Nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc omeprazole của màng cellulose vi khuẩn lên men từ môi trường nước dừa già

Tỉ lệ phần trăm giải phóng thuốc omeprazole của các màng ở các môi trường pH khác nhau trong các khoảng thời gian khác nhau ..... Nhờ những đặc tính độc đáo trên của CV

Trang 1

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

KHOA SINH-KTNN

======

ĐẶNG THỊ YẾN

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GIẢI PHÓNG

THUỐC OMEPRAZOLE CỦA MÀNG CELLULOSE VI KHUẨN LÊN MEN

TỪ MÔI TRƯỜNG NƯỚC DỪA GIÀ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Sinh lý học người và động vật

Trang 2

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

KHOA SINH-KTNN

======

ĐẶNG THỊ YẾN

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GIẢI PHÓNG

THUỐC OMEPRAZOLE CỦA MÀNG CELLULOSE VI KHUẨN LÊN MEN

TỪ MÔI TRƯỜNG NƯỚC DỪA GIÀ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Sinh lý học người và động vật

Người hướng dẫn khoa học

TS NGUYỄN PHÚC HƯNG

Trang 3

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình hoàn thành khóa luận nghiên cứu tại Viện Nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2, em đã nhận được sự hướng dẫn và giúp đỡ tận tình của thầy cô, anh chị và các bạn Đầu tiên, với lòng trân trọng và biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Phúc Hưng, người thầy đã hướng dẫn, quan tâm, giúp đỡ em

trong suốt quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp với đề tài “Nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc Omeprazole của màng Cellulose vi khuẩn lên men từ môi trường nước dừa già”

Em cũng xin bày tỏ lời cảm ơn tới các thầy cô giáo trong khoa Sinh - KTNN cùng các thầy cô tại Viện Nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2, đã tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp của mình

Mặc dù đã có nhiều cố gắng để hoàn thành khóa luận một cách tốt nhất nhưng do bước đầu đi vào thực tế sáng tạo trong nghiên cứu khoa học, kiến thức của em còn hạn chế Do vậy không tránh khỏi những thiếu xót trong quá trình thực hiện, em rất mong nhận được sự góp ý của quý thầy cô và các bạn sinh viên để đề tài khóa luận tốt nghiệp của em được hoàn thiện hơn

Một lần nữa em xin cảm ơn sự giúp đỡ của các thầy cô, cảm ơn gia đình cùng toàn thể các bạn, đã luôn ở bên động viên, giúp đỡ và khích lệ em hoàn thành khóa luận

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, tháng 05 năm 2018

Sinh viên

Đặng Thị Yến

Trang 4

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đề tài này là của chính tôi thực hiện dưới sự hướng

dẫn của TS Nguyễn Phúc Hưng Những số liệu kết quả nghiên cứu trong khóa

luận này là trung thực và không trùng lặp hay sao chép với một đề tài nào khác

Những trích dẫn, kết quả nghiên cứu có trong khóa luận lấy từ các công bố chính

thức và có ghi chú rõ ràng

Hà Nội, tháng 05 năm 2018

Sinh viên

Đặng Thị Yến

Trang 5

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

1 Lí do chọn đề tài 1

2 Mục đích nghiên cứu 2

3 Nhiệm vụ nghiên cứu 2

4 Phạm vi nghiên cứu 2

5 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn 2

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN VỀ TÀI LIỆU 4

1.1 Giới thiệu tổng quan về đối tượng, lĩnh vực nghiên cứu 4

1.1.1 Đặc điểm phân loại của Acetobacter xylinum 4

1.1.1.1 Vị trí phân loại 4

1.1.1.2 Đặc điểm vi khuẩn Acetobacter xylinum 4

1.1.1.3 Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn A xylinum 4

1.1.2 Cấu trúc và đặc tính của màng CVK tạo bởi Acetobacter xylinum 5

1.1.2.1 Cấu trúc của màng CVK 5

1.1.2.2 Đặc tính của màng CVK 5

1.1.2.3 Sinh tổng hợp CVK 6

1.1.2.4 Môi trường nuôi cấy A xylinum 6

1.1.3 Giới thiệu tổng quan về thuốc Omeprazole 7

1.2 Giới thiệu tổng quan về tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 8

1.2.1 Trên thế giới 8

1.2.2 Ở Việt Nam 8

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 10

2.1 Vật liệu và trang thiết bị nghiên cứu 10

Trang 6

2.1.2 Vật liệu nghiên cứu 10

Các vật liệu sử dụng trong nghiên cứu được liệt kê trong bảng 2.1: 10

2.1.3 Thiết bị và dụng cụ 10

Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu như bảng 2.2: 10

2.2 Nội dung nghiên cứu 11

2.3 Phương pháp nghiên cứu 12

2.3.1 Tạo chủng vi khuẩn Acetobacter từ dịch trà xanh lên men 12

2.3.2 Phương pháp tạo màng CVK từ môi trường nước dừa già 12

2.3.3.Phương pháp xử lý màng CVK trước khi nạp Omeprazole 13

2.3.4 Đánh giá độ tinh khiết của vật liệu CVK 14

2.3.5 Phương pháp dựng đường chuẩn 15

2.3.6.Phương pháp xác định lượng thuốc hấp thụ vào màng CVK 16

2.3.7.Chuẩn bị môi trường đệm 17

2.3.8 Phương pháp xác định lượng thuốc giải phóng từ màng CVK nạp thuốc.18 2.3.9 Phương pháp đánh giá động học giải phóng của Omeprazole………… 20

2.3.10 Phương pháp xử lí số liệu thống kê……… 21

2.4 Địa điểm tiến hành nghiên cứu 21

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 22

3.1 Màng Cellulose vi khuẩn nuôi cấy từ môi trường nước dừa già 22

3.2 Thu màng CVK thô từ môi trường 23

3.4 Kết quả quét phổ và xây dựng phương trình đường chuẩn của Omeprazole 26 3.5 Màng sau khi được nạp thuốc Omeprazole 30

3.6 Lượng thuốc giải phóng từ màng CVK vào các môi trường pH 33

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40

TÀI LIỆU THAM KHẢO 40

Trang 7

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Vật liệu sử dụng trong nghiên cứu 10

Bảng 2.2 Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu 11

Bảng 2.3: Thành phần môi trường tạo màng CVK 12

Bảng 3.1 Bảng nồng độ Omeprazole giá trị OD 276nm (pH = 2) 27

Bảng 3.2 Bảng nồng độ Omeprazole giá trị OD 275nm (pH = 4,5) 28

Bảng 3.3 Bảng nồng độ Omeprazole giá trị OD 275nm (pH = 6,8) 29

Bảng 3.4 Giá trị trung bình của 3 lần đo được của màng dừa 31

hấp thụ thuốc Omeprazole 31

Bảng 3.5: Khối lượng thuốc omeprazole hấp thụ vào màng CVK 32

tại thời điểm 2h 32

Bảng 3.6 Mật độ quang khi tiến hành giải phóng thuốc trong các môi trường pH khác nhau tại các thời điểm khác nhau (n = 3) 33

Bảng 3.7 Tỉ lệ phần trăm giải phóng thuốc omeprazole của các màng ở các môi trường pH khác nhau trong các khoảng thời gian khác nhau 36

Bảng 3.8: Hệ số tương quan R2, tốc độ giải phóng thuốc (k) và trị số số mũ giải phóng (n) đối với các môi trường pH khác nhau 38

Trang 8

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1: Sơ đồ tinh chế màng CVK 13

Hình 2.2 Chuẩn bị môi trường đệm ở pH 2; 4,5; 6,8 18

Hình 2.3 Chuẩn bị điều kiện cho giải phóng máy khuấy từ 50 vòng/phút và ở nhiệt độ 37°C 19

Hình 3.1 Màng CVK được nuôi cấy trong môi trường nước dừa già 23

Hình 3.2 Thu màng CVK thô ở các khoảng thời gian khác nhau 24

Hình 3.4 Màng đã được tinh chế và kiểm tra độ tinh sạch 26

Hình 3.5 Biểu đồ biểu diễn đường chuẩn của Omeprazole ở pH 2 27

Hình 3.6 Biểu đồ biểu diễn đường chuẩn của Omeprazole ở pH 4,5 28

Hình 3.7 Biểu đồ biểu diễn đường chuẩn của Omeprazole ở pH 6,8 30

Hình 3.8 Mật độ quang phổ của màng CVK - Omeprazole trong các độ dày, thời gian và môi trường pH khác nhau 35

Hình 3.9 Đồ thị biểu diễn tỉ lệ giải phóng thuốc từ màng CVK 37

Trang 9

MỞ ĐẦU

1 Lí do chọn đề tài

Cellulose vi khuẩn (viết tắt là CVK) là sản phẩm của một số loài vi khuẩn,

đặc biệt là chủng Acetobacter xylinum [2, 4] Màng sinh học (CVK) có cấu trúc

và đặc tính rất giống với cellulose của thực vật (gồm các phân tử glucose liên kết với nhau bằng liên kết β - 1,4 glucozit) Nhưng cellulose vi khuẩn cũng khác với cellulose thực vật ở chỗ: không chứa các hợp chất cao phân tử như ligin, hemicellulose, peptin và sáp nến do vậy chúng có những đặc tính vượt trội với độ dẻo dai, bền chắc, có khả năng hút nước cao ở trạng thái ẩm và độ tinh khiết cao [2,5] Trên thế giới màng Cellulose vi khuẩn đã được ứng dụng nhiều trong các lĩnh vực công nghệ như dùng làm màng phân tách cho quá trình xử lí nước, chất mang đặc biệt cho các pin và năng lượng cho tế bào, dùng làm chất biến đổi độ nhớt trong sản xuất các sợi truyền quang, làm môi trường cơ chất trong sinh học, thực phẩm hay thay thế thực phẩm [7] Đặc biệt trong lĩnh vực y học, màng CVK đã được ứng dụng làm da tạm thời thay thế da trong quá trình điều trị bỏng [3, 4], loét da, làm mạch máu nhân tạo điều trị các bệnh tim mạch, làm mặt nạ dưỡng da cho con người Ở Việt Nam, việc nghiên cứu và ứng dụng màng CVK còn ở mức độ khiêm tốn, các nghiên cứu ứng dụng mới chỉ dừng lại bước đầu nghiên cứu

Omeprazole được dùng để điều trị các rối loạn về dạ dày và thực quản (như trào ngược axit, viêm loét) Thuốc hoạt động bằng cách làm giảm lượng axit do dạ dày tiết ra Thuốc giúp làm giảm các triệu chứng như ợ nóng, khó nuốt và ho dai dẳng Thuốc giúp chữa lành tổn thương dạ dày và thực quản do axit, giúp ngăn ngừa các vết loét, và có thể giúp ngăn ngừa ung thư thực quản Omeprazole thuộc nhóm thuốc ức chế bơm proton (PPI)

Trang 10

Nhờ những đặc tính độc đáo trên của CVK nhằm tăng khả năng hấp thụ thuốc có kiểm soát, tăng khả dụng sinh học của thuốc Omeprazole trong điều trị

bệnh, chúng tôi quyết định chọn đề tài: “Ngiên cứu khả năng giải phóng thuốc

omeprazole của màng cellulose vi khuẩn lên men từ môi trường nước dừa già”

2 Mục đích nghiên cứu

- Thiết kế hệ thống màng CVK được lên men từ môi trường nước dừa già

- Nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc Omeprazole của màng CVK lên men từ môi trường nước dừa già

- Sử dụng màng để bảo vệ thuốc Omeprazole tránh tác nhân gây ảnh hưởng tới thuốc trong quá trình sử dụng

3 Nhiệm vụ nghiên cứu

- Tạo màng và xử lí màng CVK lên men từ môi trường nước dừa già

- Thiết kế, chế tạo màng CVK nạp thuốc Omeprazole

- Nghiên cứu khả năng giải phóng Omeprazole từ hệ thống CVK đã được nạp thuốc ở môi trường pH khác nhau, định hướng sử dụng

Trang 11

ở việc khắc phục hạn chế của thuốc này mà còn có thể ứng dụng trên nhiều các loại thuốc khác nữa giúp cho ngành y học ngày một phát triển hơn Bên cạnh đó ta cũng có thể tìm ra được những ưu nhược điểm của màng CVK để từ đó có những hướng nghiên cứu làm tăng các đặc tính của màng CVK, hạn chế các yếu điểm của màng để ứng dụng màng trên nhiều lĩnh vực khác nhau

5.2 Ý nghĩa thực tiễn

+ Xây dựng được quy trình tạo màng CVK từ chủng Acetobacter xylinum

+ Từ màng CVK đã được tạo ra được dùng để nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc nhằm khắc phục được những tác dụng phụ không mong muốn trong việc điều trị rối loạn dạ dày và thực quản bằng thuốc Omeprazole

+ Từ kết quả nghiên cứu được có thể áp dụng vào thực tiễn

Trang 12

NỘI DUNG CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN VỀ TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu tổng quan về đối tượng, lĩnh vực nghiên cứu

1.1.1 Đặc điểm phân loại của Acetobacter xylinum

1.1.1.1 Vị trí phân loại

A xylinum thuộc nhóm vi khuẩn Acetic, chi Acetobacter, họ

Pseudomonadaceae

Là loại hiếu khí bắt buộc, có chu mao và sản xuất cellulose ngoại bào

Theo khóa phân loại của Bergey, A xylinum thuộc:

+ Lớp: Schizomycetes

+ Bộ: Pseudomonadales

+ Bộ phụ: Pseudomonadieae

+ Họ: Pseudomonadaceae

1.1.1.2 Đặc điểm vi khuẩn Acetobacter xylinum

A xylinum có dạng hình que, thẳng hay hơi cong, kích thước ngang khoảng

0,6 - 0,8µm, dài khoảng 2 - 3µm, vi khuẩn không sinh bào tử, gram âm, không di động, sắp xếp riêng rẽ đôi khi xếp thành chuỗi Nhưng khi tế bào già hay do điều kiện môi trường nuôi cấy, hình dạng có thể bị biến đổi: tế bào dài hơn, phình to

ra, phân nhánh hoặc không phân nhánh

Trong môi trường nuôi cấy rắn, sau khoảng từ 3 – 7 ngày nuôi cấy, sẽ thu được khuẩn lạc nhỏ rồi lớn dần, đường kính hạt từ 2 – 5mm, tròn, nhày, rìa mép trơn, có màu kem, hơi trong Nhưng sau một tuần khuẩn lạc to, đục, có màu cafe sữa rồi khô dần

1.1.1.3 Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn A xylinum

Trang 13

A xylinum là loài vi khuẩn hiếu khí Nhiệt độ tối ưu cho vi khuẩn phát triển

từ 25 – 300C, ở 370C tế bào sẽ bị suy thoái hoàn toàn và nhiệt độ thích hợp nhất là 250C Vi khuẩn tăng trưởng trong khoảng pH từ 3 - 8, pH tối ưu để sản xuất cellulose là 5,5

A xylinum sử dụng cacbon từ nhiều loại đường khác nhau Tùy thuộc vào

chủng mà lượng đường có thể thay đổi, nhưng đường hay được sử dụng và cho hiệu suất cao là: glucose, fructose, manitol, sorbitol, nguồn đường cho hiệu suất thấp hơn là glycerol, galactose, sucrose, maltose

Khi nuôi cấy, để tránh nhiễm các loài vi khuẩn lạ, người ta thường bổ sung acid acetic vào môi trường

Trong môi trường nuôi cấy lỏng, vi khuẩn sử dụng đường để chuyển hóa thành cellulose tạo lớp màng dày trên bề mặt của môi trường Sau 36 – 48h lớp màng dày, trong và đạt đến độ dày nhất định sau 7 – 19 ngày

1.1.2 Cấu trúc và đặc tính của màng CVK tạo bởi Acetobacter xylinum

1.1.2.1 Cấu trúc của màng CVK

Cellulose vi khuẩn cấu tạo bởi những chuỗi polimer β - 1,4 glucopyranose không phân nhánh Những nghiên cứu đã cho thấy cấu trúc hóa học cơ bản của CVK giống cellulose của thực vật (plant cellulose – PC), tuy nhiên chúng khác nhau về cấu trúc đại thể [7]

Theo AJ Brown (1886), CVK gồm nhiều sợi siêu nhỏ có bản chất là hemicellulose, đường kính 1,5nm, kết hợp với nhau thành bó, nhiều bó hợp thành dãy, mỗi dãy dài khoảng 100nm, rộng khoảng 3 - 8nm

1.1.2.2 Đặc tính của màng CVK

Trong nuôi cấy tĩnh, CVK tích lũy trên bề mặt môi trường dinh dưỡng lỏng thành lớp màng mỏng như da, sau khi tinh chế và làm khô tạo thành sản phẩm

Trang 14

tương tự như giấy da với độ dày 0,01 – 0,5nm Sản phẩm này có những tính chất rất đặc biệt như: độ tinh sạch cao, khả năng đàn hồi tốt, độ kết tinh và độ bền cơ học cao, có thể bị phân hủy sinh học, bề mặt tiếp xúc lớn hơn gỗ thường, không độc và không gây dị ứng, có khả năng chịu nhiệt tốt, đặc biệt là khả năng cản khuẩn Với các tính chất này CVK được ứng dụng rất nhiều trong các ngành công nghiệp khác nhau trong đó có y học

1.1.2.3 Sinh tổng hợp CVK

Quá trình lên men:

- Pha sinh trưởng

- Pha tích tụ sản phẩm

- Quá trình tổng hợp cellulose của A xylinum

1.1.2.4 Môi trường nuôi cấy A xylinum

Môi trường nuôi cấy A xylinum là môi trường tổng hợp từ các nguồn dinh

dưỡng cần thiết như nguồn cacbon, nito, nguồn sulfur và phospho, các yếu tố tăng trưởng và các yếu tố vi lượng

Nhu cầu sử dụng đường của A xylinum là rất lớn và giữ vai trò quan trọng

trong quá trình tổng hợp CVK nên có rất nhiều nghiên cứu và đề nghị sử dụng các sản phẩm thứ cấp trong các ngành công nghiệp khác như: rỉ đường, nước dừa

già, nước mía để làm nguyên liệu trong nuôi cấy A xylinum Trong đó nước dừa già được xem là môi trường điển hình trong nuôi cấy A xylinum

Nước dừa già là môi trường thích hợp để nuôi cấy vi khuẩn do trong nước dừa chứa rất nhiều chất dinh dưỡng và chất kích thích tăng trưởng như 1,3 -

diphenyllurea, hexitol, cytolunin, myoinositol, sorbitol, Vì vậy, A xylinum rất

thích hợp phát triển trong môi trường này

Nước dừa sau khi thu hoạch được sử dụng không quá 3 ngày, tránh để lâu

Trang 15

làm cho đường và các chất dinh dưỡng khác giảm đi dẫn đến cho hiệu suất kém

1.1.3 Giới thiệu tổng quan về thuốc Omeprazole

Nhóm dược lí: Thuốc đường tiêu hóa

Tên biệt dược: Abacid, Bicasan, Drivo

Dạng bào chế: viên nang; viên nén bao phim; viên nén; bột pha dung dịch tiêm

Thành phần: Omeprazole

Công thức hóa học:

Công thức phân tử: C17H19N3O3S [1]

Tên khoa học: 5-methoxy-2-[4 methoxy-3,5 dimethyl-2 pyridinyl methyl sulfinyl] -1H-benzimidazole [1]

Trọng lượng phân tử: 345,4

Tính chất: Bột trắng hoặc gần như trắng Rất khó tan trong nước, tan trong dicloromethan, hơi tan trong ethanol 96% và methanol, tan trong dung dịch kiềm loãng [1]

Dược lực: Omeprazole là chất ức chế đặc hiệu tác dụng bằng cách khóa hệ thống enzyme của Hydrogen-potassium Adenosine Triphosphatase, cũng gọi là bơm proton H+ K+ ATPase của tế bào thành dạ dày

Dược động học: Omeprazole bị hủy trong môi trường acid, nên thuốc ở dưới dạng viên bao không tan ở dạ dày chỉ hấp thụ ở tá tràng, ruột non [16]

Trang 16

Thuốc bắt đầu tác dụng 1 giờ sau uống, đạt đỉnh cao nồng độ huyết tương sau 2 giờ, và sự hấp thụ hoàn toàn sau 3 giờ đến 6 giờ

Omeprazole bị sinh biến đổi ở gan Các chất chuyển hóa không hoạt tính trong huyết tương là sulfon, sulfua, hydroxyl omeprazole 80% các chất chuyển hóa bài tiết trong nước tiểu, 20% bài thải theo phân

Thuốc Omeprazole chỉ định: loét tá tràng tiến triển, loét dạ dày tiến triển, viêm thực quản do hồi lưu dạ dày - thực quản, hội chứng Zollinger - Ellison [1, 12]

Liều tiêu chuẩn: 20mg/ ngày

Tác dụng phụ: thuốc dung nạp tốt Các triệu chứng như buồn nôn, nhức đầu, đầy hơi và táo bón rất hiếm Thỉnh thoảng có ban da nhưng biểu hiện này thường nhẹ và chóng hết

1.2 Giới thiệu tổng quan về tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

1.2.1 Trên thế giới

Trên thế giới màng Cellulose vi khuẩn đã được ứng dụng rất nhiều trong các lĩnh vực công nghệ khác nhau: như dùng làm màng phân tách cho quá trình xử lí nước, chất mang đặc biệt cho các pin và năng lượng cho tế bào, dùng làm chất biến đổi độ nhớt trong sản xuất các sợi truyền quang, làm môi trường cơ chất trong sinh học, thực phẩm hay thay thế thực phẩm Đặc biệt trong lĩnh vực y học, màng CVK đã được ứng dụng làm da tạm thời thay thế da trong quá trình điều trị bỏng, loét da, làm mạch máu nhân tạo điếu trị các bệnh tim mạch; làm mặt nạ dưỡng da cho con người

1.2.2 Ở Việt Nam

Trang 17

Ở Việt Nam, việc nghiên cứu và ứng dụng màng CVK còn ở mức độ khiêm tốn, các nghiên cứu ứng dụng mới chỉ dừng lại bước đầu nghiên cứu Các kết quả ứng dụng của màng CVK hầu như mới chỉ dừng lại ở điều kiện thí nghiệm Trong những năm gần đây phòng thí nghiệm Thực vật - Vi sinh Trường Đại

học Sư phạm Hà Nội 2 phân lập tuyển chọn được chủng A xylinum BHN có khả

năng tạo màng CVK và những nghiên cứu bước đầu cho thấy màng CVK từ

chủng A xylinum BHN có khả năng ứng dụng cho trị bỏng cho thỏ là cơ sở để

tạo ra màng trị bỏng cho người [2, 3]

Mong muốn khắc phục được những tác dụng phụ của thuốc Omeprazole trong chữa bệnh viêm loét dạ dày, nâng cao tối đa hiệu quả của thuốc mà tiết kiệm được chi phí Màng CVK có thể tự sản xuất trong nước từ những nguồn nguyên liệu dễ kiếm và giá thành thấp, có những đặc tính phù hợp trong việc nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc Omeprazole

Trang 18

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu và trang thiết bị nghiên cứu

2.1.1 Chủng vi sinh

Vi khuẩn tạo Cellulose từ dịch trà xanh lên men [5, 9, 11] được nuôi cấy tại Phòng sạch Vi sinh - Động vật, Viện Nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng, Trường ĐHSP Hà Nội 2

2.1.2 Vật liệu nghiên cứu

Các vật liệu sử dụng trong nghiên cứu được liệt kê trong bảng 2.1:

Bảng 2.1 Vật liệu sử dụng trong nghiên cứu

2 Nước dừa già

10 Nước cất 2 lần Viện NCKH và UD trường

Đại học Sư phạm HN 2

12 Kali dihidrophotphat Trung Quốc

2.1.3 Thiết bị và dụng cụ

Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu như bảng 2.2:

Trang 19

Bảng 2.2 Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu Thiết bị Nước sản xuất Địa điểm nghiên cứu

Nồi hấp khử trùng

HV-110/HIRAIAMA

ĐHSP Hà Nội 2 Máy đo quang phổ UV-

ĐHSP Hà Nội 2 Tủ sấy, tủ ấm Binder - Đức Viện NCKH&ƯD Trường

Viện NCKH&ƯD Trường ĐHSP Hà Nội 2

Tủ lạnh Daewoo, tủ

lạnh sâu

Viện NCKH&ƯD Trường ĐHSP Hà Nội 2

- Bình tam giác có chia vạch, ống nghiệm, cốc đong thủy tinh có chia vạch, bình thủy tinh, lọ penicilin, đèn cồn, kẹp gỗ, thước, gạc vô trùng, giấy lọc, giấy bạc và các dụng cụ hóa sinh thông dụng

2.2 Nội dung nghiên cứu

- Tạo màng CVK từ vi khuẩn A xylinum

Trang 20

- Xử lí màng CVK thô để thu được CVK tinh chế

- Cho màng CVK nạp thuốc Omeprazole

- Nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc Omeprazole từ hệ thống đã làm,

từ đó chọn ra hệ thống màng cho khả năng giải phóng thuốc chậm nhất

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Tạo chủng vi khuẩn Acetobacter từ dịch trà xanh lên men

Đun sôi 1000ml nước, bổ sung 20g trà xanh để trong thời gian 10 - 15 phút Sau đó lọc lấy dịch trà đổ vào bình thủy tinh sạch, thêm 100g đường khuấy đều, để nguội Sau 7 – 10 ngày ở nhiệt độ 30oC thu được dịch trà đường lên men

(chứa vi khuẩn Acetobacter: Acetobacter xylinum, Acetobacter ketogenum, )

[5, 9, 11] và miếng thạch nổi lên trên bề mặt

2.3.2 Phương pháp tạo màng CVK từ môi trường nước dừa già

A xylinum được nuôi cấy trong môi trường cải biến từ môi trường chuẩn

Hestrin - Schramm và được trình bày ở bảng 2.3 dưới đây:

Bảng 2.3: Thành phần môi trường tạo màng CVK

Trang 21

2.3.3.Phương pháp xử lý màng CVK trước khi nạp Omeprazole

Sau khi ủ tĩnh trong 6 - 14 ngày ở 26°C, màng CVK được nhúng vào nước cất, và sau đó các màng CVK được tinh chế bằng cách rửa nhiều lần theo quy trình được thể hiện ở sơ đồ hình 2.1 dưới đây:

- Ngâm HCl: Màng sau khi được ngâm bằng NaOH rửa nước cất 2 lần rồi ép màng, sau đó ngâm với HCl 3% khoảng 48h để trung hòa hết NaOH

Ép loại nước Tách màng CVK thô

Ngâm trong NaOH 3%

Hấp trong nồi hấp

48h, rửa và ép

Ngâm trong nước

CVK tinh chế

48h, kiểm tra tạp chất 113℃, 1 giờ

Trang 22

- Ngâm nước: Màng sau khi ngâm với HCl rửa sạch bằng nước cất 2 lần rồi ép màng Ngâm nước cất 2 lần để trung hòa hết acid trong khoảng 48h ta thu được Cellulose vi khuẩn tinh chế [4]

2.3.4 Đánh giá độ tinh khiết của vật liệu CVK

Nhằm đảm bảo cho vật liệu CVK sau khi xử lý đã loại được các tạp chất có thể gây độc hại Sử dụng đường glucose và protein của vi khuẩn là chất để khảo sát

* Tìm sự hiện diện của glucose trong CVK tinh chế

Nguyên tắc: + Dùng thuốc thử Fehling mới pha để phát hiện sự hiện

diện của đường D - glucose, nếu có sẽ xuất hiện kết tủa nâu đỏ [3]

Tiến hành:

+ Dịch thử của vật liệu CVK các loại sau khi đã xử lý hóa học

+ Mẫu đối chứng là nước cất và dung dịch D – glucose

+ Cho vào các ống nghiệm chứa mẫu thử mỗi ống nghiệm 1ml thuốc thử

Fehling rồi ngâm trong cốc nước nóng

+ Quan sát màu sắc kết tủa xuất hiện trong ống nghiệm

*Tìm sự hiện diện của protein trong vật liệu CVK tinh chế

Nguyên tắc: Định tính protein còn lại trong màng bằng phản ứng tạo kết tủa

của protein với acid triclor acetic

Tiến hành: + CVK tinh chế được cắt nhỏ, cho vào 50ml nước cất, lắc kỹ

với máy rung siêu âm trong 10 phút

+ Dùng dung dịch acid triclor acetic 1% để phát hiện sự hiện diện của protein trong dịch chiết màng

+ Mẫu chứng âm là nước cất và mẫu chứng dương là dung dịch pepton 1% (pepton đã sử dụng để nuôi cấy vi khuẩn)

Trang 23

+ Phản ứng dương tính khi cho kết tủa đục So sánh với mẫu chứng âm

không chứa protein [3]

Vật liệu CVK tinh chế dùng để tạo màng nạp thuốc phải đạt được những tính chất sau:

+ Cảm quan: mềm mại, dẻo dai, mỏng, có khả năng áp sát vào da, có tính che phủ tốt

+ Độ ẩm thích hợp, có khả năng hút nước và dịch mô

2.3.5 Phương pháp dựng đường chuẩn

Nguyên lí: Sử dụng máy đo quang phổ tử ngoại UV - 2450 đo mật độ quang phổ (OD) của Omeprazole ở các nồng độ khác nhau với bước sóng 275nm

Máy quang phổ bao gồm hệ thống quang học có khả năng cung cấp ánh sáng đơn sắc trong dải từ 200 – 800nm Và có hai cuvet đo dùng cho dung dịch thử và dung dịch đối chiếu được làm từ chất liệu thạch anh, dung sai về độ dài quang trình của cốc đo là ±0,005cm Các cuvet đo được làm sạch và thao tác thận trọng [1]

Thực hiện:

+ Chuẩn bị dung dịch mẫu trắng: NaOH 0,1N

+ Chuẩn bị dung dịch mẫu chuẩn chứa thuốc Omeprazole ở các nồng độ (mg/ml) khác nhau: 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50% mg/ml trong dung môi NaOH 0,1N

+ Để kết quả đo có độ chính xác cao tiến hành pha dung dịch chuẩn 3 lần và đo quang phổ 3 lần, lấy giá trị trung bình để xây dựng đường chuẩn

Phương trình biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ và độ hấp thụ có dạng:

y = ax + b với R2 là hệ số tương quan

Trong đó: y: độ hấp thu của dung dịch tại λmax

Trang 24

x: nồng độ của dung dịch Giá trị mật độ quang (OD) của dung dịch thuốc ở các nồng độ khác nhau Làm tương tự trên khảo sát phổ Omeprazole và xây dựng khoảng tuyến tính định lượng (đường chuẩn) của Omeprazole trong môi trường pH = 2,0; 4,5 và 6,8

2.3.6 Phương pháp xác định lượng thuốc hấp thụ vào màng CVK

Sử dụng màng CVK được tạo ra từ nước dừa già có kích thước 0,5cm

và độ dày 1cm, đem hấp thụ theo các thông số thiết kế thí nghiệm tối ưu hóa Dùng máy đo quang phổ UV - 2450 xác định lượng Omeprazole trong CVK đã nạp thuốc

Lấy giá trị OD thu được thay vào phương trình đường chuẩn ta được nồng độ Omeprazole (C%) trong dung dịch, từ đó tính được khối lượng Omeprazole có trong dung dịch theo công thức số 1:

C% (w/v) = x 100% (1)

Trong đó: C% là nồng độ phần trăm khối lượng - thể tích chỉ số

mg chất tan có trong 100ml dung dịch

mct: khối lượng chất tan (mg)

Vdd: thể tích của dung dịch (ml)

Sau khi tính được lượng thuốc Omeprazole có trong dung dịch ta tính được khối lượng thuốc Omeprazole được hấp thụ vào màng CVK theo công thức 2:

Trang 25

m2 là khối lượng thuốc Omeprazole trong dung dịch sau khi hấp thụ (mg)

Hiệu suất nạp thuốc vào màng CVK được tính theo công thức 3:

EE (%) = mht/m1 x 100% (3)

Trong đó: EE: phần trăm thuốc nạp vào màng

2.3.7 Chuẩn bị môi trường đệm

Pha 3 dung dịch đệm có pH là 2; 4,5; 6,8 theo cách pha chế một số dung dịch chuẩn độ theo Dược điển Việt Nam [1]

+ Dung dịch đệm pH = 2,0: Hoà tan 6,57g kali clorid trong nước, thêm 119ml dung dịch acid hydrocloric 0,1M và thêm nước vừa đủ 1000ml, đo pH và hiệu chỉnh pH nếu cần (Dùng HCl hoặc NaOH)

+ Dung dịch đệm pH = 4,5: Hòa tan 6,8g kali dihydro phosphat trong 1000ml nước, đo pH và hiệu chỉnh pH nếu cần (Dùng H3PO4 hoặc KOH)

+ Dung dịch đệm pH = 6,8: Hoà tan 28,80g dinatri hydrophosphat và 11,45g kali dihydrophosphat trong nước vừa đủ 1000ml, đo pH và hiệu chỉnh pH nếu cần (Dùng H3PO4 hoặc KOH hay NaOH)

Định dạng
Số trang	51
Dung lượng	1,85 MB