Nghiên cứu chế tạo polime tương thích sinh học chitosan cấu trúc nanô ứng dụng làm chất mang thuốc có tác dụng phân giải chậm

MỞ ĐẦU Chitin CT/Chitosan CS là một polysacarit mạch thẳng nguồn gốc thiên nhiên, tập trung nhiều chủ yếu ở vỏ các loài thuỷ sản giáp xác như: tôm, cua, mai mực [12]… CT/CS có khả năng

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

KHOA CÔNG NGHỆ HOÁ HỌC

……***……

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO POLIME TƯƠNG THÍCH

SINH HỌC CHITOSAN CẤU TRÚC NANÔ ỨNG

NGUYỄN THỊ THÚY NGA

Người hướng dẫn khoa học: TS TRẦN ĐẠI LÂM

Hà Nội 2005

NguyÔn ThÞ Thuý Nga

LỜI CẢM ƠN

Luận văn này được hoàn thành tại Bộ môn Hoá Vô cơ & Đại

cương-Khoa Công nghệ Hoá học-Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội

Trước tiên, tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn vô cùng sâu sắc đến Tiến sĩ

Trần Đại Lâm-người đã rất tận tình và tâm huyết hướng dẫn tôi hoàn

thành luận văn này

Tôi xin cảm ơn Tiến sĩ Lê Thị Ngọc Liên và các cán bộ nghiên cứu

phòng Công nghệ các hợp chất Sinh học-Viện Khoa học và Công nghệ

Việt Nam đã nhiệt tình giúp đỡ và cố vấn cho tôi trong quá trình thực

hiện đề tài

Đồng thời tôi cũng xin gửi lời cám ơn sâu sắc đến Tiến sĩ Trần Việt

Hùng-Viện kiểm nghiệm-Bộ Y tế đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi về cơ sở vật

chất và cố vấn cho tôi để hoàn thiện luận văn

Cuối cùng, tôi xin cám ơn các đồng nghiệp trong Bộ môn Hoá Vô

cơ & Đại cương đã tạo điều kiện về thời gian, cơ sở vật chất, giúp đỡ và

động viên tôi hoàn thành tốt luận văn

Tác giả

NGUYỄN THỊ THUÝ NGA

MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU 7

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 10

1.1 Giới thiệu chung về Chitin (CT)/Chitosan (CS) 10

1.1.1 Nguồn gốc CT/CS 10

1.1.2 Cấu trúc và tính chất của CT/CS 11

1.1.3 Một số phương pháp xác định độ deaxetyl hóa (DD) của CT/CS 15

1.1.4 Xác định khối lượng phân tử trung bình của CT/CS 16

1.1.5 Một số dẫn xuất chủ yếu của CT/CS 17

1.1.6 Hoạt tính sinh học và ứng dụng của CT/CS trong Y Dược 19

1.2 Một số phương pháp sản xuất CT/CS và chế tạo nanô CS 21

1.2.1 Một số phương pháp sản xuất CT/CS 21

1.2.2 Phương pháp chế tạo CS có cấu trúc nano 23

1.3 Ứng dụng CS làm chất mang polime để gắn thuốc 25

1.4 Sơ lược một số thuốc gắn lên chất mang CS 28

1.4.1 Axit salixylic (Sa) 28

1.4.2 Artesunat (ART) 28

CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM 31

2.1 Các phương pháp vật lý 31

2.1.1 Phương pháp phổ hồng ngoại ( IR) 31

2.1.2 Phương pháp phổ nhiễu xạ tia X (XRD) 32

2.1.3 Phương pháp hiển vi điện tử truyền qua (TEM) và hiển vi điện tử quét (SEM) 33

2.1.4 Phương pháp phân tích nhiệt (TA) 35

2.1.5 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 36

NguyÔn ThÞ Thuý Nga 2.1.6 Phương pháp quang phổ hấp thụ tử ngoại- khả kiến ( UV-vis) 39

2.2 Các phương pháp hóa học 41

2.2.1.Chiết xuất và chuyển hoá CT/CS từ vỏ tôm 41

2.2.2 Xác định các thông số của CS nguyên liệu 43

2.2.3 Chế tạo vật liệu CS có cấu trúc nanô 45

2.2.4 Nghiên cứu gắn axit Sa lên chất mang CS 47

2.2.5 Nghiên cứu gắn thuốc sốt rét ART vào chất mang CS 48

2.2.6 Khảo sát khả năng gắn ART vào chất mang CS cấu trúc nanô 50

2.2.7 Khảo sát khả năng phân giải ART sau khi gắn lên chât mang CS theo thời gian trong môi trường giả dịch ruột và dịch dạ dày theo thời gian bằng HPLC và UV-vis 50

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 53

3.1 Tổng hợp và đặc trưng CS nguyên liệu từ vỏ tôm 53

3.1.1 Chiết xuất CT/CS từ vỏ tôm 53

3.1.2 Xác định các thông số đặc trưng của CS nguyên liệu 55

3.2 Tổng hợp và đặc trưng chất mang nanô CS 58

3.2.1 Tổng hợp chất mang nanô CS 58

3.2.2 Nghiên cứu đặc trưng của chất mang nanô CS 59

3.3 Nghiên cứu quá trình gắn thuốc vào chất mang nanô CS 64

3.3.1 Nghiên cứu khả năng gắn Sa (thuốc mô hình) lên chất mang CS 65

3.3.2 Nghiên cứu khả năng gắn ART lên chất mang CS 68

3.3.3 Nghiên cứu khả năng gắn ART lên chất mang nanô CS 72

3.4 Nghiên cứu động học quá trình phân giải ART trên chất mang CS trong môi trường giả dịch ruột và dịch dạ dày 76

3.4.1 Nghiên cứu sự phân huỷ chậm của chất mang CS theo thời gian trong các môi trường bằng HPLC 76

3.4.2 Khảo sát khả năng phân giải ART từ CS-ART trong các môi

trường giả dịch ruột và dịch dạ dày bằng HPLC 81

3.4.3 Khảo sát khả năng phân giải ART từ CS-ART trong các môi

trường giả dịch ruột và dịch dạ dày bằng UV-vis 83

KẾT LUẬN 87

TÀI LIỆU THAM KHẢO 89

NguyÔn ThÞ Thuý Nga

MỘT SỐ KÝ HIỆU DÙNG TRONG LUẬN VĂN

ART – Artesunat

CS – Chitosan

CS-ART – Sản phẩm Artesunat gắn lên chất mang Chitosan

CS-TPP - Phức hợp Chitosan và Tripolyphotphat (nanô Chitosan)

CS-TPP-ART - Sản phẩm gắn Artesunat lên chất mang nanô Chitosan

DD - Độ deaxetyl hoá

Sa – Axit Salixylic

CS-Sa – Sản phẩm Salixylic gắn lên chất mang Chitosan

TPP - Tripolyphotphat

MỞ ĐẦU

Chitin (CT)/Chitosan (CS) là một polysacarit mạch thẳng nguồn gốc

thiên nhiên, tập trung nhiều chủ yếu ở vỏ các loài thuỷ sản giáp xác như: tôm,

cua, mai mực [12]…

CT/CS có khả năng hoà hợp và phân huỷ sinh học [16], độc tính thấp,

có hoạt tính đa dạng: kháng khuẩn, kháng nấm [11], [8], tăng sinh tế bào, tăng

cường miễn dịch của cơ thể với các tác dụng kích thích sản sinh bạch cầu,

giảm cholesterol trong máu, hạn chế sự phát triển khối u, có tác dụng tốt trên

các vết thương, vết bỏng [12]… CT/CS có ứng dụng rất rộng rãi trong nhiều

lĩnh vực như: nông nghiệp, công nghiệp, thực phẩm, mỹ phẩm, xử lý nước

thải và y dược học…

Tổ chức Y tế thế giới (WHO) đã đánh giá cao vai trò của CT/CS và

chính thức cho phép sử dụng trong Y Dược học và thực phẩm [16], [38]

Người ta đã phát hiện được một số tác dụng của các sản phẩm CT/CS trong Y

Dược học như: làm thuốc điều trị vết thương, giảm colesterol trong máu và

giảm cân cho người béo phì, ức chế u và ung thư, làm tá dược trong thuốc

viên, làm chất mang trong thuốc polime để kiểm soát liều phân giải, làm vật

liệu Y sinh học [12]…

Nhờ có những tính chất như trên, hiện nay CT/CS được một số nhà

khoa học nghiên cứu với mục đích chế tạo các vật liệu tiên tiến có cấu trúc

nanô Các vật liệu có cấu trúc nanô này ngày nay được cho là rất có triển vọng

trong Y-Dược học: trong đó phải kể đến tác dụng làm chất dẫn thuốc nhằm

kéo dài thời gian tác dụng và tăng hiệu quả của việc sử dụng thuốc – chất

mang thuốc; là polime dẫn điện có thể dùng để chế tạo các cảm biến sinh học

(cảm biến ADN, cảm biến enzim) hoạt động theo nguyên lý điện hoá rẻ tiền

và đơn giản

NguyÔn ThÞ Thuý Nga

Trên thế giới hiện nay, hướng nghiên cứu áp dụng công nghệ nanô vào

lĩnh vực Y học, Sinh học, Dược phẩm như chẩn đoán bệnh, chữa trị bệnh, bào

chế thuốc và sản xuất các sản phẩm Y Dược khác là một trong những hướng

nghiên cứu mũi nhọn, thu hút sự quan tâm lớn của các nhà khoa học Trên

thực tế, hâù hết các dược phẩm ngoài tác dụng dược lý còn có những tác dụng

phụ không mong muốn Chính vì vậy, các hệ thống đặc hiệu và dẫn chuyển

dược phẩm trên cơ sở công nghệ nanô ngày càng thu hút được nhiều sự quan

tâm nghiên cứu và triển khai Các hệ thống này bao gồm các hạt nanô, vectơ

điều khiển dược phẩm tác dụng trực tiếp tới tế bào đích mà không gây ảnh

hưởng đến các tế bào xung quanh

Ở nước ta, nhờ có vị trí địa lý và khí hậu thuận lợi nên hàng năm sản

lượng đánh bắt thuỷ, hải sản rất lớn Đây là nguồn nguyên liệu phong phú cho

việc điều chế CT/CS.Việc điều chế CT/CS từ nguyên liệu vỏ tôm, cua, mai

mực…còn có một mục đích nữa là tận dụng những phế thải từ các nhà máy

chế biến thuỷ, hải sản (vỏ tôm, cua, mai mực…) để làm sạch và bảo vệ môi

trường – một vấn đề cũng đang được toàn thế giới quan tâm hàng đầu

Với mục đích tận dụng nguồn nguyên liệu rẻ tiền, sẵn có, bảo vệ môi

trường và nâng cao ứng dụng của CT/CS trong Y, Dược học và đóng góp một

phần vào việc phát triển công nghệ nanô ứng dụng trong Y – Sinh học và

công nghệ Dược phẩm, trong phạm vi luận văn này chúng tôi đã đặt ra những

nhiệm vụ sau:

• Chiết xuất CT/CS từ vỏ tôm

• Xác định các thông số đặc trưng của CS nguyên liệu

- Xác định độ deaxetyl hoá (DD) của CS nguyên liệu

- Xác định khối lượng phân tử trung bình của CS nguyên liệu

• Tổng hợp và đặc trưng chất mang CS có cấu trúc nanô dùng

trong Y, Dược học

- Thử khả năng phân giải chậm của thuốc sau khi đã gắn và so

sánh với khả năng phân giải của thuốc khi không gắn với chất mang CS bằng một số phương pháp HPLC, UV-vis

nhằm tạo ra sản phẩm mới có tác dụng kéo dài thời gian phân giải và tăng

hiệu quả sử dụng thuốc

CT/CS có chủ yếu trong vỏ cứng của các loài động vật giáp xác như:

tôm, cua, mai mực, tảo biển, vỏ của bọ cánh cứng [12]…vì vậy trong số các

polime nguồn gốc tự nhiên sản lượng của CT/CS rất lớn (chỉ đứng thứ hai sau

xenlulo)

Trong mỗi loại nguyên liệu ta thu được những dẫn xuất khác nhau

Bằng phương pháp nhiễu xạ tia X, người ta đã chứng minh được CT tồn tại ở

ba dạng cấu trúc , và , cả ba dạng này đều có cấu trúc tinh thể rất chặt chẽ

và đều đặn chỉ khác nhau ở sự sắp xếp các mạch phân tử trong tinh thể (hình

1.1) Từ vỏ tôm, cua ta thường thu được  - CT,  - CT có cấu trúc mạch

ngược chiều nhau đều đặn nên ngoài liên kết hiđro trong một lớp và hệ chuỗi,

nó còn có lực liên kết hiđro giữa các lớp, do các chuỗi thuộc lớp kề nhau nên

rất bền vững Loại CT này là loại phổ biến nhất trong tự nhiên  - CT thường

được tách ra từ mai mực ống, loại này trong tự nhiên ít hơn rất nhiều so với 

- CT  - CT được tách ra từ sợi kén của bọ cánh cứng, mai mực nang,  - CT

có trữ lượng rất ít  - CT có thể chuyển về  - CT nhờ quá trình axetyl hoá

cho cấu trúc tinh thể bền vững hơn

 - CT  - CT  - CT

Hình 1.1: Các kiểu sắp xếp trong mạch đại phân tử của CT

 - CT: Các mạch được sắp xếp ngược chiều nhau đều đặn

 - CT: Các mạch được sắp xếp song song

 - CT: Hai mạch song song rồi đến một mạch ngược chiều

Ở nước ta vị trí địa lý và khí hậu rất thuận lợi cho việc đánh bắt và nuôi

trồng thuỷ, hải sản Hàng năm sản lượng đánh bắt tôm, mực từ biển là rất lớn,

ngoài ra chúng ta còn nuôi trồng các loại tôm, cua nước ngọt và nước mặn

(sản lượng tôm, cua, mực của ta đứng hàng thứ ba trên thế giới sau Trung

Quốc và Mỹ) Cụ thể là sản lượng của Việt nam và Ấn Độ đạt 9,3% so với

sản lượng toàn thế giới (sản lượng đánh bắt các loài giáp xác trên thế giới

khoảng 6 triệu tấn/ năm) [30] Cùng với sản lượng đánh bắt thuỷ, hải sản cao

như vậy là một con số khổng lồ các phế thải từ các nhà máy chế biến Đó là

vỏ tôm từ các nhà máy tôm đông lạnh, vỏ tôm, cua, mai mực từ chất thải sinh

hoạt do sử dụng trực tiếp các loài thuỷ, hải sản này làm thức ăn Nếu không

được xử lý kịp thời nó sẽ là nguồn gây ô nhiễm, ảnh hưởng lớn tới vệ sinh

môi trường Tuy nhiên đây lại là nguồn nguyên liệu rất phong phú cho công

nghiệp sản xuất CT/CS, nó là những nguyên liệu tái sinh, hoàn toàn con người

có thể khai thác nó mà không ảnh hưởng đến sự phát triển bền vững

Như vậy sản xuất CT/CS đi từ các phế thải của các nhà máy chế biến

thuỷ, hải sản như vỏ tôm, cua…có ý nghĩa rất lớn trong việc phát triển công

nghệ mới, công nghệ sạch, tận dụng được nguồn nguyên liệu sẵn có và bảo vệ

môi trường, bảo vệ sự phát triển bền vững

1.1.2 Cấu trúc và tính chất của CT /CS

Bằng phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR), phổ hồng ngoại (IR) và một

số phương pháp khác đã xác định được cấu trúc Hoá học của CT/CS rất giống

của Xenlulo Trong Xenlulo nhóm –OH ở vị trí C2 của mỗi đơn vị D–

Glucoza Khi thay nhóm –OH trong Xenlulo bằng nhóm –NHCOCH3 ta được

NguyÔn ThÞ Thuý Nga

cấu trúc của CT, còn khi thay bằng nhóm –NH2 ta được cấu trúc của CS (công

n (ct1.1)

Công thức tổng quát của Xenlulo, CT, CS

R = OH: Xenlulo R = NHCOCH3: CT R = NH2: CS

CS là dẫn xuất deaxetyl hoá của CT, trong thực tế sự deaxetyl hoá xảy

ra không hoàn toàn vì vậy người ta quy ước:

- Độ deaxetyl hoá (degree of deacetylation) (DD) > 50% gọi là CS

- DD  50% gọi là CT

1.1.2 1 Cấu trúc và tính chất của CT

Tên Hoá học của CT: Poly -  - (1→4) – N axetyl – D – glucozamin

Hay còn gọi là Poly  (1→4) – 2 axetamit – 2 – desoxyl – D

o

ch2oh

hoh

nhcoch3

h

h

ohh

nhcoch3

n (ct1.2)

Công thức lý thuyết của CT

Kết cấu bề mặt của CT khá chặt chẽ, phẳng lỳ, điều này đã được khẳng

định nhờ kính hiển vi điện tử quét Chính vì kết cấu bề mặt như vậy nên nó

rất khó tham gia vào các phản ứng Hoá học và không tan trong các dung môi

thông thường

Tính chất Hoá học của CT

Nhìn vào cấu trúc của CT ta thấy nó có chứa các nhóm chức: OH,

-CH2OH, -NHCOCH3 vì vậy CT sẽ có tính chất Hoá học của các nhóm chức

này Có thể biểu diễn công thức cấu tạo của CT một cách tượng trưng như

sau: -CH2OH, -OH, -NHCOCH3

• Phản ứng deaxetyl hoá CT thành CS trong môi trường kiềm đặc để

biến đổi nhóm axetyl thành nhóm amin Sơ đồ phản ứng như sau:

-CH2OH, -OH, -NHCOCH3 ⎯ ⎯ NaOHdÆ c ⎯ ⎯ →-CH2OH, -OH, -NH2

• Phản ứng thuỷ phân: CT bị thuỷ phân trong axit Clohiđric đậm đặc ở

nhiệt độ cao gây cắt mạch tạo ra glucosamin

• Phản ứng este hoá: CT tác dụng với axit nitric đậm đặc cho sản phẩm

CT nitrat; tác dụng với anhiđric sunfuric trong pyriđin, đioxan và N,

N-dimetyl anilin cho sản phẩm CT sunfonat.; tác dụng với axit cloaxetic tạo ra

o

ch2oh

hoh

nh2

h

h

ohh

nh2

n (ct1.3)

NguyÔn ThÞ Thuý Nga

Công thức lý thuyết của CS

Tên Hoá học của CS là: Poly -  - (1→4) - D – Glucosamin

Hay còn gọi là Poly -  - (1→4) – 2- amino – 2 –desoxyl - D – Glucoza

CS là dẫn xuất của CT, sau khi deaxetyl hoá CT ta được CS Sơ đồ

phản ứng:

-CH2OH, -OH, -NHCOCH3 ⎯ ⎯ NaOHdÆ c ⎯ ⎯ →-CH2OH, -OH, -NH2

Như đã nói ở trên, phản ứng deaxetyl hoá CT thành CS xảy ra không

hoàn toàn nên với DD > 50% gọi là CS và DD < 50% gọi là CT Vì vậy công

o

ch2oh

hoh

nhcoch3

h

h

ohh

nh2

n m (ct1.4)

Công thức chính xác của CT/CS

CS được Rouget phát hiện lần đầu tiên vào năm 1859, khi ông đun sôi

CT trong dung dịch KOH đặc

Do CS có nhóm amin nên tính chất của nó khác rất nhiều so với CT

CS tan được trong xít loãng, đây cũng chính là đặc điểm dễ nhất để ta phân

biệt CT và CS

Tính chất vật lý của CS

CS ở thể rắn tồn tại dưới hai dạng: dạng tinh thể và dạng vô định hình

CS không tan trong nước, kiềm đặc và loãng, không tan trong cồn, axeton và

các dung môi hữu cơ khác CS tan trong dung dịch axit loãng tạo dung dịch

keo trong suốt Độ nhớt của CS trong dung dịch axit loãng liên quan tới kích

thước và khối lượng phân tử trung bình của CS (đây cũng chính là tính chất

chung của tất cả các dung dịch polime)

Tính chất hoá học của CS

CS có nhóm NH2 nên tính chất hoá học của nó có mang tính chất hoá

học của một amin, một bazơ, và nhất là có khả năng tạo phức với các ion kim

loại Một số phản ứng của CS:

- CS có thể bị cắt mạch bởi axit, enzim, hoặc bằng bức xạ để tạo

oligome

- Phản ứng Van – Wisselingh [12]: CS tác dụng với dung dịch lugo

cho màu nâu, chuyển sang đỏ tím khi có mặt axit sunfuric

- Phản ứng Alternative: CS tác dụng với axit H2SO4 tạo tinh thể hình

cầu CS sunfat, chất này làm mất màu dung dịch fucsin 1% hay dung

dịch axit picric 1%

- Nhóm amin trong phân tử có thể bị khử do một số tác nhân oxy hoá

như Ba(BrO)2, AgNO3, N2O3, HNO2, [12]…

1.1.3 Một số phương pháp xác định độ deaxetyl hoá (DD) của CT/CS

1.1.3.1 Phương pháp dựa vào phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (H 1 -

NMR)

Đây là phương pháp cho độ chính xác cao nhất Dựa vào giá trị tích

phân phổ H1- NMR ở các tín hiệu pic của nhóm CH3 và H ở vị trí 2,3,4,5,6 và

6’ (vị trí C thứ 6 của nhân thứ hai) ta có thể xác định được độ deaxetyl hoá

CT/CS [19]

1.1.3.2 Phương pháp dựa vào phổ hồng ngoại (IR)

Từ phổ IR người ta xác định độ hấp thụ A của các đỉnh tại số sóng xác

định.Với mẫu CT /CS có DD cao khoảng 90% trở lên người ta xác định A1655

NguyÔn ThÞ Thuý Nga

(amit 1) và A2867 (CH) theo phổ IR Tính tỷ lệ A1655 / A2867 và theo đồ thị

tương quan chuẩn để xác đinh độ DD trong mẫu CT /CS

Với mẫu CT /CS có độ DD thấp người ta có thể xác định độ DD dựa

trên dải hấp thụ ở 1550 cm-1 (amit II).Tính tỷ lệ A1550/A2867 và theo đồ thị

tương quan chuẩn để xác định độ deaxetyl hoá của mẫu CT/CS [12]

1.1.3.3 Phương pháp chưng cất CT/CS với axit phosphoric

Tách gốc axetyl trong CT/CS ra dưới dạng axit axetic bằng axit

phosphoric ở nhiệt độ cao Sau đó định lượng axit axetic bằng phương pháp

chuẩn độ thể tích [25]

1.1.3.4 Phương pháp dựa vào phản ứng của CT/CS với ninhyđrin

Cho CT/CS tạo màu với ninhyđrin và định lượng bằng phương pháp đo

quang đối chiếu với mẫu chuẩn [12]

1.1.3.5 Phương pháp nhiệt phân - sắc ký khí với sự có mặt axit oxalic

Phương pháp nhiệt phân kết hợp với sắc ký để xác định DD của mẫu

liên quan đến tỷ lệ của cường độ pic của sản phẩm, cụ thể là axit axetic và các

sản phẩm chứa nitơ.Axit oxalic được dùng làm chất phản ứng để thuỷ phân

CT/CS [36]

1.1.3.6 Phương pháp xác định theo nitơ

Xác đinh độ deaxetyl hoá CT/CS bằng tỷ lệ của lượng aminonitrogen

[N]am và tổng số nitơ [N]tot Tổng số nitơ [N]tot được xác địmh bằng phân tích

nguyên tố, amin/nitơ [N]am được xác định bởi Phương pháp chuẩn độ Hoá học

của dung dịch polymer trong HCl với NaOH [34]

Người ta còn xác định DD của CT/CS theo phương pháp định lượng

nitơ toàn phần theo công thức tính 1.1[7]:

x 100

8 1

89 6 c DD

,

, (%)= −

Trong đó c là hàm lượng (%) Nitơ toàn phần đo được trong mẫu CT/CS

đem kiểm nghiệm

Phương pháp này thường cho sai số cao

1.1.4 Xác định khối lượng phân tử trung bình của CT/CS

Khối lượng phân tử trung bình của CT/CS (M) chỉ mang ý nghĩa là

một đại lượng thống kê Không giống như những hợp chất có khối lượng phân

tử thấp nó là hằng số, CT/CS phải lấy khối lượng phân tử trung bình do các

nguyên nhân như: sự deaxetyl hoá luôn xảy ra không hoàn toàn nên trong

phân tử có lẫn cả nhóm axetyl và nhóm amin; các mạch đại phân tử có kích

thước dài ngắn khác nhau; các liên kết ngang tạo thành giữa các mạch đại

phân tử…

Theo các tài liệu thì có một số cách xác định khối lượng phân tử trung

bình như sau:

• Phương pháp đo khối lượng phân tử trung bình trực tiếp như:

- Phương pháp tán xạ ánh sáng (light scattering)

- Phương pháp xác định khối lượng phân tử theo độ tăng điểm sôi

(ebulioscopy)

- Phương pháp xác định khối lượng phân tử trung bình theo độ hạ

nhiệt độ đông đặc (cryoscopy)

- Phương pháp xác định khối lượng phân tử trung bình theo áp

suất thẩm thấu (osmometry)

• Phương pháp xác định khối lượng phân tử trung bình gián tiếp

- Phương pháp xác định khối lượng phân tử trung bình theo độ

nhớt của dung dịch polyme

- Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

- Phương pháp ghép sắc ký lỏng hiệu năng cao với tán xạ ánh

sáng nhiều góc (HPLC - MALLS)

NguyÔn ThÞ Thuý Nga

1.1.5 Một số dẫn xuất chủ yếu của CT/CS

1.1.5.1 CT tan trong nước

Là CT/CS có độ DD  50% [12].Để tổng hợp được CT này có hai

cách: Deaxetyl hoá CT có kiểm soát các thông số phản ứng để thu được sản

phẩm có độ DD  50% hoặc axetyl hoá CS thành CT có độ DD  50%

1.1.5.2 N,O – Cacboxylmetyl CT/CS

Khi tham gia các phản ứng thế CT/CS hay xảy ra đồng thời ở cả hai

nhóm chức – OH và - NH2 Kết quả của phản ứng là hỗn hợp của nhiều loại

sản phẩmthế ở vị trí – O hay – N hoặc cả hai – O và - N Ví dụ: CS phản ứng

với hỗn hợp NaOH và ClCH2COONa thu được sản phẩm có chứa N,O –

Cacboxylmetyl CT/CS theo phương trình:

n NaOH/ClCH2 COOH

O

Ch2och2cooh h

h och2cooh h

h nhch2cooh h o

n (ct1.5)

Bằng phổ cộng hưởng từ hạt nhân, người ta đã thấy khả năng

cacboxylmetyl hoá CS giảm theo thứ tự từ – C6 > - C3 > - N Muốn thu được

sản phẩm là O – Cacboxylmetyl CS, người ta phải bảo vệ nhóm NH2 bằng

Cu2+, còn muốn tạo ra sản phẩm N – Cacboxylmetyl CS thì cho CS tác dụng

với axit glioxylic (OHC – COOH)

- CH2OH

CS - OH NaBH4 - NH-CH-(CH2)2COOH

CH3 N–[(4-metyl) cacboxybutyl] CS

Sản phẩm CS với axit levulinic để tạo thành dẫn xuất của CS tan trong

nước và có tác dụng kháng khuẩn, chữa liền vết thương [12]

-Phản ứng này có thể thực hiện với CS có độ deaxetyl hoá cao và môi

trường NaOH loãng để tránh hiện tượng cắt mạch CS

1.1.5.5 Một số dẫn xuất của CT/CS không tan trong nước

O – Acy CT, O – Akyl CT, Akali CT, CT xanthogenat, O –

Hidroxyalkyl CT, O – Cacboxymetyl CS, N – Acyl CS, N – Cacboxylacyl

CS, N – Alkyliden CS, N – Alkyl CS, N – Cacboxyalkyliden CS, N –

Hidroxyalkyl CS, N – Cacboxyalkyl CS [12]

1.1.6 Hoạt tính sinh học và ứng dụng của CT/CS trong Y Dựơc

1.1.6.1 Độc tính của CT/CS và ứng dụng trong Y Dược

Nhiều nhà khoa học trên thế giới đã nghiên cứu và đều đi đến kết luận

CT/CS không độc đối với người và động vật thí nghiệm [14] Độc tính thứ

cấp thấp và không đáng kể [12], có thể sử dụng an toàn trên người theo con

đường ăn, uống, tiêm, bôi ngoài da và ghép mô

Chính vì vậy CT/CS được phép sử dụng trong thực phẩm và dược

phẩm Những ứng dụng của CT/CS trong các lĩnh vực này được thừa nhận

rộng rãi trong những năm gần đây [16], [38]

NguyÔn ThÞ Thuý Nga

Năm 1983 cơ quan quản lý thuốc và thực phẩm của Mỹ (United States

Food and Drug Administration – FDA) đã chấp nhận dùng CS làm chất phụ

gia trong thực phẩm và dược phẩm

CS chính thức được WHO cho phép sử dụng trong Y, dược [13]

Trong thuốc – thực phẩm CT/CS có thể dùng cho bổ dưỡng sức khoẻ,

giảm cân nặng, giảm cholesterol xấu trong máu, bảo quản thực phẩm

Ngoài ra nhờ tính chất này CT/CS còn được sử dụng làm tá dược trong

bào chế thuốc, làm vật liệu y sinh…

1.1.6.2 Một số hoạt tính sinh học và ứng dụng của CT/CS trong Y-Dược

a Khả năng kháng nấm, kháng khuẩn của CT/CS và ứng dụng trong Y Dược

Qua khảo sát khả năng kháng nấm, kháng khuẩn của CT/CS người ta

thấy nó có tính chất kháng nấm, kháng khuẩn Với nhiều mức độ khối lượng

phân tử trung bình khác nhau các nhà khoa học đi đến kết luận: CS có khối

lượng phân tử trung bình khoảng 100.000 –300.000 có tác dụng kháng khuẩn

cao nhất [26] Cơ chế kháng này của CT/CS được đưa ra bởi nhiều giả thiết

khác nhau như: Sự tương tác giữa các điện tích dương của phân tử CS với

điện tích âm của màng tế bào vi khuẩn gây thẩm thấu protein và các thành

phần nội bào khác làm tiêu diệt vi khuẩn CS mang điện tích dương trên

cacbon ở vị trí số 2 ở pH<6 cho khả năng hoà tan và hoạt tính kháng khuẩn

cao hơn hẳn CT [12]

Nhờ có khả năng này CT/CS được sử dụng để làm thuốc chống nấm

gây bệnh cho cây trồng, làm chất bảo quản thực phẩm, chế tạo các màng băng

có tác dụng kháng khuẩn và liền vết thương, vết bỏng [12]…

b Khả năng hoà hợp và phân huỷ sinh học của CT/CS và ứng dụng trong Y

Dược

CT/CS có khả năng hoà hợp và phân huỷ sinh học tốt đối với cả động

vật và mô thực vật [16]

CT/CS có thể làm băng vết thương, thức ăn để chống cholesterol và

thuốc giải phóng chất chống viêm Nhờ có nhiều tính chất cơ học tốt nên

CT/CS được sử dụng nhiều trong công nghệ vật liệu Y sinh:

• Kính áp tròng được chế tạo từ CS

• Chế tạo chỉ phẫu thuật tự tiêu, mô xương giả [12]

• Chế tạo màng lọc máu, vật liệu chỉnh hình, cơ quan nhân tạo trong cơ

thể [30],…

• Chế tạo màng băng giúp nhanh liền vết thương vết bỏng [29]

c Tác dụng tăng sinh tế bào, kích thích sự liền vết thương và ứng dụng trong

Y Dược

Theo [30] CT/CS trên vết thương có tác dụng kích thích mô tái sinh,

hạn chế việc để lại sẹo

CT/CS có tác dụng kích thích mô phát triển, kích thích sự sinh trưởng

tế bào, có vai trò quan trọng trong sự phát triển tái tạo và phục hồi các tổ chức

mô [12]

Qua nghiên cứu cho thấy CS DD 65–80% có tác dụng kích thích mô

hạt phát triển tốt nhất, rất thuận lợi cho quá trình liền vết thương [12]

Vì vậy CS được sử dụng để chế tạo màng băng vết thương, thuốc kiểm

soát liều phân giải…

Ngoài ra CT/CS còn có tác dụng chống viêm, tăng cường miễn dịch

của cơ thể, hạn chế phát triển khối u và ung thư, bảo vệ tế bào và điều trị thận

trên bệnh nhân bị bệnh thận mãn tính [35], [12] Nhờ tính chất này người ta

đã bào chế ra thuốc chống ung thư, tăng cường miễn dịch…CS có tác dụng

làm giảm cholesterol trong máu, giảm hấp thụ lipit qua đường tiêu hoá, giúp

điều trị các bệnh về tim mạch và béo phì [12]

1.2.1 Một số phương pháp sản xuất CT/CS

NguyÔn ThÞ Thuý Nga

Tuỳ từng nguyên liệu mà hàm lượng CT/CS khác nhau [12]

Hàm lượng CT trong vỏ một số loài động vật giáp xác

CT tồn tại trong tự nhiên thường có DD < 10%, chúng thường ở dạng

kết hợp với protein (thịt các động vật mà ta lấy vỏ) và một số muối vô cơ

(chẳng hạn muối cacbonat) Vì vậy phương pháp sản xuất CS dựa trên nguyên

tắc loại protein, các muối vô cơ và các tạp chất…ra khỏi CT, rồi deaxetyl hoá

để thu được CS

1.2.1.1 Phương pháp thuỷ nhiệt

Phương pháp này giúp ta điều chế được trực tiếp CS từ nguyên liệu ban

đầu không qua giai đoạn điều chế CT Ưu điểm của phương pháp này là thời

gian thực hiện ngắn, sử dụng các hoá chất thông dụng và phù hợp khi muốn

thu được CS trong thời gian ngắn Tuy nhiên phương pháp này có nhược điểm

là tiêu tốn nhiều năng lượng cho các giai đoạn sản xuất

1.2.1.2 Phương pháp sử dụng enzim để thuỷ phân protein

Một số enzim thường được sử dụng để thuỷ phân protein như: proteaza,

proteolytic, papain, trypsin,…Người ta sử dụng các enzim này để tách CT,

sau đó dùng NaOH đặc để deaxetyl hoá CT thành CS [12]

Ban đầu nguyên liệu chứa CT được rửa sạch, xay nhỏ, nấu sôi Sau đó

thuỷ phân protein bằng enzim Thu dịch thuỷ phân, loại bỏ dịch, sau đó xử lý

bằng HCl thu được phức CT – protein Xử lý tiếp bằng NaOH loãng, sau đó

rửa sạch thu được CT thô Đem deaxetyl hoá bằng NaOH đặc ta thu được CS

CS này đem tinh chế và kiểm nghiệm ta thu được CS dựơc dụng [12]

Phương pháp này có ưu điểm thu được CS có khối lượng phân tử trung

bình lớn nhưng có nhược điểm là mất nhiều thời gian và quá trình thuỷ phân

protein gây mùi khó chịu làm ô nhiễm môi trường, sản phẩm có độ tinh khiết

không cao và không ổn định do hàm lượng men biến đổi

1.2.1.3 Phương pháp thu nhận đồng thời protein , CT và CS

Phương pháp này đã được áp dụng cho quy trình sản xuất với quy mô

công nghiệp lớn 100.000 tấn/năm [31] Theo phương pháp này nguyên liệu

sau khi đã loại bỏ tạp chất, sấy khô và nghiền nhỏ được đưa vào quạt gió

Phần nhẹ là CT và Canxi (có lẫn ít protein), phần nặng là protein có lẫn ít

canxi và CT Lấy phần nhẹ loại protein và Canxi ta thu được CT Deaxetyl

hoá CT ta thu được CS, tinh chế CS này ta thu được CS tinh sạch

Phương pháp này có ưu điểm là thu nhận được đồng thời cả protein, CT

và CS, tận dụng được protein để làm thực phẩm và các sản phẩm có giá trị

dinh dưỡng và chữa bệnh

1.2.2 Phương pháp chế tạo CS có cấu trúc nanô

Theo [23]: CS được pha trong dung dịch axit axetic 0,5 hoặc 1% về

khối lượng Axetaminophen (thuốc mô hình được gắn lên CS) nồng độ 1 hoặc

2% Trộn hai dung dịch với nhau bằng máy khuấy trong 20 phút thu được hệ

huyền phù của CS và axetaminophen Cho từ từ dung dịch TPP nồng độ 1%

NguyÔn ThÞ Thuý Nga

vào hệ huyền phù trên cũng khuấy với tốc độ trên trong vòng 20 phút thu

được hệ huyền phù CS-TPP- Axetaminophen Dùng máy đông khô để thu

Thuốc gắn trên CS có cấu trúc nanô

Hình 1.2: Sơ đồ tổng hợp thuốc Axetaminophen có cấu trúc nanô

Theo tài liệu [43] có thể chế tạo nano CS bằng một số cách sau:

• Phương pháp trùng ngưng

Hạt nano CS –PAA (Poly axit acrylic) được tạo thành do sự trùng hợp

của AA (axit acrylic) và CS Theo phương pháp này, CS được hoà tan trong

-OOC

Trùng hợp

CS

Hạt nanô CS-PAA

50ml dung dịch AA với tỉ lệ 1:1 đặt trên máy khuấy từ, cho đến khi dung dịch

trở nên trong suốt Cho tiếp K2S2O8 vào và tiếp tục khuấy, điều chỉnh pH

khoảng bằng 4 Sau đó sự trùng hợp được thực hiện ở trên 700C có luồng khí

N2 và đặt trên máy khuấy từ Đến khi xuất hiện các hạt lơ lửng màu trắng đục

thì làm lạnh hệ thống Các hạt lơ lửng được lọc bằng giấy lọc để thu được các

hạt keo Cuối cùng, các monome được di chuyển bằng sự thẩm thấu trong

dung dịch đệm có pH = 4,5 trong 24 giờ, dùng túi màng thẩm thấu với khối

lượng nhỏ 10KDa

Hình 1.3: Phản ứng tạo hạt nanô CS – PAA

• Phương pháp nhỏ giọt

CS-PAA cũng được tạo ra do trộn CS vào PAA bằng cách nhỏ giọt

Cho 1 ml dung dịch CS 0,02% (CS có DD=80KDa hoà trong axit

axetic 1%) vào 5 ml dung dịch PAA 0,02% đặt dưới máy khuấy Các hạt keo

được tạo thành, dùng giấy lọc để lọc lấy hạt keo Dùng túi màng thẩm thấu

bọc sản phẩm trong dung dịch đệm có pH=4,5 trong vòng 24 giờ

Theo [18], [20], [41], thì CS có cấu trúc nanô được tạo ra bằng cách tạo

phức giữa CS và Tripolyphosphate (TPP) CS được hoà tan trong dung dịch

axit loãng, TPP được hoà tan trong nước Cho từ từ dung dịch TPP vào dung

dịch CS được đặt trên máy khuấy từ và khuấy với tốc độ lớn Lọc thu được

chất rắn, đem sấy khô, nghiền nhỏ thu được CS dạng nanô

1.3 Ứng dụng CS làm chất mang polyme để gắn thuốc

Nói chung các loại thuốc tân dược cho đến nay thường được sản xuất

dưới dạng viên nén không có chất mang và có kích thước hạt lớn Chính vì

vậy thời gian tác dụng của thuốc ngắn, với cùng một tình trạng bệnh ta phải

dùng thuốc với liều lượng cao và tần suất sử dụng lớn Dùng thuốc dạng này

khả năng đào thải ra ngoài cơ thể lớn, gây lãng phí và tốn kém Để khắc phục

NguyÔn ThÞ Thuý Nga

nhược điểm này các nhà Hoá Dược đã nghiên cứu và tìm cách gắn thuốc lên

một chất mang polyme với mục đích kéo dài thời gian tác dụng của thuốc (do

khả năng phân giải chậm của thuốc trong cơ thể sau khi đã được gắn với chất

mang) Việc dùng thuốc sau khi đã được gắn với chất mang sẽ giảm được liều

dùng trong ngày, tần suất sử dụng thấp hơn, đỡ tốn kém và lãng phí

Ngày nay, với mục đích tăng hiệu quả, hấp thụ chọn lọc, giảm nồng độ,

độc tính và tác dụng phụ của thuốc cũng như bảo vệ các phân tử hoạt động

khỏi bị enzim phân huỷ việc gắn thuốc lên chất mang polime có cấu trúc nanô

- công nghệ nanô sinh học được nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi

Các hạt nanô là những hạt keo rắn có kích thước từ 10nm đến 1000nm

Chúng bao gồm các vật liệu đại phân tử trong đó nhân tố chủ động được hoà

tan, bao vỏ và/hoặc kết bám hay đính kèm vào Các hạt nanô này có những

đặc tính quý như độ bền cao và có khả năng thay đổi các đặc tính bề mặt của

chúng một cách dễ dàng

Trên thực tế, hầu hết dược phẩm không chỉ có tác dụng dược lý hữu ích

mà còn có những tác dụng phụ, vì vậy các hệ thống đặc hiệu và dẫn chuyển

dược phẩm trên cơ sở công nghệ nanô ngày càng thu hút sự quan tâm trong

nghiên cứu và triển khai Các hệ thống này bao gồm những hạt nanô, vectơ

điều khiển dược phẩm tác động trực tiếp vào tế bào đích và không gây ảnh

hưởng đến các tế bào xung quanh

Một vectơ lý tưởng cho hệ thống đặc hiệu và dẫn chuyển dược phẩm

cần thoả mãn những yêu cầu là thể mang có khả năng tăng cường sự tuần

hoàn máu, với kích thước đủ nhỏ để có thể tiếp xúc trực tiếp được với các mô

và tế bào đích, cũng như phải có tính hướng linh hoạt có thể ứng dụng được

trong nhiều loại bệnh và có thể dẫn chuyển phần có hoạt tính vào trong tế

bào… Có ba loại vec tơ chính: liposome, nanocapsule (pha nước hoặc dầu

bao bọc bởi polime phân huỷ sinh học) và nanosphere (polime phân huỷ sinh

học) Hai loại vectơ sau chính là các hạt nanô (hình 1.4)

Hình 1.4 Các hạt nanô của hệ thống đặc hiệu và dẫn chuyển dược phẩm

Hơn nữa, những polyme dùng để gắn thuốc phải có tính hoà hợp sinh

học với cơ thể, có đặc tính có thể phân huỷ được hay dễ bị thuỷ phân hoặc bị

enzim phân huỷ thành những phân tử nhỏ không độc Các polyme phải có

những nhóm chức hoạt động để dễ dàng gắn với thuốc bằng liên kết đồng hoá

trị, liên kết ion hoặc tạo phức

CS là một polyme có đầy đủ các yêu cầu của một chất mang thuốc: Nó

có tính hoà hợp sinh học với cơ thể, độc tính rất thấp, hơn nữa nó có các

nhóm chức hoạt động, đặc biệt là nhóm – NH2

Sự gắn adriamicin vào CS cho thấy thuốc phân huỷ chậm và có thể duy

trì, tập trung adriamicin ở mức nhất định trong một thời gian như mong

muốn.[44]

So sánh khi dùng thuốc Heparin gắn lên chất mang CS và dùng gel CS,

màng CS nguyên chất hoặc dung dịch Heparin không có CS người ta thấy

việc gắn thuốc lên chất mang có tác dụng hơn hẳn [12]

Một số ưu điểm của việc gắn thuốc vào chất mang polyme như sau

[13]:

NguyÔn ThÞ Thuý Nga

- Thuốc gắn vào polyme được phân giải từ từ trong cơ thể nên duy trì

nồng độ thuốc trong máu liên tục, do đó chúng có hiệu lực điều trị kéo

dài, giảm số lần sử dụng thuốc trong một phác đồ điều trị

- Thuốc có khả năng kiểm soát đựơc sự phân liều, có thể điều chỉnh tốc

độ phân giải và định hướng tác dụng theo ý muốn

- Gắn thuốc vào chất mang polyme có thể thay đổi dược lực học, thuốc

được tăng cường tác dụng hoặc có tác dụng mới so với thuốc ban đầu

- Hạn chế sự kháng thuốc của vi khuẩn trong quá trình sử dụng

Đã gắn thuốc axetaminophen lên chất mang CS [23], lựa chọn thuốc để

gắn lên CS là doxorubicin [24] Tác giả tài liệu [20] đã gắn BSA (bovine

serum albumin) Trong một số tài liệu khác người ta còn dùng CS làm chất

mang cho thuốc amoxycilin…

Qua tham khảo các tài liệu và với những ưu điểm như trên của việc gắn

thuốc vào chất mang polyme chúng tôi lựa chọn nghiên cứu gắn một số chất

như axit salixylic (làm thuốc mô hình), Artesunat (thuốc chữa sốt rét), …lên

chất mang polyme CS với hy vọng sẽ làm tăng hiệu quả trong sử dụng thuốc

và giảm chi phí…

1.4 Sơ lược một số thuốc gắn lên chất mang CS

1.4.1 Axit salixylic (Sa)

Cấu trúc Hoá học của Sa

OH

OH C O

(ct1.6)

Do Sa có nhóm COOH, có khả năng tạo liên kết amit với nhóm NH2

của CS nên chúng tôi chọn axit Sa làm thuốc mô hình (model drug) để nghiên

cứu khả năng mang thuốc của CS

1.4.2 Artesunat (ART)

1.4.2.1 Nguồn gốc và một số dẫn xuất của ART

ART là dẫn xuất của Artemisinin Cùng với một số dẫn xuất khác của

Artemisinin như Artemether, Arte – ether là dẫn chất metyl và etyl của

hidroartemisinin, ART dễ tan trong nước, thuận tiện cho việc pha dung dịch

để tiêm và có hoạt lực mạnh hơn Artemisinin

Dihydroartemisinin (DHA) là một hợp chất trung gian để tổng hợp

nhiều dẫn xuất của artemesinin như artemether, arteether, artesunate, .DHA

được tổng hợp từ artemesinin (ct 1.7) Trong điều kiện tối ưu về nhiệt độ hiệu

suất phản ứng có thể đạt tới 90 – 92%

Sản phẩm DHA thu được tinh khiết đến trên 98%, độ ẩm dưới 0,5%

Artemisinin được chiết xuất từ cây Thanh Hao hoa vàng Thanh Hao

mọc hoang ở Trung Quốc, Liên Xô, Mông Cổ, ấn Độ, Nhật, Bắc Mỹ, và một

số nước Đông Nam á Năm 1982 Thanh Hao mới chính thức được phát hiện

mọc hoang ở một số tỉnh phía Bắc Việt Nam và sau đó được trồng ở hầu hết

các tỉnh để chiết xuất Artemisinin Thanh Hao được sử dụng trong Y học cổ

truyền Trung Quốc làm thuốc chữa sốt rét vào năm 340, nhưng mãi đến năm

1967 mới được nghiên cứu và 1972 được chiết xuất dưới dạng tinh thể và

được các nhà khoa học Trung Quốc đặt tên là Qinghaosu

(ct1.7)

Artemisinin có tác dụng đối với ký sinh trùng sốt rét Tác dụng nhanh

và thải trừ nhanh vì vậy ít gây kháng thuốc Hiện nay các chế phẩm bán tổng

hợp từ Artemisinin như Artesunat, dihidroartemisinin, arteether,

artemether,…đang được quan tâm nghiên cứu với mong muốn nâng cao hiệu

lực tác dụng, đặc biệt là ART Những dẫn chất này có thể tan trong nước hoặc

dầu, có thể sản xuất dưới dạng thuốc tiêm, thuốc uống dạng viên nén hay gắn

trên chất mang, để sử dụng trong điều trị các trường hợp sốt rét ác tính [4]

O O

O O

(ct1.9)

Hình 1.5: Phổ 1 H NMR của ART trong CDCl 3 [40]

Hình 1.6: phổ 13 C NMR của ART trong CDCl 3 [40]

NguyÔn ThÞ Thuý Nga

CHƯƠNG II: THỰC NGHIỆM

Trong quá trình nghiên cứu chúng tôi sử dụng một số phương pháp vật

lý và hoá học sau:

2.1 Các phương pháp vật lý

2.1.1 Phổ hồng ngoại (Infrared spectroscopy - IR)

2.1.1.1 Cơ sở lý thuyết

Phổ hồng ngoại dùng để xác định cấu trúc phân tử của phân tử chất

nghiên cứu dựa vào các tần số đặc trưng trên phổ đồ của các nhóm chức trong

phân tử

Khi chiếu bức xạ hồng ngoại vào phân tử chất nghiên cứu, trong bản

thân các phân tử luôn có các trạng thái dao động phân tử

Đối với phân tử hai nguyên tử chuyển động dao động duy nhất là

chuyển động co dãn một cách tuần hoàn của liên kết giữa hai phân tử A-B

Loại dao động trên được gọi là dao động hoá trị (hình 2.1.a)

Hình 2.1: Dao động hoá trị và dao động biến dạng

Đối với những phân tử có số nguyên tử lớn hơn hai, trạng thái dao động

của phân tử phức tạp hơn nhiều Trong các phân tử này, ngoài các dao động

hoá trị như phân tử hai nguyên tử, ta còn gặp các dao động biến hình (hay dao

động biến dạng) (hình 2.1.b)

Với phân tử có N nguyên tử có 3N-6 dao động chuẩn (phân tử thẳng

hàng có 3N-5) Mỗi dao động chuẩn ứng với một tần số dao động cơ bản

Phương trình cơ bản của sự hấp thụ bức xạ điện từ là phương trình

Lambert-Beer:

A = lg(1/T) = lg(I0/It) = .l.C (ct 2.1)

Trong đó:

A – Mật độ quang; T- Phần trăm ánh sáng truyền qua; I0 – Cường độ

ánh sáng chiếu vào; It – Cường độ ánh sáng truyền qua;  - Hệ số hấp thụ

phân tử; C – Nồng độ (mol.l-1); l – Chiều dày của cuvet (m)

Từ các số liệu của phổ dao động, người ta có thể đi đến một số đặc

trưng về cấu trúc phân tử Dựa vào tần số (hoặc số sóng) đặc trưng của các

nhóm chức người ta suy ra cấu trúc phân tử của chất cần nghiên cứu

2.1.1.2 Thực nghiệm

Mẫu được sấy khô đến khối lượng không đổi và ép viên với KBr

Trong luận văn này các phổ IR được đo trên máy FTR –Impact 410 của

hãng Nicolet, tại Viện Hoá học – Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Phương pháp nhiễu xạ tia X được sử dụng để xác định thành phần cấu

trúc mạng tinh thể của chất cần nghiên cứu



d

NguyÔn ThÞ Thuý Nga

Hình 2.2: Sơ đồ tia tới và tia phản xạ trên tinh thể

Theo nguyên lý cấu tạo tinh thể, mạng tinh thể nguyên tử hay ion phân

bố đều đặn trong không gian theo một qui luật nhất định Khi chùm tia

Rơnghen (X) tới bề mặt tinh thể và đi sâu vào bên trong mạng lưới tinh thể thì

mạng lưới này đóng vai trò như một cách tử nhiễu xạ đặc biệt Các nguyên tử,

ion bị kích thích bởi chùm tia X sẽ thành các tâm phát ra các tia phản xạ

Hơn nữa các nguyên tử, ion này được phân bố trên các mặt song song

Do đó, hiệu quang trình của hai tia phản xạ bất kỳ trên hai mặt phẳng song

song cạnh nhau được tính như sau:

 = 2.d.sin (ct 2.2)

Trong đó: d: khoảng cách giữa hai mặt song song

: góc giữa chùm tia X và mặt phẳng phản xạ

: hiệu quang trình của hai tia phản xạ

Theo điều kiện giao thoa, để các sóng phản xạ trên hai mặt phẳng cùng

pha thì hiệu quang trình phải bằng nguyên lần độ dài sóng (), theo hệ thức

Vulf – Bragg :

2.d.sin = n (ct 2.3)

Đây là phương trình cơ sở để nghiên cứu cấu trúc mạng tinh thể Căn

cứ vào cực đại nhiễu xạ trên giản đồ (giá trị 2), có thể suy ra d theo công

thức (2.3) So sánh giá trị d tìm được với d chuẩn sẽ xác định được thành

phần cấu trúc mạng tinh thể của chất cần nghiên cứu

Phổ nhiễu xạ tia X được chụp trên máy Siemens-D5000 của hãng

Siemens, sử dụng bức xạ CuK,  = 1,5406 A0 Chế độ làm việc cho ống tia X

là: điện thế 30kV, cường độ dòng 30A

2.1.3 Phương pháp hiển vi điện tử truyền qua (Transmission Electron

Microscopy - TEM) và phương pháp hiển vi điện tử quét (Scanning

Electron Microscopy - SEM)

2.1.3.1 Cơ sở lý thuyết

Người ta sử dụng chùm tia điện tử để tạo ảnh mẫu nghiên cứu Ảnh đó

khi đến màn hình huỳnh quang có thể đạt độ phóng đại theo yêu cầu Chùm

tia điện tử được tạo ra từ catot qua hai “tụ quang” điện tử sẽ được hội tụ lên

mẫu nghiên cứu Khi chùm tia điện tử đập vào mẫu sẽ phát ra các chùm tia

điện tử phản xạ và điện tử truyền qua Các điện tử phản xạ và điện tử truyền

qua này được đi qua điện thế gia tốc vào phần thu và biến đổi thành một tín

hiệu ánh sáng, tín hiệu này được khuếch đại, đưa vào mạng lưới điều khiển để

tạo ra độ sáng trên màn ảnh Mỗi điểm trên mẫu cho một điểm tương ứng trên

màn Độ sáng tối trên màn ảnh phụ thuộc vào lượng điện tử phát ra tới bộ thu

và phụ thuộc vào hình dạng bề mặt mẫu nghiên cứu (hình 2.3)

I0 Mẫu nghiên cứu I1

I2 TEM

SEM

Hình 2.3: Nguyên tắc chung của phương pháp hiển vi điện tử

Phương pháp SEM, TEM cho ta biết kích thước hạt, đặc trưng bề mặt

và cấu trúc vật liệu

2.1.3.2 Thực nghiệm

Ảnh TEM được chụp trên kính hiển vi điện tử truyền qua JEM 1010,

điện thế gia tốc 100 kV và 80 kV, độ phân giải 0,2 nm, mẫu được đưa lên lưới

đồng 200 mắt đã phủ màng cacbon tại Viện Vệ Sinh Dịch Tễ Trung Ương và

Nguyễn Thị Thuý Nga

ảnh SEM được chụp tại Khoa Vật lý – Trường Đại học khoa học Tự Nhiờn -

Đại học Quốc Gia Hà Nội Mẫu được rửa sạch, phõn tỏn mẫu và sấy khụ

trước khi chụp

2.1.4 Phương phỏp phõn tớch nhiệt DTA-TGA (DTA-Differential Thermal

Analysis-phõn tớch nhiệt vi sai; TGA-Thermogravimetry Analysis-phõn tớch

nhiệt khối lượng)

Nguyờn tắc của phương phỏp dựa trờn sự thay đổi tớnh chất của vật liệu

như: khối lượng, entanpi, kớch thước, tớnh chất từ, theo sự thay đổi nhiệt độ

của mẫu nghiờn cứu đó được chương trỡnh hoỏ

Phõn tớch nhiệt lượng quột DSC là kỹ thuật phõn tớch nhiệt dựng để đo

nhiệt độ và dũng nhiệt truyền trong vật liệu theo hàm của thời gian và nhiệt

độ Phộp đo này cung cấp thụng tin định tớnh và định lượng về cỏc quỏ trỡnh

hoỏ lý xảy ra thụng qua cỏc quỏ trỡnh toả nhiệt, thu nhiệt hoặc biến đổi nhiệt

dung TGA đo sự biến đổi khối lượng mẫu khi tăng nhiệt độ Độ ẩm và cỏc

thành phần cú thể bay hơi được xỏc định bằng kỹ thuật này

Hỡnh 2.4: Sơ đồ nguyờn lý của phương phỏp phõn tớch nhiệt vi sai

S- mẫu đo; R – mẫu so sỏnh

Hỡnh 2.5 là thiết bị phõn tớch nhiệt TA SDT 2960-USA

Cặp nhiệt điện Pt

Hai dây đốt

Thiết bị phân tích nhiệt TA SDT 2960 kết hợp đo đồng thời cả DSC và

TGA đến 15000C Đặc điểm nổi bật của thiết bị này là có thể phân tích định

lượng DSC cho dòng nhiệt được xác định rất chính xác nhờ kỹ thuật chuẩn

hoá động Số liệu DSC được chuẩn hoá liên tục bằng cách chia tín hiệu dòng

nhiệt cho khối lượng mẫu.Sự chuẩn hoá này cho phép định lượng được nhiệt

độ nóng chảy, nhiệt phản ứng Phần TGA có độ nhạy đến 0,1g và ổn định

trên toàn thang nhiệt độ đo

Hình 2.5: Thiết bị phân tích nhiệt TA SDT 2960-USA

2.1.5 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

2.1.5.1 Cơ sở lý thuyết

Quá trình tách trong kỹ thuật tách HPLC là tổ hợp của nhiều quá trình

hoá lý Nó là sự vận chuyển và phân bố lại liên tục của các chất tan (hỗn hợp

mẫu phân tích) theo từng lớp qua chất nhồi cột (pha tĩnh) từ đầu cột tách đến

cuối cột tách Vì cấu trúc và tính chất của mỗi phân tử của chất tan là khác

nhau nên tốc độ dịch chuyển trung bình của mỗi chất tan là khác nhau trong

quá trình di chuyển đó Khi ở trong pha động, nó chuyển dịch theo tốc độ của

pha động, còn khi ở trên pha tĩnh nó lại không chuyển dịch, mà bị pha tĩnh

NguyÔn ThÞ Thuý Nga

giữ lại Như vậy là có một thời gian nhất định, chất tan bị giữ lại trong cột sắc

ký Thời gian chất tan bị pha tĩnh lưu giữ là được quyết định bởi bản chất

sắc ký của pha tĩnh, cũng như cấu trúc và tính chất của mỗi chất tan khác

nhau Đồng thời cũng phụ thuộc vào bản chất và thành phần của pha động

dùng để rửa giải chất tan ra khỏi cột sắc ký (pha tĩnh) Vì thế trong quá

trình sắc ký có chất tan bị lưu giữ lâu trên cột, có chất tan ít bị lưu giữ Điều

đó dẫn đến kết quả là có quá trình tách của các chất xảy ra trong cột sắc ký,

khi chất tan đi từ đầu cột đến cuối cột sắc ký Nếu ghi lại quá trình tách sắc ký

đó của hỗn hợp chất mẫu phân tích, chúng ta sẽ có một sắc đồ gồm nhiều pic

Các pic có thể tách nhau hoàn toàn, hoặc cũng có thể chập vào nhau một phần

hay hoàn toàn Trong quá trình sắc ký, chất nào bị lưu giữ mạnh nhất sẽ được

rửa giải ra sau cùng, chất nào bị lưu giữ kém nhất sẽ bị rửa giải ra trước tiên

Từ đó người ta đo thời gian rửa giải của từng chất và so sánh với chất chuẩn

để phân tích mẫu

Nguyên tắc và cấu tạo của hệ thống máy HPLC

Bơm Van Cột Detector

Hình 2.6: Sơ đồ khối HPLC hoàn chỉnh

Hệ thống máy HPLC bao gồm các bộ phận chính sau đây:

- Bơm cao áp: Để bơm pha động vào cột tách, thực hiện quá trình sắc ký,

giửa rải chất tan ra khỏi cột sắc ký

- Van bơm mẫu: Để bơm mẫu phân tích vào cột tách theo những lượng

mẫu nhất định không đổi trong một quá trình sắc ký

- Cột tách: Là cột chứa pha tĩnh, trái tim của quá trình tách sắc ký, nó là

một yếu tố quyết định hiệu quả sự tách sắc ký của một hỗn hợp chất

mẫu

- Trang bị phát hiện chất phân tích: Đây thường là các Detector dựa

theo các tính chất của chất phân tích Tuỳ theo chất phân tích mà chọn

loại Detector phù hợp để đạt độ nhạy cao khi phát hiện các chất đo định

lượng chúng

- Trang bị chỉ thị kết quả: ở đây có nhiều loại, nhưng đơn giản và phổ

biến nhất là các máy tự ghi (recorder) để ghi tín hiệu đo dưới dạng các

pic của các chất, rồi đến bộ tích phân kế (Intergrator), sau đó máy tính và

máy in kèm theo để xử lý kết quả và in kết quả

Ngoài 5 bộ phận chính tối thiểu cần phải có trên, ngày nay các máy

HPLC hiện đại cón có thêm bộ chương trình gradient dung môi (pha động),

bộ bơm mẫu tự động và pha loãng mẫu, bộ gia nhiệt và ổn nhiệt độ cho cột

tách sắc ký, máy tính và các phần mềm điều khiển toàn bộ hệ thống HPLC và

xử lý kết quả tách, in kết quả tách, hay bộ phân tích kế (intergrator)

2.1.5.2 Thực nghiệm

Mẫu nghiên cứu được pha thành dung dịch với nồng độ cần thiết để

tiêm vào cột sắc ký

NguyÔn ThÞ Thuý Nga

cột Lichrosorb RP 18

Kết quả HPLC được sử dụng trong luận văn đo trên máy Agilent 1100,

detector Photo Diod Array (DAD), cột Lichrosorb RP 18, bộ môn Hoá phân

tích, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội và máy Waters 1525 Binary HPLC

pump, Viện Kiểm Nghiệm, Bộ Y tế

2.1.6 Phổ tử ngoại và khả kiến (UV-Vis)

2.1.6.1 Cơ sở lý thuyết

Khi phân tử nhận năng lượng các phân tử sẽ chuyển từ trạng thái cơ

bản sang trạng thái kích thích, do đó các điện tử từ mức năng lượng thấp

chuyển lên mức năng lượng cao, trường hợp này ta gọi trong phân tử đã xảy

ra bước chuyển năng lượng điện tử

Theo quy tắc chọn lọc trong phổ điện tử khi phân tử nhận năng lượng

có thể xảy ra các bước chuyển năng lượng (hình 2.8) theo các mũi tên thẳng

đứng

 *