Xác định đặc điểm kháng thuốc của HIV trên bệnh nhân đang điều trị ARV phác đồ bậc 2 tại bệnh viện bệnh nhiệt đới trung ương

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI --- LUẬN VĂN THẠC SĨ ĐỀ TÀI: XÁC ĐỊNH ĐẶC ĐIỂM KHÁNG THUỐC CỦA HIV TRÊN BỆNH NHÂN ĐANG ĐIỀU TRỊ ARV PHÁC ĐỒ BẬC 2 TẠI BỆNH VIỆN BỆNH NHIỆ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI -

LUẬN VĂN THẠC SĨ

ĐỀ TÀI:

XÁC ĐỊNH ĐẶC ĐIỂM KHÁNG THUỐC CỦA HIV TRÊN BỆNH NHÂN

ĐANG ĐIỀU TRỊ ARV PHÁC ĐỒ BẬC 2 TẠI BỆNH VIỆN BỆNH NHIỆT ĐỚI TRUNG ƯƠNG

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI -

LUẬN VĂN THẠC SĨ

ĐỀ TÀI:

XÁC ĐỊNH ĐẶC ĐIỂM KHÁNG THUỐC CỦA HIV TRÊN BỆNH NHÂN

ĐANG ĐIỀU TRỊ ARV PHÁC ĐỒ BẬC 2 TẠI BỆNH VIỆN BỆNH NHIỆT ĐỚI TRUNG ƯƠNG

CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

MÃ SỐ : 60420201

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC : TS LÊ VĂN DUYỆT

Hà Nội, 01/2018

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học của riêng tôi dưới sự hướng dẫn của Tiến sỹ Lê Văn Duyệt Các số liệu, kết quả trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Học viên

Nguyễn Thị Hòa

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành bày tỏ kính trọng và biết ơn sâu sắc đến TS Lê Văn Duyệt

đã tận tình hướng dẫn, quan tâm giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn này Toàn bộ nội dung nghiên cứu trong khóa luận này được thực hiện và hoàn thành tại Phòng khám ngoại trú, Khoa Xét nghiệm của Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu của tập thể cán bộ trong khoa

Tôi xin tỏ lòng biết ơn chân thành đến Ban Giám hiệu, Ban chủ nhiệm Khoa Sau đại học – Viện đại học Mở Hà Nội đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Cuối cùng tôi xin chân thành cảm ơn bạn bè đồng nghiệp và gia đình đã luôn quan tâm giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian học tập và hoàn thành khóa luận này

Hà Nội, Ngày… tháng 01 năm 2018

Học viên

Nguyễn Thị Hòa

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN 1

LỜI CẢM ƠN ii

BẢNG KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT v

DANH MỤC BẢNG vi

DANH MỤC BIỂU ĐỒ vii

DANH MỤC HÌNH viii

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

1.1 Tổng quan về Human Immunodeficiency Virus (HIV) 2

1.1.1 Tác nhân gây bệnh 2

1.1.2 Dịch tễ học 2

1.1.3 Sinh bệnh học của HIV 5

1.2 Tình hình điều trị ARV tại Việt Nam 7

1.3 Các phác đồ điều trị HIV ở Việt Nam 8

1.4 Kháng thuốc của HIV 9

1.4.1 Khái niệm về HIV kháng thuốc 9

1.4.2 Các loại đột biến kháng thuốc thường gặp 10

1.4.3 Các yếu tố liên quan đến đề kháng 11

1.5 Chẩn đoán kháng thuốc 11

CHƯƠNG II: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

2.1 Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu 14

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 14

2.2 Trang thiết bị, vật liệu nghiên cứu 14

2.2.1 Trang thiết bị 14

2.2.2 Vật liệu 14

2 3 Phương pháp nghiên cứu 16

2.3.1 Thiết kế nghiên cứu 16

2.3.2 Sơ đồ nghiên cứu 16

2.3.3 Các bước tiến hành 17

2.4 Nhập, quản lý và xử lý số liệu 25

2.5 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 25

2.6 Đạo đức trong nghiên cứu 25

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ 26

3.1 Đặc điểm chung của nhóm bệnh nhân nghiên cứu 26

3.1.1 Đặc điểm về tuổi và giới 26

3.1.2 Đặc điểm đường lây truyền và thời gian nhiễm HIV 27

3.2 Đặc điểm của bệnh nhân thất bại điều trị bậc phác đồ bậc 1 28

3.2.1 Số lượng CD4 và tải lượng vi rút của bệnh nhân thất bại điều trị phác đồ bậc 1 28

3.2.2 Tuân thủ phác đồ điều trị của các bệnh nhân HIV 29

3.2.3 Đột biến điểm liên quan đến kháng thuốc phác đồ bậc 1 của HIV 29

3.2.4 Đặc điểm đề kháng thuốc ARV phác đồ bậc 1 của HIV 31

3.3 Đặc điểm kháng thuốc của HIV ở các bệnh nhân đang điều trị phác đồ bậc 2 34

3.3.1 Số lượng tế bào CD4 và tải lượng vi rút 34

3.3.2 Kết quả xác định đột biến liên quan đến đề kháng ARV phác đồ bậc 2 35

3.3.3 Mối liên quan giữa tần xuất đột biến và mức độ kháng ARV bậc 2 36

3.3.4 Mối liên quan giữa tần xuất mang đột biến và một số yếu tố liên quan 37

CHƯƠNG IV: BÀN LUẬN 40

4.1 Đặc điểm chung của nhóm bệnh nhân nghiên cứu 40

4.2 Đặc điểm về tình trạng miễn dịch và vi rút học của bệnh nhân thất bại điều trị ARV phác đồ bậc 1 42

4.3 Đột biến điểm liên quan đến kháng thuốc ARV phác đồ bậc 1, một số đặc điểm và so sánh các yếu tố liên quan 44

4.4 Đột biến điểm liên quan đến kháng thuốc ARV phác đồ bậc 2, một số đặc điểm và so sánh các yếu tố liên quan 47

KẾT LUẬN 52

KIẾN NGHỊ 53

TÀI LIỆU THAM KHẢO 54

BẢNG KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

Từ viết

HIV Human immunodeficiency

virus

Vi rút gây suy giảm miễn dịch ở

người AIDS Acquired Immunodeficiency

Syndrome

Hội chứng suy giảm miễn dịch

mắc phải ARV Antiretroviral Kháng retro vi rút

NNRTIs Nonnucleoside reverse

transcriptase inhibitors

Nhóm thuốc ức chế men sao chép ngược non-nucleoside NRTIs Nucleoside reverse

transcriptase inhibitors

Nhóm thuốc ức chế men sao chép

ngược nucleoside PIs Protease inhibitors Nhóm thuốc ức chế protease

KTC Confidence interval Khoảng tin cậy

DNA Ribonucleic acid

RT Reverse transcriptase

TAM Thymidine analogue

mutations WHO World Health Organization Tổ chức Y tế Thế giới PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp

PR Prot - Gen protease Gen prot

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1: Các cặp mồi đặc hiệu cho các gen mã hóa RT và PR (tài liệu tham khảo) 15Bảng 3.2: Đánh giá bệnh nhân tuân thủ điều trị ARV phác đồ bậc 1 29Bảng 3.3: Đột biến điểm liên quan đến đề kháng thuốc ARV nhóm NRTIs 29

Bảng 3.4: Tỷ Đột biến điểm liên quan đến đề kháng thuốc ARV nhóm NNRTIs 30

Bảng 3.5: Mối liên quan giữa điều trị các bệnh đồng nhiễm và tần xuất mang đột

biến kháng thuốc nhóm NNRTIs Error! Bookmark not defined.

Bảng 3.6: Mối liên quan giữa điều trị các bệnh đồng nhiễm và tần xuất mang đột

biến kháng thuốc nhóm NRTIs Error! Bookmark not defined.

Bảng 3.7: Tần xuất mang đột biến kháng ARV nhóm NRTIs, NNRTIs và PIs của bệnh nhân đang điều trị phác đồ bậc 2 (n=6) 35Bảng 3.11: Mối liên quan giữa tuân thủ điều trị và tần xuất mang đột biến (n=6) 37Bảng 3.12: Mối liên quan giữa tần xuất mang đột biến kháng ARV bậc 2 và điều trị các bệnh đồng nhiễm 39

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 3.1: Phân bố giới tính trong nhóm bệnh nhân 26

Biểu đồ 3.2: Phân bố độ tuổi của các bệnh nhân trong nghiên cứu 26

Biểu đồ 3.3: Các con đường lây truyền HIV của bệnh nhân trong nghiên cứu 27

Biểu đồ 3.4: Thời gian nhiễm HIV của các bệnh nhân trong nghiên cứu 27

Biểu đồ 3.5: Số lượng tế bào CD4 của bệnh nhân thất bại điều trị bậc 1 28

Biểu đồ 3.7: Đặc điểm đề kháng thuốc nhóm NRTIs 31

Biểu đồ 3.8: Đặc điểm đề kháng thuốc nhóm NNRTIs 31

Biểu đồ 3.9: Mối liên quan giữa thời gian điều trị và tần xuất mang đột biến kháng nhóm NNRTIs 32

Biểu đồ 3.10: Mối liên quan giữa thời gian điều trị và tần xuất mang đột biến kháng nhóm NRTIs 33

Biểu đồ 3.11: Số lượng CD4 của nhóm bệnh nhân đang điều trị ARV phác đồ bậc 2 34 Biểu đồ 3.13: Mối liên quan giữa đột biến và mức độ kháng ARV bậc 2 nhóm NRTIs 36

Biểu đồ 3.14: Mối liên quan giữa đột biến và mức độ kháng ARV bậc 2 nhóm NNRTIs 37

Biểu đồ 3.15: Mối liên quan giữa đột biến và mức độ kháng ARV bậc 2 nhóm PIs 37

Biểu đồ 3.16: Mối liên quan giữa thời gian điều trị ARV bậc 2 và tần xuất mang đột biến kháng thuốc nhóm NRTIs 38

Biểu đồ 3.17: Mối liên quan giữa thời gian điều trị ARV bậc 2 và tần xuất mang đột biến kháng thuốc nhóm NNRTIs 39

Biểu đồ 3.18: Mối liên quan giữa thời gian điều trị ARV bậc 2 và tần xuất mang đột biến kháng thuốc nhóm PIs 39

DANH MỤC HÌNH

Hình 1: Vòng đời của HIV với các điểm hoạt động của nhiều nhóm thuốc kháng vi rút 5Hình 2.1: Hình ảnh giải trình tự nucleotide gen PR của bệnh nhân số 23 và kết quả tìm đột biến kháng thuốc của gen PR trên ngân hàng dữ liệu HIV của đại học Stanford 25

ĐẶT VẤN ĐỀ

Tại các nước đang phát triển trong đó có Việt Nam, HIV/AIDS vẫn là nguyên nhân hàng đầu gây ra gánh nặng bệnh tật và tỷ lệ tử vong cao Theo báo cáo của Cục Phòng, chống HIV/AIDS, Bộ Y tế, tính đến quý 3 năm 2017 số người nhiễm HIV hiện được báo cáo đang còn sống là 208,371 trường hợp, trong đó chỉ quản lý được 80% số bệnh nhân này [1]

Thuốc kháng vi rút (ARV) ra đời đã mang lại niềm hy vọng cho các bệnh nhân HIV/AIDS Thuốc ARV hiện sử dụng để điều trị HIV type 1 (HIV-1) được phân thành ba nhóm dựa vào chức năng: 1) Các chất ức chế quá trình phiên mã ngược sợi ARN genome của vi rút thành phân tử ADN, 2) Các chất ức chế enzyme protease của vi rút [2], 3) Các chất ức chế sự nhập bào của các hạt vi rút HIV vào các tế bào đích (CD4) Việc kết hợp nhiều loại thuốc ARV trong điều trị HIV được gọi là liệu pháp điều trị kháng vi rút hoạt tính cao (HAART) [16]

Tuy nhiên, điều trị HIV/AIDS phải duy trì suốt đời, trong thời gian dài, bệnh nhân phải đối mặt với nhiều thách thức như tuân thủ điều trị, tác dụng phụ của thuốc, và đặc biệt là tình trạng kháng thuốc của HIV ngày càng tăng HIV đã đề kháng thuốc ARV phác đồ bậc 1 ở mức rất độ cao, nhiều bệnh nhân chuyển sang điều trị ARV phác đồ bậc 2 cũng đã xuất hiện đề kháng ngày càng nhiều Trong khi

đó các hướng dẫn điều trị cho những bệnh nhân thất bại điều trị cả phác đồ bậc 1 và bậc 2 còn rất hạn chế và nguồn lực rất eo hẹp Do vậy việc tìm hiểu các yếu tố liên quan, đặc điểm đề kháng và phương pháp chẩn đoán HIV kháng thuốc là cần thiết

để tìm hiểu nguyên nhân thất bại điều trị và đặc điểm đề kháng, từ đó đưa ra dự báo

và đề xuất các giải pháp phù hợp cho việc điều trị ARV hiệu quả hơn Trên cơ sở

đó, chúng tôi tiến hành đề tài “Xác định đặc điểm kháng thuốc của HIV trên bệnh nhân đang điều trị ARV phác đồ bậc 2 tại Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương” với các mục tiêu sau:

Tìm hiểu các yếu tố liên quan và xác định đặc điểm kháng thuốc, mức độ kháng thuốc của HIV trên những bệnh nhân đang được điều trị ARV phác đồ bậc 2 tại Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan về Human Immunodeficiency Virus (HIV)

1.1.1 Tác nhân gây bệnh

Căn nguyên gây hội chứng suy giảm miễn dịch ở người (Human Inmmunodeficiency Virus - HIV) là một vi rút thuộc chi Lentivirus, họ Retroviridae Tương tự như một số loài vi rút khác, HIV có cấu tạo genome là ARN, tuy nhiên điểm khác biệt mà HIV có được đó là chúng phiên mã ngược sợi ARN thành ADN sợi đôi ở ngoài tế bào chất dưới sự xúc tác của enzyme phiên mã ngược (reverse transcriptase), sau đó di chuyển vào trong nhân để gắn xen vào trong

hệ genome của người [17] Nhờ sở hữu đặc tính này mà HIV có thể nhân lên với tốc

độ rất nhanh và rất khó tiêu diệt bởi hệ thống miễn dịch của con người Ngoài ra, do việc phải trải qua giai đoạn phiên mã ngược để tổng hợp sợi đổi ADN, sau đó sử dụng hệ thống sinh học của tế bào chủ lại phiên mã ra sợi ARN để tạo ra hạt vi rút mới, vì vậy mà HIV thường xảy ra đột biến và có tính đa dạng di truyền cao Đã xác định được hai loại HIV gây bệnh chính ở người bao gồm HIV-1 và HIV-2, tỷ lệ gây bệnh của hai loại HIV này có nhiều sự khác biệt, HIV-1 là căn nguyên gây bệnh chủ yếu và thường gặp nhất trên thế giới và cũng là loại có độc tính rất cao Trong khi

đó HIV-2 chủ yếu gây bệnh ở một số khu vực của lục địa Châu Phi, rất hiếm khi gặp những ca bệnh mà do HIV-2 là căn nguyên và thường chúng có độc lực thấp hơn, do đó thời gian ủ bệnh dài hơn tuy nhiên chúng vẫn gây ra các triệu chứng lâm sàng điển hình khi chuyển sang giai đoạn AIDS như HIV-1 Cả hai loại HIV-1 và HIV-2 đều có cấu tạo tương tự nhau, bao gồm lớp vỏ ngoài bao bọc bên trong lõi là hai phân tử ARN đơn dương , trong lõi chứa 2 phân tử ARN đơn là bộ gen di truyền của HIV (genome), có khả năng tích hợp vào DNA của tế bào vật chủ [18] Điều này gây khó khăn lớn cho vật chủ để quét sạch vi rút, vì genome tiền vi rút có thể tồn tại mà không bị hệ thống miễn dịch và tránh được tác động của các chất kháng

vi rút Vi rút hoàn chỉnh có hình cầu đường kính 80-120 nm

1.1.2 Dịch tễ học

Dịch HIV xuất hiện trên người sau khi bị nhiễm trùng với một loại vi rút gây suy giảm miễn dịch ở khỉ và động vật linh trưởng ở Châu Phi [39] Thợ săn thịt thú

rừng là nhóm người đầu tiên được cho là bị nhiễm HIV Trong đó HIV-1 truyền bệnh từ khỉ không đuôi và HIV-2 từ khỉ mặt bồ hóng HIV-1 gồm có bốn nhóm chính, ba nhóm được truyền bệnh từ loài tinh tinh là M, N, O và một từ khỉ đột (P) Tuy nhiên nhóm N, O, P bị hạn chế gây bệnh ở khu vực Tây Phi Ngược lại nhóm

M lại là nguyên nhân chính gây ra đại dịch HIV trên toàn cầu, bắt đầu từ khoảng

100 năm trước HIV-1 nhóm M bao gồm chín phân nhóm, gồm A-D, F-H, J, K và subtype C chiếm ưu thế ở châu Phi và Ấn Độ, và chiếm 48% các trường hợp nhiễm HIV-1 trong năm 2007 trên toàn thế giới Type B chiếm ưu thế ở Tây Âu, Châu Mỹ,

và Úc Tuy nhiên việc tái tổ hợp các phân nhóm hiện đang được lưu hành phổ biến hơn Sự đa dạng di truyền của HIV-1 là hệ quả tất yếu của phân nhóm đang trở nên phổ biến hơn Sự đa dạng di truyền rõ rệt của HIV-1 là một hệ quả của hàm errorprone của phiên mã ngược, mà kết quả trong một tỷ lệ đột biến cao HIV-2 tập trung chủ yếu vào phía Tây châu Phi và gây ra một căn bệnh tương tự như HIV-1, nhưng suy giảm miễn dịch tiến triển chậm hơn và HIV-2 là ít lây lan Trong năm

2012 ước tính 35,3 triệu người đang sống với HIV Vùng hạ Sahara châu Phi, đặc biệt là miền nam châu Phi, có những gánh nặng HIV toàn cầu cao nhất (70,8%) Dịch tễ học toàn cầu nhiễm HIV đã thay đổi rõ rệt như một kết quả của sự mở rộng tiếp cận điều trị ARV, vào năm 2012 có 9,7 triệu người ở các nước thu nhập trung bình và thu nhập thấp đã bắt đầu điều trị ARV Tỷ lệ nhiễm HIV trên toàn cầu đã tăng từ 31,0 triệu người năm 2002, với 35,3 triệu USD trong năm 2012, bởi vì mọi người đang điều trị thuốc kháng vi rút được sống lâu hơn, trong khi đó tỷ lệ trên toàn cầu đã giảm từ 3,3 triệu người năm 2002, với 2,3 triệu trong năm 2012 [19] Việc giảm tỷ lệ nhiễm HIV toàn cầu phần lớn là do giảm lây truyền tình dục khác giới Thái độ trừng phạt đối với những người tiêm chích ma túy (đặc biệt là ở Đông Âu) hạn chế việc thực hiện các điều trị thay thế chất gây nghiện và các chương trình bơm kim tiêm, đó là chiến lược phòng chống có hiệu quả làm giảm lây truyền HIV Tại các vùng đường lây truyền chính là người đàn ông có quan hệ tình dục với nam giới (ví dụ, Tây và Trung Âu và châu Mỹ), tỷ lệ này là ổn định mặc dù phạm vi điều trị kháng vi rút cao (ví dụ, 75% ở châu Mỹ Latin vào năm 2012, và 80% trong Anh vào năm 2010) Các quá trình điều khiển của đại dịch HIV ở nam giới có quan hệ

tình dục với nam giới rất phức tạp, và bao gồm các hành vi nguy cơ ngày càng tăng

kể từ khi áp dụng liệu pháp kháng vi rút có hiệu quả (một hiện tượng gọi là lạc quan trị), truyền nguy cơ cao của giao hợp qua đường hậu môn dễ tiếp thu, mạng tình dục, và sự kỳ thị hạn chế tiếp cận với chăm sóc

Số ca nhiễm mới ở trẻ em tại các nước châu Phi ưu tiên trong Chương trình Liên Hợp Quốc về HIV/AIDS (UNAIDS) kế hoạch toàn cầu giảm 38% giữa năm 2009

và 2012, do việc tiếp cận với thuốc kháng vi rút để ngăn ngừa lây truyền từ mẹ sang con Tuy nhiên, dùng thuốc kháng vi rút là thấp hơn nhiều ở trẻ em hơn người lớn HIV là một đóng góp lớn vào gánh nặng bệnh tật toàn cầu Trong năm 2010, HIV là nguyên nhân gây tàn phế hàng đầu điều chỉnh năm sống trên toàn thế giới cho những người từ 30-44 năm, và các nguyên nhân thứ năm cho tất cả các lứa tuổi Trường hợp tử vong liên quan đến AIDS toàn cầu đạt đỉnh 2,3 triệu USD trong năm

2005, và giảm xuống còn 1,6 triệu 2012 Khoảng 50% của tất cả các trường hợp tử vong ở những người điều trị ARV ở các nước có thu nhập cao không phải do AIDS Trong một nghiên cứu, nguyên nhân chính gây tử vong không liên quan đến AIDS

là căn bệnh ung thư không xác định AIDS (23,5%), bệnh tim mạch (15,7%), và bệnh gan (14,1%) Những người có HIV có nguy cơ gia tăng 50% của nhồi máu cơ tim hơn làm người không có HIV sau khi điều chỉnh các yếu tố nguy cơ tim mạch Bệnh gan là phổ biến, chủ yếu là do đồng nhiễm viêm gan B và C, trong đó chia sẻ tương tự đường lây truyền HIV [20]

Lao tiếp tục là một nguyên nhân chính của bệnh tật và tử vong ở thu nhập thấp

và các nước thu nhập trung bình, đặc biệt là ở châu Phi Kết quả của một nghiên cứu được thực hiện tại Nam Phi trong thời kỳ điều trị kháng vi rút trước đã cho thấy rằng bệnh lao tăng gấp đôi trong vòng một năm sau khi nhiễm HIV, sau đó tỷ lệ tăng như khả năng miễn dịch giảm, và đạt đến một tỷ lệ rất cao 25,7/100 người/năm

ở bệnh nhân với CD4 T-cell đếm thấp hơn 50 tế bào/ml [20] Trên thế giới, tỷ lệ tử vong liên quan đến bệnh lao HIV đang giảm dần, nhưng nhiều người có HIV ở châu Phi chết vì bệnh lao không được chẩn đoán

1.1.3 Sinh bệnh học của HIV

1.1.3.1 Vòng đời của HIV

Sự lây lan trên toàn thế giới của HIV-1 cho thấy vi rút có hiệu quả chống hiện bẩm sinh, thích ứng, khả năng miễn dịch và nội tại Mặc dù kích thước hệ gen của HIV khá khiêm tốn (dưới 10 kb) và chỉ mang có vài gen, HIV-1 rất giỏi trong việc tận dụng các thành phần có sẵn của tế bào vật chủ, trong khi có khả năng trung hoà

và ẩn mình khỏi sự truy tìm của các tế bào chức năng trong hệ thống miễn dịch Vòng đời HIV-1 khá phức tạp, thời gian lây nhiễm và sinh trưởng phụ thuộc vào loại tế bào mục tiêu và mức độ hoạt hóa tế bào [21]

Hình 1: Vòng đời của HIV với các điểm hoạt động của nhiều nhóm thuốc

kháng vi rút

Trong bước khởi đầu, HIV-1 tăng khả năng bám vào các tế bào mà không gây

ra gây chết tế bào đích ngay lập tức, tuy nhiên quá trình xâm nhập có thể kích thích

các tín hiệu nội bào thác, do đó có thể tạo điều kiện cho sự nhân lên của vi rút Hai phân tử trên hạt vi rút HIV-1, các glycoprotein bên ngoài (gp120) và các protein xuyên màng (gp41), hình thành nên các gai trên bề mặt của hạ vi rút Trong quá trình xâm nhập, gp120 gắn vào màng tế bào đích bằng cách liên kết với các thụ thể CD4+ Tương tác tiếp theo giữa vi rút và chemokine đồng thụ thể (ví dụ, CCR5, CXCR4) kích hoạt sự thay đổi về hình dạng của tế bào đích Các liên kết thực tế diễn ra chỉ trong vòng vài phút nhưng có thể tạo ra các lỗ thủng trên bề mặt tế bào đích và từ đó vi rút bơm phần lõi chứa vật liệu di truyền vào bên trong tế bào chất Sau khi cởi áo phần lõi, bộ gen của vi rút được lại phiên mã ngược ra DNA sử dụng enzyme sao chép ngược của chính vi rút Tiếp đó, enzyme integrase của vi rút kết hợp với enzyme sửa chữa DNA vật chủ chèn bộ gen của vi rút vào hệ gen của tế bào đích Trong các bước cuối, sản xuất các hạt vi rút cần bộ máy của tế bào vật chủ điều khiển cũng như định hướng phiên mã và dịch mã Protein vi rút được vận chuyển đến và lắp ráp gần với màng tế bào Hạt vi rút được giải phóng ra từ các tế bào bằng cách mọc chồi [21]

1.1.3.2 Thuốc ARV dùng trong điều trị HIV

Hiện nay các thuốc ARV dùng trong điều trị HIV đang lưu hành có thể chia thành một số nhóm dựa vào chức năng tác động của chúng:

Thuốc ARV cổ điển [40] : bao gồm

- Thuốc ức chế enzyme sao chép ngược tương tự nucleoside (Nucleoside reverse transcriptase inhibitors – NRTIs): Lamivudin, stavudin, zizovudin, emtricitabin didanosin, didanosin, abacavir, tenofovir Các thuốc này có chức năng cạnh tranh với các nucleotide tự nhiên, gắn xen vào mạch ADN đang tổng hợp, qua đó ngăn chặn enzyme RT kéo dài chuỗi ADN mới

- Thuốc ức chế enzyme sao chép ngược non-nucleoside (Nonenucleoside reverse transcriptase – NNRTIs): Nevirapin, efavirenz, delavirdin Các thuốc này có chức năng gắn xen trực tiếp vào enzyme RT và ức chế hoạt động sao chép ngược sợi ARN của vi rút thành ADN

- Thuốc ức chế protease (Protease inhibitors – PIs): Raltegravir, elvitegravir, enfuvirtide Nhóm này có tác dụng ức chế sự gắn xen sợi ADN của vi rút vào

hệ gen của tế bào vật chủ, riêng enfuvirtide có chức năng ngăn cản sự hòa màng của vi rút vào màng tế bào đích

Thuốc ARV thế hệ mới [41].: bao gồm

- Các chất ức chế xâm nhập: gồm ức chế CD4, ức chế đồng thụ thể và ức chế hòa màng

- Các chất ức chế tích hợp (Intergrase inhibitors – II)

- Các chất ức chế trưởng thành (Maturation inhibitors – MI)

1.2 Tình hình điều trị ARV tại Việt Nam

Từ năm 1993 một số bệnh nhân nhiễm HIV tại các bệnh viện trung ương của các thành phố lớn đã được tiếp cận điều trị ARV thông qua các chương trình viện trợ hợp tác quốc tế với chính phủ Việt Nam hoặc theo con đường tự túc mua thuốc mang từ nước ngoài về bán trôi nổi ở ngoài thị 5 trường Các phác đồ điều trị chủ yếu dựa vào nguồn thuốc sẵn có và kinh nghiệm của các bác sỹ lâm sàng Từ đó dẫn đến việc điều trị với phác đồ chỉ 1 hoặc 2 thứ thuốc như chỉ dùng AZT đơn độc hoặc AZT kết hợp với 3TC hoặc thậm chí d4T với ddI Đây cũng là một trong những nguyên nhân dẫn đến gia tăng thất bại điều trị và kháng thuốc sau này Sau thời gian điều trị một hoặc hai loại thuốc kết hợp, người ta đã nhận thấy hiệu quả điều trị của những phương pháp này không có tính ổn định lâu dài Trong thời gian đầu số lượng HIV giảm xuống nhanh chóng kèm theo những cải thiện rõ rệt về lâm sàng Trong những năm qua, việc điều trị cho bệnh nhân HIV/AIDS bằng thuốc kháng vi rút (ARV) ở Việt Nam đã có những tiến bộ đáng kể giúp bệnh nhân kéo dài tuổi thọ, nâng cao chất lượng cuộc sống Tuy nhiên việc tăng cường tuân thủ, đánh giá thất bại điều trị và kháng thuốc là việc làm quan trọng luôn được các nhà lâm sàng đặt ra trong quá trình điều trị nhằm phát hiện sớm và chuyển đổi phác đồ kịp thời Từ năm 2005, với sự quyết tâm của Chính phủ và sự giúp đỡ của các tổ chức quốc tế, các chương trình điều trị thuốc ARV miễn phí bắt đầu được triển 6 khai và liên tục được mở rộng trên toàn quốc Tính đến tháng 6 năm 2015, toàn quốc có 312 phòng khám ngoại trú và 526 điểm cấp phát thuốc ARV tại xã/phường; đang điều trị ARV tại 23 trại giam và 33 Trung tâm Hiện có 95.752 bệnh nhân đang điều trị ARV, trong đó 91.156 người lớn, 4.596 trẻ em [6]

1.3 Các phác đồ điều trị HIV ở Việt Nam

Theo hướng dẫn của Bộ Y tế năm 2005 phác đồ điều trị ARV bậc 1 [7]:

- Phác đồ thay thế: - AZT + 3TC + EFV hoặc AZT +3TC + NVP

Hướng dẫn 2009 của Bộ Y tế Việt Nam đưa ra các lựa chọn phác đồ bậc hai tùy theo phác đồ bậc một mà bệnh nhân đã sử dụng và bản cập nhật 2011 bổ sung thêm các lựa chọn do có sự thay đổi các phác đồ bậc một trong giai đoạn hiện nay với việc ưu tiên sử dụng tenofovir và loại bỏ stavudine trong các phác đồ bậc 1 Hướng dẫn phác đồ bậc 1 theo hướng dẫn 2009 của Bộ Y tế:

- AZT/d4T + 3TC + NVP

- AZT/d4T + 3TC + EFV

- AZT/d4T + 3TC + ABC

- ABC + 3TC + NVP/EFV

Hướng dẫn phác đồ bậc 2 theo hướng dẫn 2009 của Bộ Y tế:

- ddI + ABC + LPV/r (hoặcATV/r)

- ddI + EFV + LPV/r (hoặc ATV/r)

- ddI + NVP + LPV/r (hoặc ATV/r)

- AZT + 3TC (có thể thêm ddI) + LPV/r (hoặc ATV/r)

- d4T + 3TC + LPV/r (hoặc ATV/r)

Hướng dẫn lựa chọn phác đồ bậc 1 có bổ sung năm 2011[2].:

- TDF + 3TC + NVP/EFV

- AZT + 3TC + NVP/EFV

Hướng dẫn lựa chọn phác đồ bậc 2 có bổ sung năm 2011[8].:

- AZT + 3TC + LPV/r hoặc ATV/r

- TDF + 3TC + LPV/r hoặc ATV/r

1.4 Kháng thuốc của HIV

1.4.1 Khái niệm về HIV kháng thuốc

Hai khái niệm quan trọng đối với sự hiểu biết về sự phát triển kháng thuốc Đầu tiên, nhiễm HIV được đặc trưng bởi tải lượng vi rút ở mức độ cao Ở những bệnh nhân không được điều trị nhất, tổng số hạt vi rút xâm nhập trong các tế bào bạch huyết được ước tính là khoảng 107 đến 108 Trong giai đoạn mạn tính của nhiễm HIV, con số này là tương đối ổn định, phản ánh sự cân bằng giữa sự lây nhiễm các tế bào mục tiêu mới và giải phóng hạt vi rút sau lây nhiễm tế bào Do thời gian bán hủy của các tế bào bị nhiễm bệnh là rất ngắn (1-2 ngày), duy trì trạng thái ổn định này đòi hỏi rằng HIV lây nhiễm tế bào mục tiêu mới với tốc độ rất cao Thứ hai, số lượng hạt vi rút trong một người đã bị nhiễm bệnh là rất không đồng nhất Các enzyme phiên mã ngược sợi ARN của vi rút thành DNA thường rất dễ bị lỗi, tỷ lệ lỗi sao chép trung bình trong mỗi lần sao chép của vi rút dao động từ 1-3 đột biến, tuy nhiên các dạng đột biến lặp đoạn, chuyển đoạn, và đảo đoạn cũng có thể xảy ra Tỷ lệ nhiễm HIV cao, kết hợp với tỷ lệ đột biến cao xảy ra trong mỗi chu

kỳ nhiễm, dẫn đến tình trạng bệnh nhân có thể mang nhiều chủng vi rút khác nhau,

đa dạng về mức độ đột biến gen Điều này cho thấy, các đột biến diễn ra có thể tạo

ra ưu thế chọn lọc để vi rút giảm tính nhạy cảm với các loại kháng vi rút Tốc độ đề kháng nhanh hay chậm phụ thuộc vào các ưu thế chọn lọc theo các dạng đột biến, tỷ

lệ đột biến trong quần thể vi rút và mức độ tác dụng đích của các loại thuốc kháng

vi rút [14] Trong phần lớn các trường hợp, vi rút tạo ra sự thay thế các amino acid

để hình thành các đề kháng mức độ cao

HIV kháng thuốc lây truyền: xảy ra ở các trường hợp trước đó chưa nhiễm HIV nhưng lại bị nhiễm bởi chủng HIV có kháng thuốc Thuật ngữ “HIV kháng thuốc lây truyền” chỉ phù hợp với các trường hợp mới nhiễm HIV HIV kháng thuốc lây truyền thường được xác định trong quần thể người nhiễm HIV còn trẻ tại

cơ sở tư vấn xét nghiệm HIV hoặc tại các cơ sở chăm sóc thai nghén; HIV kháng thuốc lây truyền có thể xuất hiện trong nhiều tháng hoặc nhiều năm khi không có áp lực chọn lọc của thuốc ARV (khi bệnh nhân chưa điều trị ARV) Vì thời gian trung

bình từ khi nhiễm HIV cho đến khi đủ tiêu chuẩn điều trị ARV ước tính từ 7 – 9 năm, HIV kháng thuốc lây truyền có thể đã chuyển thành dạng hoang dại hoặc ở

“dạng ngủ” dưới ngưỡng phát hiện bằng các kỹ thuật định gen kháng thuốc [42]

HIV kháng thuốc mắc phải: là tình trạng các đột biến HIV kháng thuốc xuất hiện trên quần thể bệnh nhân đang điều trị ARV Các đột biến này xuất hiện dưới áp lực chọn lọc thuốc ARV HIV kháng thuốc mắc phải có thể xuất hiện do tuân thủ điều trị kém, gián đoạn điều trị, nồng độ thuốc trong huyết thanh không đủ hoặc sử dụng các phối hợp thuốc hoặc phác đồ thuốc không tối ưu Theo chiến lược tiếp cận của WHO về đánh giá tình trạng HIV kháng thuốc mắc phải, các mốc được đánh giá bao gồm sau 12 tháng điều trị ARV (đánh giá sớm), sau 48 tháng và sau 60 tháng điều trị ARV [26]

1.4.2 Các loại đột biến kháng thuốc thường gặp:

Phân loại đột biến theo nhóm thuốc ức chế, bao gồm đột biến nhóm NRTI, NNRTI và PI

• Đột biến nhóm NRTIs

- M184V: tạo ra đề kháng với thuốc 3TC, AZT và ABC

- Đột biến TAM: M41L, D67N, K70R, L210W, T215Y/F, K219Q/E – tạo

ra đề kháng với AZT, d4T, kháng chéo với các thuốc nhóm NRTI trừ 3TC

- Q151M: tạo ra đề kháng với các thuốc nhóm NRTI

- T69S: tạo ra đề kháng với các thuốc nhóm NRTI

- K65R: có đề kháng với ABC, TDF và ddI

- Y115F: đề kháng với ABC

- L74V: đề kháng với ddI

• Đột biến nhóm NNRTI

- K103N: đề kháng với hầu hết các thuốc nhóm NNRTI

- Y181C, Y188C, C108I, Y188L: đề kháng với NVP, EFV

- L100I, V106A, G190A/S: đề kháng với hầu hết thuốc nhóm NNRTI

• Đột biến nhóm PI

- L90M: đề kháng các thuốc PI, đặc biệt là SQV

- V82A/F/T: đề kháng các thuốc PI, đặc biệt là RTV và IDV

- D30N, N88D/S: đề kháng với NFV

- L10I/F, K20R/M, M36I, M46I/L, I54V/L, A71V/T, G73S, V77I, M93L, I84V: đề kháng với hầu hết thuốc nhóm PI

- G48V: đề kháng với SQV

- L24I: đề kháng với IDV hay LPV

- I47V, I50V: đề kháng với APV và LPV

- V32I, F53L: đề kháng với nhiều thuốc thuộc nhóm PI

1.4.3 Các yếu tố liên quan đến đề kháng

Kháng thuốc do bản thân vi rút: HIV có tốc độ nhân lên rất nhanh, khoảng 10

tỷ bản sao/ngày Như đã đề cập ở trên, quá trình phiên mã sợi ARN thành sợi ADN

có thể tạo ra các đột biến chọn lọc, giúp cho HIV hình thành đột biến kháng thuốc Chủng vi rút mang đột biến kháng thuốc có thể nhanh chóng lan truyền trong quần thể và sản sinh ra nhiều chủng kháng thuốc mới Vì vậy, ở các bệnh nhân nhiễm HIV không được điều trị ARV, nguy cơ mắc kháng thuốc là rất cao [5]

Kháng thuốc do lựa chọn phác đồ điều trị: việc áp dụng điều trị HIV bằng phác đồ kháng vi rút hoạt tính cao (HAART) rất hiệu, thông thường sử dụng kết hợp 3 loại thuốc trong một phác đồ điều trị Tuy nhiên nếu sử dụng ít hơn 3 loại thuốc hoặc kết hợp 3 loại thuốc không phù hợp có thể làm gia tăng nguy cơ thất bại

vi rút học và xuất hiện tình trạng kháng thuốc

Kháng thuốc do kém tuân thủ điều trị: sử dụng thuốc đúng thời điểm và thời gian đóng vai trò quyết định đến sự thành công của điều trị Tuân thủ điều trị kém,

có thể quên uống thuốc hoặc uống thuốc sai giờ, sẽ dẫn đến gia tăng nguy cơ kháng thuốc rất cao [4],[24]

1.5 Chẩn đoán kháng thuốc

Thất bại điều trị xuất hiện khi HIV đã giảm nhạy cảm với thuốc kháng vi rút ARV do thuốc không đủ hoạt độ để ức chế vi rút tiếp tục nhân bản và sản sinh các đột biến kháng thuốc Thời gian vi rút nhân bản khi đã kháng thuốc càng kéo dài thì số đột biến kháng thuốc và tính kháng thuốc càng tăng Theo hướng dẫn chẩn đoán và điều trị HIV/AIDS của Bộ Y tế ban hành ngày 19-8-2009: được coi là thất bại điều trị ARV khi bệnh nhân đã uống ARV

đúng phác đồ 3 thuốc trong ít nhất 6 tháng, người bệnh tuân thủ tốt mà lâm sàng, miễn dịch và vi rút học có những diễn biến như sau [2]

- Thất bại về lâm sàng:

Xuất hiện mới hoặc tái phát các bệnh lý giai đoạn lâm sàng 4 sau điều trị ít nhất 6 tháng Trên thực tế trong bối cảnh còn hạn hẹp về nguồn lực, các thất bại về lâm sàng vẫn được xem là đánh giá quan trọng khi xác định thất bại điều trị

- Thất bại về miễn dịch:

Được xem là thất bại về miễn dịch khi sau điều trị ARV đúng phác đồ 3 thuốc trong ít nhất 6 tháng, người bệnh tuân thủ tốt, xét nghiệm số lượng tế bào CD4 giảm xuống bằng hoặc dưới mức CD4 ban đầu trước điều trị, hoặc CD4 giảm dưới một nửa so với mức CD4 cao nhất đạt được (nếu biết giá trị này), hoặc CD4 dưới 100 tế bào/cm3 máu liên tục trong 1 năm liền, không tăng

- Thất bại về vi rút học:

Thất bại về vi rút học được thể hiện số lượng bản sao HIV-RNA của vi rút đo được bằng kỹ thuật Realtime PCR hoặc bằng các kỹ thuật liên quan > 3000 bản sao/ml

Khi xuất hiện các diễn biến liên quan đến kháng thuốc của HIV cần tiến hành ngay xét nghiệm để chẩn đoán đặc điểm kháng thuốc của HIV cho bệnh nhân để lựa chọn các thuốc điều trị cho phù hợp Hiện nay có hai phương pháp dùng để đo độ nhạy cảm của HIV với thuốc ARV, xét nghiệm kiểu hình và xét nghiệm kiểu gen

• Xét nghiệm kiểu hình xác định HIV kháng thuốc [42]: là phương pháp do trực tiếp mức độ nhạy cảm với thuốc của HIV Tốc độ nhân bản của vi rút được đo trực tiếp trên môi trường nuôi cấy (có chứa các tế bào phù hợp) dưới áp lực chọn lọc của thuốc ở các nồng độ tăng dần và so sánh với tốc độ nhân bản của chủng vi rút hoang dại nồng độ thuốc được biểu thị bằng giá trị IC50 (là nồng độ thuốc mà ở

đó có 50% số vi rút bị ức chế không thể nhân bản) Độ nhạy cảm của vi rút với thuốc được tính bằng tỷ số giữa giá trị IC50 của chủng vi rút gây bệnh và IC50 của chủng vi rút hoang dại Điểm cut-off (giá trị ngưỡng) được xác định là tỷ số giữa IC50 của vi rút gây bệnh và IC50 của vi rút hoang dại mà tại đó chủng HIV vẫn còn

nhạy cảm với thuốc Việc xác định được giá trị ngưỡng rất quan trọng trong đánh giá kháng thuốc của HIV

• Xét nghiệm kiểu gen xác định kháng thuốc của HIV [43]: là xét nghiệm dựa trên phân tích trình tự nucleotide để tìm ra các đột biến liên quan tới kháng thuốc Phương pháp này dựa trên nguyên lý nhân dòng đặc hiệu các gen đích (gen

mã hóa các protein chịu tác độ của thuốc kháng vi rút ARV như gen mã hóa enzyme Reverse Transcriptase, Protease, Gyrase), sau đó giải trình tự nucleotide của các gen này bằng máy phân tích chuyên dụng Các trình tự nucleotide của chủng gây bệnh thu được sẽ tiến hành so sánh với trình tự nucleotide của chủng hoang dại để tìm ra các đột biến điểm liên quan đến tính kháng thuốc của HIV

Mục đích chung của cả hai phương pháp này đều được dùng để đo mức độ

đề kháng của HIV với các thuốc sử dụng trong điều trị, tuy nhiên cả hai phương pháp này đều có các nhược điểm đó là chúng đều cần một tải lượng vi rút tối thiểu

để có thể tiến hành thành công được xét nghiệm, nếu tải lượng vi rút dưới ngưỡng 500-1000 bản sao/ml thì cả hai phương pháp đều không thể phát hiện được kháng thuốc Ngoài ra, phương pháp xác định kháng thuốc bằng kiểu hình còn có thêm nhược điểm là thời gian xét nghiệm rất dài, chi phí rất tốn kém và hiệu quả lại thấp, ngược lại, phương pháp xác định bằng kiểu gen chỉ có thể phát hiện được kháng thuốc khi có ít nhất 20-30% tổng số chủng vi rút mang đột biến và đây là một cách

đo gián tiếp

CHƯƠNG II: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng là 33 bệnh nhân đang điều trị ARV phác đồ bậc 2 tại phòng khám ngoại trú Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương trong đó có 27 năm và 6 nữ

Tiêu chuẩn lựa chọn:

- Tuổi: từ 18 tuổi trở lên

- Người nhiễm HIV đang điều trị ARV phác đồ bậc 2

- Bệnh nhân được điều trị phác đồ bậc 2 trên 3 tháng và có tải lượng vi rút

> 20 bản sao/ml

- Bệnh nhân có làm giải trình tự gen kháng thuốc chuyển đổi phác đồ điều trị từ phác đồ 1 sang phác đồ 2

Tiêu chuẩn loại trừ:

- Bệnh nhân hiện đang tham gia vào một nghiên cứu khác

- Bệnh nhân không đủ các tiêu chuẩn lựa chọn

2.2 Trang thiết bị, vật liệu nghiên cứu

2.2.1 Trang thiết bị

- Tủ lạnh -20oC, tủ lạnh thường

- Máy luân nhiệt PCR (Applied Biosystem - Mỹ)

- Máy ly tâm tốc độ tối đa 16,000 vòng/phút (hãng Eppendorf - Đức)

- Máy vortex (Biorad - Mỹ), block nhiệt (Anh)

- Máy ly tâm lạnh (Nhật)

- Bộ điện di ADN Mupid-2plus (Nhật)

- Máy chụp ảnh Geldoc (Biorad - Mỹ)

- Máy giải trình tự gen tự động sequencer 3130 (Applied Biosystem - Mỹ)

- Các loại pipette, các loại đầu týp, ống eppendorf 1,5ml vô trùng, giá đựng ống, ống PCR 0,2ml vô trùng

2.2.2 Vật liệu

Vật liệu dùng cho PCR nhân dòng các gen RT và PR của HIV

- Dung dịch đệm TAE – Tris Acetate EDTA (Invitrogen - Mỹ)

- Cồn 96-100 % (Meck - Đức)

- Kít tách chiết ADN: (QIAamp DNA Mini Kit hãng QIAGEN - Đức)

- PCR Master mix của hãng QIAGEN

- PCR purification Kit (Norgen – Canada)

- Agarose dùng trong điện di phát hiện ADN (Invitrogen - Mỹ)

- GelRed Nucleic Acid Gel Stain 10,000 x dùng để nhuộm ADN (Biotium - Canada)

- Dung dịch đệm TE - Tris EDTA (Invitrogen - Mỹ)

- PBS - Phosphate Buffer Saline (First Base – Singapore)

- Nước cất vô trùng (Invitrogen - Mỹ)

- Các cặp mồi:

Bảng 2.1: Các cặp mồi đặc hiệu cho các gen mã hóa RT và PR [43]:

Gen đích Tên mồi Trình tự nucleotide (5’ – 3’)

Vật liệu dùng cho giải trình tự nucleotide các gen RT và PR của HIV

- BigDye® Terminator V3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystem – Mỹ)

- BigDye® Terminator V3.1 Purification Kit (Applied Biosystem – Mỹ)

- Capillary Array, 4 x 50cm (Applied Biosystem – Mỹ)

- POP7 Polymer (Applied Biosystem – Mỹ)

- BigDye® XterminatorTM (Applied Biosystem – Mỹ)

2 3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Thiết kế nghiên cứu

Sử dụng phương pháp hồi cứu kết hợp tiến cứu [43]

2.3.2 Sơ đồ nghiên cứu

Bệnh nhân HIV/AIDS đang được điều trị bằng phác đồ bậc 2 từ 3 tháng trở lên tại Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương được lựa chọn vào nghiên cứu Tiến hành thu thập các thông tin liên quan đến số lượng CD4, tải lượng vi rút, các phác

đồ đã điều trị, tiền sử bệnh, các bệnh truyền nhiễm đi kèm, số lần đổi thuốc, tuân thủ điều trị Đồng thời tiến hành thu thập mẫu máu của bệnh nhân để làm xét nghiệm đếm tải lượng vi rút Mẫu máu của bệnh nhân có tải lượng vi rút >102copies/ml được lựa chọn để thực hiện PCR và giải trình tự nucleotide của gen mã hóa enzyme Protease và Reverse Transcriptase Trình tự nucleotide của các mẫu thu được sau đó được xử lý, phân tích để tìm các đột biến có liên quan đến kháng thuốc của HIV Các thông tin về bệnh sử, tải lượng vi rút, bệnh truyền nhiễm đi kèm, tuân thủ điều trị, thuốc điều trị và đột biến kháng thuốc được so sánh và mô tả các yếu tố liên quan, đặc điểm di truyền và tính kháng thuốc của các chủng HIV gây bệnh trên

Bệnh nhân HIV/AIDS Đang điều trị phác đồ bậc 2 >3 tháng

- Mô tả các yếu tố liên quan, đặc

điểm di truyền, tính kháng thuốc

của HIV ở bệnh nhân đang được

điều trị ARV phác đồ bậc 2

- Xây dựng phương pháp chẩn đoán

kháng thuốc của HIV bằng kỹ thuật

giải trình tự gen

các bệnh nhân đang điều trị phác đồ ARV bậc 2, đồng thời xây dựng qui trình để xác định tính kháng thuốc của HIV bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự gen

2.3.3 Các bước tiến hành

2.3.3.1 Phương pháp thu thập số liệu

Mỗi bệnh nhân có ột bệnh án nghiên cứu ghi đầy đủ các thông tin liên quan đến nhân thân, đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng, xét nghiệm và các thông tin liên quan khác

Các thông tin liên quan đến tên tuổi, giới tính, ngày nhiễm HIV, thời gian nhiễm, đặc điểm nhiễm, thời gian làm xét nghiệm (tải lượng vi rút, đếm CD4, xét nghiệm kháng thuốc), thời gian sử dụng thuốc, đổi thuốc, phác đồ thuốc sử dụng, các bệnh lý nền, các bệnh lý kết hợp, điều trị bệnh lý kết hợp được thu thập vào mẫu phiếu điều tra tại ba thời điểm T1, T2, T3:

- Thời điểm T1: thời điểm chuyển đổi phác đồ điều trị ARV lần 1

- Thời điểm T2: thời điểm chuyển đổi phác đồ điều trị ARV lần 2

- Thời điểm T3: thời điểm chuyển đổi phác đồ điều trị ARV lần 3

Sau đó đưa các số liệu này vào phần mềm SPSS để xử lý số liệu

2.3.3.2 Thu thập và bảo quản bệnh phẩm

Bệnh nhân lựa chọn vào nghiên cứu được thu thập với thể tích 4 ml máu đựng trong ống chứa chất chống đông (EDTA), để nhiệt độ phòng 30 phút và ly tâm

ở tốc độ 4,000 vòng trong 5 phút Sử dụng pipette Pastuer để chuyển toàn bộ phần huyết tương sang ống cryotube 2.0 ml vô trùng, đóng chặt nắp, dán nhãn,và bảo quản ở nhiệt độ từ – 80oC

2.3.3.3 Kỹ thuật tách chiết ARN

Sử dụng bộ kit thương mại để tách chiết ARN tổng số theo qui trình của nhà sản xuất (bộ kit QIAamp Viral RNA Mini Kit, Cat No 52904)

3) Ủ ống chứa hỗn hợp trên ở nhiệt độ 15-25oC trong 10 phút

4) Ly tâm nhẹ để đẩy toàn bộ các dung dịch bám trên nắp ống xuống phía dưới 5) Cho thêm 560µl ethanol (96-100%) vào ống, trộn đều bằng vortex mạnh trong 15 giây Sau đó ly tâm nhẹ để đẩy các dung dịch ở phía trên xuống đáy ống

6) Chuyển toàn bộ dung dịch ở bước 5 lên cột QIAamp Mini column (có ống hứng 2ml ở phía dưới), tránh làm dính dung dịch ở miệng ống Ly tâm cột ở

tốc độ 6,000 x g (8,000 vòng) trong 1 phút, sau đó chuyển cột sang một ống

hứng mới và loại bỏ ống hứng phía dưới

7) Thêm 500µl Buffer AW1, tránh làm ướt miệng ống Đóng chặt nắp và ly tâm

ở tốc độ 6,000 x g (8,000 vòng) trong 1 phút, sau đó chuyển cột sang một

ống hứng mới và loại bỏ ống hứng phía dưới

8) Mở nắp cột QIAamp Mini spin và cho 500µl Buffer AW2, tránh làm ướt

miệng ống, đóng chặt nắp và ly tâm ở tốc độ tối đa (20,000 x g; 14,000 vòng)

trong 1 phút và sau đó ly tâm ở tốc độ 6,000 x g (8,000 vòng) trong 1 phút

11) Loại bỏ cột lọc và thu dung dịch ở ống hứng phía dưới, đây là ARN tổng số tinh sạch được hòa tan trong buffer, ARN này có thể sử dụng trực tiếp làm khuôn cho phản ứng PCR hoặc bảo quản ở nhiệt độ -20 0C

2.3.3.4 Kỹ thuật PCR

Gen RT:

Thành phần phản ứng bước RT:

Thành phần Thể tích (µl) 2x mix

Enzyme 2485F (100µM) 3372R (100µM) ARN khuôn

H2O

12.5 0.5 0.25 0.25 10.0 1.5

Thành phần phản ứng bước Nested:

Thành phần Thể tích (µl) 2x mix

2574F(100µM) 3335R(100µM) ADN khuôn

H2O

12.5 0.25 0.25 1.0 11.0

Chu kỳ nhiệt Nested-PCR:

Enzyme DRPR05 (10µM) DRPR02L (10µM) ARN khuôn

12.5 0.5 0.5 0.5 10.5

Thành phần phản ứng bước Nested:

Thành phần Thể tích (µl) 2x mix

DRPR01 (10µM) DRPR06 (10µM)) ADN khuôn

H2O

12.5 0.5 0.5 1.0 10.5

- Để gel đông lại (khoảng 30 phút ở nhiệt độ phòng), gỡ bỏ lược bằng cách kéo theo phương thẳng đứng (tránh làm thủng giếng), đặt bản gel vào buồng điện di ngang sao cho chìm hẳn trong dung dịch đệm TAE 1X

- Sử dụng micropipette hút 8 -10µl sản phẩm PCR trộn đều với 2µl loading dye và cho hỗn hợp này vào các giếng trên bản gel, với các giếng có thể tích lớn hơn có thể điện di 20µl sản phẩm PCR

- Điện di với hiệu điện thế 120V, cường độ dòng điện 100 mA trong thời gian 30 phút

- Các mẫu thực nghiệm được điện di song song cùng với chứng âm và dương

- Luôn có thang ADN chuẩn để đối chiếu kết quả khi đọc

+ Nhuộm ADN và đọc kết quả

Bản gel sau khi điện di được ngâm trong dung dịch Gel red 1% pha trong nước cất (trong 5 phút) (hoặc bổ sung ngay ở khâu chuẩn bị gel), sau đó vớt bản gel ra ngâm vào nước cất 10 phút để rửa thạch Sau khi nhuộm, các vạch ADN trên bản gel sẽ phát sáng dưới ánh đèn cực tím Đọc kết quả điện di trên hệ thống máy GelDoc (BioRad), chụp ảnh bằng thiết bị và phần mềm chuyên dụng và lưu trong

máy tính

2.3.3.6 Kỹ thuật đo nồng độ ADN của sản phẩm PCR

Sử dụng máy Bio photometer (Đức)

Tube chứng: 50µl dung dịch PBS hoặc nước cất

Tube mẫu: 5µl sản phẩm PCR + 45µl dung dịch PBS hoặc nước cất

Đo ở bước sóng 260nm: 1 đơn vị = 50µg/ml

Đọc kết quả: Lượng ADN có trong mẫu (µg/ml) x10x103/103(µl) = nanogam (ng)/µl

(x10: Độ pha loãng 10 lần, x103/103: đổi đơn vị từ µg/ml sang ng/µl)

2.3.3.7 Kỹ thuật giải trình tự gen

+ Thực hiện phản ứng PCR cho giải trình tự gen:

Sử dụng bộ kít BigDye® Terminator v3.1 sequencing Kit (Mỹ), pha mix theo hướng dẫn của nhà sản xuất:

Thành phần phản ứng:

Big Dye® Terminator (Ready mix)

Big Dye® Terminator (5X buffer)

Primer (sử dụng cả primer F và R)

ADN template (sản phẩm PCR đã tinh sạch)

Nước khử ion

4,0 2,0 1,0 2,0 11,0

Vector pGEM-3Zf Nước khử ion

4,0 2,0 1,0 1,0 12,0 Tổng thể tích phản ứng 20,0 + Chu kỳ nhiệt:

Bước nhiệt Thời gian

25 chu kỳ

+ Tinh sạch sản phẩm:

Sử dụng kit BigDye® X Terminator Purification Kit (Mỹ) để tinh sạch:

- Cho vào mỗi ống PCR sequencing có thể tích 20µl (sản phẩm PCR dùng cho bước giải trình tự nucleotide) 2 dung dịch sau:

o SAM TM Solution: 90µl (nếu có tủa thì ủ 37oC/10 phút, sau đó vortex đều trước khi dùng)

o X TerminatorTM Solution (Big Dye X): 20µl (trước khi dùng phải vortex thật kỹ)

- Sau khi cho 2 dung dịch trên vào ống, đặt trên máy, lắc đều trong 30 phút

o Pha 170-200µl Hi-DiTM Formamide vào 1 ống Matrix Standard và vortex đều

o Ủ ở 95 oC trong 2 phút, chuyển ngay vào khay đá

o Cho vào giếng chứng 20µl

o Kết quả sequence thu được từ máy ABI PRISM 3130 (Mỹ) sẽ được phân tích bằng phần mềm ATGC 7.2 và đối chiếu với các trình tự chuẩn trên ngân hàng dữ liệu HIV của đại học Stanford