Nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc omeprazole của màng cellulose vi khuẩn lên men từ môi trường chuẩn

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH - KTNN ====== NGUYỄN THỊ THANH THỦY NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GIẢI PHÓNG THUỐC OMEPRAZOLE CỦA MÀNG CELLULOSE VI KHUẨN LÊN MEN TỪ MÔI TRƯỜNG CHUẨ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

KHOA SINH - KTNN

======

NGUYỄN THỊ THANH THỦY

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GIẢI PHÓNG THUỐC OMEPRAZOLE CỦA MÀNG CELLULOSE VI KHUẨN LÊN MEN

TỪ MÔI TRƯỜNG CHUẨN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Sinh lý học người và động vật

HÀ NỘI-2018

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

KHOA SINH - KTNN

======

NGUYỄN THỊ THANH THỦY

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GIẢI PHÓNG THUỐC OMEPRAZOLE CỦA MÀNG CELLULOSE VI KHUẨN LÊN MEN

TỪ MÔI TRƯỜNG CHUẨN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Sinh lý học người và động vật

HÀ NỘI-2018

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, em xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy Nguyễn Xuân Thành, người đã hướng dẫn và giúp đỡ em rất nhiều trong suốt quá trình nghiên cứu hoàn thành khóa luận tốt nghiệp

Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu Trường ĐHSP Hà Nội 2; các thầy, cô giáo trong khoa Sinh - KTNN cùng toàn thể các thầy cô trong Viện Nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng đã tạo điều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trình làm thực nghiệm hoàn thành khóa luận của mình

Vì chưa có nhiều cơ hội tham gia nghiên cứu khoa học nên em còn nhiều bỡ ngỡ cũng như kinh nghiệm của em còn nhều hạn chế do đó không tránh khỏi những thiếu sót Em rất mong nhận được sự góp ý, xây dựng của các thầy cô và các bạn sinh viên để khóa luận tốt nghiệp của em được hoàn thiện hơn nữa.Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, Ngày 10 tháng 05 năm 2018

NGUYỄN THỊ THANH THỦY

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GIẢI PHÓNG THUỐC OMEPRAZOLE CỦA MÀNG CELLULOSE VI KHUẨN LÊN MEN

TỪ MÔI TRƯỜNG CHUẨN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Sinh lý học người và động vật

Người hướng dẫn khoa học

TS NGUYỄN XUÂN THÀNH

HÀ NỘI-2018

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, em xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy Nguyễn Xuân Thành, người đã hướng dẫn và giúp đỡ em trong quá trình nghiên cứu hoàn thành khóa luận tốt nghiệp

Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu Trường ĐHSP Hà Nội 2; các thầy, cô giáo trong khoa Sinh - KTNN cùng toàn thể các thầy cô trong Viện Nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng đã tạo điều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trình làm thực nghiệm hoàn thành khóa luận của mình

Vì chưa có nhiều cơ hội tham gia nghiên cứu khoa học nên em còn nhiều bỡ ngỡ cũng như kinh nghiệm của em còn nhều hạn chế do đó không tránh khỏi những thiếu sót Em rất mong nhận được sự góp ý, xây dựng của các thầy cô và các bạn sinh viên để khóa luận tốt nghiệp của em được hoàn thiện hơn nữa Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, Ngày 10 tháng 05 năm 2018

Sinh viên

Nguyễn Thị Thanh Thủy

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là đề tài do chính tôi thực hiện và dưới sự hướng dẫn của TS Nguyễn Xuân Thành Các số liệu và kết quả nghiên cứu trong khóa luận này là hoàn toàn trung thực và không trùng lặp với những kết quả

đã công bố Nếu sai tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm!

Hà Nội, Ngày 10 tháng 5 năm 2018

Sinh viên

Nguyễn Thị Thanh Thủy

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

1 Lí do chọn đề tài 1

2 Mục đích nghiên cứu 2

3 Phạm vi nghiên cứu 2

4 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn 2

NỘI DUNG 4

Chương 1: TỒNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1.Cellulose vi khuẩn (CVK) và sinh vật tổng hợp cellulose 4

1.1.1 Cellulose vi khuẩn (CVK) 4

1.1.1.1 Đặc điểm của Cellulose vi khuẩn (CVK) 4

1.1.1.2 Cấu trúc kết tinh của cellulose vi khuẩn 4

1.1.1.3 Tính chất của cellulose vi khuẩn 5

1.1.1.4 Đặc tính của màng CVK 5

1.1.1.5 Ứng dụng của CVK 6

1.1.2 Phân loại và đặc điểm hình thái của A xylinum 7

1.1.3 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của A xylinum 7

1.1.4 Môi trường nuôi cấy A xylinum 7

1.2 Thuốc omeprazole 8

1.2.1 Cấu trúc 8

1.2.2 Tính chất vật lí và hóa học 9

1.2.3 Dược lý và cơ chế tác dụng 9

1.2.4 Chỉ định và chống chỉ định 10

1.2.5 Liều dùng và cách dùng: 10

1.3 Tình hình nghiên cứu trên thế giới và ở Việt Nam 11

1.3.1 Trên thế giới 11

1.3.1.1 Màng CVK 11

1.3.1.2 Omeprazole 11

1.3.2 Ở Việt Nam 13

1.3.2.1 Màng CV 13

1.3.2.2 Omeprazole 13

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.1 Vật liệu nghiên cứu 15

2.1.1 Hóa chất và dung môi sử dụng trong nghiên cứu 15

2.1.2 Thiết bị được sử dụng trong nghiên cứu 15

2.1.3 Vật liệu làm môi trường nuôi cấy vi sinh vật tạo màng CVK 15

2.2 Phương pháp nghiên cứu 15

2.2.1 Tạo màng CVK 15

2.2.2 Xử lý màng CVK trước khi hấp thụ thuốc, đánh giá độ tinh khiết của màng CVK 16

2.2.2.1 Xử lý màng CVK trước khi hấp thụ thuốc 16

2.2.2.2 Đánh giá độ tinh khiết của màng CVK 17

2.2.3 Xây dựng đường chuẩn Omeprazole 18

2.2.4 Xác định lượng thuốc hấp thụ vào màng CVK 19

2.2.5 Môi trường pH dùng để xác định lượng thuốc giải phóng thông qua hệ thống được thiết kế 20

2.2.6 Nghiên cứu giải phóng thuốc từ hệ CVK nạp thuốc với các loại màng CVK có kích thước khác nhau và điều kiện môi trường khác nhau 20

2.2.7 Đánh giá động học giải phóng của thuốc từ màng CVK nạp thuốc 21

2.2.8 Xử lý thống kê 22

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 23

3.1 Tạo màng CVK 23

3.1.1 Thu màng CVK từ môi trường HS 23

3.1.2 Xử lý màng CVK trước khi hấp thụ thuốc 23

3.1.3 Kiểm tra độ tinh khiết của màng CVK sau xử lý 24

3.1.3.1 Xác định sự hiện diện của glucose trong màng CVK tinh chế 24

3.1.3.2 Xác định sự hiện diện của protein trong màng CVK tinh chế 24

3.2 Kết quả quét phổ và xây dựng phương trình đường chuẩn của Omeprazole 24

3.3 Xác định lượng thuốc hấp thụ vào màng CVK 29

3.4 Lượng thuốc giải phóng từ màng CVK vào các môi trường pH khác nhau 29

3.4.1 Mật độ quang của Omeprazole khi tiến hành giải phóng thuốc tại các thời điểm khác nhau trong các môi trường pH khác nhau 29

3.4.2 Tỉ lệ giải phóng dược chất của các màng ở các môi trường pH khác nhau trong các khoảng thời gian khác nhau 32

3.5 Đánh giá động học giải phóng của thuốc từ màng CVK nạp thuốc 35

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 39

TÀI LIỆU THAM KHẢO 40

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1: Thành phần môi trường chuẩn tạo màng CVK 16Bảng 3.1 Mật độ quang (OD) của dung dịch Omeprazole ở các nồng độ 24Bảng 3.2 Mật độ quang (OD) của dung dịch Omeprazole ở các nồng độ ở pH

= 2 26Bảng 3.3 Mật độ quang (OD) của dung dịch Omeprazole ở các nồng độ ở pH

= 4,5 27Bảng 3.4 Mật độ quang (OD) của dung dịch Omeprazole ở các nồng độ ở pH

= 6,8 28Bảng 3.5 Lượng thuốc hấp thụ vào màng 29Bảng 3.6 Mật độ quang khi tiến hành giải phóng thuốc tại các thời điểm khác nhau trong các môi trường pH khác nhau 31Bảng 3.7 Tỉ lệ giải phóng thuốc Omeprazole từ màng CVK trong các độ dày, thời gian và môi trường pH khác nhau (n=3) 33Bảng 3.8 Hệ số tương quan (R2), tốc độ giải phóng thuốc (k) và trị số mũ giải phóng (n) đối với các môi trường pH khác nhau 36

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Cấu trúc hóa học của cellulose vi khuẩn 4

Hình 1.2 Công thức cấu tạo của omeprazole 9

Hình 3.1 Màng CVK thô lên mên từ môi trường HS 23

Hình 3.2 Màng CVK tinh khiết 23

Hình 3.3 Phương trình đường chuẩn Omeprazole dung môi NaOH 0,1M 25

Hình 3.4 Phương trình đường chuẩn Omeprazole dung môi NaOH 0,1M ở pH = 2 26

Hình 3.5 Phương trình đường chuẩn Omeprazole dung môi NaOH 0,1M ở pH = 4,5 27

Hình 3.6 Phương trình đường chuẩn Omeprazole dung môi NaOH 0,1M ở pH = 6,8……… 28

Hình 3.7 Hiệu chỉnh pH 30

Hình 3.8 Dùng máy khuấy từ gia nhiệt, tốc độ khuấy 50 vòng/phút, nhiệt độ 370C ± 0,50C 30

Hình 3.9 Đồ thị biểu diễn OD giải phóng thuốc Omeprazole của màng CVK 32

Hình 3.10 Đồ thị tỉ lệ giải phóng thuốc Omeprazole của màng CVK 34

1

MỞ ĐẦU

1 Lí do chọn đề tài

Cellulose vi khuẩn (viết tắt là CVK) là sản phẩm của một loài vi khuẩn,

đặc biệt là chủng Acetobacter xylinum (A xylinum) Màng sinh học (CVK) có

cấu trúc và đặc tính rất giống với cellulose thực vật (gồm các phân tử glucose liên kết với nhau bằng liên kết β-1,4 glucozit) [3] Ngày nay, màng CVK đã được ứng dụng rộng rãi trong rất nhiều lĩnh vực như: dùng màng CVK làm môi trường phân tách cho quá trình xử lí nước, làm chất mang đặc biệt cho các pin và năng lượng cho tế bào, làm môi trường cơ chất trong sinh học, trong thực phẩm hay thay thế thực phẩm, dùng để thiết kế hệ thống vận tải phân phối thuốc và nhiều ứng dụng khác [17] Trong lĩnh vực y học, màng CVK đã được ứng dụng làm da tạm thời để thay thế da trong điều trị bỏng, loét da, làm mạch máu nhân tạo, làm mặt nạ dưỡng da,… [7,17] Theo nghiên cứu cho thấy màng CVK có khả năng giữ thuốc và giải phóng thuốc chậm lại, làm tăng hiệu quả sử dụng của thuốc [9,10,13]

Ở nước ta việc nghiên cứu và ứng dụng màng CVK vẫn còn khá mới

mẻ nhưng cũng đã đạt được một số thành tựu ban đầu Đề tài của Nguyễn Văn Thanh – Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh 2006 [5] đã “ Nghiên

cứu chế tạo màng cellulose trị bỏng từ Acetobacter xylinum” Kết quả cho

thấy màng CVK được tạo nên từ các nguyên liệu có giá thành rẻ, dễ kiếm, có thể sản xuất trên quy mô lớn Về mặt tính chất, CVK có độ tinh sạch lớn hơn nhiều so với các loại cellulose khác, có thể phân hủy sinh học, tái chế hay phục hồi hoàn toàn Ngoài ra CVK còn có độ bền tinh thể cao, sức căng lớn, trọng lượng thấp, khả năng thấm hút lớn, đường kính sợi nhỏ, chứa nhiều dưỡng chất [12] Đồng thời là một hàng rào cản oxy và các sinh vật khác, ngăn cản sự phân hủy các cơ chất ở trong tế bào và ngăn cản tác động của

UV, ổn định về kích thước, màng CVK còn có ý nghĩa giữ thuốc và giải

để điều trị các triệu chứng của bệnh trào ngược dạ dày thực quản (GERD) và các bệnh khác gây ra bởi acid dạ dày dư thừa,…Tuy nhiên, omeprazole có một số nhược điểm như không bền trong môi trường acid, dễ bị sinh biến đổi

ở gan và trong quá trình dùng thuốc, người bệnh có thể gặp những tác dụng phụ nhẹ của thuốc như: sốt, hắt hơi, đau dạ dày, ợ nóng, buồn nôn,…

Với mục đích nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc của màng CVK nhằm làm chậm quá trình giải phóng thuốc trong điều trị bệnh, chúng tôi đã

chọn đề tài: “Nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc omeprazole của màng

cellulose vi khuẩn lên men từ môi trường chuẩn”

2 Mục đích nghiên cứu

- Tạo màng CVK từ môi trường chuẩn Hestrin – Schramm (HS)

- Nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc Omeprazole của màng CVK lên men từ môi trường chuẩn nhằm tìm ra hệ thống giải phóng thuốc kéo dài

- Thiết kế hệ thống giải phóng thuốc Omeprazole nhờ màng CVK trong một số trường hợp khác nhau về kích thước, độ dày màng, pH Đánh giá khả năng giải phóng thuốc trong các trường hợp đó

3 Phạm vi nghiên cứu

Nghiên cứu được thực hiện trên quy mô của phòng thí nghiệm

4 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn

4.1 Ý nghĩa khoa học

- Tiếp tục nghiên cứu tiềm năng của màng CVK trong việc giải phóng

3

thuốc

- Việc nghiên cứu ứng dụng màng CVK nhằm khắc phục hạn chế của

Omeprazole sẽ mang lại lợi ích cho việc điều trị

- Đánh giá những ưu nhược điểm của giải phóng omeprazole của màng

CVK để từ đó đề xuất hướng nghiên cứu với các thuốc khác

4.2 Ý nghĩa thực tiễn

- Tạo ra hệ thống giải phóng Omerazole kéo dài từ màng CVK

- Từ kết quả nghiên cứu được có thể áp dụng vào thực tiễn

4

NỘI DUNG Chương 1: TỒNG QUAN TÀI LIỆU 1.1.Cellulose vi khuẩn (CVK) và sinh vật tổng hợp cellulose

1.1.1 Cellulose vi khuẩn (CVK)

1.1.1.1 Đặc điểm của Cellulose vi khuẩn (CVK)

Cellulose vi khuẩn là một chuỗi polymer do các glucopyranose nối với nhau bằng liên kết β-1,4-glucan Cấu trúc CVK phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện nuôi cấy Trong nuôi cấy tĩnh, CVK có nhiều tính chất rất đặc biệt như:

độ tinh sạch cao, đàn hồi tốt, độ kết tinh và độ bền cơ học cao, không độc và không gây dị ứng, chịu nhiệt tốt và đặc biệt là khả năng cản khuẩn [12] Cấu trúc hóa học của CVK được trình bày trên hình 1.1

Hình 1.1 Cấu trúc hóa học của cellulose vi khuẩn

1.1.1.2 Cấu trúc kết tinh của cellulose vi khuẩn

Ngày nay, nhờ có các kỹ thuật và công nghệ hiện đại mà các nhà khoa học đã xác định được cấu trúc của cellulose vi khuẩn Các kỹ thuật như phồ hồng ngoại, phổ Raman, phổ cộng hưởng từ hạt nhân,…đã giúp xác định được dạng kết tinh của cellulose

CVK được tạo thành bởi hai loại cấu trúc tinh thể là cellulose Iα và Iβ Trong vi sợi cellulose đều có sự tham gia của hai loại cấu trúc tinh thể này

5

Trong khi hầu hết tinh thể Iβ tinh khiết được từ cellulose thực vật thì vẫn chưa

có cách nào thu nhận được tinh thể Iα tinh khiết từ nguồn này Cấu trúc CVK chứa nhiều tinh thể Iα hơn ở cellulose thực vật

Nhìn chung, cấu trúc tinh thể được coi là một yếu tố rất quan trọng trong việc xác định các tính chất của cellulose mặc dù đến nay vẫn có rất ít các nghiên cứu về sự tương quan giữa cấu trúc tinh thể và những đặc tính riêng biệt của cellulose được thực hiện

1.1.1.3 Tính chất của cellulose vi khuẩn

- Cellulose vi khuẩn trong suốt, cấu trúc mạng tinh thể mịn, tỉ lệ Iα cao

- Kích thước ổn định, sức căng và độ bền sinh học cao

- Khả năng giữ nước và hấp thụ nước cực tốt, tính xốp chọn lọc

- Độ tinh sạch cao hơn so với các loại cellulose khác, không chứa ligin

và hemicellulose

- Có thể bị phân hủy hoàn toàn bởi một số loại vi sinh vật

- Là nguồn tài nguyên có thể phục hồi

- Khả năng kết sợi và tạo tinh thể tốt

- Tính bền cơ tốt và khả năng chịu nhiệt tốt: tinh thể cellulose vi khuẩn

có độ bền cao, trọng lượng nhẹ, [5,12]

1.1.1.4 Đặc tính của màng CVK

Trong nuôi cấy tĩnh, CVK tích lũy trên bề mặt môi trường lỏng thành lớp mỏng như da, sau khi tinh chế và làm khô tạo thành sản phẩm tương tự như giấy da với độ dày 0,01 – 0,05mm Sản phẩm này có những tính chất rất đặc biệt như:

- Độ tinh kết cao: CVK là cellulose sinh học duy nhất được tổng hợp không chứa lignin hay hemicelluloses nên có thể bị vi khuẩn phân hủy hoàn toàn và là nguồn nguyên liệu tái sinh

- Độ bền dai cơ học lớn: Cellulose có độ bền dai cao, trọng lượng nhẹ

6

- Khả năng hút nước cực cao ở trạng thái ẩm

Màng CVK có bề mặt tiếp xúc lớn hơn gỗ thường, không độc và không gây dị ứng, chịu nhiệt tốt (khoảng 100oC không ảnh hưởng lớn đến tính chất của CVK nhưng nhiệt độ thấp có thể làm tăng tính mềm dẻo của nó) Đặc biệt

có khả năng cản khuẩn Với đặc tính này, CVK đã được ứng dụng làm màng lọc vô khuẩn [22]

1.1.1.5 Ứng dụng của CVK

CVK được ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực như: thực phẩm, công nghiệp dệt, mỹ phẩm, công nghệ pin,…và đặc biệt trong lĩnh vực y học Trong y học, màng CVK thu được từ nuôi cấy tĩnh được nghiên cứu và sử dụng làm da nhân tạo để trị bỏng, đắp lên các vết thương hở Ở Brazil, màng CVK ướt tinh sạch và được bán ra thị trường như một loại da nhân tạo dùng

để đắp lên vết thương [3] Trường Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh cũng đã nghiên cứu sử dụng màng CVK có tẩm dầu mù u làm màng trị bỏng được thực hiện ở thỏ Kết quả cho thấy rằng màng CVK giúp vết thương mau lành và tránh bị nhiễm trùng [5] CVK còn được ứng dụng làm màng băng vết thương trong phẫu thuật, ghép mô, cơ quan nội tạng,… Dựa vào đặc tính trương nở của CVK người ta đã ứng dụng làm tác nhân vận chuyển thuốc, dùng làm huyền phù CVK để ổn định các tá dược dạng nước, làm cho chúng không bị tách khi bảo quản lâu ngày [3]

Ngoài ra CVK còn được ứng dụng trong các lĩnh vực như: Trong công nghiệp giấy màu, CVK được dùng để sản xuất giấy điện tử chất lượng cao Trong công nghiệp môi trường đã sử dụng CVK làm màng phân tách để xử lí nước và biến đổi độ nhớt của nước, dùng làm chất mang đặc biệt cho các sợi pin và tế bào năng lượng [5], làm các sợi truyền quang, là một môi trường cơ chất trong sinh học được sử dụng để cố định protein [3]

7

1.1.2 Phân loại và đặc điểm hình thái của A xylinum

A xylinum thuộc nhóm vi khuẩn Acetic, chi Acetobacter, họ

Preudomonadaceae, sống hiếu khí bắt buộc, sản xuất cellulose ngoại bào

Theo khóa phân loại của Bergey, A xylinum thuộc họ Preudomonadaceae, bộ

Pseudomonadales, lớp Schizomycetes [8]

A xylinum có dạng hình que, thẳng hay hơi cong, kích thước ngang

khoảng 0,6 – 0,8µm, dài khoảng 2 – 3 µm, có thể di động hay không di động

và không sinh bào tử Chúng là vi khuẩn gram âm nhưng đặc điểm nhuộm gram có thể bị thay đổi do tế bào già đi hay do điều kiện môi trường Chúng

có thể đứng riêng rẽ hay xếp thành chuỗi [8]

1.1.3 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của A xylinum

Nhiệt độ tối ưu để A xylinum phát triển là 25 – 30oC và pH từ 5,4 –

6,3 A xylinum có thể phát triển trong phạm vi pH từ 3 – 8, nhiệt độ từ 12 –

35oC và nồng độ ethanol có thể tới 10% [6]

Các đặc điểm sinh hóa dùng định danh của A.xylinum bao gồm: oxy hóa

ethanol thành acid acetic, CO2, H2O, phản ứng catalase dương tính, không tăng trưởng trên môi trường Hoyer Chuyển hóa glucose thành acid, chuyển hóa glyxerol thành dihydroxyacetol, không sinh sắc tố nâu, tổng hợp cellulose [6]

1.1.4 Môi trường nuôi cấy A xylinum

Môi trường nuôi cấy A xylinum là môi trường tổng hợp từ các nguồn

dinh dưỡng cần thiết như cacbon, nito, nguồn sulfur và phospho, các yếu tố

tăng trưởng và các yếu tố vi lượng Nhu cầu sử dụng đường của A xylinum là

rất lớn và giữ vai trò quan trọng trong quá trình tổng hợp CVK nên có rất nhiều nghiên cứu đề nghị sử dụng các sản phẩm thứ cấp trong các ngành công nghiệp khác như: rỉ đường, nước dừa già, nước mía, để làm nguyên liệu

trong nuôi cấy A xylinum

9

- Tên khoa học: yl)methyl]-sulphinyl]-1H-benzimidazol[2]

- Công thức cấu tạo của omeprazole được trình bày trên hình 1.2

Hình 1.2 Công thức cấu tạo của omeprazole

1.2.2 Tính chất vật lí và hóa học

- Lý tính: Omeprazole dưới dạng bột trắng hoặc gần như trắng Nóng

chảy ở khoảng 155oC kèm theo sự phân hủy, khó tan trong nước, khó tan trong acetol và isopropanol, tan trong dicloromethan, methanol và ethanol [11,22]

- Hóa tính: Omeprazole vừa có tính acid, vừa có tính base, hấp thụ

mạnh bức xạ tử ngoại Các tính chất này được ứng dụng trong định tính, định lượng và trong bào chế omeprazole Độ ổn định của omeprazole phụ thuộc vào pH Trong môi trường acid, omeprazole nhanh chóng bị phân hủy, trong môi trường kiềm omeprazole khá bền vững [11]

1.2.3 Dược lý và cơ chế tác dụng

Omeprazole là một dẫn suất của benzimidazole không có hoạt tính ức chế enzyme ở môi trường trung tính, nhưng ở pH ≤ 5 Omeprazole được proton hóa thành 2 dạng acid sulphenic và sunphenamic Hai chất này gắn thuận nghịch với nhóm sulfohydryl của enzyme H+ - K+ - ATPase ở tế bào thành nên có khả năng ức chế bài tiết acid trên 48 giờ Do vậy omeprazole được dùng điều trị trong các trường hợp: trào ngược dạ dày thực quản, loét dạ dày tá tràng, hội chứng Zollinger-Ellison

10

Dược động học [3]: Omeprazole là một chất ức chế bài tiết dịch vị dạ

dày do ức chế bơm proton ở các tế bào thành dạ dày Thuốc có tác dụng nhanh, kéo dài Omeprazole được hấp thụ tốt ở ruột non sau khi uống từ khoảng 3 đến 6 giờ Sinh khả dụng sau khi uống liều đầu tiên đạt khoảng 35%

và đạt tới trên 60% sau khi dùng vài liều Sự hấp thụ của thuốc phụ thuộc vào liều dùng, không bị ảnh hưởng bởi thức ăn Thuốc liên kết cao với protein huyết tương (khoảng 95%) và được phân bố vào các mô đặc biệt ở các tế bào thành dạ dày Thời gian bán thải của thuốc khá ngắn (khoảng 40 phút), nhưng tác dụng ức chế bài tiết kéo dài, nên có thể chỉ cần dùng một liều mỗi ngày Omeprazole hầu như chuyển hóa hoàn toàn tại gan, đào thải nhanh chóng, chủ yếu qua nước tiểu (80%), phần còn lại theo phân Các chất chuyển hóa không có hoạt tính nhưng lại tương tác với nhiều thuốc khác do tác dụng

ức chế enzyme CYT.P450 của tế bào gan Dược động học của thuốc thay đổi không có ý nghĩa ở người già hoặc người có chức năng thận suy giảm Với những người suy giảm chức năng gan, sinh khả dụng của thuốc tăng và độ thanh thải giảm, nhưng không có biểu hiện tích lũy thuốc trong cơ thể

mồ hôi,…

1.2.5 Liều dùng và cách dùng:

Nghiên cứu về màng CVK từ vi khuẩn A xylinum và những ứng dụng

của nó đã được tiến hành ở nhiều nước trên thế giới Tác giả Brown E (2007) [4] dùng CVK làm môi trường phân tách cho quá trình xử lí nước, dùng làm chất mang đặc biệt cho các pin và năng lượng cho tế bào Brown (2007), Jonas và Farah, (1998) [18] dùng CVK để sản xuất giấy chất lượng cao

Tuy nhiên, những ứng dụng chủ yếu trên thế giới của màng CVK lại là trong ngành dược phẩm và mỹ phẩm Các tác giả Wan và Millon (2009) [23], Czafa và cộng sự (2007) [14] sử dụng màng CVK đắp lên các vết thương hở, vết bỏng đã thu được các kết quả tốt Đặc biệt tác giả Wan (Canada) [23] đã

được đăng kí bản quyền về làm màng CVK từ A xylinum dùng trị bỏng Các

tác giả Jonas và Farad (1998) [18], Crafa và cộng sự (2007) [14] đã dùng màng CVK làm da nhân tạo, làm mặt nạ dưỡng da cho phụ nữ

1.3.1.2 Omeprazole

Viên nang omaprazole lần đầu tiên được công ty Astra (nay là AstraZeneca) nghiên cứu sử dụng làm thuốc điều trị và đăng ký lưu hành từ năm 1988 với tên biệt dược Losec (được công nhận là thuốc phát minh, Innovator), với doanh số khoảng 8 tỷ USD mỗi năm Tuy nhiên, khi chưa hết hạn bản quyền (1997), AstraZaneca đã xin rút đăng ký sản phẩm này ở một số

12

nước thành viên chính của EU và cho ra đời viên nén và viên nang Losec MUPs (omeprazole + magnesi) Mặc dù chế phẩm mới đã được đánh giá tương đương sinh học với chế phẩm Losec gốc nhưng nhiều nước không coi Losec MUPs là chế phẩm innovator Từ đó, trên thị trường chỉ còn lưu hành chế phẩm generic của omeprazole đã được đánh giá tương đương sinh học với Losec hoặc chế phẩm được cấp phép ở các nước Losec không được đăng kí bản quyền, như Apo – omeprazole, (Apotec – Canada), Probitor (Biochemie – Áo)

Sayed Aboflazl Mostafavi (Iran) [20] đã nghiên cứu đánh giá tương đương sinh học của 2 sản phẩm viên nang Omeprazole sản xuất tại Iran: Omeprazole (Abidi) và Lorsec (Lorestan) so với thuốc chứng là viên nang Losec của Astra, Sweden Nghiên cứu thực hiện trên 12 người tình nguyện, thiết kế chéo theo ô vuông latin, mở, liều đơn, 3 thuốc, 3 giai đoạn với thời gian nghỉ giữa các giai đoạn là 7 ngày Phân tích nồng độ thuốc trong huyết tương bằng HPLC Kết quả đánh giá qua các giá trị dược động học AUC và Cmax cho thấy 3 chế phẩm này là tương đương sinh học

Elkoshi Z [16] và cộng sự đã nghiên cứu đánh giá tương đương sinh học của viên Omepradex so với thuốc đối chứng là viên Losec trên 2 mô hình invitro (thử độ hòa tan) và in vivo (dược động học) Nghiên cứu in vivo với thiết kế chéo, ngẫu nhiên, đơn liều kết hợp với đa liều, thực hiện trên 40 người tình nguyện khỏe mạnh Hai chế phẩm nghiên cứu cho thấy không tương đương, sự sai khác sau khi dùng đa liều lớn hơn Các tác giả đã nhận định rằng nghiên cứu tương đương sinh học Omeprazole nên thực hiện với thiết kế đơn liều kết hợp đã liều

Nghiên cứu so sánh khả dụng của 2 chế phẩm Omeprazole dạng uống: Pepticum (thuốc thử) và Mopral (thuốc chứng), Duvauchelle T và cộng sự [15] đã nhận thấy không có sự khác nhau có ý nghĩa về diện tích dưới đường

13

cong (AUC) của 2 chế phẩm cả khi dùng đơn liều và đa liều Tuy nhiên có nhận thấy sự khác nhau về giá trị Cmax (p<0,05) và Tmax(p<0,01) của thuốc thử so với thuốc đối chứng ở tình trạng ổn định (sau khi dùng thuốc 5 ngày) Kết quả này khẳng định thêm rằng sau khi dùng liều nhắc lại, AUC và Cmax tăng lên so với khi dùng đơn liều và sự biến thiên giữa các cá thể là đáng kể

1.3.2 Ở Việt Nam

1.3.2.1 Màng CV

Năm 2006 nhóm nghiên cứu của tác giả Nguyễn Văn Thanh và cộng sự

đã có một công trình nghiên cứu về màng CVK, là cơ sở để chế tạo màng sinh học dùng trong trị bỏng ở Việt Nam [8]

Mới đây nhóm tác giả Đinh Thị Kim Nhung cũng đã bước đầu ứng dụng màng CVK trong điều trị bỏng trên thỏ Công tác điều trị bỏng hiện đang sử dụng phương pháp cấy ghép, phẫu thuật, hoặc sử dụng một số màng trị bỏng như màng ối, trung bì da lợn, da ếch, màng chitissan, sử dụng các chất có nguồn gốc từ tự nhiên có tác dụng điều trị bỏng Theo tác giả Huỳnh Thị Ngọc Lan [5], màng trị bỏng CVK với các hoạt chất tái sinh mô và các chất sát khuẩn đều có nguồn gốc thiên nhiên vì thế nó không chứa các yếu tố nguy cơ như không có độc tố trực tiếp, không gây dị ứng, không có yếu tố lây lan mầm bệnh, không giải phóng chất lạ vào vết thương

1.3.2.2 Omeprazole

Tình hình nghiên cứu về omeprazole ở Việt Nam vẫn còn rất hạn chế

- Đã có 1 số đề tài nghiên cứu liên quan đến thuốc Omeprazole như:

Phùng Thị Vinh, Trịnh Văn Lẩu (2007) “Nghiên cứu đánh giá tương đương

sinh học viên nang Helinzole (Omeprazol 20G) theo mô hình đơn liều kết hợp

đa liều”, Viện Kiểm nghiệm thuốc TW, Bộ Y tế Nguyễn Nam Hương (2009)

“Nghiên cứu bào chế viên nang chứa pellet omeprazol tan trong ruột”,

- Omeprazole được sử dụng nhiều trong chữa trị các bệnh như: trào

14

ngược dịch dạ dày - thực quản, loét dạ dày - tá tràng, hội chứng Zollinger - Ellison… nhưng vẫn còn rất ít nghiên cứu nhằm hạn chế các tác dụng phụ cũng như yếu điểm của thuốc

Trong khoảng 10 năm trở lại đây, Bộ Y tế đã cấp phép cho khoảng 42 chế phẩm của omeprazole lưu hành ở Việt Nam Hiện nay, 37 sản phẩm có số đăng kí còn hạn, trong đó có 25 sản phẩm nước ngoài và 12 sản phẩm trong nước

15

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Hóa chất và dung môi sử dụng trong nghiên cứu

- Omeprazole (95%) xuất xứ từ Ân Độ

- Dung môi là NaOH 0,1M và chất phản ứng khác được cung cấp từ

Viện Nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng - Trường ĐHSP Hà Nội 2

- Màng CVK lên men từ môi trường chuẩn

2.1.2 Thiết bị được sử dụng trong nghiên cứu

- Buồng cấy vô trùng (Haraeus);

- Cân kỹ thuật (Sartorius - TE612);

- Cân phân tích (Sartorius - Thụy sỹ);

- Khuấy từ gia nhiệt (IKA - Đức);

- Kính hiển vi quang học (Carl Zeiss - Đức);

- Máy đo quang phổ UV - 2450 (Shimadzu - Nhật Bản);

- Máy lắc tròn tốc độ chậm (Orbital Shakergallenkump - Anh);

- Nồi hấp khử trùng HV - 110/HIRAIAMA;

- Tủ lạnh Daewoo, tủ lạnh sâu;

- Tủ sấy, tủ ấm (Binder - Đức);

- Ngoài ra còn nhiều dụng cụ hóa sinh thông dụng khác

2.1.3 Vật liệu làm môi trường nuôi cấy vi sinh vật tạo màng CVK

Đường glucose, peptone, chiết cao nấm men, Dinatri hidrophotphat (Na2HPO4), axit citric, NaOH,… đạt tiêu chuẩn phân tích

2.2 Phương pháp nghiên cứu

- Bước 6: Thu màng CVK thô, rửa sạch chúng dưới vòi nước

2.2.2 Xử lý màng CVK trước khi hấp thụ thuốc, đánh giá độ tinh khiết của màng CVK

2.2.2.1 Xử lý màng CVK trước khi hấp thụ thuốc

Mục đích: Loại bỏ được các tạp chất trong môi trường nuôi cấy, đồng

thời phá hủy và trung hòa độc tố của vi khuẩn

Phương pháp: Trong nuôi cấy tĩnh, CVK tạo thành màng dày ở mặt

môi trường nuôi cấy, ép màng loại bỏ môi trường

+ Trong màng chứa một lượng lớn vi khuẩn vì vậy hấp màng trong NaOH nóng 3%, nhiệt độ 1130C trong thời gian 15 phút bằng nồi hấp khử