Nghiên cứu tính ổn định công hiệu và xác định mối tương quan giữa hai phương pháp tạo đám hoại tử (PFU) và liều gây nhiễm 50% nuôi cấy tế bào (CCID50) của vắc xin sởi dự tuyển mẫu chuẩn quốc gia việt nam

Xuất phát từ thực tế chuyên môn và nhu cầu cấp thiết về quản lý chủ động đánh giá chất lượng tại cơ quan KĐQG, việc cần thiết xây dựng một mẫu chuẩn vắc xin sởi quốc gia phù hợp với các

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA ĐÀO TẠO SAU ĐẠI HỌC



LUẬN VĂN THẠC SĨ CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGHIÊN CỨU TÍNH ỔN ĐỊNH CÔNG HIỆU VÀ XÁC ĐỊNH MỐI TƯƠNG QUAN GIỮA HAI PHƯƠNG PHÁP TẠO ĐÁM HOẠI TỬ (PFU) VÀ LIỀU GÂY NHIỄM 50% NUÔI CẤY TẾ BÀO (CCID50) CỦA VẮC XIN SỞI DỰ TUYỂN MẪU CHUẨN

QUỐC GIA VIỆT NAM

NGUYỄN THỊ MAI HƯƠNG

Hà Nội, 2018

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI

-

LUẬN VĂN THẠC SĨ

NGHIÊN CỨU TÍNH ỔN ĐỊNH CÔNG HIỆU VÀ XÁC ĐỊNH MỐI TƯƠNG QUAN GIỮA HAI PHƯƠNG PHÁP TẠO ĐÁM HOẠI TỬ (PFU) VÀ LIỀU GÂY NHIỄM 50% NUÔI CẤY TẾ BÀO (CCID50) CỦA VẮC XIN SỞI DỰ TUYỂN MẪU CHUẨN

QUỐC GIA VIỆT NAM

NGUYỄN THỊ MAI HƯƠNG Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan, đây là công trình nghiên cứu khoa học của riêng tôi dưới

sự hướng dẫn của TS PHẠM VĂN HÙNG VÀ TS NGUYỄN THỊ THƯỜNG

Các số liệu, kết quả trong luận văn là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Học viên

Nguyễn Thị Mai Hương

Xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn đến Phòng thí nghiệm các vi rút Viêm gan - Viện Vệ sinh dịch tễ trung ương đã không ngừng hỗ trợ và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt thời gian nghiên cứu và thực hiện luận văn

Xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn đến Ban lãnh đạo Viện và Khoa kiểm định vắc xin Vi rút – Viện Kiểm Định Quốc Gia Vắc xin và Sinh phẩm Y tế đã nhiệt tình hỗ trợ và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi thực hiện triển khai đề tài nghiên cứu

Xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn đến GS.TS Nguyễn Đăng Hiền, TS Ngô Thu Hường và các cán bộ phòng QC – Trung tâm nghiên cứu sản xuất Vắc xin và Sinh phẩm y tế (POLYVAC) đã giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn đến gia đình, các anh chị và các bạn đồng nghiệp đã hỗ trợ cho tôi rất nhiều trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và thực hiện đề tài luận văn thạc sĩ một cách hoàn chỉnh

Hà Nội, tháng 01 năm 2018

Học viên thực hiện

Nguyễn Thị Mai Hương

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1: TỔNG QUAN 3

1.1Đặc điểm sinh học của vi rút sởi 3

1.2Đặc điểm dịch tễ bệnh sởi 5

1.3Vắc xin sởi 7

1.3.1 Lịch sử phát triển vắc xin sởi 7

1.3.2 Quy trình sản xuất vắc xin Sởi 9

1.3.3 Kiểm định chất lượng vắc xin 10

1.4Sản xuất và thiết lập các mẫu chuẩn 14

1.4.1 Sự cần thiết của mẫu chuẩn 14

1.4.2 Hướng dẫn TCYTTG thiết lập mẫu chuẩn quốc gia vắc xin 15

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.1 Đối tượng nghiên cứu 18

2.2Địa điểm và thời gian nghiên cứu 18

2.3Vật liệu nghiên cứu 18

2.3.1 Vắc xin mẫu chuẩn và vắc xin mẫu thử 18

2.3.2Các sinh phẩm và hóa chất 18

2.3.3Các thiết bị chính 19

2.3.4Các dụng cụ và nguyên vật liệu khác 19

2.4Phương pháp nghiên cứu 20

2.4.1 Mô hình nghiên cứu 20

2.4.2 Kỹ thuật nghiên cứu 23

2.4.2.1 Đánh giá tính ổn định công hiệu vắc xin sởi dự tuyển MCQG 23

a Kiểm định chất lượng xuất xưởng: 23

b.Nhận dạng đặc hiệu chủng sản xuất vắc xin sởi (POLYVAC_AIK-C) 28

c.Xác định tính ổn định công hiệu vắc xin sởi dự tuyển MCQG theo thời gian bằng phương pháp PFU sau sản xuất từ 20092017 ở điều kiện bảo quản tối ưu

-700C 29

2.4.2.2 Xác định hệ số tương quan giữa hai phương pháp PFU và CCID50 29

a Quy trình thực hiện thử nghiệm công hiệu theo phương pháp PFU 29

b Quy trình thực hiện thử nghiệm công hiệu theo phương pháp CCID50 29

c Xác định hằng số tương quan (k) giữa 2 phương pháp PFU và CCID50 31

Chương 3 : KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 32

3.1 Đánh giá tính ổn định công hiệu của vắc xin sởi dự tuyển MCQG 32

3.1.1 Kiểm định chất lượng của lô vắc xin mẫu chuẩn dự tuyển RM01-07 32

3.1.2 Nhận dạng đặc hiệu chủng vắc xin sởi POLYVAC_AIK-C 33

3.1.2.1 Kết quả nhận dạng di truyền chủng vắc xin sởi POLYVAC_AIK-C khi so sánh sự thay đổi trình tự nucleotide và acid amin (aa) vùng mã hóa 33

3.1.2.3 Kết quả xác định kiểu gen của chủng POLYVAC_AIK-C 35

3.1.3 Kết quả tính ổn định công hiệu vắc xin sởi dự tuyển MCQG RM01-07 theo thời gian khi bảo quản ở nhiệt độ tối ưu -700C (2009-2017) 37

3.2 Kết quả xác định hệ số tương quan giữa 2 phương pháp PFU và CCID50 40

3.2.1 Kết quả công hiệu vắc xin sởi dự tuyển MCQG bằng phương pháp PFU 40

3.2.2 Kết quả công hiệu vắc xin sởi dự tuyển MCQG bằng phương pháp CCID50 42

3.2.3 Xác định hằng số tương quan (k) giữa 2 phương pháp PFU và CCID50 43

Chương 4: BÀN LUẬN 47

4.1 Tính cấp thiết của việc thiết lập vắc xin sởi MCQGViệt Nam theo tiêu chuẩn TCYTTG 47

4.2 Tính ổn định của vắc xin sởi mẫu chuẩn dự tuyển MCQG 48

4.2.1 Đạt các yêu cầu về kiểm định xuất xưởng lô đối với vắc xin sởi 48

4.2.2 Nhận dạng di truyền chủng sản xuất vắc xin sởi (POLYVAC_AIK-C) 49

4.2.2.1 Những thay đổi nucleotide và aa ở vùng mã hóa 49

4.2.2.2 Những thay đổi nucleotide và aa ở vùng không mã hóa 50

4.2.3 Đánh giá độ ổn định công hiệu theo phương pháp PFU 51

4.3 Xác định hằng số tương quan k giữa hai phương pháp PFU và CCID50 52

4.3.1 Sự cần thiết của việc thiết lập đơn vị cho vắc xin sởi MCQG 52

4.3.2 Xác định công hiệu mẫu chuẩn dự tuyển bằng phương pháp PFU ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau -700C, 40C/7 ngày, 370C/7 ngày 53

4.3.3 Xác định công hiệu mẫu chuẩn dự tuyển bằng phương pháp CCID50 ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau -700C, 40C/7 ngày, 370C/7 ngày 54

4.3.4 Mối tương quan giữa hai phương pháp 55

KẾT LUẬN 57

KIẾN NGHỊ 58

TÀI LIỆU THAM KHẢO 59

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 2.3 Bảng pha loãng vắc xin theo phương pháp PFU 26 Bảng 2.4 Bảng pha loãng vắc xin theo phương pháp CCID50 30 Bảng 3.1 Kết quả kiểm định chất lượng xuất xưởng của vắc xin sởi MCDT 32 Bảng 3.2 Bảng so sánh trình tự nucleotide (bên trên) và aa (bên dưới) giữa chủng POLYVAC_AIK-C và các chủng khác của vùng mã hóa 34 Bảng 3.3 Bảng so sánh song song nucleotide (bên trên) và aa (bên dưới) giữa

chủng POLYVAC_AIK-C và các chủng khác của vùng không mã hóa 35 Bảng 3.4 Kết quả hiệu giá (công hiệu) của vắc xin sởi dự tuyển MCQG RM01-07 từ năm 2009-2017 trong điều kiện bảo quản -700C 37 Bảng 3.5 Phần trăm giảm hiệu giá của vắc xin sởi dự tuyển MCQG RM01-07 từ năm 2009-2017 trong điều kiện bảo quản tối ưu -700C 39 Bảng 3.6 Kết quả công hiệu vắc xin sởi dự tuyển MCQG RM01-07 bằng phương pháp PFU 41 Bảng 3.7 Kết quả công hiệu vắc xin sởi dự tuyển MCQG RM01-07 bằng phương pháp CCID50 42 Bảng 3.8 Kết quả công hiệu vắc xin sởi dự tuyển MCQG RM01-07 ở cả 2 phương pháp PFU & CCID50 ở điều kiện bảo quản -700C, 40, 370C 43 Bảng 3.9 Kết quả xác định hệ số tương quan (k) quy đổi giữa 2 phương pháp PFU

và CCID50 46

DANH MỤC HÌNH VẼ

Hình 1.1 Mô hình của vi rút sởi 3

Hình 1.2 Tỷ lệ mắc bệnh và tỷ lệ tiêm vắc xin sởi ở Việt Nam 6

Hình 1.3 Lịch sử phát triển các chủng vắc xin sởi 8

Hình 1.4 Sơ đồ kiểm định chất lượng vắc xin sởi 11

Hình 2.1 Mô hình nghiên cứu 22

Hình 3.1 Phân tích cây di truyền của toàn bộ gen H giữa chủng vắc xin POLYVAC_AIK-C và các chủng vắc xin khác 36

Hình 3.2 Tính ổn định của vắc xin sởi MCDT từ năm 2009 – 2017 trong điều kiện bảo quản -700C 39

Hình 3.3 Phiến kết quả xác định hiệu giá vắc xin sởi bằng PFU 40

Hình 3.4 Đồ thị tương quan tuyến tính giữa PFU và CCID50 45

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

aa Axit amin

ARN Axit ribonucleic

AIK-C A= America, I=Iran, K= The Kitasato institute, C=Chick embryo

cell (Tên một loại chủng vắc xin sởi) ATCC American type culture collection

(Trung tâm cung cấp nguyên liệu sinh học của Hoa Kỳ) BTPCC Bán thành phẩm cuối cùng

(Tế bào màng đệm túi niệu gà) CDC Centers for Diseases Control and Prevention

(Trung tâm Phòng và Kiểm soát bệnh tật) CCID50 50% cell culture infectious dose

(Liều gây nhiễm 50% nuôi cấy tế bào) DĐVN Dược điển Việt Nam

FBS Fetal bovin serum

(Huyết thanh bào thai bê) FTM Fluid Thioglycollate Medium

(Môi trường lỏng thioglycolat)

GM Geomean

(Trung bình nhân) GMP Good Manufacturing practice

(Thực hành sản xuất tốt) KĐQG Kiểm định quốc gia

LM Liquid medium

(Môi trường lỏng) MEM Minimum Essential Medium

(Môi trường dinh dưỡng tối thiểu) MCQT Mẫu chuẩn quốc tế

MCQG Mẫu chuẩn quốc gia

NICVB National Institute for Control of Vaccines and Biologicals

(Viện Kiểm định Vắc xin và Sinh phẩm y tế) NRA

PFU

National Regulatory Authorities (Các cơ quan quản lý quốc gia) Plaque Forming Unit

(Đơn vị tạo đám hoại tử) RT-PCR Reverse transcription polymerase chain reaction

(Phản ứng chuỗi polymerase phiên mã ngược)

SD Standard Deviation

(Độ lệch chuẩn) TCYTTG Tổ chức y tế thế giới

TSB Trypticase soy broth

(Canh thang trypticase soy) Vero Verda Reno

(Tế bào thận khỉ xanh châu phi)

ĐẶT VẤN ĐỀ

Bệnh sởi là bệnh truyền nhiễm cấp tính do vi rút sởi gây ra, bệnh có thể gây dịch lưu hành rộng rãi ở mọi nơi trên thế giới, có tỉ lệ mắc bệnh cao trẻ nhỏ dưới 5 tuổi Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới (TCYTTG), thực tế có trên 90% số người trước lứa tuổi 20 đã bị mắc bệnh sởi và rất hiếm người không bị mắc sởi trong suốt cuộc đời [4] Ước tính hàng năm khoảng 100.000 người tử vong do bệnh sởi [46] Phương pháp phòng bệnh chủ động và hiệu quả nhất vẫn là tiêm phòng vắc xin Vắc xin sởi là một trong những vắc xin được đưa vào tiêm chủng mở rộng của rất nhiều quốc gia, trong đó có Việt Nam Hiện nay trên thế giới và Việt Nam có rất nhiều loại vắc xin sởi đơn và sởi phối hợp cùng thành phần Quai bị và Rubella (MMR,

MR, Priorix, Trivivac ), từ nhiều nhà sản xuất khác nhau với các quy trình sản xuất

và kiểm định chất lượng khác nhau được lưu hành

Vắc xin sởi trước khi được sử dụng phòng bệnh cho cộng đồng phải được kiểm định chất lượng xuất xưởng đạt các tiêu chuẩn do cơ quan kiểm định quốc gia vắc xin và sinh phẩm y tế (NICVB) đánh giá và cấp chứng nhận chất lượng Một trong các tiêu chuẩn chất lượng xuất xưởng quan trọng nhất của vắc xin là kiểm tra hiệu lực bảo vệ của vắc xin (công hiệu) phải đạt tiêu chuẩn theo qui định đăng ký của nhà sản xuất hoặc của cơ quan kiểm định quốc gia (KĐQG) hoặc theo tiêu chuẩn theo Dược điển Việt Nam (DĐVN) hoặc TCYTTG qui định

Thử nghiệm xác định công hiệu của vắc xin thử nghiệm luôn cần được tiến hành song song với vắc xin mẫu chuẩn, có thể sử dụng mẫu chuẩn quốc gia (MCQG) hoặc mẫu chuẩn quốc tế (MCQT) để làm đối chứng nhằm xác định giá trị của thử nghiệm và độ tin cậy của kết quả Hiện nay TCYTTG khuyến cáo có hai phương pháp tiêu chuẩn xác định thử nghiệm công hiệu vắc xin sởi là phương pháp xác định đám hoại tử (PFU) và phương pháp xác định liều gây nhiễm 50% nuôi cấy tế bào (CCID50)

Mặt khác, TCYTTG cũng khuyến cáo các quốc gia có nền công nghiệp sản xuất vắc xin và sinh phẩm y tế, có cơ quan quản lý quốc gia vắc xin (NRA) đạt chuẩn quốc tế nên tự chủ động nghiên cứu và thiết lập mẫu chuẩn quốc gia cho riêng mình [10], để chủ động trong công tác kiểm định chất lượng trước khi xuất xưởng và giám sát chất lượng vắc xin trong quá trình sử dụng trên thị trường, trong trường hợp cần thiết hoặc sự cố thì có thể lấy mẫu trên thị trường kiểm định lại

Do đó, việc thiết lập mẫu chuẩn quốc gia đảm bảo được các tiêu chuẩn chất lượng và có độ ổn định là yêu cầu cấp bách và cần thiết nhằm hoàn thiện chức năng đánh giá chất lượng và giám sát sử dụng vắc xin trên thị trường

Ngoài ra, hiện nay vắc xin sởi MCQT do cơ quan kiểm định và thiết lập MCQT (NIBSC – Anh) cung cấp chỉ có đơn vị CCID50, trong khi đó tại cơ quan kiểm định quốc gia (NICVB) thực hiện kiểm tra chất lượng nhiều loại vắc xin sởi đơn hoặc sởi phối hợp được sản xuất từ nhiều phương pháp và quốc gia khác nhau Chúng tôi sử dụng cả hai phương pháp PFU và CCID50 để xác định công hiệu vắc xin phục vụ công tác xuất xưởng Do vậy, các nhà sản xuất trong nước cũng như nhập khẩu đều phải cung cấp mẫu chuẩn cho cơ quan KĐQG trước khi thực hiện kiểm định xuất xưởng

lô vắc xin nên sẽ bị kéo dài thời gian và không chủ động trong công tác kiểm định xuất xưởng kịp thời phục vụ công tác phòng bệnh, đặc biệt các thủ tục nhập khẩu vắc xin mẫu chuẩn nhiều thủ tục hải quan phiền phức và chất lượng cũng dễ bị ảnh hưởng trong quá trình vận chuyển

Xuất phát từ thực tế chuyên môn và nhu cầu cấp thiết về quản lý chủ động đánh giá chất lượng tại cơ quan KĐQG, việc cần thiết xây dựng một mẫu chuẩn vắc xin sởi quốc gia phù hợp với các sản phẩm khác nhau trong công tác kiểm định cần có đủ cả hai đơn vị bao gồm PFU và CCID50, có thể sử dụng cho cả hai phương pháp tại

NICVB Chúng tôi thực hiện nghiên cứu: “Nghiên cứu tính ổn định công hiệu và

xác định mối tương quan giữa hai phương pháp tạo đám hoại tử (PFU) và liều gây nhiễm 50% nuôi cấy tế bào (CCID 50 ) của vắc xin sởi dự tuyển mẫu chuẩn Quốc gia Việt Nam” với các mục tiêu nghiên cứu sau:

Mục tiêu thứ nhất: Đánh giá tính ổn định công hiệu của vắc xin sởi dự tuyển theo

thời gian trong điều kiện bảo quản tối ưu nhiệt độ -700C

Mục tiêu thứ 2: Xác định hệ số tương quan (k) công hiệu giữa 2 phương pháp PFU

và CCID50.

Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 Đặc điểm sinh học của vi rút sởi

Vi rút sởi thuộc chi Morbillivirus, họ Paramyxoviridae [25] Vi rút sởi chỉ có

một tip huyết thanh và có tính ổn định, vì vậy sau khi bị nhiễm vi rút tự nhiên, kháng thể sởi sẽ tồn tại suốt đời [1], [43]

Vi rút sởi có cấu trúc đa hình thái nhưng chủ yếu hình cầu, kích thước

100-300 nm Thành phần cấu tạo từ trong ra ngoài gồm bộ máy di truyền (genome), capsid

protein phi cấu trúc V và C được mã hóa từ gen P [24], [25], [26] Trong đó có 3 loại protein tạo phức với ARN genom (L, N và P) và 3 loại protein tham gia vào kết cấu của vỏ (H, M và F) [39]

Protein P hay protein polymerase (protein được phosphoryl hóa) và protein L đều có liên quan đến chức năng polymerase và tham gia vào sự hình thành nucleocapsit Protein M là protein màng có nền kỵ nước, bao quanh nucleocapsit Phía ngoài màng M là vỏ ngoài có cấu tạo từ lớp lipit kép Trên bề mặt vỏ ngoài nhô

ra các gai là các protein H (haemaglutinin) và protein F (fusion) [2] Protein H là kháng nguyên ngưng kết hồng cầu giúp vi rút gắn vào thụ thể của tế bào mẫn cảm, còn protein F là kháng nguyên tan máu Hoạt tính tan máu liên quan đến khả năng gây hủy hoại tế bào sớm, giúp vỏ ngoài vi rút dung hợp với màng sinh chất của tế bào, đồng thời giúp vi rút dễ dàng xâm nhập vào tế bào

Những phân tích trình tự của gen N, H, P và gen M chỉ ra rõ sự khác biệt của các chủng hoang dại [29], [30], [31]

Virus sởi có thể sống được dưới 2 giờ ở nhiệt độ thườngvà khi đông khô với chất ổn định protein, có thể tồn tại trong nhiều thập kỷ ở nhiệt độ -700C [28] Tuy nhiên vi rút sởi dễ bị bất hoạt bởi ảnh hưởng của nhiệt độ sau 30 phút tiếp xúc ở 56 °

C, ánh sáng và pH <5, dung môi hòa tan lipit (cồn, ete, formalin…) [5], [28]

Toàn bộ chu kỳ nhân lên của vi rút sởi xảy ra tại bào tương của tế bào gây nhiễm [1] và bao gồm các giai đoạn sau:

Hấp phụ và xâm nhập

Giai đoạn này xảy ra rất nhanh Vi rút bám vào thụ thể trên màng sinh chất của tế bào Thụ thể dành cho vi rút sởi là protein điều hòa bổ thể CD 46 đồng thời cũng là protein đồng yếu tố màng Vỏ ngoài vi rút dung hợp với màng sinh chất của

tế bào chủ, sau đó bị phân giải để đưa nuleocapsit vào tế bào

Sao chép và phiên mã

Genom ARN (-) được dùng làm khuôn để tổng hợp mARN nhờ ARN – polymerase phụ thuộc ARN có sẵn trong virion, mARN có 3 tiểu đơn vị là 18, 22, 35S, mARN được gắn đuôi poly A ở đầu 3’ dùng để dịch mã tạo protein, trong đó có ARN – polymerase thứ cấp dùng để sao ARN (-) 52S thành chuỗi ARN (+) 52 S (có chiều dài đủ), không được gắn đuôi polyA để rồi chuỗi này lại được dùng làm khuôn tổng hợp ARN (-) 52S, là genome của vi rút mới [1], [2], [40]

Dịch mã

Protein cấu trúc đầu tiên được tổng hợp là protein nuclecapsit, sau đó protein

H và F được tạo thành quanh vùng nhân, thông qua màng của bộ máy Golgi để gắn vào các vị trí đặc hiệu trên màng sinh chất của tế bào chủ Protein M cũng được đưa

ra phía màng sinh chất để tạo màng trong M

Lắp ráp và giải phóng

Các glycoprotein gắn vào vị trí chuyên biệt trên màng sinh chất Gai H và F hướng ra ngoài Protein màng M xếp phía trong màng sinh chất Nucleocapsit sau khi được lắp ráp, vận chuyển tới vị trí nằm dưới M rồi ra ngoài theo lối nảy chồi, trong khi màng sinh chất của tế bào vẫn tiếp tục được khôi phục Các đám nucleocapsit thừa sẽ tập hợp dưới dạng thể vùi [2]

1.2 Đặc điểm dịch tễ bệnh sởi

Bệnh sởi là bệnh truyền nhiễm nghiêm trọng gây tử vong ở trẻ nhỏ trên toàn cầu, chỉ xảy ra ở người, không có trung gian truyền bệnh Bệnh sởi lây trực tiếp qua đường hô hấp do tiếp xúc trực tiếp với các giọt nước bọt và dịch tiết của mũi, họng, kết mạc của người nhiễm trùng ngay từ giai đoạn cuối thời kỳ ủ bệnh [6] Tất cả những người chưa có kháng thể chống lại bệnh sởi đều có khả năng mắc sởi Bệnh có biểu hiện sốt; viêm đường hô hấp, tiêu hóa, kết mạc mắt và nổi ban đặc trưng Bệnh sởi có rất nhiều biến chứng gồm các cơ quan chính như: hệ thống hô hấp, hệ thần kinh trung ương, hệ tiêu hóa Trẻ suy dinh dưỡng có nguy cơ biến chứng sau sởi cao gấp 4 lần so với nhóm trẻ không suy dinh dưỡng [6] Trẻ càng nhỏ tuổi, biến chứng sau sởi càng cao [7] Điều trị bệnh sởi chủ yếu là điều trị triệu chứng, kết hợp chế độ

vệ sinh và dinh dưỡng

Sởi là bệnh có thể phòng bệnh chủ động hiệu quả bằng tiêm phòng vắc xin do vi rút sởi chỉ có một tuýp huyết thanh duy nhất lên sau khi tiêm vắc xin tạo ra đáp ứng miễn dịch bền vững và lâu dài trong nhiều năm [43] Theo thống kê của TCYTTG, Trước khi đưa vắc xin sởi vào tiêm chủng năm 1963, dịch bệnh xảy ra khoảng 2-3 năm một lần và sởi gây ra khoảng 2,6 triệu người chết mỗi năm [46] Vắc xin sởi được đưa vào chương trình TCMR trên thế giới đã góp phần thay đổi dịch tễ học bệnh sởi: Tỷ lệ mắc sởi giảm, số vụ dịch giảm, lứa tuổi mắc bệnh tăng lên [43, 44], chu kỳ dịch dài hơn ở những nước thực hiện triệt để việc tiêm phòng vắc xin sởi dịch xảy ra lẻ tẻ và

sởi đã ngăn ngừa được khoảng 20,4 triệu người chết Trong giai đoạn 2000-2008, tỷ

lệ tử vong do sởi trên toàn cầu giảm 78%, từ 733.000 người tử vong năm 2000 xuống còn 164.000 người trong năm 2008 [27], 89.780 người vào năm 2016 [46], ước tính giảm được 84%

Vắc xin sởi được sử dụng phòng bệnh chủ động tại Việt Nam trong chương trình TCMR Năm 1981 Việt Nam bắt đầu thực hiện tiêm một mũi vắc xin sởi cho trẻ

từ 9-11 tháng tuổi, thực hiện trên toàn quốc tháng 10-1985 [5] Các nghiên cứu tình hình dịch sởi trong nước và thế giới đã cho thấy dịch sởi chủ yếu xảy ra ở những đối tượng bị bỏ sót hoặc không tạo được đáp ứng miễn dịch trong TCMR [5] Từ năm

2002, Việt Nam triển khai tiêm mũi 2 vắc xin sởi cho hơn 15 triệu trẻ từ 9 tháng đến 10 tuổi trong cả nước Tỷ lệ mắc bệnh giảm rõ rệt từ 84,7 trường hợp/1.000.000 dân vào năm 2002 xuống còn 28,7/1.000.000 dân năm 2003 và tiếp tục xuống còn 2,6 trường hợp/1.000.000 dân vào năm 2004 [8]

Hình 1.2 Tỷ lệ mắc bệnh và tỷ lệ tiêm vắc xin sởi ở Việt Nam [9]

Giai đoạn năm 2006 – 2010 Việt Nam thực hiện chiến dịch tiêm chủng mũi 2 vắc xin sởi cho trẻ em 6 tuổi trên toàn quốc Cuối năm 2008 đến giữa năm 2010, Việt Nam đã ghi nhận vụ dịch sởi có qui mô lớn trên cả nước (63/63 tỉnh), 9.434 ca mắc

[3] Năm 2014 tại Việt Nam dịch sởi diễn biến rất phức tạp: xảy ra tản phát ở hầu hết các tỉnh, thành phố trên cả nước; Tỷ lệ mắc 16,8/100.000, tăng 5,8 lần so với năm 2013; Tuổi mắc tập trung chủ yếu ở nhóm 1-4 tuổi (32.2%), nhóm trẻ chưa đến tuổi tiêm phòng chiếm tỷ lệ rất cao: Dưới 9 tháng chiếm 13,2%; từ 9-11 tháng chiếm 9,6%

Có 148 ca tử vong, trong đó có những ca tử vong khi trẻ chưa đến tuổi tiêm phòng [8] Nguyên nhân được xác định do một số bà mẹ chưa từng mắc sởi và chưa được tiêm vắc xin nên không có miễn dịch Những trẻ sinh ra từ các bà mẹ này không nhận được miễn dịch từ mẹ và từ tiêm phòng nên nguy cơ mắc sởi rất cao [13], ngoài ra việc e ngại tai biến khi tiêm phòng vắc xin trong cộng đồng cũng là một yếu tố ảnh hướng lớn đến việc giúp trẻ được tiêm phòng đủ liều theo yêu cầu

1.3 Vắc xin sởi

1.3.1 Lịch sử phát triển vắc xin sởi

Năm 1954 John F Enders và các cộng sự đã phân lập được vi rút sởi từ bệnh phẩm của cậu bé 13 tuổi David Edmonston ở Boston, bang Massachusetts- Hoa Kỳ [60] Chủng vi rút này đã được cấy truyền 24 lần trên tế bào thận người tiên phát và

28 lần trên tế bào Vero, sau đó là 6 lần trên tế bào khoang niệu của phôi gà và là chủng sản xuất vắc xin sởi sống giảm độc lực đầu tiên [1], [25], [26]

Năm 1963 vắc xin sởi sống giảm độc lực từ chủng Edmonston B được sản xuất

và cấp phép sử dụng [1], [26], [17] Năm 1965 Schwarz đã cấy truyền chủng Edmonston B trên nguyên bào sợi phôi gà (Chicken Embryonic Fibroblast - CEF) và thay đổi điều kiện nhiệt độ nuôi cấy từ 350 C-360C xuống 320C [17]

Hiện nay, trên thế giới có rất nhiều chủng sản xuất vắc xin sởi, bao gồm hai loại chính: Có nguồn gốc được cấy chuyển từ chủng Edmonston và có nguồn gốc độc lập với chủng này Chủng Schawrz và Montaren được sử dụng phần lớn ở các nước phương tây, chủng AIK-C từ Viện Kitasato- Nhật Bản và chủng Edmonston- Zagreb (EZ) từ Nam Tư, Leningrad-16 từ Nga, CAM-70 từ Biken -Nhật Bản Năm trong số

6 chủng trên đều được làm giảm độc lực qua phương pháp giảm nhiệt độ nuôi cấy sau khi cấy chuyển [52], [47], [48], [49]

CAM: Chick chorioallantoic membrane (Tế bào màng đệm túi niệu gà)

CE: Chick Embryo intra – amniotic cavity (tế bào màng ối phôi gà)

CEF: Chick Embryo Fibroblast (Tế bào sợi bào thai gà)

DK: Dog Kidney (Tế bào thận chó)

HA: Human Amnion (Tế bào màng ối người)

HK: Human Kidney (Tế bào thận người)

Hình 1.3 Lịch sử phát triển các chủng vắc xin sởi

A: Các chủng thuộc nhóm Edmonston B: Các chủng không thuộc nhóm Edmonston

Dankamp et al

Việt Nam đã sản xuất thành công vắc xin sởi đơn, sống giảm độc lực từ chuyển giao công nghệ của Viện Kitasato (Nhật Bản) cho Trung tâm Nghiên cứu Sản xuất Vắc xin và Sinh phẩm Y tế (POLYVAC), Việt Nam qua dự án ODA/JICA không hoàn lại năm 2007 sử dụng chủng AIK-C Chủng AIK-C được tạo ra từ chủng Edmonston – Ender qua hai bước:

Bước 1: Từ chủng Edmonston – Ender, các nhà khoa học phân lập và tạo bốn biến chủng thích nghi ở nhiệt độ khác nhau nhưng đều là nhiệt độ thấp (250 C, 270 C, 290

C, 330 C) bằng cách tạo dòng trên tế bào thận cừu [38]

Bước 2: Chọn chủng thích nghi ở điều kiện 330C, đặt tên là AIK, tiếp tục cấy chuyển

12 lần trên tế bào thận cừu để giảm độc lực và duy trì sự thích nghi Sau đó làm tăng

số lượng chủng trên tế bào phôi gà, đặt tên là AIK-C và dùng làm chủng gốc để sản xuất vắc xin [38]

1.3.2 Quy trình sản xuất vắc xin Sởi

Trên thế giới có hai loại vắc xin sởi: vắc xin bất hoạt và vắc xin sống giảm độc lực

Vắc xin sởi bất hoạt

Vắc xin sởi bất hoạt bằng formalin, do hãng Pfizer và Lilly sản xuất có nguồn gốc từ chủng Edmonston, được sử dụng ở Mỹ từ năm 1963-1967 Sau đó vắc xin này

đã bị khuyến cáo không nên dùng vì vắc xin này gây đáp ứng miễn dịch thấp và thời gian kháng thể tồn tại ngắn Nhiều trường hợp gây thể lâm sàng sởi không điển hình

và biến chứng sau tiêm vắc xin Sau đó vắc xin này đã không được sản xuất nữa [36], [37]

Vắc xin sởi sống giảm độc lực

Hiện nay tất cả các nhà sản xuất trên thế giới đều sản xuất vắc xin sởi sống giảm độc lực dạng đông khô Vắc xin sởi được sản xuất dưới dạng một thành phần (MVAC) hoặc phối hợp với vắc xin Rubella (MR) hoặc với Rubella và Quai bị (MMR) Hàm lượng vi rút trong một liều (0,5ml) không nhỏ hơn 1000 CCID50 (hoặc PFU) Có thể bổ sung một số chất làm tăng tính bền vững của vi rút vắc xin với nhiệt

độ môi trường Theo tiêu chuẩn của TCYTG, hiệu giá của vắc xin chỉ được phép giảm

< 1log10 CCID50 (hoặc PFU) khi để vắc xin ở 370C trong vòng 1 tuần và hàm lượng

vi rút còn lại không nhỏ hơn một liều tiêm [51] Công nghệ sản xuất vắc xin sởi tuỳ thuộc vào điều kiện và nhu cầu sử dụng mà có thể thực hiện nuôi cấy trong các chai

Roux hay hệ thống lên men lớn có chế độ khuấy, môi trường nuôi cấy không có huyết

thanh và tế bào được bám trên các vi giá thể (micro carier) Tế bào Vero và tế bào

phôi gà là hai dòng tế bào thường được sử dụng trong sản xuất vắc xin sởi [35]

Quy trình tóm tắt sản xuất vắc xin sởi tại Việt Nam:

Vắc xin sởi đơn Việt Nam do Trung tâm Nghiên cứu sản xuất Vắc xin và sinh

phẩm y tế (POLYVAC) sản xuất từ chuyển giao công nghệ của Viện Kitasato, Nhật

Bản qua dự án ODA/JICA, là dạng vắc xin sống giảm độc lực, được sản xuất từ chủng

sản xuất POLYVAC_ AIK-C có nguồn gốc từ chủng AIK-C 266286 của Nhật Bản

bằng công nghệ nuôi cấy vi rút trên tế bào phôi gà Quy trình sản xuất được tóm tắt

như sau:

1.3.3 Kiểm định chất lượng vắc xin

Sản xuất vắc xin luôn luôn phải tuân thủ theo các quy định nghiêm ngặt của

thực hành sản xuất tốt (GMP) Kiểm định chất lượng là một phần của GMP liên quan

đến việc lấy mẫu, thực hiện thử nghiệm, hồ sơ hóa tài liệu kiểm định để đảm bảo rằng

các sản phẩm khi xuất xưởng đạt cả tính an toàn và hiệu lực Kiểm định chất lượng

cần phải có tính khách quan và chính xác, tuân thủ chặt chẽ theo yêu cầu của

TCYTTG, cơ quan KĐQG quy định cho từng loạt vắc xin [18]

Đối với vắc xin sởi thành phẩm các chỉ tiêu đánh giá được thực hiện tuân thủ theo hướng dẫn của TCYTTG (WHO TRS 840, phụ lục 3 và DĐVN IV) Toàn bộ quá trình kiểm tra chất lượng vắc xin sởi được mô tả tóm tắt ở hình (1.6)

Hình 1.4 Sơ đồ kiểm định chất lượng vắc xin sởi [51]

Thử nghiệm tính chất vật lý được thực hiện bằng phương pháp quan sát trực tiếp trạng thái vắc xin, yêu cầu của thử nghiệm này đối với các ống vắc xin sau khi đóng ống và đông khô phải có độ đồng đều về mặt cảm quan của bánh đông khô, có hình trụ tròn đều, không bị vỡ, không bị sùi, không có dị vật, chứng tỏ quy trình đóng ống và đông khô đảm bảo chất lượng

Thử nghiệm độ ẩm tồn dư là một tiêu chuẩn rất quan trọng xác định tỷ lệ % lượng nước còn tồn dư sau quá trình đông khô còn lại trong vắc xin Hàm lượng nước còn lại trong vắc xin đông khô nếu vượt qua tiêu chuẩn cho phép sẽ ảnh hưởng đến tính chất vật lý và tính ổn định công hiệu khi bảo quản thời gian lâu dài

Thử nghiệm vô trùng được thực hiện trong điều kiện nghiêm ngặt với các trang thiết bị và cơ sở vật chất đảm bảo cấp độ sạch theo tiêu chuẩn của TCYTTG Khu vực thực hiện thử nghiệm luôn được giám sát các chỉ số đo hạt bụi và áp suất khí trong phòng, không khí được lọc qua hệ thống HEPA Các màng lọc và thiết bị cần phải được giám sát thường xuyên Có hai phương pháp thực hiện thử nghiệm này bao gồm: phương pháp nuôi cấy trực tiếp và phương pháp màng lọc Phương pháp màng lọc có ưu điểm chính xác hơn do kiểm tra được toàn bộ lượng vắc xin trong lọ, sử dụng hệ thống kín giúp cho mẫu không bị phơi nhiễm từ ngoài vào Tuy nhiên phương pháp này có phần hạn chế khi sử dụng cho một vắc xin có tá chất nhôm Tá chất nhôm

sẽ không đi qua được màng lọc do vậy đối với những loại vắc xin này thường phải áp dụng phương pháp nuôi cấy trực tiếp Phương pháp nuôi cấy trực tiếp ít chính xác do chỉ kiểm tra được một phần trong lọ vắc xin và dễ bị phơi nhiễm hơn Thử nghiệm

vô trùng sử dụng các môi trường tối ưu cho nấm và vi khuẩn phát triển Quy trình thử nghiệm yêu cầu cần có chứng âm và chứng dương để loại trừ các kết quả âm tính giả

và dương tính giả

Thử nghiệm Mycoplasma được yêu cầu thực hiện đối với tất cả các vắc xin được sản xuất từ nuôi cấy tế bào Mycoplasma là nguyên nhân gây nhiễm chủ yếu ở các tế bào nuôi, tỷ lệ lây nhiễm càng cao khi thực hiện cấy chuyển nhiều lần

Thử nghiệm nhận dạng vắc xin được sử dụng phổ biến ở các nhà máy sản xuất

và cơ quan KĐQG bao gồm phương pháp miễn dịch, trung hòa kháng nguyên kháng thể đặc hiệu, PCR Những phương pháp này áp dụng cho việc xác định sự có mặt thành phần vi rút cần nhận dạng có trong vắc xin, nó phù hợp với cả các vắc xin một thành phần hay nhiều thành phần

Thử nghiệm ổn định nhiệt được thực hiện sau khi mẫu thử nghiệm được ủ trong điều kiện 370C/7 ngày và thực hiện song song cùng phương pháp của thử nghiệm xác định công hiệu với mẫu bảo quản ở nhiệt độ khuyến cáo Thử nghiệm này được yêu cầu thực hiện nhằm chứng minh tính ổn định của vắc xin dưới ảnh hưởng của điều kiện nhiệt độ Phần lớn các vắc xin sống giảm độc lực đều phải yêu cầu thực hiện thử nghiệm này, vắc xin có tính ổn định nhiệt độ cao sẽ làm tăng hiệu quả tiêm chủng khi vắc xin phải vận chuyển trong những điều kiện khó khăn không đảm bảo dây chuyền lạnh như đi đến các vùng núi cao, vùng sâu, vùng xa Tính ổn định với nhiệt độ cao cũng tránh được việc loại bỏ vắc xin khi gặp sự cố không bảo quản được đúng nhiệt độ khuyến cáo Tiêu chuẩn áp dụng cho thử nghiệm ổn định nhiệt tùy thuộc vào các chủng vắc xin khác nhau Đối với vắc xin sởi đạt yêu cầu về tính ổn định nhiệt khi có kết quả ≥ 103 log10 PFU/liều (0,5ml) và chênh lệch với mẫu bảo quản ở nhiệt độ khuyến cáo ≤ 1log10 PFU/ liều (0,5ml)

Trong các thử nghiệm đánh giá chất lượng thì thử nghiệm công hiệu là tiêu chí quan trọng nhất để đánh giá hiệu lực của vắc xin là đo lường hoạt tính sinh học, sử dụng một thử nghiệm sinh học định lượng phù hợp, dựa trên thuộc tính của sản phẩm kết hợp với các đặc tính sinh học phù hợp tương ứng [1], [34] Có rất nhiều phương pháp được sử sụng để thực hiện thử nghiệm công hiệu như: sinh học phân tử xác định nồng độ kháng nguyên vi rút trong vắc xin, trung hòa giảm đám hoại tử; gây nhiễm trực tiếp tiếp trên tế bào cảm thụ,…nhưng tùy thuộc vào bản chất mỗi loại vắc xin mà

có các phương pháp thực hiện cụ thể khác nhau Đối với vắc xin sởi phương pháp phổ biến và được TCYTTG khuyến cáo là 2 phương pháp tiêu chuẩn PFU và CCID50

Phương pháp PFU

Phương pháp PFU là phương pháp tạo đám hoại tử tế bào, được sử dụng rất phổ biến để xác định nồng độ vi rút trong vắc xin sống giảm độc lực Sau khi mẫu được pha loãng tiến hành gây nhiễm trên tế bào đã được chuẩn bị kín đều một lớp Qua thời gian tiếp xúc với tế bào 60 phút, cố định vi rút thông thường sử dụng thạch (agar) Vi rút được nuôi cấy 7-10 ngày trong điều kiện CO2 5% với dải nhiệt độ phù hợp, sau đó nhuộm phiến tế bào nuôi cấy đó để có thể đếm được các đám hoại tử tại các độ pha và tính toán kết quả Phương pháp này đọc kết quả bằng mắt thường, các đám hoại tử màu trắng trên nền thuốc nhuộm đỏ hay tím rất rõ ràng và riêng biệt [16], [51]

Phương pháp CCID 50

Phương pháp CCID50 là phương pháp xác định liều gây nhiễm hủy hoại 50% tế bào, phương pháp này cũng thường xuyên được sử dụng để xác định nồng độ vi rút sống

Tế bào có thể được chuẩn bị trên phiến 96 giếng 0-4 giờ trước khi pha loãng vi rút Sau

đó vi rút được gây nhiễm vào phiến đó với các độ pha phù hợp Qua thời gian nuôi cấy

9 ngày đọc kết quả trên kính hiển vi hoặc thực hiện phản ứng miễn dịch với tín hiệu phát hiện tạo màu để xác định số lượng giếng tế bào có dấu hiệu hủy hoại Số liệu được tính qua công thức Kaber hoặc Reed-Muench [18], [51], [42]

Hệ số tương quan giữa hai phương pháp CCID 50 và PFU

Hai phương pháp thử nghiệm hiệu giá vắc xin sởi CCID50 và PFU đã được nhiều nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu so sánh và xác định hệ số tương quan Các hệ

số thay đổi tùy thuộc vào các chủng vi rút khác nhau và các điều kiện thực hiện thử nghiệm khác nhau và có giá trị tỉ lệ lý thuyết PFU: CCID50 là 1: 0,69 Có nghĩa là cứ trung bình 1 PFU sẽ tạo được sự hủy hoại tương ứng bằng 0,69 CCID50 [21]

Tùy theo mỗi chủng sản xuất khác nhau, công nghệ sản xuất khác nhau mà hằng số tương quan (k) giữa hai phương pháp có thể thay đổi Do vậy việc xác định hằng số tương quan cho một mẫu chuẩn có cả hai đơn vị xác định công hiệu (PFU và CCID50) là rất cần thiết trong việc kiểm soát chất lượng theo qui định của NRA của mỗi quốc gia

1.4 Sản xuất và thiết lập các mẫu chuẩn

1.4.1 Sự cần thiết của mẫu chuẩn

Để đảm bảo chất lượng của vắc xin thì việc kiểm tra chất lượng được coi là nền tảng Chất lượng của sinh phẩm được kiểm tra bằng các phương pháp vật lý, hóa học và sinh học Trong một thử nghiệm sinh học thường sử dụng các động vật thí nghiệm, mô, tế bào nuôi cấy, các chủng vi sinh vật Giá trị của các thử nghiệm này thường có sự giao động lớn hơn so với thử nghiệm hóa lý, có thể chênh lệch 330% hay 0,5 log10 [60], [54] Nguyên nhân gây ra sự chênh lệch này là do sự khác biệt sinh học của các loài tham gia thử nghiệm, sai số hệ thống giữa các phòng thí nghiệm, người thực hiện kỹ thuật, trang thiết bị, phương pháp thực hiện và các nguyên vật liệu…

TCYTTG đã thiết lập MCQT vì các sai lệch do độ cảm nhiễm và đáp ứng của nhóm động vật thí nghiệm được sử dụng và điều kiện thí nghiệm sẽ ảnh hưởng giống

nhau và đồng thời đến cả mẫu chuẩn và mẫu thử nếu cả hai được thử nghiệm trong cùng một điều kiện thí nghiệm Bằng phương pháp này có thể giảm tối thiểu độ chênh lệch về kết quả kiểm tra chất lượng của vắc xin và sinh phẩm [53]

Mẫu chuẩn quốc tế là các vắc xin, sinh phẩm đã được hội đồng chuyên gia của TCYTTG chuẩn định trên các labo đạt tiêu chuẩn thế giới đặt tại một số quốc gia đại diện cho từng khu vực, từng châu lục để đảm bảo tính đồng nhất khắp thế giới về hiệu lực và hoạt tính Chúng được cung cấp dưới dạng đông khô trong ống hoặc dạng dung dịch có ghi số đơn vị hoạt tính hoặc công hiệu biểu thị dưới dạng đơn vị quốc tế (IU) [57]

Mẫu chuẩn khu vực là các vắc xin mẫu chuẩn đại diện cho khu vực có thể xuất hiện dịch bệnh điển hình của khu vực mà các khu vực khác không có hoặc ít xuất hiện hơn Mẫu chuẩn khu vực là mẫu chuẩn thứ cấp sau mẫu chuẩn quốc tế và được chuẩn định nối chuẩn với mẫu chuẩn quốc tế Tuy nhiên có một số vắc xin mới hoặc đặc trưng cho khu vực như vắc xin Viêm não Nhật bản, Rota, Viêm gan B…chưa có mẫu chuẩn quốc tế thì việc thiết lập mẫu chuẩn khu vực là việc hết sức cần thiết [58]

Mẫu chuẩn quốc gia là những vắc xin, sinh phẩm được quy định bởi cơ quan KĐQG, được thiết lập từ mẫu chuẩn dự tuyển và chuẩn định bằng MCQT Mẫu chuẩn quốc gia được sản xuất nhằm tránh phụ thuộc quá nhiều vào MCQT và đảm bảo về

số lượng sử dụng trong nhiều năm [12]

1.4.2 Hướng dẫn TCYTTG thiết lập mẫu chuẩn quốc gia vắc xin

Vắc xin MCQG được thiết lập theo hướng dẫn của TCYTTG (WHO Technical Report Series, No 932, 2006, Annex 2) do cơ quan KĐQG làm đầu mối nghiên cứu

phối hợp với các nhà sản xuất trong nước sản xuất, đánh giá chất lượng so sánh song

song với MCQT với các tiêu chí chất lượng như sau:

- Phương pháp điều chế: Điều thiết yếu đầu tiên là tính đồng nhất và thành phần của mẫu chuẩn phải giống với mẫu thử nghiệm Khi dùng chất bảo quản nên chọn loại không làm ảnh hưởng đến chế phẩm khi đông khô (chất bảo quản thường dùng

là thimerosal) Những chất thêm vào hay chất pha loãng chế phẩm đều chọn chất không gây giảm hoặc ảnh hưởng đến hoạt tính [55]

- Đóng ống: mẫu chuẩn có thể được đóng vào ống hay lọ thủy tinh trung tính sẫm màu và dập nút cao su Trong quá trình đóng ống lên chú ý đến tính đồng nhất giữa các ống nên đóng ống từ một lô bán thành phẩm và trong điều kiện thực hiện

như nhau Nhiệt độ và tốc độ khuấy trong quá trình đóng ống phải ổn định Cần chú

ý các yêu cầu về tính chất của lọ hay ống thủy tinh như độ trung tính, độ dày, màu sắc, số lượng sản phẩm có trong ống phải phù hợp cho việc sử dụng [55]

- Các tiêu chuẩn về chất lượng:

 Hàm lượng kháng nguyên trong mỗi đơn vị đóng ống: Ít nhất đủ cho một lần kiểm định công hiệu

 Số lượng phải đủ dùng cho 5-10 năm cho cả KĐQG và kiểm định tại nhà sản xuất

 Hạn dùng của vắc xin mẫu chuẩn tối thiểu trên 10 năm

 Đạt các tiêu chuẩn xuất xưởng như vắc xin thông thường

Yêu cầu trước hết đối với vắc xin mẫu chuẩn là phải đảm bảo chất lượng đối với một vắc xin xuất xưởng bao gồm: tính vô khuẩn, tính an toàn, công hiệu, tính chất hóa lý… Đây là điều cơ bản bắt buộc đối với bất kỳ một vắc xin nào trước khi sử dụng Trong đó tính vô khuẩn là một trong những điều kiện hết sức quan trọng cho tính ổn định lâu dài của sản phẩm Tính an toàn có nghĩa là vắc xin đó không gây độc cho động vật thử nghiệm [11] Tính chất hóa lý là yếu tố quan trọng của vắc xin đảm bảo bản chất kháng nguyên của vắc xin không bị thay đổi Công hiệu là yếu tố kích thích cơ thể sinh miễn dịch chủ động sau khi sử dụng vắc xin [15] Đây là yếu tố quan trọng nhất, quyết định chất lượng của vắc xin

 Đạt yêu cầu tính đồng nhất giữa các ống

Thử nghiệm tính đồng nhất là yêu cầu cần thiết đầu tiên sau khi đóng ống giữa các lọ vắc xin là tương đương nhau và dao động trong giới hạn cho phép nhất định

Sự đồng nhất này sẽ là yếu tố quan trọng đảm bảo cho sự ổn định trong các thử nghiệm về công hiệu của vắc xin [12]

 Đạt yêu cầu về tính ổn định công hiệu theo thời gian

Một trong những yêu cầu quan trọng là tính ổn định về công hiệu Việc nghiên cứu tính ổn định về công hiệu có thể xác định được mẫu chuẩn có công hiệu ổn định qua thời gian bảo quản Qua đó ta có thể ước tính được thời gian sử dụng, lưu trữ và phân phối tới các phòng thí nghiệm hợp lý góp phần chủ động trong công tác kiểm định vắc xin

 Hồ sơ thực hiện

Toàn bộ hồ sơ của quá trình sản xuất và kiểm định mẫu chuẩn phải được lưu trữ đầy đủ tại cơ quan KĐQG

Vắc xin sau khi đạt các tiêu chuẩn trên và được cơ quan chức năng KĐQG phê chuẩn trở thành vắc xin MCQG

1.4.3 Vắc xin sởi Mẫu chuẩn Quốc gia (MCQG) của Viêt Nam

Việc sản xuất mẫu chuẩn quốc gia ở Việt Nam có từ rất sớm cho một số loại vắc xin BCG, Bạch hầu, Viêm não Nhật bản… tuy nhiên đối với vắc xin sởi thì chưa

có Để kiểm định công hiệu vắc xin sởi, Viện KĐQG đang phải sử dụng mẫu chuẩn quốc tế và mẫu chuẩn của nhà sản xuất cung cấp (mẫu chuẩn nội bộ), điều này dẫn đến không chủ động về thời gian và số lượng có phần hạn chế Mỗi năm các phòng thí nghiệm kiểm định vắc xin sởi cần sử dụng gần một trăm ống mẫu chuẩn, trong khi

đó số lượng được TCYTTG cung cấp rất hạn chế (khoảng 2-3 ống/năm) Thủ tục nhập khẩu qua hải quan phức tạp và tốn kém, ngoài ra chất lượng mẫu chuẩn có thể bị ảnh hưởng do quá trình vận chuyển và bảo quản khi lưu kho hải quan Do vậy nhu cầu thiết lập mẫu chuẩn quốc gia là điều cần thiết và cấp bách

TCYTTG khuyến nghị MCQG phải do cơ quan KĐQG của từng nước sở tại chuẩn định từ MCQT Tùy theo điều kiện, cơ quan KĐQG có thể lấy vắc xin dự tuyển mẫu chuẩn ở dạng bán thành phẩm rồi tự đóng ống hoặc lấy luôn lô thành phẩm từ nhà sản xuất đã đảm bảo các tiêu chí đánh giá chất lượng [53]

Loạt vắc xin sởi mẫu chuẩn dự tuyển RM01-07 được sản xuất từ chủng

AIK-C tại POLYVAAIK-C năm 2009 với số lượng 1.180 lọ, dạng đông khô và được bảo quản trong điều kiện -700C, có giá trị công hiệu trung bình tại thời điểm xuất xưởng 4,2 – 4,7 log PFU/0,5ml, sử dụng làm vắc xin dự tuyển MCQG để nghiên cứu đánh giá chất lượng và độ ổn định của lô mẫu chuẩn dự tuyển RM 01-07 cho việc quyết định

sử dụng làm vắc xin sởi MCQG

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu

Loạt vắc xin Sởi sống giảm độc lực dự tuyển MCQG RM01-07 được sản xuất tại POLYVAC

2.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

Đề tài được thực hiện tại các đơn vị (NICVB, POLYVAC và Viện Vệ sinh dịch tễ trung ương (VSDTTW)

Thời gian nghiên cứu: từ năm tháng 6/2014- tháng 8/2017

2.3 Vật liệu nghiên cứu:

2.3.1 Vắc xin mẫu chuẩn và vắc xin mẫu thử

- Vắc xin sởi mẫu chuẩn quốc tế mã số: 92-648, NIBSC – Anh cung cấp, số

lượng: 9 lọ;

- Vắc xin sởi dự tuyển MCQG mã số RM01-07, sản xuất tại POLYVAC, số

lượng: 100 lọ;

2.3.2 Các sinh phẩm và hóa chất

- Truseq Strand mRNA LT set A hoặc B (RS-122-2101 hoặc RS-122-2102);

- EpiScreiptTM Reverse Transcriptase (ERT12910K);

- RNA clean & ConcentratorTM-5 (R1015);

- Miseq Reagent Kit (MS-102-2002);

- Library Quantification Kit – Illumina (KK4824);

- Các viên bi từ tính (Ampure Bead);

- Qubit và hóa chất đo nồng độ DNA, RNA;

- Kit real-time RT-PCR Invitrogen;

- Kit tách chiết ARN Qiagen;

- Dung dịch AMPure XP bead ở 2-80C;

- Hóa chất điện di;

- Tế bào Vero (ATCC, CRL-1578);

- L- Glutamin 200 mM (Sigma, M3641);

- FBS (Sigma, F2442);

- Kháng sinh: Peniciline và Streptomycine 10mg/ml (Gibco, 14200-075);

- NaHCO37,5% (Gibco, 25080-094);

- Môi trường MEM 10%FBS;

- Môi trường MEM 2%FBS;

- Neutral Red (mp- bio, 1023438);

- Dung dịch phủ thạch MEM 2X;

- Agarose ME (Nisui-Nhật bản);

- Eagle MEM (Wako –Nhật bản);

2.3.3 Các thiết bị chính

- Máy PCR (Applied Biosystem, Mỹ);

- Máy PCR real-time 7500 FAST (Applied Biosystem, Mỹ);

- Máy đo nồng độ acid nucleic (Nanodrop- Thermo, Mỹ);

- Máy giải trình tự gen thế hệ mới (Illumina platform, Mỹ);

- Giá từ (Thermo, Mỹ);

- Pipetman đơn các loại 50 µl, 100-200µl, 1000 µl, 5000 µl (Gilson): mã GG29329, EJ87599, EG53274, 467106;

- Máy lắc JK Mã : VT 03 VR/ Thermo VT 04 VR;

- Pipet aid Model 4-000 – USA;

- Bơm chân không (Gallekamp) mã VP 01 VR;

- Bể ổn nhiệt (Shel - Lab) mã WB 03 VR;

- Máy đo pH (Themor) mã pH-14 VR;

- Tủ cấy vô trùng (Nuaire) mã LH 06 VR;

- Cân phân tích độ nhạy 0.0001g (Sartorius, Đức);

2.3.4 Các dụng cụ và nguyên vật liệu khác

- Phiến nhựa 96 giếng (Corning);

- Phiến nhựa 6 giếng (Corstar/ Nunc);

- Phiến pha loãng(Corning);

- Lá kính cho thử nghiệm real-time RT-PCR;

- Tube Eppendorf 1,8ml vô trùng và không có RNAse;

- Bình lọc môi trường vô trùng loại 1000ml, 500ml (Corning);

- Đầu côn 200µl, 1000µl, 5000µl (Eppendorf);

- Ống đong thuỷ tinh 500 ml (Schott Duran);

- Cốc thuỷ tinh có mỏ 1000 ml (Schott Duran);

- Chai thuỷ tinh 1000 ml (Schott Duran);

- Pipet nhựa vô trùng 5ml, 10ml, 25ml;

- Một số dụng cụ và vật liệu tiêu hao khác dùng trong nuôi cấy tế bào và sinh học phân tử;

2.4 Phương pháp nghiên cứu

Phương pháp nghiên cứu được sử dụng để nghiên cứu đánh giá tính ổn định

công hiệu của vắc xin sởi dự tuyển MCQG là phương pháp thực nghiệm (in vitro) kết

hợp hồi cứu kết quả kiểm định chất lượng khi xuất xưởng lô vắc xin dự tuyển và kết quả đánh giá tính ổn định công hiệu các năm từ 2009-2017 tại nhà sản xuất và NICVB Sử dụng MCQT của TCYTTG do NIBSC thiết lập để làm đối chứng song song với mẫu thử trong đánh giá thử nghiệm công hiệu

2.4.1 Mô hình nghiên cứu

Đánh giá chất lượng của vắc xin sởi dự tuyển MCQG được thực hiện theo hướng dẫn của TCYTTG, sử dụng các phương pháp vi sinh, miễn dịch và sinh học phân tử

Các tiêu chuẩn đánh giá chất lượng vắc xin sởi dự tuyển MCQG theo tiêu chuẩn của TCYTTG và DĐVN IV (Chuyên luận vắc xin sởi)

Phương pháp chọn mẫu: Lô vắc xin sởi sống giảm độc lực dự tuyển MCQG được sản xuất tại POLYVAC từ năm 2009, đến năm 2014 được bảo quản tại NICVB

ở điều kiện nhiệt độ -700C với số lượng 1.180 ống ước tính đủ cung cấp sử dụng cho việc kiểm định chất lượng vắc xin sởi tại NICVB và các phòng kiểm định tại nhà sản xuất trên toàn quốc trong thời gian trên 10 năm

• Đánh giá tính ổn định công hiệu vắc xin sởi dự tuyển MCQG trong điều kiện bảo quản tối ưu -700C theo thời gian 2009-2017 bao gồm:

- Kiểm định chất lượng xuất xưởng: Các thử nghiệm tính chất vật lý, nhận dạng,

độ ẩm tồn dư, vô trùng, mycoplasma, công hiệu ổn định nhiệt

- Nhận dạng đặc hiệu chủng sản xuất vắc xin sởi (POLYVAC_AIK-C) bằng phương pháp giải trình tự gen thế hệ mới (Next Generation Sequencing)

- Xác định tính ổn định công hiệu (hiệu giá) vắc xin sởi dự tuyển MCQG theo thời gian bằng phương pháp PFU sau sản xuất từ 2009-2017 ở điều kiện bảo quản tối ưu -700C

• Xác định hằng số tương quan công hiệu (hiệu giá) vắc xin sởi dự tuyển MCQG giữa hai phương pháp PFU và phương pháp CCID50

- Xác định công hiệu (hiệu giá) mẫu chuẩn dự tuyển bằng phương pháp PFU ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau -700C, 40C/7 ngày, 370C/7 ngày

- Xác định công hiệu (hiệu giá) mẫu chuẩn dự tuyển bằng phương pháp CCID50

ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau -700C, 40C/7 ngày, 370C/7 ngày

- Xác định hằng số tương quan (k) giữa hai phương pháp PFU và CCID50

Hình 2.1 Mô hình nghiên cứu

Vắc xin sởi dự tuyển MCQG

và các chủng vắc xin sởi khác trên

ngân hàng genbank (NCBI)

Xác định tính ổn định công hiệu

- Thực hiện thử nghiệm công hiệu

hàng năm sau khi sản xuất từ năm

2009 - 2017 theo phương pháp

PFU, mỗi năm lặp lại 6 lần

Xác định công hiệu MCDT bằng phương pháp PFU

- Thực hiện xác định công hiệu của các mẫu bảo quản ở điều kiện nhiệt độ -700C, 40C/7 ngày,

370C/7 ngày Thực hiện 3 ngày khác nhau, mỗi ngày lặp lại 6

370C/7 ngày Thực hiện 3 ngày khác nhau, mỗi ngày lặp lại 6 lần

Xác định hằng số tương quan

- Phân tích số liệu, tính hằng số

tương quan giữa 2 phương pháp

2.4.2 Kỹ thuật nghiên cứu

2.4.2.1 Đánh giá tính ổn định công hiệu vắc xin sởi dự tuyển MCQG

a, Kiểm định chất lượng xuất xưởng:

Vắc xin trước khi được xuất xưởng cần phải thực hiện các thử nghiệm theo yêu cầu sau: Thử nghiệm tính chất vật lý, nhận dạng, độ ẩm tồn dư, vô trùng, mycoplasma, công hiệu ổn định nhiệt [51]

• Tính chất vật lý: [16], [51], [14]

Phương pháp: Quan sát trực tiếp trạng thái bánh vắc xin

Tiến hành:

- Gõ nhẹ đáy lọ vắc xin xuống lòng bàn tay cho bong bánh vắc xin khỏi đáy lọ

- Quan sát tất cả các mặt của bánh vắc xin về các tính chất: màu sắc, bánh vắc xin còn nguyên vẹn, không bị nứt vỡ, có dị vật bất thường, có bị sùi hoặc co ngót thành miếng đặc, độ xốp của bánh vắc xin

- Ghi lại thông tin vào biểu mẫu thực hiện

Tiêu chuẩn đánh giá:

Tất cả các bánh đều có màu trắng sữa, không bị vỡ làm nhiều mảnh, không có

dị vật lạ, không bị sùi hoặc co ngót bất thường

• Nhận dạng [16], [51], [14]

Phương pháp : Miễn dịch huỳnh quang

Tiến hành :

- Tế bào Vero được nuôi cấy 1 lớp trên phiến 6 giếng có chứa lamen

- Pha loãng mẫu, gây nhiễm các nồng độ 100, 10-1 200 l /giếng, mỗi nồng độ gây nhiễm 2 giếng, cấy 200 l MEM5%FBS vào 2 giếng còn lại làm chứng

âm Láng nhẹ cho phủ kín bề mặt tế bào

- Hấp phụ 370C trong 60 phút

- Thêm vào mỗi giếng 3 ml MEM 2%FBS

- Nuôi ở 370C, 5%CO2 trong 3 ngày

- Rửa lamen bằng PBS (-), để khô tự nhiên

- Cố định Aceton trong 15 phút, để khô

- Gắn kháng thể sởi, ủ trong điều kiện 370 C/40-60 phút

- Rửa bằng PBS, để khô

- Gắn IgG kháng kháng thể sởi có gắn huỳnh quang (FITC-IgG), ủ 370C/40-60’

- Rửa, để khô, soi dưới kính hiển vi huỳnh quang

- Thử nghiệm đạt yêu cầu khi có các đám bắt màu xanh huỳnh quang trên mẫu vắc xin thử nghiệm

Tiêu chuẩn : Thử nghiệm đạt yêu cầu khi có các đám bắt màu xanh huỳnh quang trên mẫu vắc xin thử nghiệm

• Độ ẩm tồn dư: [16], [51], [14]

Phương pháp: Karl Fischer

Tiến hành:

Điều kiện thực hiện thử nghiệm: phòng thực hiện độ ẩm tồn dư có nhiệt độ 22

± 2% và độ ẩm dưới 45% Thử nghiệm sử dụng quả cân chuẩn 10g, 20g

- Rửa sạch các chén cân, sấy khô ở 600C/1h, cho vào bình hút ẩm 1h

- Hiệu chỉnh cân theo quả cân chuẩn, cân các chén cân

- Các lọ vắc xin để ở nhiệt độ phòng trước khi tiến hành thử nghiệm, nghiền nhỏ bánh vắc xin đông khô, cho vắc xin từ mỗi lọ vào một chén cân

- Cân chén cân có chứa vắc xin

- Tính trọng lượng bằng trọng lượng chén cân có chứa vắc xin trừ đi trọng lượng chén cân

- Sấy chén cân có chứa vắc xin ở 600C/3 h trong máy hút chân không với áp suất 0,6 kPa

- Để nguội trong bình hút ẩm 2h

- Cân chén cân có chứa vắc xin sau sấy

- Tính khối lượng vắc xin giảm sau sấy: bằng trọng lượng chén cân có chứa vắc xin trước khi sấy trừ đi trọng lượng chén cân có chứa vắc xin sau sấy

- Độ ẩm tồn dư = Trọng lượng giảm vắc xin sau sấy/Trọng lượng vắc xin Tiêu chuẩn chấp thuận: Vắc xin đạt yêu cầu khi độ ẩm tồn dư ≤ 2%

- Vắc xin sau khi được hoàn nguyên sẽ đưa vào 2 cốc lọc

- Loại bỏ dung dịch sau khi lọc, bơm 2 môi trường trên vào 2 cốc lọc

- Ủ môi trường FTM trong điều kiện nhiệt độ 30-350C

- Ủ môi trường TSB trong điều kiện nhiệt độ 20-250C

- Nuôi cấy trong 14 ngày và tiến hành theo dõi ngày 3, ngày 7, và ngày cuối cùng để phát hiện xem có sự phát triển của vi khuẩn và nấm trong các ông môi trường hay không

Tiêu chuẩn đánh giá: không phát hiện thấy sự phát triển của vi khuẩn và nấm trong các ống môi trường nuôi cấy

- Nuôi cấy trong điều kiện 370C / 28 ngày

- Cấy chuyển lần 1 sau gây nhiễm 7 ngày và cấy chuyển lần 2 sau gây nhiễm 14 ngày

- Nuôi cấy trong điều kiện 370C / 14 ngày

- Đọc kết quả cuối cùng sau 28 ngày, so sánh mầu chai đối chứng (-), ống đối chứng (-) cùng loại môi trường với chai gây nhiễm, ống cấy chuyển

Mầu môi trường đối chứng (-)

LM I: mầu đỏ (pH 7,6 ~ 7,8)

LM II: mầu vàng cam (pH 7,0 ~ 7,2)

Các mẫu (+) khi có sự chuyển mầu

LM I mầu đỏ → mầu vàng cam

LM II mầu vàng cam → mầu đỏ tím

Tiêu chuẩn đánh giá: Mẫu thử nghiệm đạt khi có phản ứng âm tính sau 28 ngày nuôi cấy

• Thử nghiệm công hiệu và ổn định nhiệt [16], [51], [14]

Phương pháp: PFU, mẫu ổn định nhiệt phải bảo quản trong điều kiện 370C/7 ngày, sau đó tiến hành song song cùng mẫu thử bảo quản 2-80C và mẫu chuẩn

Nguyên lý: Xác định được nồng độ virut qua việc gây nhiễm virut sởi sống giảm độc lực trên tế bào cảm thụ và hình thành những đám hoại tử đặc trưng

Tiến hành:

- Tế bào Vero được nuôi cấy trên phiến 6 giếng trước khi đưa vào thử nghiệm

3 ngày Mật độ tế bào 2 x 105 tế bào/ml x 3ml/ giếng Nuôi cấy ở 37± 10 C, 5% CO2

- Kiểm tra tình trạng tế bào dưới kính hiển vi, tế bào phát triển kín đều 1 lớp

- Pha loãng vắc xin theo bảng 2.3

Bảng 2.3 Bảng pha loãng vắc xin theo phương pháp PFU

0,5 (C)

0,5 (D)

0,5 (E)

MEM