Nghiên cứu quy trình sản xuất bột sấy phun từ lá dâu tằm

Đây là tài liệu giới thiệu về quy trình sản xuất bột từ lá dâu tằm.

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

VIỆN NGHIÊN CỨU RAU QUẢ

-*** -BÁO CÁO KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH SẢN XUẤT BỘT LÁ DÂU TẰM CÓ HÀM LƯỢNG DNJ 0,5-1% (Thuộc đề tài: “Nghiên cứu sản xuất một số thực phẩm chức năng cho người

bệnh tiểu đường từ lá dâu tằm”)

Cơ quan chủ quản : Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn

Cơ quan chủ trì : Viện khoa học nông nghiệp Việt Nam

Cơ quan thực hiện : Viện Nghiên cứu Rau quả

Chủ nhiệm đề tài : TS Hoàng Thị Lệ Hằng

Hà Nội 11/2012

MỤC LỤC

DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC HÌNH

I ĐẶT VẤN ĐỀ

Từ xa xưa cây dâu tằm (có tên khoa học Morus alba L.) đã được sử dụng trong các

bài thuốc dân gian của Trung Quốc trong việc chữa và ngăn ngừa bệnh tiểu đường (bệnh

“Xiaoke”), tuy nhiên chưa có sự đề cập nào về thành phần có tác dụng chữa bệnh trong ládâu tằm mà hoàn toàn là theo kinh nghiệm truyền thống [33] Trong những năm gần đây,

từ các công trình nghiên cứu chuyên sâu các nhà khoa học Nhật Bản, Hàn Quốc, Ấn Độ

đã công bố về thành phần, dược tính và cơ chế hoạt động của các thành phần chức năng cótrong lá dâu tằm, các kết quả nghiên cứu đã cho thấy trong lá dâu chứa một lượng lớn cácthành phần dinh dưỡng và các chất có hoạt tính sinh học, nhất là các hoạt chất có khả nănglàm giảm lượng đường máu Đặc biệt trong số đó có hoạt chất 1- Deoxynojirimycin(DNJ) là chất có chức năng chế ngự sự tăng đường máu hỗ trợ điều trị và phòng ngừabệnh tiểu đường Cho đến nay, lá dâu tằm là một trong những nguồn thực vật được pháthiện có chứa DNJ khá cao[21] Trước thực trạng về số lượng người bị mắc bệnh tiểuđường ngày càng gia tăng sự đòi hỏi việc nghiên cứu tìm ra nhiều loại thuốc để điều trịcăn bệnh nguy hiểm này cũng đã được đặt ra như là một nhu cầu bức thiết Hiện nay trênthị trường nước ta có khá nhiều loại thực phẩm chức năng chuyên biệt dùng cho người bịbệnh tiểu đường được tổng hợp và trích ly từ thảo dược như: mướp đắng, cam thảo, nấmLinh chi, hoài sơn, lá dâu… Tuy nhiên, các sản phẩm này đều được nhập khẩu từ cácnước Trung Quốc, Hàn Quốc, Nhật Bản, Mỹ vv

Trong khi đó, nước ta là một nước có truyền thống với nghề trồng dâu nuôi tằm, hơnnữa cây dâu là loại cây rất dễ trồng, dễ nhân giống, có thể thích nghi với các điều kiện khíhậu ở các vùng miền khác nhau nên có thể trồng thành vùng nguyên liệu và trồng khắpnơi Hiện nay diện tích trồng dâu tằm ở nước ta khoảng gần 20.000 ha với năng suất khácao khoảng 15-35 tấn/ha với khoảng 165 giống dâu, bao gồm cả dâu địa phương, giốngmới lai tạo trong nước và giống nhập nội đang được trồng rộng khắp ở các khu vực trong

cả nước[4][16] Đây thực sự là nguồn nguyên liệu phong phú để thu nhận hợp chất DNJ

Do vậy việc lựa chọn lá dâu làm nguyên liệu trích ly hợp chất 1- Deoxynojirimycin (DNJ)

và ứng dụng để sản xuất các thực phẩm chức năng dùng cho người bị bệnh tiểu đường làhoàn toàn khả thi, có ý nghĩa khoa học và thực tiễn cao, góp phần giảm tỷ lệ sản phẩmnhập khẩu cùng loại đồng thời nâng cao giá trị kinh tế của cây dâu ngoài việc nuôi tằm

Vì vậy, nghiên cứu trích ly, thu nhận hoạt chất 1- Deoxynojirimcyin (DNJ), đặcbiệt là xây dựng được quy trình công nghệ sản xuất bột lá dâu giàu DNJ để ứng dụng

trong sản xuất thực phẩm chức năng phòng chống bệnh tiểu đường đang được quan tâm,đặc biệt ở các quốc gia Châu Á, nơi có nguồn thực vật và cây dược liệu phong phú nhưTrung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc

Từ các lý do trên, chúng tôi tiến hành thực hiện quy trình: “Nghiên cứu quy trình

công nghệ sản xuất bột lá dâu tằm có chứa hàm lượng hoạt chất chức năng DNJ deoxynojirimycin)”.

(1-II MỤC ĐÍCH

Nghiên cứu thiết lập quy trình công nghệ sản xuất bột lá dâu có chứa hàm lượngDNJ để sản xuất thực phẩm chức năng cho người bệnh tiểu đường

III NGUYÊN LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1.Nguyên vật liệu nghiên cứu

3.1.1 Nguyên liệu:

Nguyên liệu được sử dụng là giống dâu Quế ưu đang được trồng phổ biến ở tỉnh TháiBình được thu hái vào vụ hè (từ 21/4÷30/8), ở độ già thành thục, lá bánh tẻ (lá thứ 5 -12),được làm khô đến độ ẩm 10 ± 1%

3.1.2.Vật liệu

3.1.2.1 Hóa chất

Chế phẩm enzim pectinex Ultral SP-L, Ethanol thực phẩm 96% V, DNJ chuẩn, fluorenylmethy chloroformat (FMOC_CL), Glycin- metanol, Axit formic, Axit sulfuric, Chloroform, Diethylether, NH4OH, Na2SO4, Axit axetic, Maltodextrin, đường isomalt,

9-tinh bột biến tính

3.1.2.2 Thiết bị

Bình hút ẩm , Cân điện tử Presisa 62A, Thụy Điển, Cân kỹ thuật Ohaus CT 1200,

Mỹ, Cốc, bình trích ly thuỷ tinh các loại , Giấy lọc, Bình trích ly, Máy cô chân khôngBuchi, Đức, Máy đo màu Minolta, Máy đo hàm ẩm, Bể ổn nhiệt, Máy HPLC- FL, cộtODS-3, Máy sấy phun mini BUCHI – 91, Túi thiếc, túi PE, Máy dán túi

3.2 Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu xác định phương pháp chiết tách thích hợp nhằm thu được hàm lượngDNJ cao

- Nghiên cứu xác định phương pháp thu nhận cao lá dâu tằm có hàm lượng DNJ cao

- Nghiên cứu phương pháp thu nhận bột lá dâu tằm

3.3 Phương pháp nghiên cứu

Kiềm hóa dịch lọc bằng NH4OH đậm đặc đến pH = 10 Chuyển dịch lọc vào phiễutrích ly Lắc dịch lọc với hỗn hợp chloroform:diethylether (2:1): 20ml x 3 lần (đến khidịch trích ly hết màu) Tập hợp dịch chiết chloroform - diethylether, thêm Na2SO4 khan đểloại nước Gạn dịch trích ly sang cốc khô đã cân trọng lượng Bốc hơi dung môi trên cáchthủy đến khô Để cốc trong bình hút ẩm 30 phút và cân nhanh khối lượng của cốc cùngcắn

Tính hàm lượng alkaloid TS trong d ch trích ly theo công th c sau:ịch trích ly theo công thức sau: ức sau:

X% = A x 100

M Trong đó:

X- Là hàm lượng alkaloid TS trong nguyên liệu (%)

A- Là khối lượng alkaloid TS cân được (g)

M- Là khối lượng bột nguyên liệu dùng để định lượng (g)

Định lượng alkaloid toàn phần trong bột thành phẩm:

Cân chính xác khoảng 1g bột thành phẩm, hòa tan trong 40 ml dung dịch axitsulfuric 2% Lọc lấy 20ml dung dịch (tương ứng với 0,5 g bột)

Các bước tiếp theo và cách tính tương tự như đối với định lượng alkaloid toànphần trong bột nguyên liệu

Tính hiệu suất thu hồi alkaloid b t th nh ph m ột thành phẩm ành phẩm ẩm

HS thu hồi

alkaloid (%) =

Lượng alkaloid toàn phần trong bột thành phẩm (g)

x 100Lượng alkaloid toàn phần trong bột nguyên liệu (g)

- Phương pháp xác định hàm lượng DNJ bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp: Thử theo

DĐVN IV, phụ lục 5.3, Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

+ Điều kiện sắc ký: Điều chỉnh nếu cần thiết

- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao phân tích

- Cột: Luna C18 (2) 250 nm x 4,6mm, 5m (cột tương tự)

- Pha động:

o Pha động A: Dung dịch acid formic 0,2% trong methanol

o Pha động B: Dung dịch acid formic 0,2% trong nước

o Chương trình dung môi gradient

Dung dịch mẫu thử: Cân chính xác khoảng 20 mg của bột chế phẩm, thêm 10 ml

chlorhydric 0,05N, siêu âm 30 phút, ly tâm ở tốc độ 15000 rpm trong 10 phút, gạn lấydịch trong phía trên Cắn còn lại được chiết thêm như trên 3 lần nữa Gộp dịch chiết vàobình định mức 50,0 ml Thêm nước vừa đủ tới vạch, lọc qua màng lọc 0,45 µm

Dung dịch chuẩn: Chuẩn bị dung dịch DNJ chuẩn trong acid chlorhydric 0.05N có

nồng độ chính xác khoảng 2 µg/mL

Phản ứng tạo mầu dẫn xuất đo huỳnh quang với thuốc thử 9-fluorenylmethylchloroformat (FMOC-Cl) trên đầu cột theo cơ chế phản ứng như sơ đồ sau

Phản ứng FMOC: Lấy 10 µl mẫu sau khi đã được pha loãng và thêm vào 10 µl củadung dịch đệm kali borat 0,4 M (pH 8,5) và 20 µl của dung dịch FMOC-CL 5mM,giữ hỗn hợp phản ứng ở nhiệt độ phòng trong 20 phút Thêm vào 10 µl của dung dịchglycine 0,1 M để dừng phản ứng và pha loãng bằng cách thêm 950 µl dung dịch axitaxetic 0,1% Tiêm sắc ký

H m l àm lượng % DNJ trong mẫu thử được tính theo công ượng % DNJ trong mẫu thử được tính theo công ng % DNJ trong m u th ẫu thử được tính theo công ử được tính theo công đượng % DNJ trong mẫu thử được tính theo công c tính theo công

th c: ức:

% GABA = At x Cc x 50 x100Ac x Mt

Trong đó: At: Độ hấp thụ huỳnh quang của mẫu thử

Ac: Độ hấp thụ huỳnh quang của mẫu chuẩnCc: Nồng độ mẫu chuẩn (mg/ml)

Mt: Khối lượng mẫu thử đã trừ ẩm (mg)

HS thu hồi

Lượng DNJ trong bột thành phẩm (g)

x 100Lượng DNJ trong nguyên liệu ban đầu (g)

Đếm tất cả số khuẩn lac mọc trên đó từ đó suy ra lượng nấm men và nấm mốc có trongmẫu phân tích.

- Lật ngược đĩa, đặt vào tủ ấm nhiệt độ 25 ± 1˚C trong thời gian 48-72 giờ

*Kết quả:

Sau khi khuẩn lạc đã mọc, đếm số lượng khuẩn lạc mọc trên các đĩa có số lượngnằm trong khoảng 15-300 Nếu ngay ở đĩa cấy mẫu nguyên chất mà có số lượng ít hơn 15khuẩn lạc thì vẫn lấy kết quả đó (Trần Văn Tài, 2000)

Số lượng vi sinh vật trung bình có trong 1ml hay 1g mẫu được tính theo côngthức:

N = Trong đó:

N: số khuẩn lạc/g hay số khuẩn lạc trên ml

∑C: Tổng các khuẩn lạc đếm được trên tất cả các đĩa

n1:Số đĩa đếm được ở nồng độ pha loãng thứ nhất

n2: Số đĩa đếm được ở nồng độ pha loãng thứ hai

d: Độ pha loãng cho số đếm thứ nhất

3.3.2 Phương pháp thiết kế thí nghiệm và xử lý số liệu

- Thiết kế thí nghiệm theo phương pháp yếu tố ngẫu nhiên hoàn toàn

- Kiểm tra giả thiết thống kê theo ANOVA

3.3.3 Phương pháp toán học các thực nghiệm trong nghiên cứu tìm tối ưu

Tối ưu hoá quá trình trích ly đối với lá dâu mà cụ thể là xác định các giá trị tối ưu của cácbiến số nhiệt độ, thời gian và tỷ lệ nguyên liệu/dung môi bằng phương pháp quy hoạch thựcnghiệm

Bằng ngôn ngữ, tối ưu hoá quá trình là tìm giá trị của các yếu tố X i để tại đó quá trình trích

ly đạt hiệu suất cao nhất (tức là hàm lượng DNJ được trích ly tách lớn nhất), nghĩa là các hàmmục tiêu Yi đạt cực trị

Để đạt được mục đích nghiên cứu chúng tôi chọn ma trận DOEHLERT Ma trận này cho phéptìm được vùng tối ưu trong khoảng giới hạn đã chọn Ma trận cho phép phân chia rất cân đốicác điểm thí nghiệm trong giới hạn theo bất kỳ hướng nào Dựa vào ma trận, ta có thể thêm cácbiến số khác nữa mà không làm mất đi tính đúng đắn của ma trận

Trong ma trận này, số lần thí nghiệm N và các biến số K được xác định như sau:

N= K2+ K+1

Trong trường hợp K= 3 thì số điểm thí nghiệm cần thực hiện là N=13

Với 3 yếu tố ảnh hưởng, ma trận được xác định như hình sau:

Tất cả các điểm đã chọn được xác định theo phương trình hồi quy có dạng sau:

* Phương pháp: Lá dâu khô xay nhỏ, được chia thành các mẫu có khối lượng như nhau100gr Các thí nghiệm đều được xử lý ở các nồng độ enzim từ 0 – 0,3%, nhiệt độ xử lý

450C (đây là nhiệt độ tối ưu nhất cho ezim hoạt động) và thời gian xử lý 1,5 giờ Các mẫuthí nghiệm sau khi xử lý enzim ở các nồng độ khác nhau sẽ tiến hành trích ly bằngphương pháp ngấm kiệt với dung môi là nước

* Chỉ tiêu kiểm tra: Trên cơ sở xác định hàm lượng alkaloid, DNJ thu được trong dungdịch trích ly ở tất cả các mẫu

Từ đó so sánh được hiệu quả khi sử dụng chế phẩm enzim pectinex ULTral SP-L so vớiđối chứng, theo đó xác định được các thông số kỹ thuật khi sử dụng chế phẩm enzimnhằm tăng hiệu suất trích ly

Thí nghiệm 2: Nghiên cứu phương pháp trích ly thích hợp

* Phương pháp: Lá dâu xay nhỏ sau khi xử lý enzim ở các điều kiện thích hợp (có được từthí nghiệm 1) được tiếp tục khảo sát hiệu quả trích ly bằng 3 phương pháp phổ biếnthường áp dụng với dược liệu tương ứng với 3 công thức thí nghiệm:

 CT1: Trích ly bằng phương pháp ngâm trong dung môi

 CT2: Trích ly bằng phương pháp ngấm kiệt bằng dung môi

 CT3: Trích ly bằng phương pháp trích ly Soxhlet

Các mẫu có khối lượng như nhau và bằng 100gr, dung môi được sử dụng là cồn

900C ở điều kiện nhiệt độ thường (29 ±10C)

* Các chỉ tiêu kiểm tra: Hàm lượng alkaloid, DNJ trong dịch chiết (% )và hiệu suất tríchly

Thí nghiệm 3: Nghiên cứu lựa chọn loại và nồng độ dung môi trích ly thích hợp

* Phương pháp: Lá dâu xay nhỏ được chia thành các mẫu có khối lượng như nhau(m=100gr) rồi tiến hành trích ly bằng phương pháp thích hợp (là kết quả của thí nghiệm2) trong cùng các điều kiện (thời gian, nhiệt độ, tỷ lệ dung môi/nước chiết) với các loạidung môi có các nồng độ khác nhau:

- Loại dung môi: Sử dụng 02 loại dung môi là ethanol trung tính, ethanol đã axit hóa(là các dung môi thường được sử dụng trong quá trình chiết tách các dược liệu)

- Nồng độ dung môi (đối với dung môi ethanol trung tính và ethanol đã axit hóa):30%V- 90%V

* Chỉ tiêu kiểm tra: Hàm lượng alkaloid, DNJ có trong dịch chiết ở các mẫu

Từ đó xác định được loại dung môi cũng như nồng độ dung môi thích hợp nhất

Thí nghiệm 4: Nghiên cứu xác định nhiệt độ trích ly, tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu và thời gian trích ly thích hợp.

* Phương pháp: Tiến hành xác định miền ảnh hưởng của từng yếu tố trong quá trình trích

ly (nhiệt độ trích ly, tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu, thời gian trích ly) bằng cách thực hiệncác thí nghiệm thăm dò đơn yếu tố Lá dâu xay nhỏ được chia thành các mẫu có khối lượngnhư nhau (m=100gr) rồi tiến hành trích ly bằng phương pháp thích hợp (là kết quả của thínghiệm 2) với các điều kiện thăm dò đơn yếu tố ở các ngưỡng khảo sát sau:

+ Nhiệt độ trích ly (X): Từ 300C- 700C (khi cố định thời gian trích ly: 24 giờ, tỷ lệ lá dâu/dung môi:1/12)

+ Thời gian trích ly (Y): 6 – 36 giờ (khi cố định nhiệt độ trích ly: 300C, tỷ lệ lá dâu/dungmôi:1/12)

+ Tỷ lệ lá dâu/dung môi (Z): 1/8- 1/18 (khi cố định thời gian trích ly: 24 giờ, nhiệt độtrích ly:300C)

Loại và nồng độ dung môi sử dụng ở tất cả các mẫu là kết quả thu được từ thí nghiệm

và giá trị tối ưu của các yếu tố trên

Thí nghiệm 5: Nghiên cứu xác định số lần trích ly thích hợp.

* Phương pháp: Lá dâu xay nhỏ được chia thành các mẫu có khối lượng như nhau(m=100gr) rồi tiến hành khảo sát hiệu suất trích ly với các lần trích ly n=1-3, các mẫuđược trích ly bằng phương pháp thích hợp (là kết quả của thí nghiệm 2) với các thông số

kỹ thuật (là kết quả của thí nghiệm 4) trong loại dung môi có thành phần đã xác định (làkết quả của thí nghiệm 3)

* Chỉ tiêu kiểm tra: Hiệu suất trích ly, hàm lượng alkaloid, DNJ có trong dịch trích l

Hoạt động 2: Nghiên cứu xác định phương pháp thu nhận cao lá dâu tằm có hàm

lượng DNJ cao

Thí nghiệm 1: Nghiên cứu lựa chọn phương pháp loại bỏ nước.

* Phương pháp: Tiến hành khảo sát một số biện pháp tách nước khác nhau bao gồm: cô đặc

ở nhiệt độ lạnh, cô đặc ở điều kiện thường và cô đặc chân không, trên cơ sở xác định cácthành phần có trong dịch chiết sau khi tách nước (đặc biệt là thành phần DNJ) để lựa chọnphương pháp tách nước thích hợp

* Các chỉ tiêu xác định: Hàm lượng DNJ(%), màu sắc, mùi vị và khả năng hòa tan củasản phẩm

Thí nghiệm 2: Nghiên cứu xác định các thông số kỹ thuật thích hợp trong quá trình

cô đặc (nhiệt độ, hàm lượng chất khô hòa tan của sản phẩm cuối, hiệu suất sử dụng thiếtbị)

* Phương pháp: Tiến hành quá trình làm bay hơi nước (theo phương pháp đã xác địnhđược ở thí nghiệm 1) đối với dịch chiết thu được sau quá trình trích ly ở các nhiệt độ khảosát khác nhau (50-60-70-80-900C) cho đến khi dịch chiết đạt đến các hàm lượng chất khôhòa tan 13-140Bx, 19-200Bx, 25-260Bx

* Các chỉ tiêu xác định: Hàm lượng alkaloid, DNJ (%), màu sắc, mùi vị sản phẩm

Thí nghiệm 3: Xác định tính ổn định của sản phẩm cao lá dâu

* Phương pháp: Tiến hành phân tích đánh giá chất lượng của sản phẩm cao lá dâu đượcđóng trong bao bì tráng thiếc (là loại bao bì thường được sử dụng cho các dạng sản phẩmphẩm thực phẩm dạng cao) với thời gian bảo quản 1-3 tháng, với tần suất lấy mẫu phântích 7 ngày/lần Trên cơ sở các số liệu thu được để xác định thời gian thương phẩm củasản phẩm

* Các chỉ tiêu phân tích: Hàm lượng DNJ (%), màu sắc, mùi vị và các chỉ tiêu vi sinh vật(đặc biệt là nấm men, mốc )

Thí nghiệm 4: Xây dựng quy trình công nghệ sản xuất cao lá dâu tằm

Trên cơ sở các số liệu thu được từ các hoạt động 1,2 và các thí nghiệm 1,2,3 của hoạtđộng 3 để thiết lập quy trình công nghệ sản xuất cao lá dâu tằm

Hoạt động 3: Nghiên cứu xác định phương pháp thu nhận bột lá dâu tằm.

Thí nghiệm 1: Nghiên cứu xác định phương pháp sấy thích hợp

* Phương pháp: Tiến hành khảo sát một số phương pháp sấy thông thường (thường được

sử dụng cho các sản phẩm thực phẩm) đối với dịch cao lá dâu đã được bổ sung maltodextrin2% : sấy phun, sấy chân không và sấy đối lưu, trên cơ sở xác định sự thay đổi của các thành

phần có trong sản phẩm (đặc biệt là thành phần DNJ) khi được sấy bằng các phương phápkhác nhau, từ đó lựa chọn phương pháp sấy thích hợp.

Các mẫu có khối lượng như nhau và bằng 1000ml

* Các chỉ tiêu xác định: Hàm lượng DNJ(%), khối lượng DNJ, độ ẩm, màu sắc, mùi vị, độbám dính, độ hòa tan của sản phẩm

Thí nghiệm 2: Nghiên cứu xác định chất mang và nồng độ chất mang thích hợp

* Phương pháp: Sử dụng một số chất mang thường được dùng cho các sản phẩm thựcphẩm dành cho người tiểu đường như: Maltodextrin, tinh bột biến và đường isomalt với tỷ

lệ từ 1-4%

Các mẫu dịch chiết sau khi được bổ sung Maltodextrin, tinh bột biến tính, đường isomalt

ở các nồng độ khảo sát rồi được tiến hành sấy theo phương pháp đã được xác định ở thínghiệm 1 Tiến hành xác định các chỉ tiêu chất lượng của sản phẩm bột thu được sau sấy

* Các chỉ tiêu xác định: Hàm lượng DNJ(%), độ ẩm, màu sắc, mùi vị, độ bám dính, khảnăng hút ẩm của sản phẩm, khả năng hòa tan trong nước

Trên cơ sở các số liệu thu được lựa chọn được chất mang và hàm lượng chất mang thíchhợp

Thí nghiệm 3: Nghiên cứu các thông số kỹ thuật tối ưu trong quá trình sấy (áp suất, thời gian sấy, lưu lượng dịch, nhiệt độ sấy, ).

* Phương pháp: Tùy thuộc vào phương pháp được lựa chọn (là kết quả của thí nghiệm 2)

mà khảo sát ở các khoảng thông số khác nhau (áp suất, thời gian sấy, lưu lượng dịch,nhiệt độ sấy, ) Tiến hành xác định các chỉ tiêu chất lượng của các mẫu sản phẩm sausấy, từ đó lựa chọn được các thông số kỹ thuật thích hợp cho sản phẩm

* Các chỉ tiêu xác định: Hàm lượng DNJ(%), độ ẩm, hiệu suất thu hồi, màu sắc, mùi vị,

độ bám dính, độ hòa tan của sản phẩm

Thí nghiệm 4: Nghiên cứu xác định bao bì thích hợp cho sản phẩm bột lá dâu tằm

* Phương pháp: Bột lá dâu thành phẩm được đóng trong các loại bao bì khác nhau: Lọthủy tinh nắp xoáy, túi PP, túi PE, màng PE/AL/PP Tất cả các mẫu đều có khối lượngnhư nhau = 500 gr và được bảo quản ở điều kiện thường Trong quá trình bảo quản tiếnhành theo dõi các chỉ tiêu chất lượng của sản phẩm theo chu kỳ 2 tháng/lần Trên cơ sởcác số liệu sẽ lựa chọn được loại bao bì thích hợp nhất nhằm mục đích ổn định và kéo dàichất lượng của sản phẩm bột dâu tằm

* Các chỉ tiêu theo dõi: Các chỉ tiêu lý hóa (đặc biệt là hàm lượng DNJ, độ ẩm), chỉ tiêu

vi sinh và chỉ tiêu cảm quan (màu sắc, mùi vị, trạng thái)

IV KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

DNJ cao.

4.1.1 Nghiên cứu phương pháp xử lý nguyên liệu trước khi trích ly thu nhận DNJ.

Việc phá vỡ màng chất nguyên sinh của tế bào lá dâu có thể sẽ tạo điều kiện cho quátrình chuyển khối trong hệ pha rắn – lỏng (dung môi – lá dâu) được dễ dàng, nhanh chóng

và triệt để Vì vậy, trước khi đưa lá dâu vào trích ly, chúng tôi sử dụng chế phẩm enzimPectinex ULTral SP-L để thủy phân màng tế bào của lá dâu

Tiến hành các thí nghiệm như phần 3.3.4 (hoạt động 1, thí nghiệm 1) Các kết quả thuđược thể hiện qua bảng 4.1

Bảng 4.1 nh h ưởng của nồng độ enzim đến khả năng trích ly DNJ từ lá dâu tằm ng c a n ng ủa nồng độ enzim đến khả năng trích ly DNJ từ lá dâu tằm ồng độ enzim đến khả năng trích ly DNJ từ lá dâu tằm đột thành phẩm enzim đến khả năng trích ly DNJ từ lá dâu tằm n kh n ng trích ly DNJ t lá dâu t m ả năng trích ly DNJ từ lá dâu tằm ăng trích ly DNJ từ lá dâu tằm ừ lá dâu tằm ằm

Nồng độ enzim (%)

Khối lượng DNJ (g)

Khối lượng alkaloid (g)

(*) Hiệu suất thu hồi DNJ (%)

(*) Hiệu suất thu hồi alkaloid (%)

lý do đó cho thấy việc sử dụng chế phẩm enzim trong quá trình trích ly DNJ từ lá dâu tằm

là không khả thi

Do đó, từ các thí nghiệm sau, chúng tôi sẽ tiến hành trích ly DNJ trực tiếp từ lá dâukhô mà không qua bước xử lý enzim

4.1.2 Nghiên cứu phương pháp trích ly thích hợp

Trên thực tế có rất nhiều các phương pháp tách chiết khác nhau nhưng với đốitượng cụ thể là trong nghiên cứu này là lá dâu tằm nên chúng tôi tiến hành khảo sát baphương pháp trích ly: phương pháp ngâm nguyên liệu trong dung môi, phương phápngấm kiệt và phương pháp trích ly Soxhlet Các thí nghiệm được tiến hành như phần 3.3.3(Thí nghiệm 2, hoạt động 2, nội dung 2)

Kết quả phân tích hàm lượng alkaloid tổng số, hàm lượng DNJ thu được ở 3phương pháp được thể hiện trong bảng 4.13

Bảng 4.13 nh h ưởng của nồng độ enzim đến khả năng trích ly DNJ từ lá dâu tằm ng c a các ph ủa nồng độ enzim đến khả năng trích ly DNJ từ lá dâu tằm ương pháp trích ly đến hiệu suất ng pháp trích ly đến khả năng trích ly DNJ từ lá dâu tằm n hi u su t ệu suất ất

trích ly DNJ

Phương pháp trích ly

Khốilượngalkaloid(g)

Hiệu suấttrích lyalkaloid(%)

KhốilượngDNJ (g)

Hiệu suấttrích lyDNJ (%)

Tỷ lệ DNJ/alkaloid

Khi xét hai phương pháp còn lại, các kết quả cho thấy tất cả các số liệu thu được(hiệu suất trích ly DNJ, alkaloid, tỷ lệ DNJ/alkaloid trong dịch chiết) khi sử dụng phươngpháp ngâm trong dung môi cao hơn so với khi sử dụng phương pháp ngấm kiệt, hơn nữa

phương pháp ngâm trong dung môi có ưu điểm tiêu tốn lượng dung môi thấp hơn so vớiphương pháp ngấm kiệt

Do vậy chúng tôi lựa chọn phương pháp ngâm trong dung môi là phương pháp thíchhợp với mục đích tách chiết hoạt chất DNJ trong lá dâu tằm

4.1.3 Nghiên cứu lựa chọn loại và nồng độ dung môi trích ly thích hợp

Việc trích ly không chỉ định hướng vào việc trích ly được nhiều alkaloid (hoặc DNJ)

mà còn phải thu được sản phẩm có khả năng tan tốt trong nước tạo dịch có màu sắc hấpdẫn, an toàn thực phẩm đối với người sử dụng Theo các kết quả nghiên cứu và tài liệutham khảo chúng tôi tiến hành khảo sát các loại dung môi là ethanol trung tính và ethanolaxit hóa bằng axit axetic - đây là loại axit được dùng trong thực phẩm, ở dạng lỏng nên sẽ

an toàn hơn các axit vô cơ khác, đồng thời đây là loại axit dễ dàng tan trong ethanol Tiến hành các thí nghiệm như đã mô tả ở phần 3.3.4 (hoạt động 1 – thí nghiệm 3).Các chỉ tiêu như khối lượng alkaloid, DNJ, hiệu suất trích ly alkaloid trong dịch chiếtđược xác định theo các phương pháp được trình bày ở phần 2.2.3 Kết quả được trình bày

Hiệusuấttrích lyalkaloid(%)

KhốilượngDNJ(g)

Hiệu suấttrích lyDNJ (%)

Tỷ lệDNJ/alkaloid

Từ kết quả bảng trên cho thấy:

+ Khối lượng DNJ và alkaloid thu được cũng như hiệu suất trích ly alkaloid ở cácmẫu thí nghiệm khi được trích ly ở các dung môi có nồng độ ethanol khác nhau là khácnhau Điều đó cho thấy mức độ ảnh hưởng của nồng ethanol đến khả năng trích lyalkaloid và DNJ Điều này được giải thích là do các nồng độ ethanol khác nhau sẽ có hệ

số phân tán, phân cực, liên kết hydro khác nhau đốivới chất tan (alkaloid và DNJ) vì vậy

sẽ có khả năng trích ly khác nhau đối với chất tan này Theo đó, hiệu suất cũng như khốilượng DNJ và alkaloid ở tất cả các mẫu dung môi ethanol axit hóa đều tăng tỷ lệ thuận vớinồng độ ethanol Trong khi đó, chiều hướng tăng này cũng được lặp lại ở các mẫu đượctrích ly bằng ethanol trung tính trong khoảng 20 -70%V và giảm ở mẫu được trích ly bằngethanol có nồng độ 90%V

+ Hiệu suất trích ly và khối lượng alkaloid, DNJ thu được ở các mẫu được trích lybằng ethanol axit cao hơn so với các mẫu khi được trích ly bằng ethanol trung tính (tươngứng ở các mẫu có cùng nồng độ ethanol) Điều này cho thấy việc axit hoá dung môi trích

ly có tác dụng rất tốt đối với việc trích ly DNJ và alkaloid

+ Với các mẫu được trích ly bằng ethanol trung tính và axit hoá có nồng độ ethanol30%V tuy có lượng alkaloid, DNJ thấp hơn so với các mẫu trích ly bằng ethanol trungtính và axit hoá có nồng độ ethanol 50 và 70%V nhưng mức chênh lệch không đáng kể.Hơn nữa, ở các mẫu này tỷ lệ DNJ/alkaloid cao hơn và dịch trích ly đều có khả năng lọc

dễ dàng hơn so với các mẫu được trích ly ở nồng độ ethanol 50%V và 70%V, điều nàycho thấy với dung môi ethanol có nồng độ 30%V đã có khả năng trích ly thích hợp nhấtlượng DNJ có trong nguyên liệu Ngoài ra, mẫu dịch được trích ly bằng ethanol đã đượcaxit hoá cho hàm lượng DNJ cao hơn nhiều so với khi dùng dung môi ethanol 30%Vtrung tính (Hiệu suất trích ly DNJ tăng từ 53,% lên 63,6%)

Qua các nhận xét trên chúng tôi nhận thấy: Hiệu suất trích ly DNJ ở nồng độ ethanol30%V đã được axit hóa so với ở nồng độ ethanol 50%V và 70%V là không đáng kể, trongkhi đó chi phí sản xuất cho việc tăng nồng độ ethanol từ 30%V lên 50%Vvà 70% là khácao Hơn nữa, khi thao tác với dung môi ethanol có nồng độ thấp hơn 30%Vsẽ mang tính

an toàn và dễ dàng hơn khi thực hiện quá trình sản xuất thực tế Từ các lý do trên chúng

tôi chọn dung môi ethanol 30%V được axit hoá 1% là dung môi thích hợp cho quá trìnhtrích ly DNJ từ lá dâu Sử dụng kết quả này cho các nghiên cứu tiếp theo.

4.1.4 Nghiên cứu xác định nhiệt độ trích ly, tỷ lệ dung môi/nguyên liệu và thời gian trích ly thích hợp.

4.1.4.1 Nghiên cứu xác định miền ảnh hưởng của nhiệt độ

Theo lý thuyết, khi nhiệt độ càng cao thì khả năng trích ly càng tăng, tuy nhiên quyluật này còn phụ thuộc vào các yếu tố tương hỗ như loại dung môi trích ly, đặc tính củahợp chất cần trích ly… Chính vì vậy, chúng tôi đã tiến hành khảo sát khả năng trích lyDNJ và alkaloid từ lá dâu tằm ở các khoảng nhiệt độ khác nhau Các thí nghiệm được tiếnhành như 3.3.4 - thí nghiệm 4 Khối lượng, hiệu suất trích ly alkaloid và DNJ thu đượctrong dịch chiết được xác định bằng các phương pháp được trình bày ở phần 3.3 Kết quảthu được trình bày trong bảng 4.4

Bảng 4.4: Ảnh hưởng của nhiệt độ dung môi đến khả năng trích ly DNJ

t lá dâu t m ừ lá dâu tằm ằmNhiệt độ

trích ly

(0C)

Khối lượngalkaloid (g)

Hiệu suấttrích lyalkaloid (%)

Khối lượngDNJ (g)

Hiệu suấttrich lyDNJ (%)

Tỷ lệDNJ/alkaloid

Các kết quả ở bảng 4.4 cho thấy: Nhìn chung khối lượng, hiệu suất trích ly của DNJ

và alkaloid thu được trong dịch trích ly tỷ lệ thuận với nhiệt độ trích ly Ở nhiệt độ trích lythấp 300C, hiệu suất trích ly DNJ và alkaloid có trong dịch trích ly thu được là thấp nhất(tương ứng là 62,2% và 65,3%), các giá trị này tăng dần ở các nhiệt độ cao hơn và đạt giátrị cực đại khi nhiệt độ tăng đến 600C (tương ứng là 77,2% và 73,1%), tuy nhiên khi nhiệt

độ tiếp tục tăng đến ngưỡng 700C các giá trị này lại giảm đi, điều này được giải thích là

do ở nhiệt độ cao dung môi ethanol bị bay hơi một phần do vậy sẽ ảnh hưởng đến một sốtính chất của dung môi (như độ phân cực, moment lưỡng cực, hệ số phân cực và liên kếthydro) nên sẽ làm giảm khả năng hòa tan, khả năng trích ly của dung môi đối với hợpchất alkaloid và DNJ có trong lá dâu Cũng theo các số liệu thu được cho thấy, hiệu suất

trích ly ở các nhiệt độ 600C tuy có cao hơn so với khi được trích ly ở 500C nhưng mức độtăng này không đáng kể.

Từ các nhận xét trên, chúng tôi lựa chọn miền nghiên cứu ảnh hưởng của yếu tốnhiệt độ đến trích ly DNJ từ 30 – 500C

4.1.4.2 Nghiên cứu xác định miền ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu/dung môi

Theo lý thuyết, hiệu suất trích ly DNJ tỷ lệ thuận với tỷ lệ dung môi/nguyên liệu,tuy nhiên trong thực tế để đạt được một hiệu suất trích ly DNJ cao cần phải sử dụng mộtlượng dung môi rất lớn cùng với hệ thống thiết bị có dung tích rất lớn, vì vậy sẽ làm chohiệu quả của quá trình sản xuất đồng thời tăng chi phí và giá thành sản phẩm Chính vìvậy, cần phải xác định được tỷ lệ dung môi/nguyên liệu thích hợp đảm bảo hiệu quả kinh

tế cho quá trình sản xuất thực tế

Tiến hành các thí nghiệm như mục 3.3.4 - thí nghiệm 4 Các giá trị DNJ, alkaloid vàhiệu suất trích ly được xác định theo các phương pháp được trình bày ở phần 3.3.3 Kết

quả thu được trình bày ở bảng 4.5

Hiệu suất trích ly alkaloid (%)

Khối lượng DNJ (g)

Hiệu suất trich ly DNJ (%)

Tỷ lệ DNJ/alkaloid

ly tuy có tăng nhưng không đáng kể so với mẫu liền trước (tỷ lệ 1/16) Ngoài ra, ở tỷ lệ

1/18 tuy khả năng trích ly tăng thêm không đáng kể nhưng phải tốn thêm một lượng dungmôi và năng lượng để cô đặc dịch sau trích ly

Cũng từ các kết quả thu được cho thấy, hầu như tỷ lệ DNJ/alkaloid tăng tỷ lệ nghịch

so với tỷ lệ nguyên liệu/dung môi Điều đó cho thấy khi lượng dung môi tăng sẽ khôngnhững làm tăng hiệu suất trích ly alkaloid và DNJ mà còn tăng độ tinh sạch của dịch DNJ

Từ các nhận xét trên chúng tôi lựa chọn miền nghiên cứu ảnh hưởng của yếu tố tỷ lệnguyên liệu/dung môi đến trích ly DNJ từ 1/12 - 1/16

4.1.4.3 Nghiên cứu xác định miền ảnh hưởng của thời gian trích ly

Từ các kết quả nghiên cứu ở phần trên, chúng tôi thấy rằng với thời gian trích lyDNJ là 24 giờ/lần đã cho kết quả rất tốt Tuy nhiên việc tăng hay giảm thời gian trích lytrong một lần trích ly liệu có ảnh hưởng nhiều đến việc thu nhận DNJ không Để làm rõđiều này, chúng tôi tiến hành trích ly DNJ từ lá dâu tằm khô bằng dung môi ethanol 30%

đã được axit hóa bằng 1% axit axetic ở các điều kiện thí nghiệm đã được mô tả trong phần

3.3.4 - thí nghiệm 4 Kết quả được trình bày ở bảng 4.6:

Bảng 4.6: nh h ưởng của nồng độ enzim đến khả năng trích ly DNJ từ lá dâu tằm ng c a th i gian ủa nồng độ enzim đến khả năng trích ly DNJ từ lá dâu tằm ời gian đến khả năng trích ly DNJ từ lá dâu tằm đến khả năng trích ly DNJ từ lá dâu tằm n kh n ng trích ly DNJ t lá dâu t m ả năng trích ly DNJ từ lá dâu tằm ăng trích ly DNJ từ lá dâu tằm ừ lá dâu tằm ằm

Thời gian

(giờ)

Khối lượng alkaloid (g)

Hiệu suất trích ly alkaloid (%)

Khối lượng DNJ (g)

Hiệu suất trich ly DNJ (%)

Tỷ lệ DNJ/alkaloid

là 18 - 30 giờ Vì vậy, chúng tôi chọn miền ảnh hưởng của thời gian trích ly là 18 - 30 giờ

4.1.4.4 Tối ưu hóa điều kiện trích ly DNJ từ lá dâu tằm

Qua kết quả thí nghiệm ở phần đơn yếu tố, chúng tôi đã chọn được miền nghiên cứuảnh hưởng của 3 yếu tố (tỷ lệ dung môi/nguyên liệu, nhiệt độ và thời gian trích ly) đếnkhả năng trích ly DNJ l m y u t àm lượng % DNJ trong mẫu thử được tính theo công ếu tố đầu vào của quá trình quy ố đầu vào của quá trình quy đầu vào của quá trình quy u v o c a quá trình quy àm lượng % DNJ trong mẫu thử được tính theo công ủa quá trình quy

ho ch th c nghi m nh sau: ạch thực nghiệm như sau: ực nghiệm như sau: ệm như sau: ư

Mức dưới Mức giữa Mức trên

Với hàm mục tiêu (chỉ tiêu) cần xác định sau quá trình trích ly là: Y (Khối lượng DNJ) Kết quả nghiên cứu theo 15 điểm đã chọn được biểu diễn trong bảng 4.7 dưới đây:

Bảng 4.7: Kết quá thí nghiệm theo ma trận DOEHLERT

MA TRẬN THÍ NGHIỆM

Trích ly DNJ

Kết quảthínghiệm

Tỷ lệ dungmôi/nguyênliệu

Nhiệt độtrích ly

Thời giantrích ly(giờ)

KhốilượngDNJ (g)

Qua kết quả thu được cho thấy, khi thay đổi giá trị các biến số X1, X2, X3 thì khối lượng DNJ thay đổi từ 0,145 đến 0,185g Điều này chứng tỏ rằng các yếu tố X1, X2, X3 là các yếu tố ảnh hưởng rất lớn đến quá trình trích ly (tăng hiệu suất thu hồi DNJ).

Sau đó chúng tôi tiến hành xử lý các kết quả thí nghiệm trên máy tính bằng chương

trình NEMROD từ đó chúng tôi xác định được các kết quả sau:

Bảng 4.8: Độ lệch chuẩn và hệ số tương quan

Ở đây chúng tôi thấy độ lệch chuẩn là 0,00006 là tương đối nhỏ Quan trọng hơn là hệ

số tương quan của phương trình hồi quy thực nghiệm bằng 0,947 ≥ 0,7 điều này chứng tỏphương trình hồi quy thực nghiệm có độ tin cậy cao

Bảng 4.9: Giá tr các h s h i quy ị các hệ số hồi quy ệm như sau: ố đầu vào của quá trình quy ồi quy

tăng

Độ lệch chuẩn

Mức ý nghĩa %

Các hệ số hồi quy biểu thị mức độ ảnh hưởng của các yếu tố trên tới quá trình trích ly

DNJ Từ kết quả ở bảng trên cho thấy:

+ Trong khoảng đã chọn, cả 3 yếu tố (Tỷ lệ dung môi trên nguyên liệu (X1), nhiệt độtrích ly (X2) và thời gian trích ly (X3)) đều có ảnh hưởng rõ rệt đến khối lượng DNJ thuđược trong dịch chiết (hay hiệu suất trích ly)

+ Đối với đại lượng Y (khối lượng DNJ): ảnh hưởng bậc 1 của tỷ lệ dung môi trênnguyên liệu, nhiệt độ và thời gian trích ly ảnh hưởng làm tăng giá trị hàm đáp ứng khi 3biến này tăng lên, tuy nhiên yếu tố nhiệt độ có ảnh hưởng lên hàm đáp ứng nhiều hơn haiyếu tố còn lại (hệ số b1 = 0,0055 và b2 = 0,0123 và b3 = 0,0096) Nhưng ảnh hưởng bậc 2của ba yếu tố này lại tác động ngược lại làm giảm hàm mục tiêu khi ba yếu tố tăng lên (hệ

số b11= - 0,0162, b22 = - 0,0208, b33= - 0,0195 ) Đặc biệt, sự ảnh hưởng qua lại giữa haiyếu tố tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu và thời gian trích ly cũng được thể hiện khá rõ ( hệ số

b13 = 0,0069)

f là hệ số gia tăng, đây là số đo tuyệt đối thể hiện tính thích ứng của mô hình trên toànmiền đã chọn Nếu hệ số f nằm trong khoảng 1,00 - 2,50 thì chứng tỏ ma trận thựcnghiệm đã chọn là hoàn toàn thích ứng và ngược lại nếu hệ số này  2,5 thì cần phải chọnlại ma trận hoặc phải chọn lại các điểm giới hạn Tuy nhiên, theo kết quả thu được thì fđều có giá trị từ 1,0 -1,20; điều này chứng tỏ ma trận đã chọn là hoàn toàn thích ứng

Từ đó, xác định được phương trình hồi quy thực nghiệm đối với đại lượng Ynhư sau:

Y= 0,1847 + 0,0055X1 + 0,0123X2 + 0,0096X3 – 0,0162X12 – 0,0208X22 –0,0195 X32 0,0058X1X2 + 0,0069 X1X3 – 0,0165 X2X3

Từ phương trình thu được tiến hành vẽ bề mặt đáp ứng của khối lượng DNJ (Y) đối với các

yếu tố ảnh hưởng như sau:

Hình 4.1: Biểu đồ bề mặt đáp ứng và đường đồng cấp DNJ theo tỷ lệ dung môi/

nguyên liệu và nhiệt độ trích ly khi cố định thời gian ở 24 giờ

Từ hình 4.1 cho thấy, khối lượng DNJ cao nhất ứng với khoảng X1= -0,20,5 và X2=00,6, tương ứng với khoảng tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu từ 13,5/1 15/1 và nhiệt độtrích ly từ 40 460C

Hình 4.2: Biểu đồ bề mặt đáp ứng và đường đồng cấp DNJ theo tỷ lệ dung môi/

Từ hình 4.2 nhận thấy, khối lượng DNJ cao nhất ứng với khoảng X1= -0,050,55 và

X3= 00,6 tức là ở khoảng tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu từ 14/1 15/1 và thời gian trích ly

là 24 -27giờ

Hình 4.3: Biểu đồ bề mặt đáp ứng trích ly DNJ theo nhiệt độ và thời gian trích ly khi

cố định tỷ lệ dung môi / nguyên liệu = 14/1

Với kết quả cho thấy, khối lượng DNJ cao nhất ứng với khoảng X2= -0,1 0,55 và

X3= -0,20,5, tức là ở nhiệt độ trích ly từ 40  460C và thời gian từ 23 26 giờ

Từ đây chúng tôi tiến hành giải bài toán tối ưu hóa để tìm ra điểm tối ưu với hàm

mong đợi DNJ là 0,185 Kết quả thu đượcnđược trình bày ở các bảng sau:

Bảng 4.10: i m t i u c a các h m áp ng Điểm tối ưu của các hàm đáp ứng ểm tối ưu của các hàm đáp ứng ối ưu của các hàm đáp ứng ư ủa nồng độ enzim đến khả năng trích ly DNJ từ lá dâu tằm ành phẩm đ ức sau:

X1 0,396798 Tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu 14,8