Nghiên cứu các hợp chất isoflavone chiết xuất từ củ sắn dây pueraria thomsonii benth

Một trong số các nhóm chất được chứng minh là có tác dụng chữa bệnh của sắn dây là các dẫn chất thuộc nhóm isoflavone có hoạt tính estrogen, hay còn gọi là các phytoestrogen.. Puerosid A

TrÇn ThÞ Xu©n- LuËn v¨n cao häc n¨m 2005

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

-

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC

NGHIÊN CỨU CÁC HỢP CHẤT ISOFLAVONE

CHIẾT XUẤT TỪ CỦ SẮN DÂY TRỒNG PUERARIA

THOMSONII BENTH

TRẦN THỊ XUÂN

HÀ NỘI 2005

TrÇn ThÞ Xu©n- LuËn v¨n cao häc n¨m 2005

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

-

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC

NGHIÊN CỨU CÁC HỢP CHẤT ISOFLAVONE CHIẾT XUẤT TỪ CỦ SẮN DÂY TRỒNG

PUERARIA THOMSONII BENTH

TrÇn ThÞ Xu©n- LuËn v¨n cao häc n¨m 2005

LỜI CẢM ƠN

Bản luận văn này là kết quả những nghiên cứu của em được thực hiện dưới sự hướng dẫn của TS Đỗ Thị Hoa Viên Nhân dịp này cho phép em được bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS Đỗ Thị Hoa Viên, người đã trực tiếp chỉ bảo và giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện luận văn

Em xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ nhiệt tình của cán bộ phòng thí nghiệm Công nghệ bảo vệ môi trường, thuộc Liên hiệp Khoa học sản xuất công nghệ mới, tập thể cán bộ phòng Đông y thực nghiệm, Viện Y học cổ truyền Việt Nam

Em cũng xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ tận tình của các thầy cô giáo

và cán bộ của Viện Công nghệ sinh học và Thực phẩm cùng gia đình và bạn bè

đã động viên, hỗ trợ em về mặt phương tiện, hoá chất, sức lực cũng như tinh thần trong thời gian qua

Do thời gian thực hiện có hạn nên luận văn này không tránh khỏi những thiếu sót, em rất mong nhận được sự đóng góp ý kiến và chỉ bảo của các thầy các cô

Một lần nữa em xin chân thành cảm ơn mọi sự giúp đỡ quý báu đó

Hà Nội ngày 10 tháng 11 năm 2005

Học viên

Trần Thị Xuân

TrÇn ThÞ Xu©n- LuËn v¨n cao häc n¨m 2005

1.2.1 Cấu tạo hoá học 13

1.2.3 Tác dụng sinh học của các isoflavone 16

1.2.3.2 Hoạt tính chống oxy hoá (antioxydant) 18

1.2.3.5 Tác dụng phòng chống các biểu hiện rối loạn hoocmon ở

TrÇn ThÞ Xu©n- LuËn v¨n cao häc n¨m 2005

2.2.1 Nghiên cứu chiết xuất hỗn hợp isoflavone 32

2.2.4 Nghiên cứu hoạt tính chống oxy hoá của hỗn hợp isoflavone có

2.2.5 Nghiên cứu in vivo tác dụng nội tiết kiểu estrogen của cao chiết

3 2.1 3 Nghiên cứu lựa chọn nồng độ dung môi chiết xuất 39

3 2.1 4 Nghiên cứu lựa chọn tỷ lệ nguyên liệu và dung môi

3 2.1 5 Nghiên cứu lựa chọn thời gian chiết 41

3 3 Phân tích định tính isoflavone trong sắn dây trồng và sắn dây mọc

3 4 Phân tích định lượng isoflavone trong sắn dây trồng và sắn dây mọc hoang bằng phương pháp sắc ký bản mỏng và sắc ký lỏng cao áp 45

TrÇn ThÞ Xu©n- LuËn v¨n cao häc n¨m 2005

3.4.1 Phân tích định lượng isoflavone từ sắn dây trồng và sắn dây mọc

3.4.2 Phân tích định lượng isoflavone từ sắn dây trồng và sắn dây 48 mọc hoang bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC)

3 5 Nghiên cứu hoạt tính chống oxy hoá của hỗn hợp isoflavone chiết xuất 59

từ sắn dây

3.5.1 Nghiên cứu hoạt tính chống oxy hoá của hỗn hợp isoflavone chiết xuất từ sắn dây bằng phương pháp Peroxydaza 59 3.5.1 Nghiên cứu hoạt tính chống oxy hoá của hỗn hợp isoflavone chiết xuất từ sắn dây bằng phương pháp Catalaza 62

3 6 Nghiên cứu in vivo tác dụng nội tiết kiểu estrogen của cao chiết

TrÇn ThÞ Xu©n- LuËn v¨n cao häc n¨m 2005

MỞ ĐẦU

Sắn dây là một loài cây thuốc lâu đời ở Việt Nam và được trồng khá phổ biến từ vùng miền núi đến đồng bằng Từ lâu, y học dân gian đã coi sắn dây như một loại thuốc có thể chữa được nhiều chứng bệnh như cảm sốt phong nhiệt, kiết lỵ kèm theo sốt, giải nhiệt,

Một trong số các nhóm chất được chứng minh là có tác dụng chữa bệnh của sắn dây là các dẫn chất thuộc nhóm isoflavone có hoạt tính estrogen, hay còn gọi là các phytoestrogen Đây là một nhóm hoạt chất đa dạng có nguồn gốc từ thực vật mà những chất này có cấu trúc và chức năng tương tự như hoocmon estrogen của động vật có vú, có khả năng thay thế estrogen trong cơ thể phụ

nữ

Các phytoestrogen có tác dụng ngăn ngừa các biểu hiện rối loạn hoocmon cũng như làm giảm nguy cơ mắc các bệnh về tim mạch, loãng xương, ung thư

vú, ở phụ nữ thời kỳ tiền mãn kinh và cả ung thư tiền liệt tuyến ở nam giới

Vì vậy, nhiều nghiên cứu đã xem phytoestrogen như một sự lựa chọn cho giải pháp thay thế hoocmon ( Hormone Replacement Therapy- HRT ) và giải pháp thay thế estrogen (Estrogen Replacement Therapy- ERT )

Ở Việt Nam, sắn dây có 5 loài, phổ biến nhất là loài Pueraria thomsonii

Benth được trồng để làm thực phẩm và làm thuốc Để góp phần nghiên cứu và khai thác các hoạt chất có hoạt tính sinh học từ sắn dây, chúng tôi đã tiến hành

chiết xuất và nghiên cứu các phytoestrogen từ củ sắn dây Pueraria thomsonii

Benth và sắn dây mọc hoang tại tỉnh Hoà Bình

Trên cơ sở hướng nghiên cứu đã chọn, luận văn được chia thành 3 chương: Chương 1: Tổng quan

Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương 3: Kết quả và bàn luận

TrÇn ThÞ Xu©n- LuËn v¨n cao häc n¨m 2005

Ảnh 1.1: Cây sắn dây trồng

Ảnh 1.2: Cây sắn dây mọc hoang

TrÇn ThÞ Xu©n- LuËn v¨n cao häc n¨m 2005

1.1.2 Đặc điểm hình thái:

Sắn dây thuộc loại dây leo, có thể dài tới 10m, rễ phát triển to lên thành

củ, có nhiều bột Thân cành hơi có lông Lá kép, mọc so le, gồm 3 lá chét, lá chét hình trứng rộng, đầu nhọn, mép nguyên hoặc chia thành 23 thuỳ, phiến lá chét dài 715 cm, lá chét giữa lớn hơn, có lông áp sát ở cả hai mặt, cuống lá kép dài 1,31,6 cm

Cụm hoa mọc ở kẽ lá thành chùm dài 1530cm, hoa thơm, màu xanh lơ hoặc xanh tím; đài hình chuông, có lông áp sát màu vàng, chia 4 răng, có 1 răng rộng hơn; tràng có cánh ngắn; nhị một bó; bầu dài gấp hai lần vòi nhuỵ, có lông mịn

Quả đậu, dẹt, dài khoảng 810cm, thắt lại giữa các hạt, có nhiều lông màu vàng nâu

Cây ra hoa vào tháng 910, đậu quả vào tháng 1112 [15]

1.1.3 Phân bố, thu hái:

Sắn dây vốn có nguồn gốc từ hoang dại, thường mọc ở ven rừng kín hoặc theo hành lang ven suối

Cây có vùng phân bố rộng từ Đông Ấn Độ đến Mianma, Trung Quốc, Triều Tiên, Nhật Bản,Việt Nam, Lào, Campuchia, Thái Lan, Malaysia Hiện nay sắn dây đã trở thành cây trồng phổ biến ở Trung Quốc, Việt Nam, Lào và hầu hết các nước ở vùng Đông Nam Á

Qua quá trình chọn giống và nhân trồng ở nhiều nơi, người ta đã tạo ra nhiều giống sắn dây khác nhau

Ở Việt Nam, sắn dây mọc hoang ở nhiều miền rừng núi nước ta và cũng được trồng ở nhiều nơi để lấy củ ăn và chế biến bột sắn dây làm thuốc [15]

Cây ưa sáng, có thể sinh trưởng phát triển tốt trên nhiều loại đất và ở các vùng khí hậu khác nhau Cây sinh trưởng phát triển mạnh trong mùa mưa ẩm (xuân- hè và hè- thu), chịu được hạn do có hệ thống rễ củ phát triển

TrÇn ThÞ Xu©n- LuËn v¨n cao häc n¨m 2005

Cây trồng thường có hoa vào năm thứ hai Ở những nơi đất tốt và có giá thể leo đầy đủ, cây có thể ra hoa ngay trong năm đầu tiên Sắn dây có khả năng tái sinh khoẻ, trước khi vào thời kỳ lụi đông, người ta cắt bỏ phần thân già để sang năm cây mọc chồi mới Từng đoạn thân, cành bánh tẻ đem vùi xuống đất cũng có khả năng nảy mầm

Sắn dây trồng sau một năm có thể thu hoạch Nếu cây sinh trưởng kém có thể để đến mùa đông năm sau Cần thu hoạch lúc cây tàn nhưng chưa nảy mầm trở lại

Rễ củ thu hái từ cuối tháng 10 đến tháng 34 năm sau Khi đào củ chú ý không làm củ bị đứt, gãy Củ đào xong được rửa sạch đất cát, bóc bỏ lớp vỏ bên ngoài, cắt thành từng khúc dài 1015cm Nếu đường kính rễ quá to thì bổ dọc làm đôi,

có khi thái thành từng miếng dày 0,51cm Xông diêm sinh rồi phơi hoặc sây khô Nếu chế biến bột sắn dây thì giã rễ nhỏ, gạn lấy tinh bột, lọc nhiều lần, phơi khô [15]

1.1.4 Cách trồng:

Sắn dây không đòi hỏi môi trường sống khắt khe nhưng muốn có năng suất cao, nên trồng ở chỗ có đủ ánh sáng, tầng đất dày, tơi xốp, nhiều mùn, tiện tưới tiêu

Sắn dây được nhân giống bằng đoạn thân Về mùa đông, trước khi đào

củ, chọn đoạn thân bánh tẻ ở giữa để làm giống

Đào thành hố sâu 50cm, rộng 11,2m, dùng rơm rác ủ mục, phân chuồng hoai, tro bếp trộn với đất cho vào gần đầy hố Sau đó đặt mầm giống, lấy đất nhỏ lấp bằng miệng hố rồi phủ rơm rạ và tưới ẩm Khi cây mọc, tiả bớt mầm, để lại mỗi gốc 23 mầm khoẻ nhất và cho leo vào thân cây gỗ ở xung quanh

Khi cây đã leo lên giàn, dùng đất mùn, tro, phân mục trộn lẫn đắp vào gốc cho cao hơn mặt đất Nói chung, sắn dây không yêu cầu chăm bón quá đặc biệt, ngoài việc giữ gìn cho đất đủ ẩm và không bị úng ngập

TrÇn ThÞ Xu©n- LuËn v¨n cao häc n¨m 2005

Sắn dây là cây leo thân dài có nhiều đốt, dễ ra rễ từ các đốt thân Nếu để

bò lan trên mặt đất, rễ phụ ra nhiều, củ sẽ nhỏ Vì vậy nên dùng cọc làm giàn cho dây leo Giàn leo cần làm sớm khi cây mới mọc khỏi mặt đất; làm quá chậm, dây dài cuốn vào nhau khó chăm sóc Nếu không có cọc làm giàn leo, có thể để cây bò trên mặt đất, nhưng phải thường xuyên nhấc dây không để rễ phụ bám xuống đất

Sắn dây là cây ưa phân bón, càng bón thúc nhiều càng tốt Chủ yếu dùng phân chuồng, tro bếp, kali hoặc nước phân, nước giải Phân chuồng và tro bếp

có thể bón theo rạch, cách gốc 1015 cm, rắc phân rồi phủ đất lại

Khi mầm dài có thể bấm ngọn để kích thích ra nhiều chồi nhánh và lá, tăng khả năng quang hợp Nếu để 2 năm thu hoạch, đến năm thứ hai cây ra hoa Khi cuống hoa mọc dài 710 cm cần ngắt bỏ Nếu để cây ra hoa, củ sẽ không lớn tiếp và bị xơ, rỗng ruột [15]

1.1.5 Thành phần hoá học:

Trong củ sắn dây có chứa 1215% tinh bột (củ tươi) đến 40% (củ khô ), các chất saponosid, flavonoid Trong dây và lá có các thành phần sau: protein 16,3%; lipid 1,8%; gluxit31,1%; xenllulo 31,3% và nhiều axit amin, đáng chú ý

là axit asparaginic, axit glutamic, prolin, leucin [6]

Trong rễ sắn dây, người ta quan tâm đến các flavonoid có hoạt tính estrogen Đó là các dẫn chất isoflavonoid như puerarin, daidzein, genistein, daidzin, daidzein 7- 4-diglucosid, 4-methyl puerarin Bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng và sắc ký lỏng cao áp, nhiều hợp chất khác đã được phân lập và xác định như formononetin, 3'-hydroxy puerarin; 3' methoxy puerarin; 8C- apiosyl (1→6) glucosid của daidzein và genistein

Một dẫn chất coumestan là puerarol cũng được phân lập từ rễ củ

Kinjo, Junei, Kurrusawa Junichi đã phân tích thành phần hoá học trong rễ củ sắn dây thấy ngoài các 8C- apiosyl (1→ 6) glucosid của daidzein và genistein còn phát hiện 13 isoflavonoid (CA.108, 1988, 183644K) Hai chất isoflavon

TrÇn ThÞ Xu©n- LuËn v¨n cao häc n¨m 2005

dime kudzuisoflavon A và B được Hakamatsuka, Takashi, Shinkai Keujii phát hiện trong tế bào sắn dây nuôi cấy mô [15]

O

O

Từ hoa sắn dây, người ta chiết được một saponin triterpenic có cấu trúc xác định là 3- 0- sophoradiol Cũng từ hoa, Kinjo Junei,Takeshita Takashi đã chiết được một dẫn chất glucosid tryptophan

N

O

CH2OH

OH OH

OH

COOH

H N

O

Me

Glucosyl tryptophan

1.1.6 Tác dụng dược lý của sắn dây trong y học cổ truyền:

Trong y học cổ truyền, sắn dây được dùng để chữa các bệnh cảm sốt phong nhiệt, cổ gáy cứng đau, sởi mọc không đều, viêm ruột, kiết lỵ kèm theo sốt, khát nước,

TrÇn ThÞ Xu©n- LuËn v¨n cao häc n¨m 2005

Củ sắn dây: còn gọi là cát căn, vị ngọt, tính bình, không độc, chủ trị những chứng tiêu khát, thân thể nóng nảy, nôn mửa, huyết lỵ, giải được tửu độc, mụn nhọt, làm mau lành bệnh sởi,

Cát căn giã sống vắt lấy nước tính rất hàn, chủ trị chứng khát nước, các chứng nhiệt độc,

Cát diệp (lá sắn dây): giã nhỏ đắp vào những chỗ bị thương có tác dụng cầm máu, vò với nước gạn uống chữa ngộ độc nấm Lá tươi giã nát dùng làm thuốc trị rắn cắn

Cát phấn (bột sắn dây): được dùng để pha với nước có đường uống vào mùa hè có tác dụng giải nhịêt, làm mát cơ thể, trừ nhiệt khi bị sốt nóng, sưng cổ họng, Ngoài ra, nó còn được dùng làm chất kết dính trong bào chế thuốc viên

vì nó có tính chất giúp cho thuốc kết dính đồng thời lại dễ phân rã để thuốc chóng tác dụng [15]

Cát hoa (hoa sắn): giải được men rượu và chất độc của rượu Dùng cát hoa phơi khô, tán thành bột, uống hết một thìa thì uống rượu rất ít bị say Hoa sắn dây với liều 410g sắc nước uống chữa say rượu, tiêu chảy ra máu, trĩ, [13]

1.1.7 Tác dụng dược lý của sắn dây trong y học hiện đại:

Tác dụng đối với tim mạch:

Cao sắn dây với liều 750 mg/kg tiêm tĩnh mạch có khả năng đối kháng với tác dụng kích thích tim của isoprenalin, ngoài ra còn làm giảm nhịp tim và gây hạ huyết áp Sắn dây còn chữa bệnh cao huyết áp với liều dùng 1015 gam sắc nước uống

Trong y học hiện đại, gần đây ở Trung Quốc, người ta dùng sắn dây chữa bệnh mạch vành, các cơn đau thắt ngực dưới dạng viên Mỗi viên chứa 10mg flavon toàn phần, mỗi lần uống 13viên, ngày uống 34 lần

Thuốc đã được dùng điều trị cho 71 bệnh nhân, quan sát trong 48 tuần, kết quả đạt 68,9%

TrÇn ThÞ Xu©n- LuËn v¨n cao häc n¨m 2005

Tác dụng đối với hệ thần kinh:

Nước sắc sắn dây cho chuột nhắt trắng uống với liều 6 gam/kg có tác dụng cải thiện hiện tượng trí nhớ bị tổn thương do scopolamin gây nên

Trong điều trị tai bị điếc đột ngột, người ta dùng dạng chiết cồn từ sắn dây và bào chế dưới dạng viên, mỗi viên tương đương 1,5 gam dược liệu

Tác dụng hạ đường huyết :

Puerarin với liều 250 -500 mg/kg cho thẳng vào dạ dày trên chuột nhắt trắng thực nghiệm gây đường huyết tăng cao bằng alloxan, có tác dụng làm hạ đường huyết, liều càng lớn tác dụng càng mạnh

Tác dụng chống ung thư:

Dạng chiết cồn từ sắn dây với liều 10gam/kg trên động vật thí nghiệm có tác dụng ức chế nhất định sự phát triển của tế bào sarcom 180, u báng và tế bào ung thư phổi Daidzein với nồng độ 14 g/ml có tác dụng ức chế sự tăng trưởng của tế bào HL.60 [ 15]

1.1.8 Một số bài thuốc có sắn dây: [10]

- Chữa mạo cảm sốt:

Bột sắn 8 gam, ma hoàng 5 gam, quế chi 4 gam, đại táo 4 gam, thược dược 4 gam, sinh khương 5 gam, cam thảo 4 gam, nước 600 ml, sắc còn 200 ml, chia 3 lần uống trong ngày

- Chữa sởi mọc không đều ở trẻ em:

Sắn dây 5  10 gam; thăng ma, cam thảo, ngưu bàng tử mỗi thứ 10 gam Sắc nước uống

- Chữa viêm ruột, viêm dạ dày, lỵ kèm theo sốt:

Sắn dây, hoàng cầm, hoàng liên, cam thảo đều chế thành cao rồi dập viên 0,632 gam, mỗi viên tương đương 2 gam dược liệu Mỗi lần uống 3  4 viên, ngày uống 3 lần

TrÇn ThÞ Xu©n- LuËn v¨n cao häc n¨m 2005

- Chữa hạ sốt, giảm đau:

Sắn dây, bạch chỉ, địa liền điều chế dạng viên Mỗi viên gồm 0,12 gam sắn dây; 0,1 gam bạch chỉ; 0,03 gam địa liền Uống mỗi lần 23 viên, mỗi ngày dùng 23 lần

1.2 Các hợp chất isoflavonoid:

1.2.1 Cấu tạo hoá học:

Khung cacbon của flavonoid gồm 2 vòng benzen A, B và 1 vòng pyran C Vòng A kết hợp vòng C tạo thành khung croman

Vòng B nối với vòng C ở vị trí C-3 tạo thành hợp chất isoflavonoid

Bảng 1.1: Phân loại các Flavonoid

Flavonoid

Euflavonoid Có gốc aryl ở vị trí C-2 Isoflavonoid Có gốc aryl ở vị trí C-3 Neoflavonoid Có gốc aryl ở vị trí C-4

Hình 1.1: Cấu trúc hoá học chung của các isoflavonoid

Isoflavonoid bao gồm nhiều nhóm khác nhau: Isoflavan, isoflav-3-en,

TrÇn ThÞ Xu©n- LuËn v¨n cao häc n¨m 2005

isoflavan-4- ol, isoflavanon, isoflavone, retenoid, pterocarpan, coumestan, 3- arylcoumarin, coumaronochromen, coumaromachromon,

TrÇn ThÞ Xu©n- LuËn v¨n cao häc n¨m 2005

1.2.2 Các isoflavone trong sắn dây:

Các dẫn chất có trong rễ sắn dây gồm có rất nhiều loại:

puerarin, daidzein, genistein, daidzin, daidzein-7-4-diglucosid, 4-methyl puerarin,

Puerarin

Daidzein-7-4’-diglucoside

Genistein

Từ rễ củ, người ta cũng phân lập được một dẫn chất coumestan là puerarol

và hai hợp chất glucosid nhân thơm là puerosid A và puerosid B

TrÇn ThÞ Xu©n- LuËn v¨n cao häc n¨m 2005

Puerarol

1

Puerosid A

Puerosid B

1.2.3 Tác dụng sinh học của các chất isoflavone:

Trong cơ thể sống, hoạt tính sinh học của các dẫn chất thuộc nhóm isoflavone được thể hiện nhờ khả năng dập tắt các gốc tự do, kìm hãm quá trình oxy hoá dây chuyền, tham gia vào quá trình vận chuyển điện tử, khả năng tạo phức với các ion kim loại, liên kết với nhiều enzym và làm thay đổi hoạt tính của các enzym đó

TrÇn ThÞ Xu©n- LuËn v¨n cao häc n¨m 2005

Các gốc tự do như HO*, ROO* sinh ra trong tế bào bởi nhiều nguyên nhân và khi sinh ra cạnh DNA sẽ gây ra những ảnh hưởng nguy hại như gây biến dị, huỷ hoại tế bào, gây ung thư, tăng quá trình lão hoá [19]

Nhiều công trình nghiên cứu đã chứng minh rằng quá trình chuyển hoá trong cơ thể động vật ăn cỏ phụ thuộc khá nhiều vào các flavonoid có chứa trong thức ăn, đồng thời các flavonoid cũng là những hoạt chất chủ yếu dùng cho người (Harbone1975, Kuchman1970, Havaleen 1983)

Sau đây là một số tác dụng sinh học chủ yếu của các isoflavone

1.2.3.1 Hoạt tính hoocmon:

Cơ thể có hai hệ thống chính để điều hoà hoạt động các chức năng: đó là

hệ nội tiết và hệ thần kinh Hệ nội tiết điều hoà hoạt động chức năng bằng những chất gọi là kích tố hay hoocmon luân chuyển theo máu, bạch huyết và dịch ngoại bào

Tuyến nội tiết là loại tuyến không có ống dẫn, chất tiết từ tế bào truyền trực tiếp vào máu hoặc bạch huyết đi khắp cơ thể, chúng có tác dụng sinh học cao, điều hoà các quá trình sinh lý quan trọng như sinh trưởng, phát dục, sinh sản, Cơ thể cần lượng hoocmon rất nhỏ nhưng lại vô cùng cần thiết cho các hoạt động sinh lý Khi lượng hoocmon nhiều quá hoặc ít quá đều dẫn tới trạng thái bệnh lý: ưu năng hay nhược năng tuyến nội tiết

Estrogen do buồng trứng (tuyến sinh dục) tiết ra theo máu đi khắp cơ thể động vật cái, được niêm mạc tử cung tiếp nhận do có những chất thụ cảm đặc hiệu với estrogen Trong nội mạc tử cung có khoảng 2000 - 2500 cấu tạo thụ cảm tiếp nhận estrogen (estrogen receptor - ER)

Trong cơ thể động vật cái, estrogen có nhiều tác dụng sinh lý như:

- Làm tăng sinh tế bào niêm mạc âm đạo tích luỹ nhiều glycogen, tăng sinh sừng tử cung, ống dẫn trứng do tăng sinh tổng hợp protein qua cơ chế hoocmon-gen (hoocmon tác dụng thông qua ảnh hưởng đến gen để điều hoà sự tổng hợp protein) Lượng estrogen trong máu tăng cao nhất khi động dục

TrÇn ThÞ Xu©n- LuËn v¨n cao häc n¨m 2005

- Làm hệ thống ống dẫn tuyến vú phát triển

- Gây hứng phấn vỏ não: làm xuất hiện động dục

- Đối với cơ trơn tử cung: trong thời kỳ động dục tăng nhu động cơ tử cung tạo điều kiện cho tinh trùng di động nhanh hơn khi thụ tinh, [20]

Ở phụ nữ thời kỳ mãn kinh có sự suy giảm nội tiết tố estrogen (do sự "lão hoá" của buồng trứng) gây mất cân bằng hoocmon, có thể dẫn đến những biểu hiện bệnh lý như chảy máu, bốc hoả, loãng xương,

Genistein được thừa nhận là có thụ thể bề mặt giống như estrogen- một hoocmon sinh dục nữ, do tuyến nội tiết bài vào máu và có tác dụng sinh lý trên các tế bào của cơ thể Genistein và estrogen cạnh tranh với nhau, khi lượng estrogen nhiều hơn mức cần thiết thì genistein được gan loại bỏ, nhưng khi lượng hoocmon này giảm đi (thời kỳ mãn kinh) thì genistein sẽ bù đắp vào sự thiếu hụt đó, làm giảm bớt các ảnh hưởng bất lợi do thiếu nội tiết tố estrogen gây ra

1.2.3.2 Hoạt tính chống oxy hoá (antioxydant)

Một trong những cơ sở sinh hoá quan trọng nhất để các isoflavonoid nói chung và các isoflavone nói riêng thể hiện hoạt tính sinh học của chúng là kìm hãm các quá trình oxy hoá dây chuyền sinh ra bởi các gốc tự do hoạt động

Các gốc tự do được sinh ra trong cơ thể thường kém bền và có khả năng phản ứng rất lớn, chúng phá huỷ cấu trúc các phân tử lớn cạnh nó như ADN (liên quan đến bệnh ung thư) và các tổ chức lipit của màng tế bào (là nguyên nhân dẫn đến các bệnh về tim mạch)

Phản ứng của gốc tự do là nguyên nhân sinh ra quá trình peroxyt hoá các hợp chất hữu cơ Chúng thường là tác nhân khơi mào cho phản ứng dây chuyền, tiếp đó các gốc thứ cấp được sinh ra, phản ứng với các phần tử ở cạnh tạo ra phản ứng dây chuyền, , cứ thế nhân mãi cho tới khi tiêu tốn hết cơ chất

Trong cơ thể người, ngoài nước thì thành phần nhiều nhất là các tổ chức màng được cấu tạo chủ yếu từ các axit béo không no, vì vậy các peroxyt hình

TrÇn ThÞ Xu©n- LuËn v¨n cao häc n¨m 2005

thành chủ yếu là peroxyt lipit Kết quả là các cơ quan, tổ chức bị phá huỷ gây nên những biến đổi bệnh lý nghiêm trọng như ung thư, hoại tử , rối loạn tiêu hoá, Vì vậy, việc ngăn chặn, loại bỏ, dập tắt các gốc tự do là ngăn chặn phản ứng gốc, loại bỏ các gốc tự do thứ cấp Khi dập tắt mạch, các gốc phản ứng với nhau tạo ra những sản phẩm bền, các gốc mất đi, mạch phản ứng không thể lan truyền được nữa

Như vậy, sự tăng số lượng các gốc tự do hoạt động trong tế bào của cơ thể làm cho các phân tử sinh học bị biến đổi, đó là nguyên nhân phát sinh nhiều bệnh lý đối với cơ thể

Để chống lại tác hại gây ra bởi các gốc tự do đó, trong mỗi cơ thể đều có hệ thống các chất chống oxy hoá nội sinh như các Superoxy dismutaza (SOD), Glutathion peroxydaza, ngoài ra còn có các chất chống oxy hoá được đưa vào

cơ thể dưới dạng thức ăn, thuốc uống như vitamin C, vitamin P, vitamin E, các steroid, các polyphenol, trong đó các hợp chất flavonoid được coi là chất chống oxy hoá lý tưởng đối với con người

Người ta thấy rằng genistein ức chế hư hại DNA bị oxy hoá bởi tia UV qua con đường thu dọn các gốc oxy đơn trị hay liên kết tới vị trí đặc hiệu để ngăn cản DNA khỏi sự hư hại vì oxy hoá

Khi đưa isoflavonoid vào cơ thể sẽ sinh ra các gốc tự do bền vững hơn các gốc tự do được hình thành trong các quá trình bệnh lý (viêm nhiễm, ung thư, lão hoá, ) chúng có khả năng giải toả các điện tử trên mạch vòng của nhân thơm và hệ thống nối đôi liên hợp, làm triệt tiêu các gốc tự do hoạt động

Các gốc tự do tạo bởi các flavonoid phản ứng với các gốc tự do hoạt động và trung hoà chúng nên không tham gia vào dây chuyền phản ứng oxy hoá tiếp theo Kết quả làm hạn chế quá trình bệnh lý do cắt đứt dây chuyền phản ứng oxy hoá

TrÇn ThÞ Xu©n- LuËn v¨n cao häc n¨m 2005

Ngoài ra, các isoflavonoid còn kìm hãm sự phát triển các gốc tự do hoạt động bằng cách liên kết với kim loại nặng chuyển tiếp như Fe2+, Cu2+, để chúng không thể xúc tác cho phản ứng Fenton sinh ra các gốc tự do hoạt động

O2 + H2 O2 → OH* + OH* + O2

Tính chất chống oxy hóa của isoflavonoid cũng bảo toàn hoạt độ các enzym có chức năng tạo cầu nối pentoza-enzym của chu trình tricacboxylic và của quá trình - oxy hoá các axit béo trong gan, tăng cường chức năng chống độc của gan, ngăn chặn sự phân huỷ phospholipid do phospholipaza A gây nên, ngăn chặn sự nhiễm mỡ trong gan và hoại tử mô gan [19]

1.2.3.3 Hoạt tính chống ung thư:

Ung thư là bệnh xuất hiện khi những tế bào tiếp tục phân chia và hình thành những tế bào mới một cách bất thường không chịu sự kiểm soát của cơ thể Bình thường các tế bào chỉ phân chia thành nhiều tế bào khi cơ thể cần Quá trình có kiểm soát này giúp cơ thể khoẻ mạnh Nếu các tế bào phân chia khi cơ thể không cần đến sẽ hình thành một khối mô Khối mô thừa có thể lành tính hay ác tính, được gọi là đám tăng trưởng hay khối u Những khối u ác tính là ung thư [8]

Khi đưa một số hợp chất isoflavonoid vào vật chủ mang khối u, người ta nhận thấy chúng có tác dụng như những tác nhân hoá trị liệu Chúng có khả năng chống u lành, u ác tính, tác dụng tốt lên hệ thống miễn dịch đối với cả miễn dịch thể và miễn dịch tế bào, có vai trò quan trọng trong việc chuyển dạng lympho bào

Đặc trưng cấu trúc cho thấy daidzein và genistein có khả năng gắn với thụ thể estrogen (estrogen recepter- ER) và các protein gắn hoocmon giới tính Do vậy chúng có tác dụng rất lớn trong việc phòng chống các bệnh ung thư liên quan đến hoocmon sinh dục như ung thư vú, ung thư tiền liệt tuyến [24]

+ Chống ung thư vú:

TrÇn ThÞ Xu©n- LuËn v¨n cao häc n¨m 2005

Ung thư vú không những là một bệnh ung thư hay gặp nhất ở phụ nữ mà còn là nguyên nhân chính gây tử vong đối với phụ nữ tại nhiều nước

Tỷ lệ tử vong do ung thư vú ở Anh và Hà Lan là 25- 35/100.000 dân, ở Nhật Bản là 1- 5/100.000 dân Ở Mỹ, mỗi năm có khoảng 180.000 trường hợp mới mắc và 44.000 trường hợp chết do ung thư vú

Tại Việt Nam, theo ghi nhận ở Hà Nội và thành phố Hồ Chí Minh năm

2000, ước tính tỷ lệ mắc ung thư vú là 17,4/100.000 dân [8]

Ảnh hưởng của hoocmon với sự phát triển của ung thư vú đã được nhiều tác giả nghiên cứu Estrogen và progestin là những hoocmon tham gia vào sự thay đổi các tế bào biểu mô tuyến vú trong quá trình sinh lý cũng như trong sinh bệnh học

Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng có mối liên hệ rõ ràng giữa chế độ

ăn uống giàu isoflavonoid và sự suy giảm tỷ lệ mắc ung thư vú ở người [8]

Các nhà nghiên cứu về dịch tễ học cũng cho thấy rằng tỷ lệ phụ nữ Nhật Bản và Trung Quốc mắc bệnh ung thư vú thấp hơn phụ nữ các nước châu Âu

Sở dĩ có sự khác nhau này là do chế độ ăn uống Một trong những thực phẩm trong chế độ ăn của người châu Á là đậu tương và các sản phẩm từ đậu tương, trong đó có chứa một lượng phong phú các isoflavone bao gồm genistein, daidzein, glycitein, và các dẫn xuất của chúng [25]

Các isoflavonoid có tác động khá phức tạp đến sự phát triển của các tế bào ung

thư vú invitro

Một báo cáo đã chỉ ra rằng, nồng độ genistein thấp có thể trung hoà hiệu quả của các hợp chất có cấu trúc tương tự là tamoxifen Tamoxifen được sử dụng trong điều trị khám cho các bệnh nhân ung thư vú do ảnh hưởng của nó như một chất kháng estrogen trong mô vú, làm chậm lại quá trình tăng sinh tế bào ung thư [23] Tuy nhiên, ở nồng độ cao, genistein có độc tính mạnh chống lại các tế bào ung thư vú theo cơ chế độc lập với ER Genistein là isoflavone duy nhất có cả hoạt tính kích thích estrogen mạnh và kìm hãm mạnh tế bào ung

TrÇn ThÞ Xu©n- LuËn v¨n cao häc n¨m 2005

thư vú phát triển [29] Điều này ủng hộ giả thiết cho rằng tiếp xúc sớm với genistein có thể ngăn cản hoạt chất gây ung thư vú

+ Chống ung thư tiền liệt tuyến:

Ung thư tiền liệt tuyến là một trong ba loại ung thư phổ biến của nam giới

và là nguyên nhân gây tử vong thứ hai trong số các bệnh ung thư của nam giới ở

Mỹ và các nước châu Âu Hiện nay chưa có biện pháp chữa trị hiệu quả khi nó

đã di căn Ung thư tiền liệt tuyến có phạm vi ảnh hưởng rất khác nhau giữa các khu vực dân cư và giữa các nước Tốc độ phát triển thấp nhất là ở châu Á, trung bình ở Trung Quốc là 1,9 người mắc bệnh/100.000 nam giới/năm [18]

Trong một vài nghiên cứu khác lại cho thấy rằng những người Nhật Bản

di cư đến Mỹ có nguy cơ mắc bệnh ung thư tiền liệt tuyến tăng Một số tác giả

đã đưa ra giả thuyết rằng đó là do chế độ ăn của người châu Á ít chất béo và đạm động vật hơn so với chế độ ăn của người phương Tây

Nghiên cứu 83 ca ung thư tiền liệt tuyến tại Mỹ vào những năm 1996-1998 cho thấy việc hấp thụ daidzein và coumestrol trong bữa ăn hàng ngày có liên quan đến việc giảm rủi ro ung thư tiền liệt tuyến [32]

Daidzein kìm hãm sự phát triển các tế bào biểu mô tiền liệt tuyến thấp ở người nhưng chất chuyển hoá của nó là equol có khả năng kìm hãm mạnh ở nồng độ micromol [31] Do vậy, chuyển hoá của daidzein thành equol có thể là yếu tố quan trọng giúp phòng chống ung thư tiền liệt tuyến từ chế độ ăn uống

Genistein đã được nghiên cứu rộng rãi hơn và dường như có nhiều triển vọng là tác nhân ngăn chặn bệnh ung thư hơn daidzein Genistein là chất ức chế

sự hoạt động của enzym protein tyrosin kinaza làm thay đổi sự sinh sản cũng như sự biến dạng tế bào Nó cũng ức chế enzym toiposomeraza II và ribosom S6 kinaza, sau đó dẫn đến làm gãy chuỗi DNA được liên kết với protein và làm dừng sự lớn lên của tế bào ung thư [23]

Các bệnh ung thư khác:

TrÇn ThÞ Xu©n- LuËn v¨n cao häc n¨m 2005

Bên cạnh sự tác động đối với ung thư vú và ung thư tiền liệt tuyến, genistein

và các isoflavone có liên quan cũng ức chế sự tăng trưởng tế bào làm giảm các bệnh: ung thư da, ung thư dạ dày, ung thư phổi, ung thư bàng quang và ung thư máu, Genistein áp chế tetradecanoyl phorbol acetate (TPA) mà chất này phát động sự gây ra ung thư da [1]

Sự ức chế tăng trưởng của các dòng tế bào ung thư dạ dày in vitro của

genistein và biochanin A liên quan đến sự kích thích con đường chuyển hoá tín hiệu dẫn đến adoptosis

Genistein liên kết với một kháng thể đơn dòng ức chế mạnh sự tăng trưởng của các tế bào ung thư máu

Genistein cũng có khả năng phá huỷ trên tế bào B của bệnh máu trắng bởi đích tấn công của nó vào enzym tyrosin kinaza được kết hợp với CD19

Đã có những khẳng định về hiệu quả bảo vệ của isoflavone với ung thư ruột kết ở nồng độ thấp, genistein khử độc pha II do enzym quinone reductaza trong các tế bào ruột kết, coumestrol và biochanin A cũng có khả năng này nhưng hiệu quả thấp hơn, còn daidzein thì không có [25]

1.2.3.4 -Tác dụng lên hệ tim mạch:

Cholesterol không phải là chất hoàn toàn gây hại cho cơ thể Nó là thành phần cấu tạo chủ yếu của màng tế bào, sợi thần kinh và của nhiều nội tiết tố trong cơ thể Ngoài ra, gan còn dùng cholesterol sản xuất ra axit mật giúp tiêu hoá thức ăn Cholesterol có hai nguồn gốc:

- Từ thức ăn hàng ngày trong thịt mỡ, trứng, chiếm 20% nhu cầu cholesterol trong cơ thể

- Do gan tạo ra chiếm 80%

Mỡ trong máu tồn tại dưới hai dạng chính là cholesterol và triglycerid

Cholesterol được mang đi trong máu nhờ kết hợp với lipoprotein Có nhiều loại lipoprotein, loại có trọng lượng phân tử cao có tên là HDL (high density lipoprotein), loại có trọng lượng phân tử thấp có tên là LDL (low density

TrÇn ThÞ Xu©n- LuËn v¨n cao häc n¨m 2005

lipoprotein), Cholesterol kết hợp với HDL, ký hiệu là HDL- C là một dạng cholesterol bảo vệ cho cơ thể chống lại quá trình xơ vữa động mạch bằng cách mang cholesterol từ trong thành mạch ra ngoài Trong khi lipoprotein cholesterol mật độ thấp LDL- C lại là thành phần gây hại do chức năng vận chuyển cholesterol từ gan tới các tế bào

Khi cholesterol trong máu tăng cao có thể dẫn tới nguy cơ mắc các bệnh

về tim mạch, đặc biệt là xơ vữa động mạch do sự tích tụ cholesterol ở bên trong động mạch làm lòng mạch bị thu hẹp lại [24]

Các nghiên cứu về dịch tễ học cho thấy bữa ăn hàng ngày giàu isoflavone

có thể làm giảm nguy cơ mắc các bệnh về tim mạch ở phụ nữ Nhật Bản [23] Điều này được giải thích có thể là do các hợp chất này kìm hãm sự oxy hoá lipoprotein trọng lượng thấp, duy trì tính chất vật lý thành động mạch

Các flavonoid từ thực vật nói chung và các isoflavonoid nói riêng đều có hoạt tính vitamin P có tác dụng chống bệnh chảy máu, làm tăng sức bền và tính đàn hồi của mao mạch, ngăn cản không cho protein của máu thẩm dịch qua các

mô khác, có tác dụng dự phòng vỡ mao mạch gây xuất huyết, phù thũng

Ngoài ra, puerarin, daidzein và dạng chiết cồn từ sắn dây, trên chuột cống trắng và chuột nhắt trắng với những mô hình gây loạn nhịp tim bằng aconitin, bari clorit, calci clorid và thắt động mạch vành trái trước đều có tác dụng đối kháng rõ rệt với loạn nhịp tim do các tác nhân trên gây ra So sánh tác dụng của

3 dạng thuốc trên thấy rằng daidzein có tác dụng kháng loạn nhịp tim tương đối mạnh, dạng chiết cồn có tác dụng giống với daidzein; điều đó chứng tỏ daidzein

là thành phần chủ yếu có tác dụng chống loạn nhịp tim

Puerarin trên chó thí nghiệm tiêm tĩnh mạch với liều 20 mg/kg có tác dụng hạn chế phạm vi nhồi máu cơ tim thực nghiệm

Trên lâm sàng ở những bệnh nhân nhồi máu cơ tim cấp tính, puerarin tiêm tĩnh mạch với liều 45 mg/kg sau đó 4 giờ tiếp tục tiêm truyền tĩnh mạch với liều 45 mg/kg, kết quả các chỉ số tiêu hao oxygen của cơ tim, men phosphocreatin-

TrÇn ThÞ Xu©n- LuËn v¨n cao häc n¨m 2005

kinaza và phạm vi nhồi máu cơ tim đều giảm so với lô đối chứng Flavon toàn phần của sắn dây, tiêm tĩnh mạch với liều 5-30 mg/kg trên chó, mèo gây mê và không gây mê đều có tác dụng hạ huyết áp [15]

1.2.3.5 Tác dụng phòng chống các biểu hiện rối loạn hoocmon ở phụ nữ thời kỳ mãn kinh

Ở phụ nữ thời kỳ tiền mãn kinh và mãn kinh thường có các biểu hiện do

sự suy giảm nội tiết tố estrogen gây nên như: tụ máu nóng, ra mồ hôi, đau nhức, mỏi mệt, khô âm đạo, rối loạn tiêu hoá, loãng xương, [24]

Các thử nghiệm y học đã chỉ ra rằng, chế độ ăn uống giàu isoflavone có thể giúp làm giảm chứng loãng xương sống ở phụ nữ thời kỳ mãn kinh Điều này được giải thích là do các isoflavone có hoạt tính estrogen có tác dụng kích thích sự hình thành các tế bào tạo xương, kìm hãm sự hấp thụ lại tế bào huỷ xương mà cơ chế chính là kích thích tăng sinh tế bào tạo xương, bảo vệ các tế bào này không bị oxy hoá

Nghiên cứu gần đây tại Tây Ban Nha với 190 phụ nữ ở thời kỳ mãn kinh cho thấy có sự cải thiện đáng kể về mặt thống kê liên quan đến các bệnh đường sinh dục khi bổ sung isoflavone vào bữa ăn hàng ngày dưới dạng viên con nhộng, người ta không quan sát thấy hiệu ứng phụ âm tính [23]

Các nghiên cứu về dịch tễ học cũng chỉ ra rằng phu nữ châu Á ít bị chứng bốc hoả hơn so với phụ nữ phương Tây, trung bình tỷ lệ phụ nữ thời kỳ mãn kinh bị mắc chứng bốc hoả là 70- 80% ở các nước phương Tây trong khi ở châu

Á là 20% (ở Malaixia là 57%, ở Trung Quốc là 18%, ở Singapo là 14%, )

Các nghiên cứu cũng chỉ ra rằng khi cơ thể được cung cấp 50- 80 mg isoflavone mỗi ngày có thể làm giảm 40- 50% số cơn bốc hoả

Nghiên cứu của Moscarini và cộng sự trên 90 phụ nữ mãn kinh bị mắc chứng loãng xương đã chỉ ra rằng khi sử dụng 20mg isoflavone mỗi ngày trong

12 tháng sẽ có tác dụng tương tự như việc sử dụng 100mg canxi trong phòng chống loãng xương [39]

TrÇn ThÞ Xu©n- LuËn v¨n cao häc n¨m 2005

1.3 Phytoestrogen:

Thuật ngữ này xuất hiện lần đầu tiên vào những năm cuối của thập kỷ 80 Phytoestrogen là các chất có hoạt tính estrogen có nguồn gốc từ thực vật Có ba nhóm phytoestrogen chính là isoflavone, lignan và coumestan, trong đó daidzein và genistein là những isoflavone có nhiều trong đậu tương, cỏ ba lá và sắn dây

Bảng1.3: Các nguồn phytoestrogen trong tự nhiên [25]

Cỏ ba lá Sắn dây

Vai trò của các phytoestrogen trong cây:

TrÇn ThÞ Xu©n- LuËn v¨n cao häc n¨m 2005

Tác dụng sinh học của các phytoestrogen trong cây tuy chưa được nghiên cứu một cách đầy đủ nhưng một vài nghiên cứu đã chứng tỏ các hợp chất này có khả năng kháng nấm, chống lại tia UV, chống oxy hoá, tạo sắc tố cho hoa, tham gia vào sự nảy mầm của phấn hoa [28]

Vai trò của các phytoestrogen đối với cơ thể người:

Các nghiên cứu đã chứng minh rằng daidzein và genistein có hoạt tính estrogen giống như hoocmon sinh dục tự nhiên của nữ giới Tác dụng này được giải thích

là do sự gần nhau về cấu trúc của daidzein, genistein và 17 estradiol- hoocmon sinh dục nữ:

TrÇn ThÞ Xu©n- LuËn v¨n cao häc n¨m 2005

hiệu quả bảo vệ bệnh tim trong hệ thống tim mạch, bảo vệ chống lại ung thư ruột kết và sự già hoá của da (Gruber, Ruggien và Likis, 2002)

Một nghiên cứu khác ở trên người cũng cho thấy khả năng cải thiện trí nhớ của các phytoestrogen (File và cộng sự, 2002)

Con người đang cố gắng hoàn chỉnh và thay đổi cách chăm sóc sức khoẻ cũng như việc chữa trị bệnh theo cách gần với tự nhiên để hoàn thiện việc chăm sóc sức khoẻ bằng các loại thuốc có nguồn gốc tự nhiên Nhiều phụ nữ đã xem phytoestrogen như một sự lựa chọn cho giải pháp thay thế hoocmon (Hormon Replacement Therapy - HRT) và giải pháp thay thế estrogen (Estrogen Repacement Therapy - ERT)

Các triệu chứng mãn kinh đã được điều trị thành công trên 50 năm qua bằng liệu pháp điều trị hoocmon thay thế

Một nghiên cứu đã chỉ ra rằng sử dụng liệu pháp HRT có thể làm tăng mật độ khoáng của xương (Bone Mineral Density- BMD) cột sống từ 3,5- 5,0% ở phụ

nữ thời kỳ mãn kinh [29]

Nhiều phụ nữ cũng sử dụng liệu pháp HRT để kiểm soát các triệu chứng xuất hiện thời kỳ mãn kinh như chứng nóng cửa mình, khô âm đạo, Đã có nhiều nghiên cứu về mối liên quan giữa việc sử dụng estrogen và progesteron kéo dài dùng điều trị bệnh ung thư vú của phụ nữ sau mãn kinh nhưng kết quả chưa thực sự thống nhất Phần lớn các nghiên cứu đều cho rằng trong vòng 10 năm đầu sử dụng thuốc thay thế cho estrogen đều không gây phản ứng phụ

Từ việc công nhận các ảnh hưởng của estrogen có trong cơ thể người, điều này cũng không gây bất ngờ khi công nhận khả năng của phytoestrogen đối với sức khoẻ con người

Cơ chế của sự tác động:

Có hai cơ chế được đưa ra để giải thích tác dụng của phytoestrogen đối với sức khoẻ của người: cơ chế có liên quan đến gen và cơ chế không liên quan đến gen Các phytoestrogen có thể tương tác với các enzym và các thụ thể, do

TrÇn ThÞ Xu©n- LuËn v¨n cao häc n¨m 2005

cấu trúc bền vững của chúng cùng với trọng lượng phân tử thấp, chúng có thể đi xuyên qua màng tế bào

Sự tương tác này cho phép chúng liên kết với các thụ thể estrogen (estrogen receptor- ER), kích thích thụ thể, gây cản trở sự chuyển hoá hoocmon, làm biến đổi cấu trúc ER,

Một số cơ chế có liên quan đến gen bao gồm: hoạt tính estrogen và kháng estrogen (do các phytoestrogen có cấu trúc tương tự với estrogen nội sinh trong

cơ thể) tác động đến các ER,

Cơ chế không liên quan đến gen, không có các ER bao gồm: sự phân biệt

tế bào ung thư, sự ức chế tyrosine kinaza và hoạt tính của DNA topoisomeraza,

sự ngăn chặn hình thành mạch và hiệu quả chống oxy hoá của các phytoestrogen Các phytoestrogen ức chế các enzym cần thiết cho sự chuyển hoá hoocmon, mà những hoocmon này có thể làm giảm nguy cơ ung thư, bằng hoạt tính sinh học thấp của hoocmon giới tính ở các cơ quan đích

Hoạt tính sinh học đa dạng của các phytoestrogen chính là khả năng hoạt động của chúng tương tự như hoocmon estrogen hoặc kháng estrogen Tương tự như estrogen, các phytoestrogen "bắt chước" các estrogen nội sinh và gây hoạt tính estrogen Tương tự như các chất kháng estrogen, chúng có thể ngăn cản và làm biến đổi các thụ thể estrogen và kìm hãm hoạt tính estrogen, gây hiệu quả kháng estrogen [23]

Hoạt tính sinh học của các phytoestrogen phụ thuộc vào các nhân tố như: cấu trúc của các phytoestrogen, liều lượng dùng, sự chuyển hoá riêng biệt, sự tiêu thụ các chất dược lý khác, Số lượng và loại ER, sự có mặt và vắng mặt của estrogen nội sinh cũng ảnh hưởng đến hiệu quả của phytoestrogen [25]

Cơ chế được đưa ra để giải thích cho tác dụng phòng chống bệnh tim mạch của các phytoestrogen là: sự thay đổi nồng độ lipid trong máu, sự giảm bớt việc hình thành các cục gây nghẽn mạch như ức chế hoạt động của tiểu

TrÇn ThÞ Xu©n- LuËn v¨n cao häc n¨m 2005

huyết cầu (chất nhỏ hình đĩa ở trong máu giúp máu đóng cục), tăng cường sự thông mạch và hoạt tính chống oxy hoá (Van der Schouw và cộng sự, 2000)

Cơ chế hoạt động giải thích tác dụng lên nồng độ lipid trong máu bao gồm: sự hoạt động của các thụ thể estrogen, sự giảm tổng hợp các cholesterol nội sinh, tăng cường hoạt tính của thụ thể cholesterol (Glazier và Bowman, 2001) Các isoflavone như genistein cũng hoạt động như một chất kìm hãm protein tyrosin kinaza, cơ chế này giải thích cho sự giảm hoạt động của tiểu huyết cầu (Tham và cộng sự, 1998)

Một vài cơ chế đưa ra để giải thích cho tác dụng làm giảm cholesterol của các phytoestrogen gồm: tăng cường sự bài tiết axít mật là yếu tố phụ giúp làm giảm lipoprotein mật độ thấp (LDL), tăng cường sự chuyển hoá của gan lên gấp đôi cùng với việc làm giảm LDL của các tế bào gan, tăng cường chức năng

tuyến giáp (Wroblewski Lissin và Cooke, 2000)

TrÇn ThÞ Xu©n- LuËn v¨n cao häc n¨m 2005

CHƯƠNG 2 : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu:

2.1.1 Nguyên liệu:

Nguyên liệu để tiến hành chiết xuất isoflavone là củ của loài sắn dây

trồng Pueraria thomsonii Benth và sắn dây mọc hoang tại xã Lâm Sơn, huyện

Lương Sơn, tỉnh Hoà Bình

Củ sắn dây sau khi thu hoạch được rửa sạch, cạo lớp vỏ bên ngoài, thái thành lát mỏng và đem sấy khô ở nhiệt độ 60oC đến trọng lượng không đổi Lát sắn khô được nghiền thành bột khô và bảo quản trong túi P.E Độ ẩm của bột là 4,5%, bảo quản ở nơi khô mát, thoáng gió

Ảnh 2.1: Củ sắn dây trồng Ảnh 2.2: Củ sắn dây mọc hoang 2.1.2 Hoá chất và dụng cụ thí nghiệm:

TrÇn ThÞ Xu©n- LuËn v¨n cao häc n¨m 2005

Máy quay cất dung môi

Máy khuấy từ gia nhiệt

Máy sấy chân không

Máy sắc ký lỏng cao áp

Kính hiển vi soi tế bào

Lam kính, giấy đo pH, kim tiêm, bàn mổ, pince, kéo, bông, que lấy tế bào,

2.1.3 Đối tượng sinh học:

Thử nghiệm hoạt tính estrogen trên đối tượng sinh học là chuột bạch

TrÇn ThÞ Xu©n- LuËn v¨n cao häc n¨m 2005

Chuột được chia thành 3 lô: lô chuẩn, lô chứng, lô thử

Ảnh 2.3: Lô chuột thí nghiệm 2.2 Phương pháp nghiên cứu:

2.2.1 Nghiên cứu chiết xuất hỗn hợp isoflavone

Nghiên cứu thay đổi các thông số công nghệ khác nhau để lựa chọn các thông số công nghệ thích hợp cho quy trình chiết xuất các hợp chất isoflavone

2.2.2 Phương pháp sắc ký bản mỏng (Thin Layer Chromatography- TLC)

Phương pháp sắc ký bản mỏng được dùng để đinh tính, bán định lượng hoặc định lượng hoạt chất

Sắc ký bản mỏng là một kỹ thuật tách các chất được tiến hành khi cho pha động

di chuyển qua pha tĩnh trên đó đã đặt hỗn hợp các chất cần tách Pha tĩnh là chất hấp phụ được chọn theo yêu cầu phân tích, được trải thành lớp mỏng đồng nhất

và được cố định trên phiến kính hay phiến kim loại Pha động là một hệ dung môi đơn hoặc đa thành phần được trộn với nhau theo tỷ lệ quy định Trong quá trình di chuyển qua lớp hấp phụ, các cấu tử trong hỗn hợp mẫu phân tích được

di chuyển trên lớp mỏng, theo hướng pha động với tốc độ khác nhau

Cơ chế của sự phân tách là cơ chế hấp phụ, phân bố, sàng lọc phân tử

TrÇn ThÞ Xu©n- LuËn v¨n cao häc n¨m 2005

Đại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của chất phân tích là hệ số di chuyển

Rf được tính bằng tỷ lệ giữa khoảng cách dịch chuyển của chất thử và khoảng dịch chuyển của dung môi:

2.2.3 Phương pháp sắc ký lỏng cao áp (High Performance Liquid Chromatography- HPLC)

Sắc ký lỏng cao áp là phương pháp tách trong đó pha động là một chất lỏng, còn pha tĩnh - chứa trong cột là một chất rắn đã phân chia dưới dạng tiểu phân, hoặc là một chất lỏng phủ trên chất mang dạng rắn hoặc một chất mang rắn đã được biến đổi bằng liên kết hoá học với các nhóm hữu cơ Quá trình sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay loại trừ theo kích cỡ

Thiết bị gồm: hệ thống bơm, bộ phận tiêm mẫu (bơm tiêm hoặc van tiêm), cột sắc ký, detector và máy ghi

- Bơm: áp suất 300 bar, tốc độ pha động là 0,4 ml/phút

- Cột tách là cột Superisorb C18 có chiều dài là 125 mm, đường kính trong của cột là 4 mm Vật liệu nhồi trong cột là silicagel Pha động là hỗn hợp acetonitril và nước theo tỷ lệ 1:1

TrÇn ThÞ Xu©n- LuËn v¨n cao häc n¨m 2005

- Detector UV có bước sóng có khả năng phát hiện các hydrocacbon vòng thơm Các tín hiệu thu được từ detector sẽ được chuyển đổi đến bộ xử lý số liệu

đã được chương trình hoá, do đó có thể biết đầy đủ các thông số của mẫu: thời gian lưu, chiều cao của pic, độ rộng của pic, diện tích pic,

2.2.4 Nghiên cứu hoạt tính chống oxy hoá của hỗn hợp isoflavone có trong cao chiết sắn dây

2.2.4.1 Phương pháp Peroxydaza:

Nguyên tắc của phương pháp là xác định tốc độ phản ứng oxy hoá của indigocarmin do peroxy hydro (H2O2) trong môi trường axít yếu khi có sự tham gia của enzym peroxydaza trong máu người Hoạt tính của enzym được xác định bằng thời gian cần thiết để oxy hoá indigocarmin chuyển từ màu xanh sang màu vàng

2.2.4.2 Phương pháp Catalaza:

Phương pháp này dựa trên nguyên tắc xác định tốc độ phản ứng oxy hoá của kali permanganat (KMnO4) 0,1N do peroxy hydro (H2O2) trong môi trường axít yếu khi có sự tham gia của enzym catalaza trong máu người Hoạt tính của enzym được xác định bằng thời gian cần thiết để KMnO4 từ màu tím kết hợp với H2O2 tạo thành phức chuyển sang màu hồng

2.2.5 Nghiên cứu in vivo tác dụng nội tiết kiểu estrogen của cao chiết

isoflavone từ sắn dây

Mục đích: Xem cao chiết isoflavone từ sắn dây có tác dụng nội tiết kiểu

estrogen trên động vật thí nghiệm hay không?

Tiến hành theo phương pháp Allen- Doisy

Các bước tiến hành:

Bước 1: Cố định chuột nằm sấp trên bàn mổ

Bước 2: Cắt bỏ hai buồng trứng Thủ thuật được tiến hành ở vùng hông Cắt

xong buồng trứng tiến hành khâu hai lớp, lớp cơ rồi đến lớp da

TrÇn ThÞ Xu©n- LuËn v¨n cao häc n¨m 2005

Bước 3: Sau khi cắt bỏ hai buồng trứng, chuột được nghỉ 15 ngày Đến ngày thứ

16, kiểm tra và loại bỏ đi những con còn sót lại buồng trứng

Bước 4: Chia chuột thành 3 lô thí nghiệm:

+ Lô chuẩn: Tiêm dung dịch chuẩn EDP (Estradiol- dipropionat) với liều lượng 0,05mg/1 con ( tiêm 1 lần dưới da bụng)

+ Lô chứng: Cho chuột uống nước đun sôi để nguội 0,5ml/con/ngày

+ Lô thử: Cho chuột uống với liều lượng 150 mg cao chiết/1 con/ ngày

Lô chứng và lô thử uống liền trong 7 ngày

Ngày nào cũng kiểm tra pH âm đạo để theo dõi sự xuất hiện của các tế bào sừng

TrÇn ThÞ Xu©n- LuËn v¨n cao häc n¨m 2005

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN

Độ ẩm nguyên liệu của sắn dây trồng là 65,1%

Độ ẩm nguyên liệu của sắn dây mọc hoang là 60,0%

Sau đó, lát sắn dây khô được nghiền thành dạng bột nhỏ Tiếp tục cho bột vào khay nhôm và sấy ở 600C trong máy sấy chân không đến khi khối lượng không đổi

Độ ẩm của bột sắn dây sau khi sấy là 4,5%

TrÇn ThÞ Xu©n- LuËn v¨n cao häc n¨m 2005

3.2.1.1 Nghiên cứu lựa chọn phương pháp chiết

Quá trình thu nhận cao chiết có chứa hỗn hợp isoflavone từ bột sắn dây chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố khác nhau, trong đó việc lựa chọn phương pháp chiết là yếu tố quan trọng đầu tiên trong quá trình nghiên cứu

Mỗi mẫu thí nghiệm lấy 10 gam sắn dây trồng, bổ sung 50ml etanol

Phương pháp tĩnh: Tiến hành ngâm mẫu trong dung môi

Phương pháp động: Khuấy đều các mẫu bằng máy khuấy từ

Tiến hành lọc thu dịch chiết của các mẫu, tiếp tục bổ sung dung môi lần thứ

2 và thứ 3 Lượng dịch chiết thu được trong 3 lần chiết đem bay hơi bớt bằng máy quay cất dung môi Sau đó sấy mẫu ở 450C bằng máy sấy chân không tới khối lượng không đổi ta thu được cao chiết chứa hỗn hợp isoflavone có màu nâu

đỏ

Bảng 3.1: Ảnh hưởng của phương pháp chiết đến lượng cao chiết chứa hỗn

hợp isoflavone thu được từ bột sắn dây:

Chỉ tiêu

PP chiết

Nguyên liệu

sẽ nhiều hơn phương pháp tĩnh

Vì vậy, chúng tôi đã lựa chọn phương pháp chiết động để tiến hành chiết xuất