NGHIÊN cứu CHUYỂN hóa SINH KHỐI LIGNOCELLULOSE bởi ENZYME FERULOYL ESTERASE từ nấm ALTERNARIA TENUISSIMA

DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1.1: Cấu trúc thành tế bào thực vật 8 Hình 1.2: Lignocellulose và các thành phần cấu tạo 9 Hình 1.3: Cấu trúc của Cellulose 10 Hình 1.4: Các đơn vị cơ bản của li

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA ĐÀO TẠO SAU ĐẠI HỌC



LUẬN VĂN THẠC SỸ CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGHIÊN CỨU CHUYỂN HÓA SINH KHỐI LIGNOCELLULOSE BỞI ENZYME FERULOYL

ESTERASE TỪ NẤM ALTERNARIA TENUISSIMA

NGUYỄN TRUNG HIẾU

Hà Nội, năm 2017

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI

-

LUẬN VĂN THẠC SĨ

NGHIÊN CỨU CHUYỂN HÓA SINH KHỐI LIGNOCELLULOSE BỞI ENZYME FERULOYL

ESTERASE TỪ NẤM ALTERNARIA TENUISSIMA

NGUYỄN TRUNG HIẾU

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Mã ngành:8420201

HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS ĐỖ HỮU NGHỊ

Hà Nội, năm 2017

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan, đây là công trình nghiên cứu khoa học của riêng tôi dưới

sự hướng dẫn của TS Đỗ Hữu Nghị Các số liệu, kết quả trong luận văn là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Học viên

Nguyễn Trung Hiếu

LỜI CẢM ƠN

Để có thể hoàn thành đề tài luận văn thạc sĩ một cách hoàn chỉnh, bên cạnh sự nỗ lực cố gắng của bản thân còn có sự hướng dẫn nhiệt tình của quý Thầy Cô, cũng những sự động viên ủng hộ của gia đình và bạn bè trong suốt thời gian học tập nghiên cứu và thực hiện luận văn thạc sĩ

Xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn đến TS Đỗ Hữu Nghị người đã hết lòng giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi hoàn thành luận văn này

Xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn đến toàn thể quý thầy cô trong Khoa đào tạo sau Đại học – Viện Đại học Mở Hà Nội đã tận tình truyền đạt những kiến thức quý báu cũng như tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong suốt quá trình học tập nghiên cứu và cho đến khi thực hiện đề tài luận văn

Xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn đến Phòng Sinh học thực Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã không ngừng hỗ trợ và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt thời gian nghiên cứu và thực hiện luận văn

nghiệm-Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn đến gia đình, các anh chị và các bạn đồng nghiệp đã hỗ trợ cho tôi rất nhiều trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và thực hiện đề tài luận văn thạc sĩ một cách hoàn chỉnh

Hà Nội, tháng 10 năm 2017

Học viên thực hiện

Nguyễn Trung Hiếu

2.2 Máy móc thiết bị và dụng cụ thí nghiệm 22

2.4.1 Định danh nấm theo hình thái và sinh học phân tử 23 2.4.2 Sàng lọc hoạt tính Feruloyl esterase 25 2.4.3 Xác định hoạt tính enzyme 26 2.4.4 Tách chiết, tinh sạch protein enzyme 27

2.4.5 Xác định nồng độ protein 27 2.4.6 Điện di gel polyacrylamide (SDS-PAGE) 28 2.4.7 Điện di điểm đẳng điện (IEF) 39 2.4.8 Xác định đặc tính của protein enzyme tinh sạch 31 2.4.9 Xúc tác chuyển hóa sinh học các vật liệu giàu lignocellulose 31 2.4.10 Phương pháp HPLC-DAD 32

3.3.2 Trọng lượng phân tử của AltFAE 43

3.3.3 Hằng số xúc tác và tính đặc hiệu cơ chất của AltFAE 44 3.4 Quy trình lên men, chiết tách và tinh sạch enzyme esterase từ nấm 46 3.5 Chuyển hóa sinh khối lignocellulose giải phóng các phân ảnh lignin 48 3.6 Chuyển hóa sinh khối lignocellulose giải phóng acid hydroxycinnamic 49 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 52

DANH MỤC BẢNG

Trang Bảng 1.1: Thành phần một số nguồn sinh khối giàu lignocellulose 8 Bảng 3.1: Tinh sạch protein enzyme hoạt tính feruloyl esterase từ dịch lên

men Alt.tenuissima (AltFAE) 41

Bảng 3.2: Hằng số động học xúc tác của FAE từ Alt tenuissima (AltFAE) 45

DANH MỤC HÌNH

Trang Hình 1.1: Cấu trúc thành tế bào thực vật 8 Hình 1.2: Lignocellulose và các thành phần cấu tạo 9 Hình 1.3: Cấu trúc của Cellulose 10 Hình 1.4: Các đơn vị cơ bản của lignin 11 Hình 1.5: Cấu trúc xoắn đặc trưng của α/β-hydrolase và bộ ba axit amin

trung tâm xúc tác

13

Hình 1.6:Cơ chế xúc tác thủy phân ester của feruloyl esterase (FAE) 14

Hình 1.7: Hình ảnh nấm Alternaria tenuissima trên lá cây 19

Hình 1.8: Hình ảnh nấm Alternaria tenuissima dưới kính hiển vi x100 19 Hình 2.1:Phản ứng de-methyl hóa methyl ferulate xúc tác bởi feruloyl

esterase (FAE) tạo sản phẩm alcohol và acid ferulic xác định bằng phương

pháp HPLC

26

Hình 2.2: Sơ đồ điện di SDS-PAGE 29

Hình 3.1: (A) Điện di ADN tổng số đại diện của các mẫu nấm trên gel

agarose 0,9% (B) Sản phẩm PCR đại diện (mẫu SP66) của nấm phân tích

với cặp mồi ITS1/ITS4điện di trên gel agarose 0,9% (M: marker phân tử

1 kb)

34

Hình 3.2: Chủng nấm phân lập Alternaria tenuissima [ký hiệu SP66; (A)]

phát triển trên môi trường thạch và hình thái bào tử [độ phóng đại x100;

(B)]

36

Hình 3.3: Mối quan hệ họ hàng của chủng nấm SP66 với các loài/dưới

loài trong cùng chi lấy trên Genbank trên cơ sở phân tích trình tự

nucleotide vùng gen ITS bằng phương pháp Maximum Likelihood (ML)

(outgroup)

37

Hình 3.4:Mối quan hệ họ hàng của chủng nấm SP66 với các loài/thứ

trong cùng chi lấy trên Genbank trên cơ sở phân tích trình tự nucleotide

39

vùng gen ITS bằng phương Maximum Parsimony (MP) Tomophagus

Hình 3.5: Mối quan hệ họ hàng của chủng nấm SP66 với các loài/dưới

loài trong cùng chi lấy trên Genbank trên cơ sở phân tích trình tự

nucleotide vùng gen ITS bằng phương pháp Neighbor Joining (NJ)

39

Hình 3.6: Hoạt tính feruloyl esterase (FAE) của chủng nấm phân lập

Alternariatenuissima cho thấy vòng phân giải cơ chất chỉ thị ethyl

ferulate

40

Hình 3.7: Động học sinh tổng hợp feruloyl esterase trong 24 ngày nuôi

cấy Alt tenuissima trên các môi trường cơ chất cà chua (CC), bã ngô

(BN), đậu tương (DT), rơm (RR), khoai tây (KT) và mùn gỗ (MG)

41

Hình 3.8: Tinh sạch protein enzyme hoạt tính feruloyl esterase từ nấm

Alternariatenuissima (AltFAE) qua cột sắc ký trao đổi anion Q

Sepharose®;(─) protein hấp thụ ở λ=280 nm; (●) hoạt tính Alt FAE đối

với cơ chất methyl ferulate

42

Hình 3.9: Protein tinh sạch (1) biểu hiện hoạt tính feruloyl esterase

(AltFAE) trên gel điện di SDS-PAGE (A); (2) protein marker

43

Hình 3.10: Đường cong động học Michaelis–Menten (hình lớn) và đồ thị

phương trình Lineweaver–Burk (hình nhỏ) của feruloyl esterase từ Alt

tenuissima (AltFAE) xúc tác thủy phânmethyl p-coumarate

45

Hình 3.11: Quy trình chiết tách và tinh sạch protein enzyme hoạt tính

feruloyl esterase từ môi trường lên men nấm Alt tenuissima

46

Hình 3.12: Sắc ký đồ HPSEC các phân mảnh hợp chất lignin từ cơ chất

mùn gỗ chuyển hóa in vivo bởi nấm X polymorpha (sau 7 ngày nuôi cấy;

đường nét mảnh) và chuyển hóa in vitro bởi acetyl esterase (XpoAE, sau

48h; đường nét đậm) Đối chứng gồm cơ chất và enzyme XpoAE đã biến

tính (đường nét đứt) Peak (1) – alkaline lignin, (2) – axit sulfonic lignin

48

Hình 3.13: Sắc ký TLC sản phẩm là axit hydroxycinnamic sau chuyển

hóa sinh khối rơm (RR) và mùn gỗ (MG) bởi “enzyme cocktail” Chất

49

chuẩn: axit ferulic R f(FA)= 0,63; p-coumaric Rf (p-CA) = 0,63; axit sinapic

R f(SA) = 0,48

Hình 3.14: Sắc ký đồ HPLC sản phẩm sau chuyển hóa sinh khối

lignocellulose

50

Hình 3.15: Sản phẩm axit hydroxycinnamic (axit ferulic, p-coumaric) sau

chuyển hóa mùn gỗ (MG) bởi các đơn enzyme và “enzyme cocktail”

Alt FAE: feruloyl esterase từ nấm Alt tenuissima, XpoAE: acetyl esterase

cellulase/glucuronoxylanase

50

Enzyme acetyl esterase

Enzyme feruloyl esterase (tinh sạch) từ nấm Alternaria tenuisima

Base pair (cặp bazơ) Bovine serum albumin (albumin huyết thanh bê)

Acid p-coumaric

Carbohydrate esterase Đầu dò diode array Diethylaminoethyl Enzyme commision (Tiểu ban enzyme, Hội Hóa sinh quốc tế) Acid ferulic

Ferulic acid esterase (≡ feruloyl esterase) High performance liquid chromatography (Sắc ký lỏng hiệu năng cao) High-performance size exclusion chromatography

Điện di đểm đẳng điện Hằng số xúc tác enzyme Kilo dalton

Hằng số Michaelis-Menten Bước sóng

Molecular weight (trọng lượng phân tử)

Acid 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid

National Center For Biotechnology Information Acid sinapic

Polymerase chain reaction (phản ứng chuỗi polymerase) Isoelectric point (điểm đẳng điện)

Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (điện di PAGE)

SDS-Unit (đơn vị enzyme)

Enzyme acetyl esterase tinh sạch từ nấm Xylaria polymorpha

MỞ ĐẦU

Sinh vật phân hủy sinh khối thực vật đóng một vai trò quan trọng trong việc duy trì vòng tuần hoàn carbon nhờ khả năng chuyển hóa hiệu quả các vật liệu thực vật bởi hệ enzyme thủy phân Trong số các sinh vật phân hủy lignocellulose, các loài nấm thuộc nấm đảm Basidiomycota và nấm túi Ascomycota được biết là có hệ xúc tác sinh học hiệu quả nhất và được chia thành 3 nhóm: nấm mục trắng, nấm mục nâu và nấm mục mềm [3] Thật vậy, nấm có hai hệ enzyme ngoại bào - hệ enzyme thủy phân có vai trò trong phân hủy polysaccharide; và hệ enzyme oxy hóa, enzyme phân giải lignin ngoại bào để phân hủy lignin và xúc tác phản ứng mở vòng phenyl Các enzyme phân giải thành tế bào thực vật nhận được nhiều sự quan tâm bởi chúng có thể giải phóng các đơn vị đường C5-C6 cần thiết cho các quá trình lên men và sản xuất ethanol sinh học cũng như giải phóng các hợp chất thơm (phenolic)

từ các vật liệu sinh khối thô [11]

Feruloyl esterase (EC 3.1.1.73), một phụ lớp của carboxylic ester hydrolase, là enzyme thủy phân các liên kết ester trong cấu trúc sinh khối

thực vật để giải phóng các acid phenolic (acid ferulic, acidp-coumaric…) và

các dimer của chúng Enzyme có hoạt tính feruloyl esterase gần đây nhận được nhiều sự quan tâm bởi vai trò của chúng trong nhiều ngành công nghiệp như hóa chất, giấy và bột giấy, dệt và nhiên liệu sinh học Sự quan trọng của enzyme này còn liên quan đến sự thu nhận các acid hydroxycinnamic từ phụ phẩm nông nghiệp Các acid hydroxycinnamic được biết là các chất chống oxi hóa mạnh, cơ chất cho sản xuất vanillin, chống ung thư da và ung thư đường ruột [40], [27], kháng virus, virus cúm, AIDS [26],[56] chứng minh khả năng của acid ferulic làm tăng sinh các tế bào thần kinh gốc và cải thiện

sự đáp ứng với biểu hiện trầm cảm cho thấy tiềm năng sử dụng các acid hydroxycinnamic trong y dược

Đây là những cơ sở có ý nghĩa khoa học và ứng dụng thực tế để chúng

tôi thực hiện đề tài: Nghiên cứu chuyển hóa sinh khối lignocellulose bởi

enzyme feruloyl esterase từ nấm Alternaria tenuissima

NỘI DUNG CỦA ĐỀ TÀI

- Nghiên cứu lên men sinh tổng hợp feruloyl esterase (FAE) bởi nấm

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Giới thiệu

Sinh khối thực vật, nguồn carbohydrat có khả năng tái tạo lớn nhất trên trái đất, được quang tổng hợp khoảng 200 tỷ tấn mỗi năm, trong đó lignocellulose chiếm 60 % tổng sinh khối [46],[57] Gần đây, các ý tưởng cho mục đích tinh chế nguồn sinh khối thực vật nhận được nhiều quan tâm bởi tiềm năng chuyển hóa vật liệu này thành các sản phẩm có giá trị cao, bao gồm các hợp chất hữu cơ, cơ chất cho các quá trình lên men vi sinh, nhiên liệu sinh học Do vậy, các công nghệ mới đã và đang được phát triển nhằm thu được nguồn nhiên liệu từ sinh khối một cách có hiệu quả, trong khi đó các quốc gia phát triển và đang phát triển tập chung nỗ lực nghiên cứu nhằm thu được các nhiên liệu sinh học như bioethanol và biodiesel [37] Tại Việt Nam, năm 2007 Thủ tướng CP đã phê duyệt “Đề án phát triển nhiên liệu sinh học đến năm

2015, tầm nhìn đến năm 2025” nhằm mục tiêu tổng quát là phát triển nhiên liệu sinh học để thay thế một phần nhiên liệu hóa thạch truyền thống, góp phần đảm bảo an ninh lương thực và bảo vệ môi trường Tới nay, nước ta vẫn còn là một nước dựa trên kinh tế nông nghiệp, chủ yếu là cây lúa nước, ngô, sắn, cây mía…, đây chính là nguồn nguyên liệu sinh khối rất tiềm năng cho mục tiêu phát triển nhiên liệu sinh học cũng như các sản phẩm chuyển hóa có giá trị khác

Về cấu trúc, ngoài các thành phần chính là polysaccharide sinh khối thực vật còn có các hydroxycinnamate liên kết cộng hóa trị với các polymer này qua các liên kết ester- và ether Có thể phát hiện các hydroxycinnamate ở nhiều loài thực vật và chúng có hàm lượng cao ở các vật liệu như các sản

phẩm phụ công-nông nghiệp, ví dụ như rơm rạ (0,7% và 1,2%

acidp-coumaric và ferulic) [33], cám (0,5-0,8% acid ferulic) [32] Ở lớp vỏ trấu của

hạt đại mạch có khoảng 0.6-0.9% acid phenolic tổng tính theo trọng lượng

khô và hàm lượng cao nhất là ferulic và p-coumaric [13] Hơn nữa, các hợp chất phenolic từ bột cà phê cho thấy acid chlorogenic (5-O-caffeoyl quinic) là

thành phần chính trong đó chiếm tới khoảng 40% [45] Sự thu hút về ứng dụng công nghiệp của các acid phenolic này ngày càng tăng trong vài năm trở lại đây bởi các hoạt tính sinh học của chúng, như hoạt tính chống oxy hóa cũng như các lợi ích đối với sức khỏe Acid phenolic cũng như các dẫn xuất của chúng nhận được sự quan tâm đặc biệt như những chất bảo vệ tiềm năng chống lại các bệnh mạn tính liên quan đến quá trình lão hóa hay suy giảm miễn dịch ở người như tiểu đường, ung thư, AIDS và các bệnh tim mạch Theo đó, các enzyme xúc tác giải phóng hoặc chuyển hóa các hợp chất thơm này cũng nhận được sự quan tâm đặc biệt [50],[14] Một số các enzyme carboxyl esterase liên quan đến sự thủy phân sinh khối thực vật (như feruloyl esterase) đã được tinh sạch và nghiên cứu đặc tính, chủ yếu là từ nguồn nấm

và vi khuẩn (ví dụ như Clostridium spp., Pseudomonas spp., Aspergillus spp.,

thủy phân hemicellulose ở nhiều loài vi sinh vật Các esterase này đại diện cho một nhóm rất đa dạng của các enzyme có khả năng xúc tác giải phóng

acid phenolic (acid ferulic và p-coumaric) và dimer của chúng từ các vật liệu

sinh khối thô

Liên quan đến chuyển hóa sinh học các vật liệu sinh khối thực vật, đã

có những nghiên cứu của các nhà khoa học trong nước sử dụng các enzyme thủy phân (cellulase, xylanase, β-glucosidase, pectinase) và enzyme oxidoreductase (laccase, peroxidase) trong chuyển hóa các sản phẩm phụ nông nghiệp [4],[7], [10] PGS Trần Đình Mấn, Viện Công nghệ sinh học (Viện Hàn lâm KHCNVN) đã có nhiều năm nghiên cứu về các enzyme

cellulase chịu nhiệt từ vi sinh vật, như Geobacillus thermoglucosidasius,

suối nước nóng [6] Nhóm nghiên cứu của TS Võ Hoài Bắc (2012; Viện

CNSH) đã tạo được chủng Bacillus subtilis tái tổ hợp sinh enzyme pectinase

với hoạt tính cao và đã được thử nghiệm để loại pectin trong xử lý vải bông PGS.TS Nguyễn Thị Xuân Sâm (2003) [8], Viện CNSH và thực phẩm - Đại học Bách khoa HN, sử dụng β-glucosidase từ chủng nấm thuộc Ascomycota

là A niger để thủy phân bã mía với hiệu quả cao, trong khi đó xylanase từ

loài nấm này cũng được nghiên cứu ứng dụng trong tẩy trắng bột giấy bởi

Nguyễn Văn Diệp et al (2005) [2] Tuy nhiên, ngoài nhóm nghiên cứu của

TS Đỗ Hữu Nghị [42],[43]hiện chưa có công bố nào là kết quả của các nghiên cứu trong nước về vai trò của các enzyme esterase (feruloyl esterase, acetyl esterase…) đến quá trình chuyển hóa vật liệu sinh khối thực vật Hiện nay, chỉ một số feruloyl esterase được biết và chủ yếu từ nguồn vi khuẩn hoặc

vi nấm (Vd., Clostridium spp., Pseudomonas spp., Aspergillus spp.,

feruloyl esterase từ nấm lớn được đề cập đến Từ kết quả thu nhận, tinh sạch

và đặc tính của enzyme esterase từ nấm Alt tenuissima, trong nội dung

nghiên cứu của luận văn này chúng tôi sử dụng enzyme feruloyl esterase từ loài nấm túi này cũng như xúc tác phối hợp với các enzyme thủy phân và oxy hóa (laccase) khác cho chuyển hóa hiệu quả sinh khối (rơm rạ, bã mía, mùn

gỗ, arabinoxylan…) thành các chất có giá trị cao hơn (đường đơn và acid hydroxycinnamic)

1.2Cấu trúc của lignocellulose

Lignocellulose là thành phần cấu trúc chính của thực vật thân gỗ và các thực vật khác như cỏ, lúa, ngô…Trong tự nhiên, lignocellulose có thể tìm

thấy ở thực vật hay các chất thải nông nghiệp, lâm nghiệp và các chất thải rắn trong thành phố Thành phần chủ yếu của lignocellulose bao gồm cellulose (25 -55%), hemicellulose (chủ yếu xylan, 8 - 30%) và lignin (18 -35%) [21],[39] Cellulose và hemicellulose là các đại phân tử cấu tạo từ các gốc đường khác nhau, trongkhi lignin là một polymer dạng vòng được tổng hợp từ tiền phenylpropanoid Thành phần là cấu trúc của các polymer này là khác nhau giữa các loài, trong cùng một cây hay các cây khác nhau là khác nhau theo độ tuổi, giai đoạn sinh trưởng, phát triển của cây và các điều kiện khác Ngoài các thành phần này, Lilholt & Lawther (2000) còn cho rằng pectin cũng là thành phần của lignocellulose thành tế bào, đặc biệt là ở các cấu trúc sợi thực vật không phải thành phần gỗ [35]

Ngoài ra, một trong những lý do khó chuyển hóa vật liệu lignocellulose

là sự có mặt của các gốc acetyl hóa trong thành phần hemicellulose và pectin Các nhóm acetyl này có trong hemicellulose của gỗ dưới dạng liên kết mạch nhánh, như O-acetyl-4-O-methyl-glucurono-β-D-xylans ở thực vật hạt kín và O-acetyl-galacto-glucomannan ở thực vật hạt trần [29],[51] Sự acetyl hóa ở

vị trí 3-O của gốc xylosyl liên kết với acid 4-O-methyl-D-glucuronic cũng được thấy ở xylan của rơm hay cây ngũ cốc [41] Khoảng 22-50% các gốc xylose có liên kết với nhóm acetyl, đây là nguyên nhân góp phần hạn chế sự chuyển hóa sinh học hemicellulose sinh khối thực vật [17],[18] Do đó, các enzyme có khả năng đề acetyl hóa vật liệu lignocellulose (như acetyl esterase hay acetyl xylan esterase) có tiềm năng lớn trong các ứng dụng công nghiệp như các xúc tác thân thiện với môi trường Acetyl esterase (EC 3.1.1.6) là một hydrolase xúc tác giải phóng nhóm acetyl từ polymer sinh học như pectin và xylan của lignocellulose [16] Cùng với hệ enzyme thủy phân cellulose và xylan, acetyl esterase được biết là có vai trò quan trọng cho khả năng đồng hóa các vật liệu thành tế bào thực vật Enzyme này từ một số nấm

ascomycetes đã được miêu tả, bao gồm Trichoderma reesi [51], A awamori [62], A niger [36], Penicillium purpurogenum [67], Fusarium oxysporum [19] và Chrysosporium lucknowense [47]

Bảng 1.1: Thành phần một số nguồn sinh khối giàu lignocellulose

(Limayem & Rick, 2012)

Nguồn lignocellulose Cellulose

(%)

Hemicellulose (%)

Lignin (%)

chắc Cellulose không tan trong n

dung dịch Schweitzer là hydroxyd

ammoniac, tan trong dung d

chính tạo nên lớp màng t

cơ học và tính đàn hồi Cellulose có nhi

nứa, gỗ (Cellulose chi

cho thấy cellulose có th

hóa Vi khuẩn trong d

nguyên sinh trong ruộ

Hình 1.2: Lignocellulose và các thành phần cấu tạo [68]

Cellulose là polysaccharide phổ biến nhất có mặt chủ yế

u trúc hóa học, cellulose là một mạch thẳng do các

t với nhau qua liên kết 1,4-glucoside [9]

cellulose kết hợp với nhau tạo thành các bó s100Å Các mixel lại tạo thành bó microfiril vớ

thấy được bằng kính hiển vi điện tử, còn fibril tcác microfibril có đường kính 2000Å và có thể quan sát đư

ợi cellulose chính là các fibril Các phân t

có rất nhiều liên kết hydro nên tạo được d

c Cellulose không tan trong nước và dung môi hữu cơ như

ch Schweitzer là hydroxyd đồng trong [Cu(CH3)4 ](OH)

ammoniac, tan trong dung dịch kẽm chlorid đậm đặc Cellulose là thành ph

p màng tế bào thực vật, giúp cho các mô thực v

i Cellulose có nhiều trong bông (95-98%), đlose chiếm khoảng 40-45% trong gỗ) [68] Một s

y cellulose có thể có vai trò trong điều hòa họa động của h

n trong dạ cỏ của gia súc, các động vât nhai lạ

ột của mối sản xuất enzyme phân giải cellulose N

i cellulose chính là các fibril Các phân tử cellulose

t số nghiên cứu

a hệ thống tiêu

ại và động vật

i cellulose Nấm

cũng có thể phân hủy cellulsoe để cung cấp nguồn carbon cho sự phát triển của chúng

Hình 1.3: Cấu trúc của Cellulose [68]

1.2.2 Hemicellulose

Các đơn vị mắt xích của hemicellulose thường là vòng anhydro của nhiều saccharide như D-glucose, D-mannose, D-galactose (thuộc hexose), D-xylose, L-arabinose (thuộc pentose) Ngoài ra, còn có các đơn vị acid D-glucuronic, acid 4-O-metyl-D-glucuronic và D-galacturonic Một số polysaccharide hemicellulose còn liên kết với nhóm acetyl, làm thành phần của hemicellulose trở nên phức tạp hơn [9]

Thành phần hemicellulose của cây gỗ cứng chủ yếu là methylglucuronoxylan (hay xylan) Xylan là một polysaccharide hỗn tạp có chứa các nhóm phụ là các gốc acety l,4-O-methyl-D-glucuronosyl và α-arabinofuranosyl liên kết với bộ khung được tạo bởi các gốc xylopyranose

O-acetyl-4-O-Bộ khung này liên kết với nhau bằng liên kết β-1,4-glycoside [29] Xấp xỉ 70% các đơn vị xylose được ester hóa với acid acetic ở nhóm hydroxyl của carbon thứ hai hoặc thứ ba và trung bình thì cứ mười đơn vị xylose thì có một nhóm acid uronic liên kết với gốc xylose theo kiểu α-1,2-glycoside [23]

60-Ở gỗ mềm, mannan chiếm ưu thế trong thành phần hemicellulose với lượng xấp xỉ 20% trọng lượng khô Mannan trong gỗ mềm điển hình là

glucomannan với các hàm lượng D-glucose khác nhau Mannan với hàm lượng galactose cao đã được đề cập như galactogluco mannan Gỗ mềm cũng

có chứa arabinoglucuronoxylan, cấu tạo phân tử gồm L-arabinose, methyl-α-D-glucoronic và D-xylose, tỉ lệ 1,3:2:10 [54]

4-O-1.2.3 Lignin

Sau cellulose, lignin là một trong những polymer có nguồn gốc sinh học phổ biến nhất trong tự nhiên Lignin chiếm khoảng 30% khối lượng gỗ khô ở cây lá kim, khoảng 20% ở cây lá rộng và không tồn tại trong thực vật bậc thấp như rong, tảo, nấm Tỉ lệ phần trăm lignin ở cây gỗ cứng và gỗ mềm

là khác nhau [1] Các đơn vị hình thành nên cấu trúc của lignin là phenylpropan Lignin của thực vật có thể được chia thành ba loại: lignin gỗ lá kim, lignin gỗ lá rộng, lignin cây thân thảo và cây hàng năm Lignin gỗ lá kim gồm các đơn vị mắt xích guaiacylpropan còn chứa các đơn vị mắt xích 3,5-dimetoxy-4-hydroxy phenylpropan Lignin các loại cây thân thảo, ngoài các đơn vị mắt xích trên còn có 4-hydroxy phenylpropan Các nhóm chức ảnh hưởng lớn nhất đến tính chất của lignin là nhóm hydroxylphenol, nhóm hyroxyl và nhóm cacbonyl Hàm lượng các nhóm chức thay đổi tùy theo loài thực vật và tùy thuộc vị trí của lignin ở lớp liền kế, lớp sơ cấp hay thứ cấp của

tế bào thực vật

Hình 1.4: Các đơn vị cơ bản của lignin [68]

1.3 Enzyme esterase

Esterase được phát hiện nhiều ở động vật, thực vật và vi sinh vật Nhờ đặc tính hữu ích như tương đối ổn định trong dung môi hữu cơ, phổ cơ chất đặc hiệu rộng, không nhất thiết có mặt của các cofactors, esterase có vai trò quan trọng và ứng dụng rộng rãi trong công nghệ sinh học và công nghiệp [13] Về mặt cấu trúc, hầu hết tất cả các esterase được biết đều có cấu trúc gồm nếp gấp đặc trưng α/β-hydrolase và những phức hệ bộ ba xúc tác Nếp gấp này tạo nên cấu trúc đặc trưng cho bộ ba xúc tác của esterase (Ser, His và Asp/Glu) và chuỗi thống nhất Sm-XAA-Ser-XAA-Sm (Sm = acid amin nhỏ; XAA = acid amin bất kỳ) bảo vệ cho vùng hoạt động của acid amin Kiểu chuỗi này có sự thống nhất vị trí hoạt động của serine và là một penta peptid đặc trưng cho hầu hết các esterase [43] Gần đây, sự tồn tại của một kiểu khác nhau Gly-XAA-XAA-Leu đã được mô tả Tuy nhiên, cấu trúc thực của các protein cho thấy rằng một số esterases chứa một xúc tác Ser-His thay vì bộ ba phổ biến Ser-Aps-His, như được tìm thấy ở esterase từ Streptomyces Các chuỗi bên có tính acid, thường ổn định các điện tích dương của vị trí hoạt động dư lượng của His, được thay thế bởi các cacbonyl xương sống của Trp nằm vị trí đầu của His [58]

Cơ chế xúc tác thủy phân ester bởi esterase được biết đến gồm hai bước chính: Bước đầu tiên là acetyl hóa - nguyên tử oxy của nhóm hydroxyl ở vùng hoạt động của serine gắn vào carbon qua liên kết ester Tiếp đến là bước deacetyl hóa, nhóm hydroxyl của một phân tử nước tấn công carbon của phức

hệ acetyl-enzyme, các thành phần acetyl được giải phóng và các enzyme hoạt động được tiếp tục [43]

Quá trình chuyển hóa lignocellulose cần hỗn hợp các enzyme thủy phân bao gồm các cellulase, xylanase, carbohydrate esterase… có thể hoạt động phối hợp với nhau để tấn công cấu trúc polymer [11]

Carbohydrate esterase (EC 3.1.1x) đại diện cho một nhóm lớn các hydrolases xúc tác đặc biệt cho sự phân tách hoặc hình thành các ester no và ester thơm Một trong số các carbohydrate esterase tham gia vào chuyển hóa lignocellulose là enzyme acetyl esterase và feruloyl esterase

Hình 1.5: Cấu trúc xoắn đặc trưng của α/β-hydrolase

và bộ ba acid amin trung tâm xúc tác [68]

1.3.1 Acetyl esterase

Acetyl esterase (EC 3.1.1.6) là enzyme thủy phân xúc tác cho phản ứng giải phóng nhóm acetyl từ các polysaccharit acetyl hóa như pectin hay xylan của lignocellulose [16] Acetyl esterase cùng với hệ enzyme thủy phân cellulose và xylan đóng vai trò quan trọng trong khả năng chuyển hóa các vật liệu thành tế bào thực vật, có thể loại bỏ các nhóm acetyl ester từ vị trí C-2, C-3 của d-xylopyranosyl trong chuỗi xylan [16] Acetyl esterase là enzyme quan trọng tác động đến khả năng chuyển hóa các dưỡng chất cần thiết của thành tế bào thực vật qua thủy phân liên kết ester giữa acetyl và xylose trong cấu trúc xylan Quá trình deacetyl này làm các đơn vị xylopyranosyl của mạch chính xylan dễ bị phân hủy hơn bởi endo-β-1,4-xylanases (EC 3.2.1.8) Các nhóm acetyl mạch nhánh có thể làm ảnh hưởng tiếp cận của các enzyme phân cắt mạch chính bởi trở ngại về không gian,vì vậy hoạt động của enzyme

acetyl esterase sẽ phân c

phân tử là 40 kDa, nhiệ

tối ưu là 8,0; còn với ch

và hoạt động tối ưu ở

D xylopyranosyl của acetyl xylan

Acetyl esterase có thể được tách chiết từ nguồn vi sinh vậ

và pH khác nhau Với chủng B.pumilis, enzyme có tr

ệt độ tối ưu để enzyme hoạt động là 55ºC cùng v

i chủng B.subtilis enzyme trọng lượng phân t

45ºC Enzyme tách chiết từ vi khuẩn đư

ới pH 8,0 Ngoài nguồn enzyme từ vi khu

xúc tác thủy phân ester bằng feruloyl acid esterase (FAE)

t các nhóm acetyl nhánh này, giúp enzyme phân cắt

các nhóm O-acetyl

ật nhưBacillus ộng ở các điều , enzyme có trọng lượng

ng là 55ºC cùng với pH

ng phân tử là 31 kDa đường ruột hoạt

Feruloyl esterase (EC 3.1.1.73) hay ferulic acid esterase(FAE), cinnamoyl esterase, đại diện cho một nhóm các estease serine khác nhau, giải

phóng acid phenolic (acid ferulic và acidp-coumaric) và dimers của chúng từ

vật liệu lignocellulose [43] Các enzyme này tác động lên các chuỗi bên cạnh các cấu trúc polysaccharide của tế bào vách tế bào (ví dụ các đơn vị arabinofuranosyl của arabinoxylan), thủy phân liên kết chéo giữa xylan và xylan và lignin và đóng một vai trò quan trọng trong giai đoạn đầu của quá trình phân hủy lignocellulose [59] Các FAE gần đây đã thu được nhiều sự chú ý do vai trò của họ trong các ngành công nghiệp khác nhau như hóa chất, nhiên liệu, dệt may, bột giấy và giấy Tầm quan trọng của các enzyme này cũng liên quan đến việc lấy acid ferulic từ các phụ phẩm nông nghiệp, có tiềm năng ứng dụng cho thực phẩm, mỹ phẩm và dược phẩm [59] Ngoài ra, FAE

là những công cụ phân tích tiềm năng trong hóa học carbohydrate hiện đại Kết hợp với các enzyme phân hủy tế bào thực vật khác, các esterase này sẽ cung cấp các công cụ quan trọng để hiểu cấu trúc và mô hình liên kết của thành tế bào thực vật, nhưng khoa học đang ở giai đoạn sớm và chín muồi để khai thác

FAE là một tập hợp các enzyme rất đa dạng nhưng rất ít trình tự chuỗi polypeptide được biết cũng như các đặc tính lý - hóa để liên kết của các protein này Việc phân loại FAE thành bốn loại (type A-D) dựa trên các đặc điểm trình tự protein và tính tương đồng hoạt tính thủy phân đối với các methyl este của các acid hydroxycinnamic hydroxyl hóa hoặc methoxyl hóa đơn hoặc các dimer của chúng Các enzyme nấm khuyếch đại gồm các chuỗi

mã hóa FAE type A đồng thời biểu hiện họa tính endoxylanase type B của A

của các enzyme thủy phân này tạo nên enzyme xúc tác đa năng cho phép tăng

hiệu quả chuyển hóa các cơ chất sinh khối thô có cấu trúc phức tạp như thân ngô, rơm, rạ [68]

1.4 Giới thiệu nấm túi Ascomycota và loài Alternaria tenuissima

1.4.1 Nấm túi Ascomycota

Là nhóm phân loại đông nhất trong nấm thật (Eumycota) Sinh bào tử giảm phân gọi là bào tử nang, mà được chứa trong một cấu trúc đặc biệt có dạng giống túi gọi là nang (ascus) Ngành này bao gồm nấm nhăn (moscela),

vài loại nấm lớn và nấm cục, nấm men đơn bào (như các chi Saccharomyces,

và cộng sinh [3] Nhiều loài nấm nang chỉ trải qua quá trình sinh sản vô tính (ở nấm gọi là anamorph), tuy nhiên, những dữ liệu phân tử đã giúp nhận dạng được những giai đoạn hữu tính (teleomorph) gần nhất của chúng ở nấm nang Bởi những sản phẩm của quá trình giảm phân được chứa trong nang nấm, nên

vài loài nấm nang (như Neurospora crassa) được sử dụng để giải thích những

nguyên lý của di truyền học [1]

Hệ sợi của nấm túi rất phát triển, sợi nấm có vách ngăn ngang chưa hoàn chỉnh (mang lỗ có gờ ở mép) Sinh sản vô tính bằng bào tử ngoại sinh (đính bào tử), sinh sản hữu tính bằng các bào tử túi được sinh ra trong túi (ascus) trong mỗi túi thường có 8 bào tử Túi thường được hình thành trong một bộ phận đặc biệt gọi là thể quả, nhưng cũng có khi túi nằm trực tiếp trên sợi nấm Ở những nấm túi còn nguyên thủy thì quá trình sinh sản hữu tính giống như ở lớp nấm tiếp hợp Ở đây xảy ra sự tiếp hợp của 2 tế bào có nhân đơn bội trên 2 sợi nấm khác tính nhau hình thành hợp tử lưỡng bội (2n) và phân chia 3 lần với lần đầu giảm nhiễm tạo thành 8 nhân đơn bội, và hợp tử trở thành túi chứa bào tử túi Trường hợp này túi nằm trực tiếp trên sợi nấm

Ở đa số nấm túi có cấu tạo cơ thể phức tạp hơn thì quá trình sinh sản hữu tính xảy ra sự kết hợp nội chất của 2 cơ quan sinh sản đực và cái, không

có sự phân hóa thành giao tử Cơ quan sinh sản cái (túi cái, hay còn gọi là túi quả) gồm 2 phần, phần dưới phình to trong chứa nhiều nhân và phần cổ ở trên

có hình một ống ngắn Cơ quan sinh sản đực (túi đực) chỉ gồm một tế bào trong cũng chứa nhiều nhân Túi đực và túi cái tiếp xúc với nhau qua phần cổ của túi cái, vách ngăn bị mất đi, tạo thành một ống thông nối liền 2 túi, toàn

bộ nội chất của túi đực chuyển sang túi cái Lúc này chỉ có chất nguyên sinh kết hợp còn nhân không kết hợp ngay mà xếp từng đôi một (1 nhân đực và 1 nhân cái) tạo thành các cặp nhân Từ túi cái mọc ra nhiều chồi, các cặp nhân chuyển vào đó, phân chia nhiều lần riêng rẽ ở từng nhân, đồng thời xuất hiện các vách ngăn tạo thành những sợi sinh túi gồm nhiều tế bào có 2 nhân Về sau, tế bào ở đầu sợi uống cong lại, 2 nhân phân chia thành 4, xuất hiện thêm

2 vách ngăn tách ra thành 3 tế bào trong đó tế bào ở giữa (tế bào đỉnh) chứa 2 nhân, còn 2 tế bào kia mỗi cái chỉ chứa một nhân, sau sẽ gặp nhau để thành một tế bào có 2 nhân mới Tế bào đỉnh có 2 nhân nói trên tương ứng với tế bào sinh bào tử Nó phát triển dài ra, 2 nhân tới lúc này mới kết hợp tạo thành một nhân lưỡng bội Nhân này phân chia 3 lần, lần đầu giảm nhiễm, cho ra 8 nhân con đơn bội Mỗi nhân con này cùng một ít chất nguyên sinh quanh nó tạo lấy một màng bọc và biến thành một bào tử túi Tế bào sinh bào tử trở thành túi chứa bào tử túi [68]

Nấm túi là một lớp lớn, khoảng hơn 30.000 loài, chiếm tới 30% số nấm hiện biết, được chia làm 2 phân lớp và nhiều bộ

- Phân lớp nấm túi trần (Hemiascomycetidae): gồm những nấm túi chưa có thể quả và sợi sinh túi Bộ đại diện là Endomycetales với họ điển hình là Saccharomycetaceae Họ này có rất nhiều giống, giống thường gặp

nhất và có ý nghĩa kinh tế nhất là Saccharomyces (nấm men)

- Phân lớp nấm túi thật (Euascomycetidae): gồm những nấm túi có thể quả, chia thành 3 nhóm:

+ Nhóm có thể quả kín

+ Nhóm có thể quả mở lỗ đỉnh

+ Nhóm có thể quả hở, hình đĩa [5]

1.4.2 Nấm Alternaria tenuissima

cây trồng Alt.tenuissima ký sinh trên thực vật được biểu hiện là những đốm

nhỏ màu vàng nâu trên lá, sau đó lan rộng tạo những vết hình nhẫn đồng tâm; Toàn bộ phiến lá, cuống lá, gân lá và thậm chí cả hệ thống mạch dẫn cũng tổn thương đứt gãy do bị nhiễm Phần còn lại của ống mạch có màu nâu [1]

Hệ sợi nấm: Màu nâu sáng, mảnh, phân nhánh mạnh, sợi nấm có vách ngăn trước hết là gian bào, sau đó có thể trở thành nội bào;Mỗi tế bào thường

có nhiều nhân [1]

Sinh sản: Giống Alternaria chủ yếu sinh sản bằng cách tạo bào tử đính

Các hạt bào tử này đươc phát tán nhờ gió, gặp điều kiện nhiệt độ và độ ẩm thích hợp bào tử nảy mầm hình thành sợi nấm [1]

Sinh lý học: Alt.tenuissima sinh ra các độc tố nấm alternariol (AOH),

methyl este alternariol (AME), altenuene (ALT), altertoxin (ATX), và acid tenuazonic (TA) và nhiệt độ tối ưu khoảng 25°C [1]

Môi trường sống và hệ sinh thái: Alt tenuissima là loài phổ biến trên

một loạt các cây chủ khác nhau với các điều kiện môi trường khác nhau Điều kiện tối ưu xảy ra giữa 25-30°C [1]

Đến nay chưa có công bố nào về hoạt tính carbohydrate esterase của loài nấm này ngoài tác giả Chi DH và Nghị ĐH (2017) [65]

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Nguyên vật liệu

2.1.1 Chủng giống

Chủng giống để nghiên cứu điều kiện tối ưu sinh tổng hợp enzyme

acetyl esterase là chủng nấm Alternaria tenuissima.Chủng nấm trên được

phân lập và hiện đang được lưu giữu tại phòng Sinh học thực nghiệm, Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên (Viện Hàn lâm KHCNVN)

NấmAlt.tenuissima được phát triển trên môi trường thạch malt (20 g/L)

ở nhiệt độ 23ºC và sau khi khuẩn ty phát triển đầy bề mặt thạch lưu giữ ở 4ºC

Để nhân giống cho quá trình sinh tổng hợp enzyme tiếp theo, khuẩn ty nấm từ môi trường thạch được cấy chuyển sang các đĩa môi trường thạch malt mới nuôi cấy ở 23ºC trong 3 tuần để nấm phát triển [65]

Các môi trường trên đều được tiệt khuẩn ở 121 ºC, 1atm trong 30 phút

Môi trường lên men sinh tổng hợp enzyme:

Để sinh tổng hợp enzyme ở quy mô lớn hơn, 2-3 kg vật liệu lignocellulose (rơm hoặc mùn gỗ) được ngâm nước qua đêm sau đó cho vào các túi plastic chịu nhiệt và khử trùng ở 121 oC trong 30 phút Sử dụng 2 hộp

peptri môi trường thạch-malt có khuẩn ty nấm Alt tenuissima nghiền đồng

thể trong 160 ml nước cất có 0,9% NaCl Tiếp theo, cấy chuyển toàn bộ dịch khuẩn ty vào túi plastic với cơ chất rơm hoặc mùn gỗ, toàn bộ quá trình nuôi cấy được thực hiện ở điều kiện vô trùng Sau 2 tuần (cho hoạt tính AE) hoặc 4-6 tuần (hoạt tính FAE) nuôi cấy ở 23 oC, các túi nấm được thu và chiết với nước cất dưới điều kiện lắc để thu dịch enzyme thô cho các nghiên cứu tiếp theo

Môi trường lên men dịch thể:

Môi trường tối thiểu cho sự phát triển của nấm bao gồm MgSO4,

KH2PO4, cao nấm men và các nguyên tố vi lượng dạng vết Sau đó, bổ sung các chất cảm ứng sinh tổng hợp esterase từ các nguồn giàu lignocellulose như: rơm, xylan gỗ, arbinoxylan (Megazyme, Wicklow, Ireland), các triester

(triacetin, dầu olive) và các thành phần môi trường dinh dưỡng khác như cà chua (CC), bã ngô (BN), đậu tương (DT), rơm lúa (RR), khoai tây (KT) Nấm được nuôi cấy ở điều kiện thích hợp trong các bình Erlenmeyer 1000 ml hoặc trên thiết bị lên men AmAr (Mumbai, Ấn Độ) trong điều kiện có sục khí và lắc liên tục

2.2 Máy móc thiết bị và dụng cụ thí nghiệm

Máy móc thiết bị:

Tủ cấy vi sinh vật Box – Laminar (Đức), tủ ấm CO2 (Deawoo – Hàn Quốc), cân điện tử AL300 (Thụy Sỹ), nồi khử trùng Lequenx (Pháp), tủ lạnh Sanyo (Nhật Bản), máy li tâm Sigma (Mỹ), máy lắc ngang (Đức), máy votex (Mỹ), máy siêu âm Sonix (Canada), máy siêu lọc 10 kDa cut-off (Mỹ) Hệ sắc

kí protein nhanh FPLC AKTA Pure (GE Healtheare, Đức), thiết bị điện di (Clever Scientific – Anh),…

Dụng cụ thí nghiệm:

Các dụng cụ cấy vi sinh: ống nghiệm, bình tam giác, đĩa petri, pipet, cột sắc ký, ống eppendorf, ống falcon, đèn cồn, que cấy… (Việt Nam, Pháp, Trung Quốc)

Tất cả các dụng cụ vi sinh được tiệt khuẩn trước khi đưa vào sử dụng trong khi thử nghiệm

2.3 Phương pháp nghiên cứu

Để đạt được mục tiêu nghiên cứu của luận văn, chúng tôi đã tiến hành một

số phương pháp như sau:

- Phương pháp nuôi cấy, lên men sinh tổng hợp enzyme trên môi trường rắn với cơ chất sinh khối thực vật (rơm rạ, bã mía, mùn gỗ ) 2-3kg sinh khối/mẻ

- Chiết tách và tinh sạch enzyme bằng siêu lọc 5kDa và 10 kDa cut-off (hệ Vivaflow200, màng Polyethersulfon 10MW, Sartorius, Goettingen, CHLB Đức hoặc amicon Ultra Centrifugal Filters, 5MW, Millipore, Bedford, USA)

và sắc ký trao đổi ion (DEAE Sepharose, Q sepharose và SuperdexTM 75;

- Đánh giá khả năng chuyển hóa vật liệu sinh khối bởi enzyme và phân tích sản phẩm tạo thành sử dụng phương pháp sắc ký bản mỏng TLC và sắc

ký lọc gel HSEC trên hệ HPLC

2.4 Thực hành

2.4.1 Định danh nấm theo hình thái và sinh học phân tử

Để xác định Alt.tenuissima trong nghiên cứu này thì chủng nấm được định tên theo hình thái giải phẫu so sánh [5], [49, [60] và phương pháp sinh học phân tử (xác định trình tự vùng ITS 18S-rDNA) Cụ thể như sau:

-Hình thái giải phẫu so sánh

- Định tên bằng phương pháp sinh học phân tử:

+ Phương pháp tách chiết và tinh sạch ADN tổng số:

ADN tổng số được tách chiết theo Doyle & Doyle (1987) [20] và điện

di trên gel agarose 0,8% (80 - 100 V) Kiểm tra độ sạch và hàm lượng ADN tổng số bằng đo quang phổ ở λ = 260 nm và 280 nm Tinh sạch ADN bằng bộ KIT Fermentas (Thermo Fisher, Waltham, USA) và quy trình tiến hành theo hướng dẫn của nhà sản xuất

+ Nhân gen đích bằng kỹ thuật PCR:

Nhân vùng gen nhân (ITS) bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi ITS1: TCCGTAGGTGAACCTGCGG; ITS4: TCCTCCGCTTATTGATATGC [58]

sử dụng trong chương trình ADN barcodes (http://www.barcoding.si.edu/) [72] Thành phần mỗi phản ứng PCR có thể tích 25 µl với các thành phần: 13

µl d.H2O; 2,5 µl buffer 10X; 1 µl MgCl2 25 mM; 2,5 µl dNTPs 2,5 mM; 1,25

µl mồi xuôi (10 pmol/µl); 1,25 µl mồi ngược (10 pmol/µl); 0,5 µl Taq polymerase (5 U µl-1); 3 µl ADN (10-20ng) Phản ứng được thực hiện trên máy PCR model 9700 (GeneAmp PCR System 9700, Mỹ)

Chu trình nhiệt của phản ứng PCR gồm: 94oC trong 3 phút; tiếp theo là

35 chu kỳ nối tiếp nhau với các bước: 94 oC trong 45 giây, 55 oC trong 45 giây, 72 oC trong 45 giây; kết thúc phản ứng nhân gen ở 72 oC trong 10 phút, giữ sản phẩm ở 4oC Phản ứng được thực hiện trên máy PCR model 9700 (GeneAmp PCR System 9700, USA)

Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1,5% và tinh sạch bằng Qiaquick Gel Extraction KIT (Qiagen, CHLB Đức) Sản phẩm này được sử dụng làm khuôn cho phản ứng giải trình tự trực tiếp hai chiều (mồi xuôi và mồi ngược) với mồi ITS1/ITS4, sử dụng BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit và đọc kết quả trên hệ thống ABI 3100 Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems, USA) Trình tự nucleotide của các chủng nấm được so sánh với các trình tự đã có trên GenBank, sử dụng phần mền BLAST trong NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) [73] Trình tự ADN sau khi đọc được hiệu chỉnh bằng mắt với sự trợ giúp của phần mền ChromasPro 1.7.6 (Technelysium Pty Ltd., Australia) để loại bỏ các vùng tín hiệu nhiễu Các trình tự phân tích được sắp xếp thẳng hàng bằng phần mền Bioedit v7.0.5.2 [24], Clustal W [55], geneDoc 2.7 [44]

+ Xác lập mô hình tiến hóa: