3.2 Vật liệu nghiên cứu 33 3.3 Phương pháp bố trí thí nghiệm 33

3.3.1 Khảo sát thành phần nguyên liệu dùng để thủy phân 33

3.3.2 Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ nước bổ sung vào quá trình thủy phân 33

3.3.3 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ muối bổ sung vào quá trình thủy phân 34

3.3.4 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ enzym lên quá trình thủy phân 34

3.3.5 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian lên quá trình thủy phân 35

3.3.6 Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ bã đậu nành bổ sung vào sản phẩm 35

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ THẢO LUẬN 36

4.1 Kết quả khảo sát thành phần nguyên liệu dùng để thủy phân 36

4.2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thể tích nước tới quá trình thủy phân 37

4.3 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ muối tới quá trình thủy phân 38

4.4 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ enzyme tới quá trình thủy phân 39

4.5 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian tới quá trình thủy phân 40

4.6 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ bã đậu nành bổ sung vào sản phẩm 41

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 43

5.1 Kết luận 43 5.2 Đề nghị 43

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

HSTNĐHT Hiệu suất thu nhận đạm hòa tan

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng Trang

Bảng 3.1 Bố trí các nghiệm thức khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ bã đậu nành bổ sung 35 Bảng 4.1 Thành phần nguyên liệu phụ phẩm mực dùng để thủy phân 36 Bảng 4.2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thể tích nước tới quá trình thủy phân 37 Bảng 4.3 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ muối tới quá trình thủy phân 38 Bảng 4.4 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng enzyme tới quá trình thủy phân 39 Bảng 4.5 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian thủy phân 40 Bảng 4.6 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ bã đậu nành bổ sung vào sản phẩm 41 Bảng 4.7 Các chỉ tiêu của sản phẩm bột đạm 42

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình Trang

Hình 2.2 Trùn quế 15 Hình 2.3 Tụy tạng 15 Hình 2.4 Nguồn thu protease từ thực vật 16

Hình 2.6 Nấm mốc 17 Hình 2.7 Xạ khuẩn 18

Chương 1

MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Với bờ biển dài trên 3260 km, hệ thống sông hồ dày đặc, cùng với khí hậu thuận lợi đã tạo điều kiện cho ngành thủy sản của Việt Nam phát triển một cách mạnh

mẽ trong những năm qua Việt Nam hiện đã đứng trong danh sách 10 nước xuất khẩu thủy sản lớn nhất thế giới Diện tích nuôi trồng ngày càng được mở rộng, kỹ thuật nuôi ngày càng được cải tiến làm cho sản lượng thủy sản tăng liên tục trong những năm qua Sự phát triển mạnh mẽ không ngừng của ngành nuôi trồng thủy sản đã kéo theo

sự phát triển lớn mạnh của ngành chế biến và xuất khẩu thủy sản Các nhà máy chế biến thủy sản không ngừng được mở rộng quy mô sản xuất, kỹ thuật ngày càng được nâng cao

Kim ngạch xuất khẩu thủy sản của nước ta đã tăng một cách mạnh mẽ trong những năm qua Kim ngạch xuất khẩu thủy sản năm 1980 chỉ đạt khoảng 11 triệu USD Sau đó, hàng năm kim ngạch xuất khẩu thủy sản tăng đều, đến năm 1999 cũng chỉ mới đạt khoảng 971 triệu USD Năm 2003 kim ngạch này đã tăng lên 2,24 tỷ USD, năm 2005 là 2,65 tỷ USD Đến năm 2007 là 3,75 tỷ USD, tăng 12% so với năm 2006 Theo Hiệp hội Chế biến và Xuất khẩu thủy sản (Vasep): năm 2008 xuất khẩu thủy sản của cả nước đạt trên 1,2 triệu tấn, trị giá trên 4,5 tỷ USD, tăng 33,7% về khối lượng và 19,8% về giá trị so với năm 2007 Năm 2009, do ảnh hưởng của suy thoái kinh tế toàn cầu nên đã tác động mạnh mẽ đến tình hình xuất khẩu của ngành thủy sản Việt Nam Tuy vậy, kế hoạch dự kiến vẫn là khoảng 3,5 – 4 tỷ USD trong năm 2009 Và phấn

đấu đến năm 2020 sẽ đạt khoảng 7 tỷ USD về kim ngạch xuất khẩu thủy sản

Đi cùng với sự phát triển mạnh mẽ như vậy, ngành thủy sản cũng đang là nguyên nhân gây ra những vấn đề hết sức đáng lo ngại Đó chính là vấn đề ô nhiễm môi trường do nước thải và các phụ phẩm của các nhà máy chế biến thủy sản gây ra

Lượng phụ phẩm này một phần được sử dụng để sản xuất thức ăn cho gia súc

và thủy sản hoặc sản xuất phân bón, phần còn lại hoặc được xử lý trước khi thải ra môi trường hoặc được thải trực tiếp ra môi trường mà không qua xử lý cùng với nước thải Hiện nay đa số các nhà máy chế biến thủy sản đều thải trực tiếp ra môi trường vì để xử

lý lượng phụ phẩm và nước thải này thì sẽ tốn một khoản tiền không nhỏ Việc làm này đã và đang làm cho môi trường sống của con người bị ô nhiễm nặng Đứng trước thách thức trên, đòi hỏi các nhà quản lý phải có những biện pháp xử lý và các công ty phải có giải pháp để khắc phục

Protease là một trong những enzyme có nhiều ứng dụng quan trọng và được sử dụng rộng rãi trong rất nhiều lĩnh vực khác nhau như: nông nghiệp, công nghiệp, y học, thuộc da, mỹ phẩm, thực phẩm và xử lý rác thải So với phương pháp thủy phân bằng acid thì phương pháp sử dụng protease có nhiều ưu điểm hơn hẳn như: không độc hại, đảm bảo giá trị dinh dưỡng của sản phẩm sau thủy phân Chính vì vậy, trong công nghiệp, protease có thể được bổ sung trực tiếp vào thức ăn nhằm tăng khả năng hấp thu chất dinh dưỡng của vật nuôi hoặc được sử dụng để thủy phân các loại protein khác nhau tạo sản phẩm chứa hàm lượng amino acid cao để bổ sung vào khẩu phần dinh dưỡng cho người hoặc cho gia súc

Được sự chấp thuận của Khoa Thủy Sản, chúng tôi đã tiến hành đề tài: “Tận Dụng Phụ Phẩm Trong Chế Biến Mực Bằng Chế Phẩm Enzyme Protease Từ Nấm

Mốc Aspergillus oryzae”

1.2 Mục đích của đề tài

Đề tài: “Tận Dụng Phụ Phẩm Trong Chế Biến Mực Bằng Chế Phẩm Enzyme

Protease Từ Nấm Mốc Aspergillus oryzae” được thực hiện với các mục đích như sau:

- Tận dụng nguồn phế thải dồi dào từ quá trình chế biến mực của các nhà máy chế biến thủy sản nhằm giải quyết một phần vấn đề ô nhiễm môi trường hiện nay

- Tạo ra sản phẩm có hàm lượng amino acid cao để bổ sung vào khẩu phần dinh dưỡng của gia súc và thủy sản

1.3 Yêu cầu

- Xác định các yếu tố (nồng độ muối, tỷ lệ nước, nồng độ enzyme bổ sung) tối

ưu cho quá trình thủy phân protein mực

- Xác định thời gian tối ưu nhất cho quá trình thủy phân để có hiệu suất thủy phân và hiệu suất thu nhận đạm hòa tan cao nhất

- Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ bã đậu nành bổ sung để thu được sản phẩm bột

có hàm lượng đạm tốt nhất

Chương 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan về enzyme

2.1.1 Khái niệm enzyme

Trong cơ thể sống luôn luôn xảy ra quá trình trao đổi chất Một khi sự trao đổi chất ngừng hoàn toàn thì sự sống không còn tồn tại Quá trình trao đổi của một chất là tập hợp của rất nhiều các phản ứng sinh hóa khác nhau Các phản ứng phức tạp này có liên quan chặt chẽ với nhau và điều chỉnh lẫn nhau Enzyme là các hợp chất protein xúc tác cho các phản ứng sinh hóa đó Chúng có khả năng xúc tác đặc hiệu các phản ứng nhất định và đảm bảo cho các phản ứng xảy ra theo một chiều hướng nhất định với tốc độ nhịp nhàng trong cơ thể sống

Enzyme có trong hầu hết các loại tế bào của cơ thể sống Và là những tác nhân xúc tác có nguồn gốc sinh học nên enzyme còn được gọi là các chất xúc tác sinh học nhằm phân biệt với các chất xúc tác hóa học

Ngoài những tính chất của một chất xúc tác, enzyme còn có những tính chất ưu việt hơn so với các chất xúc tác khác như: hiệu suất cao trong điều kiện nhiệt độ và áp suất bình thường, có tính đặc hiệu cao Các tính chất này vẫn được giữ nguyên khi tách

enzyme ra khỏi hệ thống sống và hoạt động trong điều kiện In vitro (trong ống

nghiệm) Vì vậy enzyme được sử dụng rộng rãi trong thực tế sản xuất, trong công nghiệp Nhiều ngành liên quan đến enzyme đã được hình thành như công nghệ sản xuất enzyme, công nghệ sản xuất các thiết bị có phần tử enzyme như biosensor (thiết

bị cảm biến sinh học)

Enzyme học là ngành khoa học nghiên cứu những chất xúc tác sinh học có bản chất protein Hay nói cách khác, enzyme học là ngành khoa học nghiên cứu những tính chất chung, điều kiện, cơ chế tác dụng và tính đặc hiệu của các enzyme (Đỗ Quý Hai

và ctv, 2009)

2.1.2 Sơ lược lịch sử nghiên cứu enzyme

Do enzyme học được coi như cột sống của sinh hóa học cho nên phần lớn các nghiên cứu sinh hóa từ trước tới nay đều có liên quan nhiều đến enzyme

Trải qua quá trình phát triển lâu dài của học thuyết enzyme, có thể chia thành 4 giai đoạn như sau:

+ Giai đoạn 1

Trong giai đoạn trước thế kỷ XVII con người đã biết sử dụng các quá trình enzyme trong đời sống Song, chưa ai hiểu được đó là bản chất của quá trình hoạt động của enzyme, mà chỉ biết làm qua kinh nghiệm thực tế và thông qua hoạt động của vi sinh vật Đó là các quá trình như lên men rượu, muối dưa, làm nước tương và nước chấm

+ Giai đoạn 2

Ở giai đoạn này, các nhà khoa học đã tiến hành nghiên cứu tìm hiểu bản chất của các quá trình lên men Các nghiên cứu ở thời kỳ này đã khái quát hiện tượng lên men như là một hiện tượng phổ biến trong sự sống và enzyme là yếu tố gây nên sự chuyển hóa các chất trong quá trình lên men

Khoảng những năm 1600 của thế kỷ XVII, Van Helmont là người đầu tiên đã

cố gắng đi sâu tìm hiểu bản chất của quá trình lên men Ông đã nhận thấy bản chất của

sự tiêu hóa là sự chuyển hóa hóa học của thức ăn và giải thích cơ chế của nó với sự so sánh với quá trình lên men rượu Danh từ ferment (fermentatio – sự lên men) được Van Helmont dùng để chỉ tác nhân gây ra sự chuyển biến các chất trong quá trình lên men rượu

Sau đó người ta đã tìm ra và tách được nhiều enzyme khác như enzyme phân giải protein của dịch tiêu hóa trong dạ dày như pepsin, trypsin

+ Giai đoạn 3

Giai đoạn này bắt đầu từ giữa thế kỷ XIX đến 30 năm đầu của thế kỷ XX Ở giai đoạn này, một số lượng lớn các enzyme ở dạng hòa tan đã được các nhà khoa học tách chiết

Trong thời kỳ này, có hai trường phái có quan điểm trái ngược với nhau là: trường phái Pasteur – nhà bác học người Pháp và trường phái Liebig – nhà bác học người Đức

* Trường phái Pasteur:

Năm 1856, Pasteur đã đề cập đến bản chất của quá trình lên men Theo ông thì không thể tách các enzyme ra khỏi tế bào Ông cũng cho rằng tác dụng và tính chất của enzyme gắn liền với sự sống của tế bào và quá trình lên men rượu là kết quả của hoạt động sống của tế bào nấm men chứ không phải là kết quả của tác dụng enzyme

Quan điểm sai lầm này của Pasteur đã thống trị ngành enzyme học trong một thời gian dài Năm 1878, Kuhne đã đề nghị dùng danh từ “ferment” (fermentatio – lên men) để gọi các “enzyme có tổ chức” và đã gọi các chất chiết có tác dụng xúc tác cho phản ứng hóa học là các enzyme (từ chữ Hy Lạp : en – bên trong, zyme – men rượu, tức là “ở trong nấm men”) để gọi các enzyme “không có tổ chức” Danh từ enzyme đã được xuất phát từ đây

* Trường phái Liebig:

Trái ngược với quan điểm trên của Pasteur, Liebig (trước đó có cả Berzelius) cho rằng có thể không có hoạt động của các tế bào vi sinh vật vẫn có quá trình lên men Điều đó có nghĩa là ông coi enzyme như là một chất hóa học gây nên hiệu quả tương tự như các chất xúc tác, tác dụng cả ở trong và ngoài tế bào, mà không phụ thuộc vào hoạt động sống của vi sinh vật

Nhưng năm 1871, Liebig thất bại vì thực nghiệm không chứng minh được quan điểm trên của ông Các thí nghiệm được tiến hành bằng cách lấy dịch chiết từ tế bào nấm men đã nghiền nát đều không có tác dụng gây lên men rượu

+ Giai đoạn 4

Bản chất hóa học của enzyme chỉ được xác định đúng đắn từ sau khi kết tinh được enzyme Năm 1926 nhà hóa sinh Mỹ trẻ tuổi Sumner (39 tuổi) đã thành công trong việc chứng minh protein được kết tinh từ hạt đậu tương là chất giống enzyme xúc tác cho phản ứng thủy phân urê Đây cũng chính là enzyme đầu tiên được kết tinh Bốn năm sau (1930) ở Mỹ, Northrop đã tách được pepsin ở dạng tinh thể, và vào năm

1931 Northrop và Kunitz cũng đã tách được trypsin ở dạng tinh thể

Trong mấy chục năm cuối của thế kỷ XX và đầu thế kỷ XXI, người ta đã chú ý nghiên cứu việc ứng dụng enzyme Người ta đã tận dụng các nguyên liệu giàu enzyme

để tách enzyme, dùng chế phẩm enzyme này để chế biến các nguyên liệu khác nhau hoặc sử dụng vào mục đích khác nhau Ở nhiều nước đã hình thành ngành công nghệ enzyme, hàng năm đã sản xuất hàng trăm tấn chế phẩm enzyme để phục vụ cho các ngành sản xuất khác nhau và cho y học (Đỗ Quý Hai và ctv, 2009)

2.1.3 Danh pháp – cấu tạo – phân loại

* Danh pháp

Tên enzyme = tên cơ chất + ase

Ví dụ: enzyme thủy giải protein: protease

Enzyme phân hủy nucleic: nuclease

Enzyme tổng hợp DNA: DNA-polymerase

Bên cạnh đó còn có những tên gọi theo thói quen, không cho thấy bản chất hóa học của phản ứng do enzyme xúc tác, ví dụ như ligase (enzyme nối trong quá trình tự sao DNA), amylase (enzyme thủy phân tinh bột, có trong dịch ruột)

Trung tâm hoạt động: chỉ có 1 phần rất nhỏ của enzyme tham gia phản ứng, phần này gọi là trung tâm hoạt động, số trung tâm hoạt động có thể lớn hơn 1

* Phân loại

Càng ngày càng có nhiều enzyme mới được phát hiện, để thống nhất tên gọi enzyme, người ta đã phân tất cả enzyme làm 6 loại (xem bảng 2.1)

Bảng 2.1: Bảng phân loại enzyme

Loại enzyme Loại phản ứng được xúc tác

Oxidoreductase

Các enzyme này xúc tác các phản ứng oxi-hóa khử có nghĩa là chúng vận chuyển các nguyên tử hydro hoặc điện tử của chúng

từ cơ chất của chúng sang các phần tử nhận

Transferase Các nhóm nhỏ các nguyên tử được vận chuyển từ cơ chất này

sang cơ chất khác

Hydrolase Các enzyme này làm gãy đứt các liên kết hóa học bằng phản ứng

thủy phân

Lyase Các enzyme này nối thêm một nhóm mới vào cơ chất bằng cách

làm gãy nối đôi, ngược lại nó cũng có thể xúc tác để tạo nối đôi

Izomerase Chúng xúc tác sự tái phân bố các nguyên tử trong cơ chất, tức là

chúng tạo ra các đồng phân của cùng một hợp chất

Ligase

Các enzyme này tạo liên kết hóa học mới, năng lượng từ ATP sẽ cần cho sự tạo các liên kết hóa học này, ligase giúp cho sự tổng hợp nên hydrocarbon, protein và các đại phân tử khác

(Đỗ Quý Hai và ctv, 2009)

2.1.4 Tính chất lý hóa của enzyme

Enzyme sử dụng năng lượng liên kết tạo phản ứng xúc tác đặc hiệu thông qua một số cơ chế như sau:

+ Giảm entropi

+ Làm mất vỏ nước bao quanh cơ chất

+ Năng lượng liên kết do các tương tác yếu tạo ra ở trạng thái chuyển tiếp

+ Tạo ra khớp phản ứng làm cho phản ứng xảy ra dễ dàng hơn

Sau khi tạo thành phức enzyme – cơ chất, các nhóm chức năng nằm ở vị trí đặc biệt trong phức sẽ phát huy tác động của mình theo một số cơ chế Phổ biến nhất là cơ chế xúc tác acid – base và cơ chế xúc tác hóa trị

- Cơ chế xúc tác acid – base: thường trong phản ứng sinh hóa luôn luôn có sự hình thành các chất trung gian mang điện không bền, dễ dàng phân rã trở lại trạng thái ban đầu Tuy nhiên, chúng có thể ổn định nhờ sự trao đổi proton với sự tham gia của

H+, H3O+ và OH- trong môi trường nước tạo ra xúc tác acid – base riêng, khác với xúc tác acid – base chung xảy ra trong môi trường phản ứng ngoài nước còn có chất cho và nhận proton khác

- Xúc tác thông qua liên kết hóa trị tạm thời: liên kết này tồn tại trong khoảng thời gian rất ngắn giữa enzyme và cơ chất Sự hình thành liên kết yếu tạm thời này giữa enzyme và cơ chất sẽ hoạt hóa rất mạnh cho phản ứng

- Xúc tác thông qua ion kim loại: rất nhiều trường hợp enzyme có chứa các kim loại và cơ chất xuất hiện tương tác (thông qua ion kim loại) giúp định hướng cơ chất vào tâm phản ứng Ngoài ra kim loại còn tham gia vào phản ứng oxi-hóa khử

2.1.5 Tính đặc hiệu của enzyme

* Khái niệm chung

Do cấu trúc lý hóa đặc biệt của phân tử enzyme và đặc biệt là của trung tâm hoạt động mà enzyme có tính đặc hiệu rất cao so với những chất xúc tác thông thường khác Mỗi enzyme chỉ có khả năng xúc tác cho sự chuyển hóa một hay một số chất nhất định theo một kiểu phản ứng nhất định Đặc tính tác dụng chọn lọc cao này gọi là tính đặc hiệu hoặc tính chuyên hóa của enzyme Tính đặc hiệu là một trong những đặc tính cơ bản quan trọng nhất của enzyme

* Các hình thức đặc hiệu

Có thể phân biệt hai kiểu đặc hiệu là: đặc hiệu kiểu phản ứng và đặc hiệu cơ chất

+ Đặc hiệu kiểu phản ứng

Đa số mỗi enzyme đều có tính đặc hiệu với một loại phản ứng nhất định Những chất có khả năng xảy ra nhiều loại phản ứng hóa học thì mỗi loại phản ứng ấy phải do một enzyme đặc hiệu xúc tác Ví dụ, amino acid có khả năng xảy ra phản ứng khử carboxyl, phản ứng khử amin bằng cách oxy hóa và phản ứng vận chuyển nhóm amin, vì vậy mỗi phản ứng ấy cần có một enzyme đặc hiệu tương ứng xúc tác theo thứ

tự là decarboxylase, aminoacid oxydase và aminotransferase

+ Đặc hiệu cơ chất

Mỗi enzyme chỉ xúc tác cho sự chuyển hóa một hoặc một số chất nhất định Mức độ đặc hiệu cơ chất của các enzyme khác nhau không giống nhau, người ta thường phân biệt thành các mức như sau:

- Đặc hiệu tuyệt đối

Một số enzyme hầu như chỉ xúc tác cho phản ứng chuyển hóa một cơ chất xác định và chỉ xúc tác cho phản ứng ấy mà thôi Ví dụ: urease, arginase, glucoseoxydase Đối với các enzyme này, ngoài các cơ chất đặc hiệu của chúng là ure, arginine, β- D – glucose (theo thứ tự tương ứng) chúng cũng có thể phân giải một vài chất khác nhưng với vận tốc thấp hơn nhiều Chẳng hạn như urease, ngoài ure nó còn có thể phân giải hydroxyure nhưng với vận tốc thấp hơn 120 lần Đối với trường hợp glucose oxydase thì enzyme này có trong các loại nấm mốc ngoài khả năng oxy hóa đặc hiệu β- D – glucose thành gluconic acid, nó còn có khả năng phân giải 10 cơ chất nhưng với khả năng nhỏ hơn nhiều

Những enzyme có tính đặc hiệu tuyệt đối thường được dùng để định lượng chính xác cơ chất của nó

- Đặc hiệu nhóm tuyệt đối

Các enzyme này chỉ tác dụng lên những cơ chất có cùng một kiểu cấu trúc phân

tử, một kiểu liên kết và có những yêu cầu xác định đối với nhóm nguyên tử ở phần liên kết chịu tác dụng Ví dụ: maltase thuộc nhóm α- glucosidase chỉ xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết glucoside được tạo thành từ nhóm OH- glucoside của α - glucose với nhóm OH- của một monose khác

- Đặc hiệu nhóm tương đối

Mức độ đặc hiệu của các enzyme thuộc nhóm này kém hơn nhóm trên Enzyme

có khả năng tác dụng lên một kiểu liên kết hóa học nhất định trong phân tử cơ chất mà không phụ thuộc vào cấu tạo của các phần tham gia tạo thành mối liên kết đó Ví dụ lipase có khả năng thủy phân được tất cả các mối liên kết este Aminopeptidase có thể xúc tác thủy phân nhiều peptid

- Đặc hiệu quang học (đặc hiệu lập thể)

Hầu như tất cả các enzyme đều có tính đặc hiệu không gian rất chặt chẽ, nghĩa

là enzyme chỉ tác dụng với một trong hai dạng đồng phân không gian của cơ chất

Trong tự nhiên cũng có các enzyme xúc tác cho phản ứng chuyển hóa tương hỗ giữa các cặp đồng phân không gian tương ứng Các enzyme này có vai trò quan trọng khi sản xuất các chất dinh dưỡng bằng phương pháp hóa học, vì chúng có thể chuyển các chất từ dạng cơ thể không thể sử dụng được thành dạng có thể hấp thụ (Đỗ Quý Hai và ctv, 2009)

2.1.6 Cơ chế xúc tác của enzyme

Bước đầu tiên của bất kỳ phản ứng nào có sự xúc tác của enzyme là sự hình thành mối liên kết đặc hiệu giữa các phân tử tạo thành phức enzyme – cơ chất, nhờ cấu hình của enzyme phù hợp với cơ chất qua một khu vực tương đối lớn là trung tâm hoạt động của enzyme, sau khi tạo ra phức này enzyme và cơ chất tác dụng với nhau (như phần tính đặc hiệu) làm xảy ra phản ứng hóa học trong cơ chất và các sản phẩm tương ứng được tạo ra liền sau đó enzyme tách khỏi cơ chất để sẵn sàng kết hợp với các cơ chất mới, quá trình này diễn ra rất nhanh

Quá trình trên có thể được tóm tắt qua sơ đồ như sau:

E + S ES P + E Trong đó:

E: là enzyme

S: là cơ chất (Substrate)

ES: là phức hợp enzyme – cơ chất

P: là sản phẩm (Product)

- Giai đoạn thứ nhất: enzyme kết hợp với cơ chất bằng liên kết yếu tạo thành

phức hợp enzyme – cơ chất (ES) không bền, phản ứng này xảy ra rất nhanh và đòi hỏi năng lượng hoạt hóa thấp

- Giai đoạn thứ hai: xảy ra sự biến đổi cơ chất dẫn tới sự kéo căng và phá vỡ

các liên kết đồng hóa trị tham gia phản ứng

- Giai đoạn thứ ba: tạo thành sản phẩm, còn enzyme được giải phóng ra dưới dạng tự do

Các loại liên kết chủ yếu được tạo thành giữa E và S trong phức hợp ES là: tương tác tĩnh điện, liên kết hydrogen, tương tác Van der Waals Mỗi loại liên kết đòi hỏi những điều kiện khác nhau và chịu ảnh hưởng khác nhau khi có nước

Cơ chế hoạt động như trên là giả thuyết ổ khóa và chìa khóa, khái niệm này chỉ

có tính chất tương đối Ổ khóa và chìa khóa ở đây không phải có cấu trúc cố định mà tương tác với nhau kèm theo sự thay đổi của cả hai bên (Đỗ Quý Hai và ctv, 2009)

2.1.7 Các yếu tố ảnh hưởng tới tốc độ phản ứng của enzyme

+ Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất

Tốc độ phản ứng enzyme phụ thuộc nồng độ cơ chất Nồng độ cơ chất tăng, tốc

độ phản ứng xúc tác của enzyme tăng, nhưng khi nồng độ cơ chất tăng đến mức cao thì tốc độ phản ứng đạt đến mức cực đại và không tăng nữa Thời điểm này enzyme bão hòa cơ chất

+ Ảnh hưởng của nồng độ enzyme

Tốc độ phản ứng xúc tác bởi enzyme tỷ lệ thuận với hàm lượng enzyme nhưng khi tăng cao nồng độ enzyme thì tốc độ cũng không tăng nữa do các sản phẩm được tạo ra nhiều sẽ tác dụng vào vị trí dị lập thể của enzyme làm cho phản ứng đạt ở mức

độ bão hòa

+ Ảnh hưởng của nhiệt độ

Nhiệt độ có tác dụng làm tăng tốc độ của phản ứng enzyme lên đến tốc độ cực đại đến chừng nào enzyme chưa bị biến tính, mỗi khi tăng nhiệt độ lên 10oC, tốc độ

phản ứng sẽ tăng lên khoảng 2 lần Khi nhiệt độ tăng đến khoảng 60 – 70oC thì phần lớn các enzyme mất hẳn hoạt tính và nhiệt độ đó gọi là nhiệt độ tới hạn

Mỗi enzyme yêu cầu một nhiệt độ xúc tác tối ưu riêng, ở nhiệt độ này phản ứng enzyme đạt tốc độ cao nhất Nhìn chung nhiệt độ thích hợp của enzyme gần với nhiệt

độ của cơ thể, vào khoảng 40oC Ở các vi sinh vật chịu nhiệt độ cao, enzyme của chúng có nhiệt độ thích hợp cao, ví dụ amylase động vật có nhiệt độ thích hợp cao, enzyme ứng dụng khoảng 45 – 50oC; nhưng α-amylase của vi sinh vật chịu nhiệt có nhiệt độ thích hợp là 70oC, đối với các enzyme của các vi sinh vật cảm ứng sống trong các suối nước nóng thì nhiệt độ thích hợp vào khoảng gần nhiệt độ sôi của nước Nhiều enzyme thực vật vẫn có thể hoạt động ở nhiệt độ khá cao như papain ở 80oC

Đối với enzyme có những nhóm hoạt động đặc biệt có thể tồn tại dưới nhiều dạng ion khác nhau và thường chỉ ở một trạng thái có tác dụng xúc tác pH có tác dụng quyết định đối với trạng thái ion hóa của phân tử enzyme nói chung và các nhóm hoạt động của enzyme nói riêng, nên ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme

+ Ảnh hưởng của ion kim loại

Sự có mặt hay vắng mặt của ion kim loại không thể hiện rõ đối với một số enzyme, nhưng cũng có nhiều enzyme chịu ảnh hưởng sâu sắc bởi nồng độ và bản chất của ion kim loại Có một số ion kim loại rất cần thiết cho sự hoạt động của một số enzyme; nhưng cũng có những ion kim loại như Ag+, Hg+, Pb+ có độc tính cao với hầu hết các enzyme Một số ion kim loại ức chế enzyme này nhưng hoạt hóa enzyme kia

Có những ion kim loại ức chế một enzyme ở nồng độ này nhưng lại hoạt hóa chính enzyme đó ở nồng độ khác Tác dụng của ion kim loại rất phức tạp vì nó còn tác dụng với cả trung tâm hoạt động và cơ chế xúc tác của enzyme

+ Ảnh hưởng của chất hoạt hóa

Chất hoạt hóa có khả năng làm tăng tác dụng xúc tác của enzyme Chất hoạt hóa thường có bản chất rất khác nhau Ví dụ, các anion nhóm halogen như Cl-, Br-, I-

có tác dụng hoạt hóa α-amylase Glutathion có tác dụng hoạt hóa nhiều protease thực vật, một số enzyme oxy hóa khử có nhóm hoạt động –SH Cystein là acid amin hoạt hóa nhiều men có nhóm –SH hoạt động Tác dụng hoạt hóa của glutathion, cystein là

do khả năng khử liên kết disulfur của phân tử enzyme Các enzyme có nhóm –SH hoạt động thường chỉ hoạt động được khi các nhóm này ở dạng khử (Nguyễn Văn Nam và ctv, 2007)

2.2 Tổng quát về protease

2.2.1 Khái niệm protease

Protease còn được gọi là các proteolytic enzyme, là các enzyme có khả năng thủy phân các liên kết peptid của chuỗi peptid, protein thành các đoạn peptid ngắn hơn

và thành các acid amin Các protease thủy phân các liên kết peptid bên trong chuỗi polypeptid được gọi là các endoprotease và được chia thành 4 loại trên cơ sở các nhóm hóa học tham gia vào quá trình xúc tác: Serin proteinase (EC3.4.21), Cystein proteinase (EC3.4.22), Aspartic proteinase (EC3.4.23) và Metalloproteinase (EC3.4.24) Trong cơ thể, các protease đảm nhiệm nhiều chức năng sinh lý như: hoạt hóa zymogen, đông máu và phân hủy sợi fibrin của cục máu đông, giải phóng hormon

và các peptid có hoạt tính sinh học từ các tiền chất, vận chuyển protein qua màng Ngoài ra, các protease có thể hoạt động như các yếu tố phát triển của cả tế bào ác tính

và tế bào bình thường, đó là tăng sự phân chia tế bào, sinh tổng hợp DNA

Các protease có thể ở dạng:

- Hiện diện trong tế bào (protease nội bào)

- Được tiết vào môi trường nuôi cấy (protease ngoại bào)

Cho đến nay, các protease ngoại bào được nghiên cứu kỹ hơn so với protease nội bào (Tiêu Thị Ngọc Thảo và ctv, 2008)

2.2.2 Nguồn nguyên liệu thu nhận protease

Protease có ở tất cả các loài động vật và thực vật Tuy nhiên, sự phân bố của nó không đồng đều ở các loài, các mô cũng như các cơ quan Một số loài, cơ quan và mô của động thực vật có chứa một hoặc một số protease nhất định có thể dùng làm nguyên liệu để tách các enzyme tương ứng Bên cạnh đó, các vi sinh vật cũng là một nguồn thu nhận protease tương đối dồi dào

có đủ nồng độ Ca2+. Đây là quá trình động tụ sữa rất điển hình, được nghiên cứu và ứng dụng đầy đủ nhất

Gần đây có nghiên cứu sản xuất protease từ các động vật khác như nội tạng cá basa, đầu tôm sú, trùn quế

Hình 2.2 Trùn quế Hình 2.3 Tụy tạng

¾ Nguồn thực vật

Có 3 loại protease thực vật như Bromelain, Papain và Ficin Papain thu được từ nhựa của lá, thân, quả đu đủ (Carica papaya) còn Bromelain thu từ quả, chồi dứa, vỏ dứa (Pineapple plant) Các enzyme này được sử dụng để chống lại hiện tượng tủa trắng của bia khi làm lạnh do kết tủa protein Những ứng dụng khác của protease thực vật

này là trong công nghệ làm mềm thịt và được bổ sung để hỗ trợ cho quá trình tiêu hoá Ficin thu được từ nhựa cây cọ (Ficus carica)

Trong các chủng vi khuẩn có khả năng tổng hợp mạnh protease là Bacillus

subtilis, B mesentericus, B thermorpoteoliticus và một số giống thuộc chi

Clostridium Trong đó, B subtilis có khả năng tổng hợp protease mạnh nhất Các vi

khuẩn thường tổng hợp các protease hoạt động thích hợp ở vùng pH trung tính và kiềm yếu

Các protease trung tính của vi khuẩn hoạt động ở khoảng pH hẹp (pH 5-8) và

có khả năng chịu nhiệt thấp Các protease trung tính tạo ra dịch thủy phân protein thực phẩm ít đắng hơn so với protease động vật và tăng giá trị dinh dưỡng Các protease

trung tính có khả năng ái lực cao đối với các amino acid ưa béo và thơm Chúng được

sinh ra nhiều bởi B subtilis, B mesentericus, B thermorpoteoliticus và một số giống

thuộc chi Clostridium

Hình 2.5 Bacillus subtilis

+ Từ nấm mốc

Nhiều loại nấm mốc có khả năng tổng hợp một lượng lớn protease được ứng

dụng trong công nghiệp thực phẩm là các chủng: Aspergillus oryzae, A terricola, A

fumigatus, A saitoi, Penicillium chysogenum Các loại nấm mốc này có khả năng tổng

hợp cả ba loại protease: acid, kiềm và trung tính Nấm mốc đen tổng hợp chủ yếu các protease acid, có khả năng thủy phân protein ở pH 2,5-3

Một số nấm mốc khác như: A candidatus, P cameberti, P roqueforti cũng có

khả năng tổng hợp protease có khả năng đông tụ sữa sử dụng trong sản xuất pho mát

Hình 2.6 Nấm mốc + Từ xạ khuẩn

Về phương diện tổng hợp protease, xạ khuẩn được nghiên cứu ít hơn vi khuẩn

và nấm mốc Tuy nhiên, người ta cũng đã tìm được một số chủng có khả năng tổng

hợp protease cao như: Streptomyces grieus, S fradiae, S Trerimosus

Các chế phẩm protease từ xạ khuẩn được biết nhiều là pronase (Nhật) được tách

chiết từ Streptomyces grieus, enzyme này có đặc tính đặc hiệu rộng, có khả năng thủy

phân tới 90% liên kết peptide của nhiều protein thành amino acid Ở Liên Xô (cũ),

người ta cũng tách được chế phẩm tương tự từ S grieus có tên là protelin

Hình 2.7 Xạ khuẩn

Có thể nói vi sinh vật là nguồn nguyên liệu thích hợp nhất để sản xuất protease

ở quy mô lớn dùng trong công nghệ và đời sống Dùng nguồn vi sinh vật có những lợi ích chính như sau:

- Chủ động về nguyên liệu nuôi cấy vi sinh vật và giống vi sinh vật

- Chu kỳ sinh trưởng của vi sinh vật ngắn: 16 ÷ 100 giờ và tốc độ sinh sản nhanh nên có thể thu hoạch nhiều lần trong năm và thu được một khối lượng lớn tế bào trong khoảng thời gian ngắn Vì thế người ta có thể sản xuất được số lượng lớn chế phẩm protease

- Có thể điều khiển quá trình sinh tổng hợp enzyme dễ dàng theo hướng có lợi (định hướng sử dụng và tăng hiệu suất tổng thu hồi)

- Giá thành nguyên liệu tương đối thấp vì môi trường tương đối rẻ, đơn giản, dễ kiếm và dễ tổ chức sản xuất

- Hoạt tính protease của một số chủng vi khuẩn khá cao, nên khả năng phân giải protein thành các hợp chất đơn giản của chúng cao, giúp cho tế bào dễ đồng hóa

- Protease do vi khuẩn tổng hợp có khả năng chịu nhiệt độ cao hơn các nguồn khác

Bởi lẽ đó, trong những năm gần đây các chế phẩm protease của vi khuẩn dần dần được thay thế các chế phẩm protease lấy từ động vật và thực vật

Để sản xuất chế phẩm enzyme, người ta có thể phân lập các giống vi sinh vật có trong tự nhiên hoặc các giống đột biến có lựa chọn theo hướng có lợi nhất, chỉ tổng hợp ưu thế một loại enzyme nhất định cần thiết nào đó

Tuy nhiên trong mọi trường hợp cần lưu ý khả năng sinh độc tố (gây độc, gây bệnh) để có biện pháp phòng ngừa, xử lý thích hợp

2.2.3 Phân loại protease

+ Căn cứ vào cơ chế phản ứng, dựa vào đặc trưng của trung tâm hoạt động, pH hoạt động thích hợp, có thể phân loại protease của vi sinh vật thành 4 nhóm sau:

Serine protease

- Gồm có 2 họ protease chính:

Họ chymotrypsin: bao gồm các enzyme của động vật có vú như chymotrypsin, trypsin, elastase

Họ subtilisin: bao gồm các enzyme vi khuẩn như subtilizin

- Hai amino acid tham gia vào trung tâm hoạt động là serine và histidine

- Cơ chế thủy giải gồm hai giai đoạn: acyl hóa và deacyl hóa

Cysteine protease

- Bao gồm các protease thực vật như papain, bromelin

- Trung tâm hoạt động có hai amino acid: cysteine và histidine

- Cơ chế thủy giải gồm hai giai đoạn: acyl hóa và deacyl hóa

Aspartic protease

- Hầu hết đều thuộc họ pepsin gồm: pepsin, chymosin và protease của vi nấm

- Trung tâm hoạt động có 3 amino acid: 2 aspartic và 1 tyrosine

Metallo protease

- Bao gồm các họ protease của vi khuẩn, vi nấm

- Trung tâm hoạt động có chứa nguyên tố kim loại như: Zn, Mg, Co

- Tuy nhiên, cũng có nhiều protease mang tính chất trung gian giữa các nhóm kể trên, nhất là giữa nhóm Serine protease và nhóm Aspartic protease

+ Một số tác giả dựa vào pH tác dụng tối ưu để chia protease vi khuẩn thành: protease acid, protease kiềm, protease trung tính

Nhưng tác dụng tối ưu của protease còn phụ thuộc giá trị pH của cơ chất Vì cùng một protease của một chủng vi khuẩn khi thủy phân casein hemoglobin hay gelatin sẽ thể hiện hoạt độ cực đại ở những giá trị pH khác nhau

+ Dixon phân loại protease theo tác động vào vị trí liên kết peptide trong phân tử protein:

- Exopeptidase: protease cắt nối peptide ở phía đầu dây protein

- Endopeptidase: protease cắt nối peptide phía trong dây protein

+ Năm 1974, Morihara đã phân loại protease của vi sinh vật theo tính đặc hiệu của chúng đối với cơ chất tổng hợp hoặc đối với chuỗi insulin đã bị oxy hóa

- Nhóm 1: nhóm này có tính đặc hiệu đối với các gốc amino acid ở về nhóm

(–CO–) của liên kết peptide, do đó, cũng có thể gọi là carboxyendopeptidase

- Nhóm 2: nhóm phân giải các amino acid kiềm ở về phía nhóm carboxyl (–

CO– ) của liên kết peptide

- Nhóm 3: nhóm này có tính đặc hiệu đối với các gốc amino acid về phía nhóm

(–NH–) của liên kết peptide (aminoendopeptidase)

- Nhóm 4: nhóm này có tính đặc hiệu đối với các gốc amino acid ở cả hai phía

của liên kết peptide

Mỗi nhóm này tiếp tục được phân thành nhóm nhỏ cũng dựa vào tính đặc hiệu của chúng và một số tính chất khác

Nói chung, tính đặc hiệu của các protease không chỉ thể hiện đối với gốc amino acid chứa nhóm (-CO-) hoặc (-NH-) của liên kết bị phân giải (đặc hiệu sơ cấp) mà còn

cả với các gốc amino acid ở xa liên kết bị thủy giải (đặc hiệu thứ cấp)

Các enzyme trong một nhóm có tính đặc hiệu giống nhau cũng chịu những ảnh hưởng giống nhau của tương tác thứ cấp Thông thường, các enzyme có tính đặc hiệu nghiêm ngặt ít chịu ảnh hưởng của tương tác thứ cấp và ngược lại Protease vi sinh vật cũng như protease thực vật không có tính đặc hiệu cao như protease động vật Do đó,

dưới tác dụng của protease vi sinh vật, protease bị thủy giải triệt để hơn (Tiêu Thị Ngọc Thảo và ctv, 2008)

2.2.7 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của protease

+ Ảnh hưởng của nhiệt độ

Protease vi khuẩn hoạt động thích hợp trong khoảng nhiệt độ 30 – 50oC Đa số protease hoạt động mạnh nhất ở nhiệt độ 40oC Tuy nhiên, một số protease của một vài chủng vi khuẩn có nhiệt độ hoạt động thích hợp cao hơn Nhiệt độ hoạt động thích hợp của một protease vi khuẩn không cố định mà có thể thay đổi tùy theo cơ chất, môi trường, thời gian tác dụng

Ở nhiệt độ cao hơn, hoạt động của protease giảm vì nhiệt độ cao làm hỏng cấu trúc enzyme Nhiệt độ mà protease bị mất hoàn toàn hoạt độ gọi là nhiệt độ tới hạn Ngược lại, ở nhiệt độ dưới 0oC đa số protease của vi khuẩn bị giảm hoạt tính nhưng không bị mất hoạt độ Do đó, hoạt động của protease có thể tăng lên khi tăng nhiệt độ Tuy nhiên, cũng có một số protease bị mất hoạt độ trong quá trình làm đông khô

+ Ảnh hưởng của pH

Hoạt độ protease phụ thuộc rõ rệt vào pH môi trường Đó là vì pH môi trường ảnh hưởng đến mức độ ion hóa của cơ chất, trung tâm hoạt động của protease, phức chất protease – cơ chất và ảnh hưởng đến độ bền của protease

Đa số protease vi khuẩn bền ở pH trung tính 6,2 – 7,4 pH thích hợp cho hoạt động của nhiều protease gần bằng 7 Điều đáng lưu ý là pH thích hợp cho hoạt động của protease ở ngoài tế bào không nhất thiết phải trùng với pH môi trường bên trong tế bào

+ Ảnh hưởng của thời gian hoạt động của enzyme

Thời gian hoạt động của protease vi khuẩn phụ thuộc độ bền hoạt tính của protease Thông thường hoạt tính của protease có thể giữ được trong khoảng từ 60 đến

80 giờ, tuy nhiên hoạt tính protease sẽ giảm dần Protease chỉ hoạt động mạnh trong

khoảng thời gian xác định tùy loài vi khuẩn Ví dụ: protease do B subtilis tổng hợp

hoạt động tốt nhất trong khoảng 46 – 68 giờ

+ Ảnh hưởng của bản chất protease

Các protease cố định thường có hoạt độ cao hơn các protease tự do Điều này là

vì các protease cố định ít chịu ảnh hưởng của các chất khác trong dung dịch môi trường nuôi cấy

Tóm lại, các protease cố định bền với các yếu tố gây biến tính hơn so với các protease hòa tan

+ Ảnh hưởng của độ bền hoạt tính của protease

Trong công nghiệp enzyme, người ta luôn luôn chú ý đến yếu tố quan trọng khác bên cạnh hoạt độ protease vi sinh vật đó là độ bền hoạt tính của protease

Các metallo protease bền trong phạm vi pH 6 – 9 và bị mất hoạt độ nhanh chóng khi thay đổi pH ngoài phạm vi này

Thêm canxi vào môi trường làm tăng độ bền của các enzyme Canxi có tác dụng giữ vững cấu trúc không gian thích hợp cho hoạt động xúc tác của các metallo protease Ngoài ra, canxi còn có vai trò ngăn ngừa tác dụng tự phân hủy của các enzyme này Và canxi cũng có tác dụng làm bền metallo protease đã mất kẽm Tác

dụng làm bền của canxi cũng thể hiện rõ đối với Thermolysin

- Các acid protease

Khá bền trong phạm vi pH acid (từ 2 – 6) Trong môi trường acid các protease này khá bền với nhiệt (Tiêu Thị Ngọc Thảo và ctv, 2008)

2.3 Ứng dụng của protease

Hiện nay, protease đã được ứng dụng rộng rãi trong khá nhiều lĩnh vực như: xử

lý rác, công nghiệp, nông nghiệp, y dược, thực phẩm, sản xuất mỹ phẩm, nghiên cứu khoa học

2.3.1 Trong thực phẩm

Trong chế biến thực phẩm, protease được sử dụng khá phổ biến

Protease được sử dụng trong quá trình chế biến cá Ở mang cá và đặc biệt là ở ruột cá thì hệ vi sinh vật rất phong phú Khi làm nước mắm, muối cá, sản xuất bột cá, thì protease có trong ruột và mang cá thủy phân một phần protein của cá

Protease được sử dụng để làm mềm thịt và tăng hương vị thịt sau khi chế biến Việc sử dụng trong chế biến làm mềm thịt là ứng dụng có tính truyền thống Từ rất lâu, người ta đã biết sử dụng thơm để nấu canh thịt bò; dùng rau sống lá chuối chát, và kết hợp thức ăn nhiều thịt; đu đủ trong chống táo bón… mà thực chất là sử dụng papain, bromelain, fixin Người Nga còn dùng protease từ hạt đậu tương nảy mầm để làm mềm thịt

Người ta cũng sử dụng protease để sản xuất các dịch đạm thủy phân từ các phế liệu giàu protein như thịt vụn, đầu, da cá và để sản xuất thức ăn kiêng

Một số protease có khả năng làm đông tụ sữa trong sản xuất phomat Protease làm phomat nhanh chín, nâng cao chất lượng và có thể tạo ra nhiều loại phomat khác nhau Protease của vi khuẩn có thể thay thế một phần renin Vì thế, ta có thể giảm giá thành sản xuất phomat

Ngoài ra, người ta còn dùng protease vi khuẩn để thu casein dùng trong các ngành kỹ thuật khác nhau như: vecni, chất màu, hương liệu Protease cũng được dùng trong sản xuất chao và các dịch thủy phân

2.3.2 Trong y dược

Người ta đã sản xuất các chất hoạt hóa và kìm hãm protease để điều trị các bệnh đặc trưng Protease được sử dụng để sản xuất các thuốc tăng khả năng tiêu hóa protease cho những người bị tiêu hóa kém do dạ dày, tụy tạng hoạt động không bình

thường, thiếu enzyme Protease được dùng để phân hủy các cục máu đông trong cơ thể, chữa bệnh nghẽn tĩnh mạch Protease được dùng để làm tiêu mủ ở các vết thương, những chỗ bị viêm, làm thông đường hô hấp

2.3.3 Trong công nghiệp sản xuất nước giải khát

Protease được sử dụng trong sản xuất bia và nước quả Ngoài ra, protease cũng được sử dụng trong sản xuất rượu Trong đó protease sẽ phân giải các protein có tác dụng kìm hãm amylase, do đó sẽ làm tăng quá trình đường hóa tinh bột

2.3.4 Trong nông nghiệp

Trong nông nghiệp, protease được sử dụng để xử lý nhằm tận dụng các phế liệu giàu protein làm thức ăn cho động vật nuôi, nhằm tăng khả năng tiêu hóa thức ăn và hệ

số sử dụng thức ăn Có thể tiến hành việc này bằng cách thêm trực tiếp protease vào thức ăn gia súc trước khi dùng hoặc dùng protease để sử lý sơ bộ thức ăn gia súc

2.3.5 Trong xử lý rác

Một vấn đề cấp bách dặt ra cho các đô thị lớn hiện nay là vần đề rác thải Đây là nguồn gốc lây lan chủ yếu của bệnh tật Trong rác thải, vi khuẩn thương hàn có thể tồn tại đến 115 ngày Các hợp chất của các ngành công nghiệp độc hại cùng tất cả rác thải lắng đọng lại đã ngấm vào đất, gây ô nhiễm môi trường và làm ảnh hưởng đến sức khỏe của cộng đồng xung quanh

Hiện nay, một trong những biện pháp tốt để xử lý rác có hiệu quả và kinh tế nhất là biến chúng thành phân bón hữu cơ, giá thể trồng nấm, nuôi giun, nuôi trùn… Việc sản xuất phân bón hữu cơ từ rác nhờ vi sinh vật là một giải pháp có thể thực hiện được trong điều kiện nước ta hiện nay

Người ta sẽ vận dụng quá trình phân hủy chất hữu cơ dưới tác dụng của các vi sinh vật Nguồn vi sinh vật có hoạt tính protease hiện hữu khá phong phú trong tự nhiên Ta có thể sử dụng các vi sinh vật này để phân hủy nguồn protein thực vật và động vật có trong rác hữu cơ

Một số vi sinh vật có thể phân hủy triệt để protein tạo thành các sản phẩm đơn giản có chứa nitrogen hoặc không nitrogen như: indole, scatole, phenol, acid béo, NH3,

CH4, CO2, O2

Tóm lại, protease vi khuẩn giữ vai trò quan trọng trong cuộc sống con người Các nhà khoa học ngày càng khám phá ra nhiều công dụng của protease vi khuẩn Protease là những nhà máy xử lý rác hữu cơ khổng lồ với công suất cực lớn Protease còn thường xuyên cung cấp một lượng lớn dưỡng chất cho đất – chủ yếu là các chất đạm mà thực vật dễ sử dụng Có thể nói protease là một nhân tố quan trọng và tích cực trong việc giải quyết nạn ô nhiễm môi trường

2.4 Tổng quan về quá trình sấy

2.4.1 Bản chất quá trình sấy

Sấy là sự bốc hơi nước của sản phẩm bằng nhiệt ở nhiệt độ bất kỳ, là quá trình khuếch tán do chênh lệch ẩm ở bề mặt và bên trong vật liệu, hay nói cách khác do chênh lệch áp suất hơi riêng phần ở bề mặt vật liệu và môi trường xung quanh (Trần Nguyễn Hạ Trang và Trương Vĩnh, 2005)

Trong quá trình sấy vật liệu sấy sẽ được làm khô đến một độ ẩm nào đó nhờ quá trình truyền nhiệt từ tác nhân sấy thường là chất khí Sản phẩm sau khi sấy đã sẵn sàng cho việc đóng gói

Vật liệu sấy có nhiều dạng như hạt rời, kết tinh, tinh bột, bột tấm, thanh, … và bản chất khác nhau Tùy theo vật liệu mà cơ chế bốc hơi có thể là do sự khuếch tán chất lỏng, sự khuếch tán hơi, sự mao dẫn và gradient nhiệt độ Nước từ bên trong vật liệu vừa bốc hơi ở bề mặt vừa di chuyển từ bên trong ra bên ngoài và nhiệt được truyền từ tác nhân vào bên trong vật liệu

Trong quá trình sấy xảy ra các quá trình trao đổi nhiệt và trao đổi chất như sau:

- Quá trình truyền nhiệt từ chất tải nhiệt cho vật sấy

- Quá trình truyền ẩm từ trong vật sấy ra ngoài bề mặt vật sấy

- Quá trình truyền ẩm từ bề mặt vật sấy vào môi trường

Các quá trình truyền nhiệt, truyền chất trên xảy ra đồng thời trên vật sấy, chúng

có ảnh hưởng qua lại lẫn nhau (Lê Thanh Quang và Trương Vĩnh, 2004)

2.4.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến tốc độ sấy

- Bản chất của vật liệu sấy: cấu trúc, thành phần hóa học, đặc tính liên kết ẩm

- Hình dạng vật liệu sấy: kích thước mẫu sấy, bề dày lớp vật liệu Diện tích bề mặt riêng của vật liệu càng lớn thì tốc độ sấy càng nhanh

- Độ ẩm đầu, độ ẩm cuối và độ ẩm tới hạn của vật liệu

- Độ ẩm, nhiệt độ và tốc độ của tác nhân sấy Độ ẩm tác nhân tăng thì thời gian sấy kéo dài, làm giảm cường độ sấy và độ ẩm tới hạn thứ nhất của vật liệu (là độ ẩm cuối của giai đoạn sấy đẳng tốc) Nhiệt độ tác nhân có ảnh hưởng trực tiếp đến thời gian sấy, cường độ sấy và ẩm độ tới hạn thứ nhất của vật liệu Nhiệt độ tác nhân sấy càng lớn thì thời gian sấy càng ngắn Nhiệt độ tác nhân tăng thì cường độ sấy tăng, đồng thời làm tăng điểm tới hạn thứ nhất

- Cấu tạo thiết bị sấy, phương thức và chế độ sấy

- Chênh lệch giữa nhiệt độ đầu và nhiệt độ cuối của tác nhân sấy (Trần Nguyễn

Hạ Trang và Trương Vĩnh, 2005)

- Ảnh hưởng của chế độ sấy đến động học quá trình Động học nhằm nghiên cứu sự biến đổi hàm ẩm (độ ẩm) và nhiệt độ trung bình của vật liệu theo thời gian sấy Hai hàm này được xác định bởi tính chất hóa lý của vật liệu Trường hàm ẩm và trường nhiệt độ được xác định bởi các quy luật truyền vận ẩm và nhiệt độ bên trong vật liệu cũng như sự trao đổi nhiệt ẩm với môi trường xung quanh Chế độ sấy (nhiệt

độ và tốc độ sấy của tác nhân) không những ảnh hưởng đến thời gian sấy mà còn ảnh hưởng đến chất lượng của vật liệu ẩm Vì vậy, cần tìm chế độ sấy thích hợp sao cho thời gian sấy ngắn nhất, tiêu tốn năng lượng ít nhất, đồng thời thu được các sản phẩm

có tính chất công nghệ tốt nhất (Lê Thanh Quang và Trương Vĩnh, 2004)

2.5 Giới thiệu về mực ống và phế phẩm từ mực ống

2.5.1 Giới thiệu chung

Theo thống kê, ở vùng biển Việt Nam có tới 25 loài mực ống (mực lá), thuộc bộ

Teuthoidea Đa số mực ống sống ở độ sâu <100 m, tập trung nhiều nhất ở vùng nước

sâu khoảng 30 – 50 m Ngoài ra còn có một số loài thường sống ở các vùng biển khơi với độ sâu >100 m

Mực ống là động vật nhạy cảm với biến đổi của điều kiện thủy văn, thời tiết và ánh sáng nên sự di chuyển theo mùa, ngày và đêm Ban ngày khi nước bề mặt bị ánh sáng mặt trời nung nóng, làm nhiệt độ nước tăng lên, mực ống thường lặn xuống dưới đáy hoặc lớp nước tầng dưới Ban đêm, khi nhiệt độ nước bề mặt giảm đi thì mực ống lại di chuyển lên bề mặt

Trong các tháng mùa khô (tháng 12 đến tháng 3 năm sau), mực ống di chuyển đến các vùng nước nông hơn, ở độ sâu <30 m Trong các tháng mùa mưa (tháng 6 đến tháng 9), mực ống di chuyển đến các vùng nước sâu 30 – 50 m

2.5.2 Vùng phân bố

Ở phía Bắc, mực ống tập trung ở các vùng chính là quanh đảo Cát Bà, Cái Chiên, Cô Tô, Hòn Mê – Hòn Mát và khu vực Bạch Long Vĩ, nhất là vào mùa xuân

Ở phía Nam, mực ống tập trung chủ yếu ở Phan Rang, Phan Thiết, Vũng Tàu,

Cà Mau và quanh Côn Đảo, Phú Quốc

2.5.3 Sản lượng khai thác

Hàng năm, sản lượng khai thác mực ống trên cả nước ta đạt khoảng 24.000 tấn, trong đó vùng biển Việt Nam có sản lượng cao nhất khoảng 16.000 tấn (chiếm 70%), vịnh Bắc Bộ chiếm sản lượng lớn thứ nhì, khoảng 5.000 tấn (chiếm 20%), còn biển miền Trung có sản lượng thấp nhất khoảng 2.500 tấn (10%)

2.5.4 Xuất khẩu

Mực ống của Việt Nam xuất khẩu sang hơn 30 thị trường nước ngoài, với doanh thu hàng năm đạt khoảng 50 – 60 triệu USD tính trên cả sản phẩm đông lạnh và sản phẩm khô

Sản phẩm chế biến: Đông lạnh nguyên con dưới các hình thức đông khối (Block), đông rời nhanh (IQF), hay đông lạnh semi-IQF, hoặc semi-block Các sản phẩm chế biến gồm có phi lê, cắt khoanh, tỉa hoa và được làm thành các sản phẩm chế biến sẵn để nấu, hoặc dưới dạng sản phẩm sushi, sashimi để ăn gỏi, các sản phẩm phối chế khác và chế biến ăn liền như mực nướng, mực khô nghiền tẩm gia vị

2.5.5 Một số loài mực ống thường gặp ở biển Việt Nam

¾ Mực Ống Trung Hoa

Tên tiếng Anh: Mitre Squid

Tên khoa học: Loligo chinensis Gray, 1849

Hình 2.8 Mực Ống Trung Hoa

- Đặc điểm hình thái: là loài mực ống cơ thể lớn, thân dài khoảng 350-400mm, thân hình hoả tiễn, chiều dài thân gấp 6 lần chiều rộng, đuôi nhọn, vây dài bằng 2/3 chiều dài thân Vỏ trong bằng sừng trong suốt, giữa có gờ dọc

- Vùng phân bố: Loài mực ống này sống ở tầng mặt, phân bố rộng khắp ở cả dọc bờ biển Việt Nam từ Bắc đến Nam

- Mùa vụ khai thác: quanh năm, chính vụ vào các tháng 1-3 và tháng 6-9

- Ngư cụ khai thác: câu, mành, vó, chụp kết hợp ánh sáng

- Các dạng sản phẩm: nguyên con sạch, phi lê, cắt khoanh, khô, khô tẩm gia vị

¾ Mực Ống Nhật Bản

Tên tiếng Anh: Japanese Squid

Tên khoa học: Loligo japonica Hoyle, 1885

- Đặc điểm hình thái: Thân hình đầu đạn, chiều dài thân gấp đôi khoảng 4 lần chiều rộng Bề mặt thân có các đặc điểm sắc tố gần tròn, to, nhỏ xen kẽ Chiều dài vây bằng 65% chiều dài thân

Hình 2.9 Mực Ống Nhật Bản

- Vùng phân bố: Loài mực ống này sống ở vùng biển nông và thềm lục địa Mùa hè thường vào vùng nước ven bờ <10 m nước để đẻ trứng Mực này chủ yếu phân bố ở vùng biển miền Trung và Nam bộ, đặc biệt khai thác nhiều ở vùng biển Nha Trang và Bình Thuận

- Mùa vụ khai thác: quanh năm, chính vụ vào các tháng 1-3 và tháng 6-9

- Ngư cụ khai thác: câu, mành, vó, chụp kết hợp ánh sáng

- Các dạng sản phẩm: nguyên con sạch, phi lê, cắt khoanh, khô, khô tẩm gia vị

¾ Mực Lá

Tên tiếng Anh: Bigfin reef Squid (Broad squid)

Tên khoa học: Sepioteuthis lessoniana Lesson, 1830

- Đặc điểm hình thái: là loài mực có cơ thể lớn, nhìn bề ngoài vừa giống mực nang, vừa giống mực ống Chiều dài thân 250-400mm, thân dài gấp 3 lần chiều rộng

- Vùng phân bố: Ở Việt nam, loài mực này được phân bố ở cả ba vùng biển Bắc trung Nam bộ, nhưng tập trung nhiều nhất là ở vùng Vịnh Bắc Bộ, Phú yên, Khánh Hoà, Bình Thuận

Hình 2.10 Mực Lá

- Mùa vụ khai thác: quanh năm, chính vụ vào các tháng 1-3 và tháng 6-9

- Ngư cụ khai thác: câu, mành, vó, chụp kết hợp ánh sáng

- Các dạng sản phẩm: nguyên con sạch, phi lê, cắt khoanh, khô, khô tẩm gia vị

¾ Mực Ống Thái Bình Dương

Tên tiếng Anh: Japanese flying squid

Tên khoa học: Todarodes pacificus Steenstrup, 1880

- Đặc điểm hình thái: Thân tròn, hình ống thuôn dài Vây ngắn, chiều dài vây chiếm khoảng 40% chiều dài thân Rãnh phễu dạng hố nông, không có túi bên Bông xúc giác rộng, thô, dài Các tay tua ngắn

Hình 2.11 Mực Ống Thái Bình Dương

- Vùng phân bố: loài mực này sống cả ở vùng lộng và vùng khơi, tới độ nước sâu 500m Thích nghi với phạm vi nhiệt độ 5-270C Loài này được phân bố tập trung ở vùng biển miền Trung Việt Nam

- Mùa vụ khai thác: quanh năm, chính vụ vào các tháng 1-3 và tháng 6-9

- Ngư cụ khai thác: câu, mành, vó, vây, rê kết hợp ánh sáng

- Các dạng sản phẩm: nguyên con sạch, phi lê, cắt khoanh, khô, khô tẩm gia vị (Theo Trung tâm Thông tin khoa học và kinh tế thủy sản quốc gia)

2.5.6 Phụ phẩm từ chế biến mực

Phụ phẩm mực là phần nội tạng và các phần cơ thể mực sau quá trình chế biến

mà không còn có thể sử dụng được nữa Hàng năm, lượng phụ phẩm này tăng lên nhanh chóng do ngành thủy sản ngày càng phát triển Đây là nguồn enzyme động vật quý giá với nhiều loại enzyme, những loại có hoạt tính cao là enzyme protease Hiện nay đã có rất nhiều các công trình nghiên cứu của các nhà nghiên cứu tiến hành chiết rút enzyme này từ nội tạng động vật thủy sản cũng như nội tạng mực, đặc biệt là mực ống để sử dụng cho nhiều mục đích trong thực phẩm và công nghiệp Hoạt động này

đã giải quyết một lượng lớn phụ phẩm cho ngành chế biến thủy sản – một trong các yếu tố gây ô nhiễm môi trường

Ngoài nguồn enzyme quý giá, nội tạng và phụ phẩm mực còn chứa hàm lượng protein tương đối cao Vì vậy, đây sẽ là một nguồn thu nhận đạm tương đối tốt và khá

rẻ tiền Khi sử dụng các sản phẩm từ mực để sản xuất thức ăn nuôi tôm cá sẽ góp phần vào việc tăng lượng và sức thu hút của thức ăn này Các sản phẩm từ mực cũng sẽ cho kết quả tốt hơn các hoạt động sinh lý, dẫn đến cá khỏe mạnh Do vậy, cần nghiên cứu các vấn đề cơ bản của quá trình thủy phân nội tạng và phụ phẩm mực, tiến tới hoàn