Phân tích hệ gen biểu hiện (exome) ở con của nạn nhân chất độc da cam dioxin bị thiểu năng trí tuệ

Các dị dạng, dị tật bẩm sinh, chậm phát triển trí tuệ thiểu năng trí tuệ được phát hiện ở các thế hệ F1 và F2 của các nạn nhân bị phơi nhiễm.. Giả thuyết là chất độc da cam/ dioxin gây r

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI

LUẬN VĂN THẠC SỸ

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

PHÂN TÍCH HỆ GEN BIỂU HIỆN (EXOME)

Ở CON CỦA NẠN NHÂN CHẤT ĐỘC DA CAM/DIOXIN

BỊ THIỂU NĂNG TRÍ TUỆ

NGUYỄN THỊ HIỀN

HÀ NỘI, 2017

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI

LUẬN VĂN THẠC SĨ

PHÂN TÍCH HỆ GEN BIỂU HIỆN (EXOME)

Ở CON CỦA NẠN NHÂN CHẤT ĐỘC DA CAM/DIOXIN

BỊ THIỂU NĂNG TRÍ TUỆ

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan, đây là công trình nghiên cứu khoa học của riêng tôi dưới

sự hướng dẫn của PGS.TS Nguyễn Huy Hoàng Các số liệu, kết quả trong luận

văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kì công trình nào khác

Học viên

Nguyễn Thị Hiền

LỜI CẢM ƠN

Để có thể hoàn thành đề tài luận văn thạc sĩ một cách hoàn chỉnh, bên cạnh

sự nỗ lực cố gắng của bản thân còn có sự hướng dẫn nhiệt tình của quý Thầy Cô, cũng những sự động viên ủng hộ của gia đình và bạn bè trong suốt thời gian học tập nghiên cứu và thực hiện luận văn thạc sĩ

Xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn đến PGS.TS Nguyễn Huy Hoàng người

đã hết lòng giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi hoàn thành luận văn này

Xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn đến toàn thể quý thầy cô trong Khoa đào tạo sau Đại học – Viện Đại học Mở Hà Nội đã tận tình truyền đạt những kiến thức quý báu cũng như tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong suốt quá trình học tập nghiên cứu và cho đến khi thực hiện đề tài luận văn

Xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn đến Viện nghiên cứu hệ gen – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã không ngừng hỗ trợ và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt thời gian nghiên cứu và thực hiện luận văn

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn đến gia đình, các anh chị và các bạn đồng nghiệp đã hỗ trợ cho tôi rất nhiều trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và thực hiện đề tài luận văn thạc sĩ một cách hoàn chỉnh

Hà Nội, tháng 10 năm 2017 Học viên thực hiện

Nguyễn Thị Hiền

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

- CĐDC: Chất độc da cam

- CĐHH: Chất độc hóa học

- cDNA: Complementary DNA – ADN bổ trợ

- DTBS: Dị tật bẩm sinh

- GATK: Genome Analysis Toolkit – Công cụ phân tích hệ gen

- ID: Intellectual disability – Khuyết tật trí tuệ

- IQ: intelligence quotient – Chỉ số thông minh

- HET: Heterozygote – Biến thể dị hợp tử

- HOM: Homozygote – Biến thể đồng hợp tử

- TEFs/TEQ: toxic equivalance factors – Độ độc

- WES: whole exome sequencing – Giải trình tự toàn bộ hệ gen mã hóa

- WGS: whole genome sequencing – Giải trình tự toàn bộ hệ gen

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.2: Thông tin các mẫu bệnh nhân và gia đình nghiên cứu 31 Bảng 3.3: Nồng độ DNA tổng số của 09 bệnh nhân 33 Bảng 3.4: Bảng thông tin chất lượng đọc của các mẫu giải trình tự 37 Bảng 3.4: Bảng gióng hàng dữ liệu với hệ gen tham chiếu hg19 37

Bảng 3.6: Bảng các biến thể di truyền trên các gen ở bệnh nhân thiểu

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 2.2: Các bước giải trình tự gen thế hệ mới 26

Hình 3.2: Điện di đồ DNA tổng số mẫu bệnh phẩm 32 Hình 3.2 : Kết quả kiểm tra QC chất lượng DNA tổng số 34 Hình 3.3: Kết quả kiểm tra chất lượng thư viện DNA 35 Hình 3.4: Thống kê chất lượng dữ liệu của FastQ của mẫu đọc lần 1 36 Hình 3.5: Thống kê chất lượng dữ liệu của FastQ của mẫu đọc lần 2 36

Hình 3.6: Vị trí đột biến trên exon 10 của gen FAT1 44 Hình 3.7: Sơ đồ phả hệ và trình tự đột biến c.8798A>C (Gln2933Pro)

Hình 3.8: Mô hình mô phỏng cấu trúc 3D chứa vị trí đột biến

MỤC LỤC

1.6 Các nghiên cứu ở mức độ phân tử trên bệnh nhân dioxin ở Việt Nam đến nay 18

2.4.2 Điện di DNA trên gel agarose 22

2.4.4 Giải trình tự gen thế hệ mới 23 2.4.5 Nhân gen bằng kĩ thuật PCR 26

2.4.7 Giải trình tự gen tự động trên máy Sanger 29

3.3 Xác định nồng độ và độ tinh sạch mẫu DNA 32

3.4.2 Kết quả tạo thư viện DNA 35

3.5 Kết quả giải trình tự trên máy Illumina 36

3.5.1 Kết quả đọc trình tự của các mẫu bệnh nhân 36 3.5.2 Kết quả kiểm định chất lượng gióng hàng 37 3.5.3 Xác định biến thể di truyền ở bệnh nhân thiểu năng trí tuệ 38

3.8 Phân tích đột biến trên mô hình cấu trúc protein 3 chiều 45

1

MỞ ĐẦU

Chất độc da cam/ dioxin gây ra hàng loạt bệnh khác nhau trong đó có nhiều bệnh liên quan đến hệ thần kinh Rối loạn tâm thần là một trong 17 bệnh mà Việt Nam đã công nhận Các dị dạng, dị tật bẩm sinh, chậm phát triển trí tuệ (thiểu năng trí tuệ) được phát hiện ở các thế hệ F1 và F2 của các nạn nhân bị phơi nhiễm Giả thuyết là chất độc da cam/ dioxin gây ra ảnh hưởng ở mức độ gen lên toàn bộ hệ gen/ hệ gen biểu hiện (exome) hay cấu trúc và chức năng của các gen/ nhóm gen nhất định dẫn tới phát sinh bệnh tật; các thay đổi/ đột biến này có thể di truyền cho các thế hệ tiếp theo cần phải được chứng minh về mặt khoa học Trí tuệ là một tính trạng cực kỳ phức tạp do nhiều gen quy định Vì vậy, nghiên cứu ảnh hưởng của thay đổi các gen liên quan đến trí tuệ, dẫn đến thiểu năng trí tuệ cần được tiến hành

ở mức độ hệ gen, nhất là hệ gen biểu hiện (exome)

Đề tài tập trung giải quyết vấn đề trên thông qua việc sàng lọc rất kỹ lưỡng, theo tiêu chuẩn quốc tế, các đối tượng nạn nhân thuộc thế hệ con/ cháu của các gia đình có nạn nhân bị phơi nhiễm chất độc da cam/ dioxin Từ đó, tiến hành giải trình

tự hệ gen biểu hiện (exome) của các đối tượng, phân tích tin sinh về các thay đổi/ đột biến gen và tìm hiểu mối liên hệ giữa thay đổi cấu trúc và chức năng gen với cơ chế tác động của dioxin và cơ chế phát sinh thiểu năng trí tuệ

Mục đích của luận văn:

- Sàng lọc gen bị ảnh hưởng bởi dioxin và tìm đột biến có khả năng di truyền từ bố

mẹ sang con gây bệnh thiểu năng trí tuệ

Nội dung tiến hành nghiên cứu:

- Sàng lọc nạn nhân chất độc da cam/ dioxin trên cơ sở các hồ sơ, tài liệu, bệnh án hiện có và bằng bộ câu hỏi phỏng vấn khi thăm, khám

- Tạo và lưu giữ DNA từ các bệnh nhân

- Giải trình tự và phân tích hệ gen biểu hiện (exome) của một số gia đình có con/ cháu bị thiểu năng trí tuệ do chất độc da cam/dioxin Qua đó, xác định các biến dị di truyền liên quan đến thiểu năng trí tuệ

là sản phẩm phụ của nhiều quá trình sản xuất chất hóa học công nghiệp liên quan đến clo như các hệ thống đốt chất thải, sản xuất hóa chất và thuốc trừ sâu và dây truyền tẩy trắng trong sản xuất giấy Để so sánh mức độ gây độc của các chất, tổ chức Y tế thế giới (WHO) dùng chỉ số TEFs (toxic equivalance factors) để đánh giá Hiện tại 2,3,7,8 tetrachlorodibenzo-p-dioxin (tên gọi tắt là TCDD) được đánh giá có mức độ gây độc cao nhất trong tất cả các chất trên [1],[5],[7] Trong chiến dịch khai quang, Mỹ đã rải 15 loại độc chất xuống lãnh thổ Việt Nam như: chất độc da cam (CĐDC) (Agent orange - chiếm 64%), chất độc màu trắng (Agentwhite - chiếm 27%), chất độc màu xanh (Agent blue, green - chiếm 8,7%), chất độc màu tím (Agent pink - chiếm 0,6%) Nói đến độc chất dioxin, nhiều người thường đồng hóa

nó với CĐDC (Agent orange), lầm tưởng hai chất trên là một Nhưng thực ra,

dioxin chỉ là một thành phần hóa học chính trong CĐDC [5] Dioxin được các nhà nghiên cứu đánh giá là một trong những độc chất nguy hiểm nhất mà con người tạo

ra và biết đến, nó có thể làm cây cối cháy trụi lá, làm cho con người phơi nhiễm bị ung thư phổi, ung thư máu, có tính chất di truyền từ bố mẹ sang con, gây dị thai, thai chết lưu trong bụng mẹ và dị dạng bẩm sinh Dioxin là thành phần chính của chất độc diệt cây (antiplant) là những chất độc hóa học thường được sử dụng dưới dạng bột, keo, dung dịch và được phun rải bằng các phương tiện trên không hoặc trên bộ để phá hoại mùa màng hoặc các thảm thực vật, nhiều loại chất độc còn gây tổn thương cho con người và động vật Chất độc diệt cây chủ yếu là chất độc da cam, chất trắng, chất xanh, chất hồng, chất đỏ tía… Chúng được gọi với cái tên như thế là theo màu của các vệt sơn quanh các thùng chứa nhưng khi phun rải đều có màu trắng Chất trắng (White) một chất diệt cây có tác dụng làm khô kiệt đất đai, diệt cỏ và có khả năng tồn tại lâu trong đất Kết quả thí nghiệm của trường Đại học Yale (Mỹ) cho thấy: sau 467 ngày hàm lượng chất trắng còn lại trong đất là 80- 96,6% Chất trắng được sử dụng thí nghiệm ở miền Nam Việt Nam từ năm 1967 và

có hiệu quả hơn so với chất đỏ tía (Purple) và da cam (Orange), sau đó được sử dụng với quy mô lớn để triệt hại rừng già ở dạng dung dịch nước, nồng độ 25%; gây hại cho nhiều loài thực vật thân gỗ mạnh hơn chất da cam và chỉ phun một lần là đủ triệt phá rừng Do khả năng tích tụ trong các lớp đất sâu, nên có thể diệt cả những cây có rễ ăn sâu, liều lượng sử dụng 15- 16 kg/ ha Chất xanh ( Blue) chất này tác động lên thực vật bằng cách rút nước của lá cây, gây héo úa mạnh đối với cây cối

Lá cây gặp chất độc bị khử nước, cuộn tròn lại và rụng trong vòng từ 2- 4 ngày Để triệt phá toàn bộ sự sinh trưởng quân đội Mỹ đã phun rải nhiều lần với liều lượng 8 kg/ ha Đối với cây lúa nước, chất xanh gây ảnh hưởng xấu đến quá trình tạo hạt, cây vẫn có vẻ phát triển bình thường, liều lượng để sử dụng diệt cây lúa nước từ 3- 4kg / ha Chất hồng (Pink) chất diệt cây loại lá rộng Liều lượng sử dụng làm rụng

lá 18- 36 kg/ha, diệt cây lá rộng 12kg / ha, diệt cây lúa nước từ 30 -60 kg/ha Chất

đỏ tía ( Purple) loại cây sú vẹt, đước rất nhạy cảm với chất đỏ tía lá rụng hoàn toàn sau một tuần bị phun rải, thường dùng với liều lượng 28 lít /ha Chất đỏ tía được

5

quân đội Mỹ sử dụng những năm đầu của cuộc chiến tranh hóa học với 645.000-lít Chất da cam (Orange) là chất độc diệt cây có độc tính cao, và được sử dụng nhiều nhất ở Việt Nam, ở dạng lỏng sánh như dầu, màu nâu thẫm, không tan trong nước, tan trong diesel và mỡ, dễ xâm nhập vào màng tế bào của lá, đặc biệt là loài cây lá kép Chất da cam tương tác với hệ men của cây, ức chế quá trình quang hợp, làm ngừng trệ hình thành chất diệp lục làm rối loạn điều tiết sinh trưởng, gây xoắn lá, xoắn cành rễ, nứt vỏ thân cành Úa đỏ, khô cành lá, quả cây ngừng lớn và chết [1],[5],[12]

Thiệt hại do chất độc da cam trong những năm kháng chiến chống Mỹ cứu nước, khu vực Tây Nguyên nói riêng và cả nước Việt Nam nói chung phải hứng chịu một lượng độc chất rất lớn do Mỹ rải xuống, có lẽ là lớn nhất trong lịch sử chiến tranh thế giới đó là chất độc màu dacam/dioxin Sau 35 năm khi cuộc chiến kết thúc, tưởng rằng ảnh hưởng của chất độc đó sẽ không còn nhiều nữa Nhưng trên thực tế, những di chứng mà chất độc da cam (CĐDC) và dioxin để lại vô cùng

to lớn, hàng vạn nạn nhân CĐDC/ dioxin Việt Nam đã chết; đồng thời hàng triệu nạn nhân có con và cháu sinh ra bị dị tật bẩm sinh; nhiều phụ nữ không được hưởng hạnh phúc làm mẹ, rơi vào tuyệt vọng khi sinh ra những đứa con bệnh tật, dị dạng không ra hình người Cho đến nay, hàng triệu nạn nhân Việt Nam vẫn đang hàng ngày phải vật lộn với những cơn đau mà di chứng CĐDC/dioxin để lại, họ mất mát

và đau khổ cả về vật chất và tinh thần Ảnh hưởng của chất độc da cam/dioxin vô cùng to lớn, tác động tới con người, môi trường sinh thái Trong đó, ảnh hưởng nặng nhất để lại cho chúng ta là hiện nay Việt Nam có hơn ba triệu người là nạn nhân của chất độc da cam/dioxin Có nhiều người đã chết do dioxin Nhiều người mắc bệnh hiểm nghèo hiện vẫn đang phải từng ngày từng giờ đối mặt với tử thần Hàng nghìn người bị phơi nhiễm và là nạn nhân CÐDC/dioxin Có một xóm nhỏ chỉ hơn 20 gia đình, nhưng tới hơn mười hộ có người bị nhiễm chất độc Có gia đình sáu người con thì bốn người bị di chứng CÐDC Có thể nói họ là những người cơ cực và khổ sở nhất trần gian này Hiện nay, các cựu chiến binh của Việt Nam tham gia chiến trường miền nam Việt Nam hầu hết bị phơi nhiễm chất độc da cam/dioxin Sức khỏe của họ giảm sút nghiêm trọng và gần đây nhất bệnh tật của họ phát triển

như bệnh ung thư, bệnh tiểu đường, huyết áp và các bệnh khác Nghiêm trọng hơn, một số lớn cựu chiến binh sinh ra những đứa con tàn tật ngay từ khi được sinh ra hoặc sống mà không thể tự chăm sóc bản thân mình Tác hại của dioxin trên cơ thể con người được tính bằng ppt (picrogram - phần tỷ của miligram), và một người khỏe mạnh, chỉ cần nhiễm vài ppt là đã ảnh hưởng đến nhiều bộ phận [2],[3],[4] Hơn nữa, thời gian bán hủy của dioxin trong cơ thể con người được ước tính từ 12 đến 20 năm Nếu một người sống trong vùng bị rải dioxin vào năm 1970 - và bị nhiễm 200 ppt chẳng hạn, thì 12 năm sau - nghĩa là năm 1982, số lượng này còn

100 ppt 12 năm sau nữa - năm 1994, nó còn 50 ppt và đến năm 2006, lượng dioxin vẫn còn 25ppt - nghĩa là vẫn thừa để sinh ra các bệnh ung thư, hoặc con cái bị dị tật

Vì nó tồn lưu lâu dài, và có tính chất lipophilic (nghĩa là dioxin có thể bám chắc vào

mỡ người), nó đi vào thức ăn và nằm trong các cơ quan nội tạng động vật, cả trong

sữa và máu người

1.2 Ảnh hưởng của dioxin

Chất độc da cam/ dioxin và các chất độc hóa học khác do Mỹ sử dụng trong chiến tranh Việt Nam từ năm 1961- 1972 đã gây những hậu quả hết sức nghiêm trọng đến môi trường và sức khỏe người Việt Nam Các chất độc này tác động lên các đối tượng nạn nhân bị phơi nhiễm, gây ra những thay đổi ở mức độ gen, là nguyên nhân của 14 bệnh đã được Hoa Kỳ và thế giới công nhận Ngoài ra, dioxin còn gây ra ít nhất 22 bệnh khác cần được kiểm chứng, trong đó có rối loạn nhận thức và tâm lý tri giác, u não và thiểu năng trí tuệ Việt Nam đã công nhận thêm 3 bệnh (nhóm bệnh) khác do dioxin gây ra: các bất thường sinh sản; các dị dạng, dị tật bẩm sinh (đối với con của người bị nhiễm chất độc hóa học/dioxin); rối loạn tâm thần Trong số 17 bệnh này, có nhiều bệnh liên quan đến hệ thần kinh như: Bệnh thần kinh ngoại biên cấp tính và bán cấp tính và 3 bệnh mà Việt Nam đã công nhận [2],[3],[7] Nghiên cứu này nhằm mục tiêu giải trình tự hệ gen biểu hiện (exome, chiếm khoảng 1% của toàn bộ hệ gen) của một số nạn nhân chất độc da cam/ dioxin

bị thiểu năng trí tuệ bằng công nghệ giải trình tự thế hệ mới Qua đó, có thể phát hiện các đa hình/ đột biến gen liên quan đến nguyên nhân và cơ chế gây thiểu năng

Các nghiên cứu trước đây cũng cho thấy có bằng chứng khơi gợi về mối liên quan với ung thư thanh quản, ung thư đường hô hấp và tiền liệt tuyến, đa u tủy, chứng thoái hóa dạng tinh bột AL (là sự lắng đọng chất amyloid một cách bất thường ngoài tế bào), bệnh thần kinh ngoại biên, rối loạn chuyển hóa porphyrin, bệnh Parkinson và bệnh tim thiếu máu cục bộ, tăng huyết áp, tiểu đường type 2, tật nứt đốt sống của con cái của những người bị phơi nhiễm [13]

Ở Việt Nam, Hội Chữ Thập Đỏ Việt Nam cũng liệt kê các bệnh sau gắn với với sự phơi nhiễm với dioxin: bệnh thần kinh ngoại biên cấp tính, mạn tính và bán cấp tính, chứng ban clor, tiểu đường type 2, ung thư gan, chuyển hóa lipid, sinh sản bất thường và dị tật bẩm sinh như hở môi và hở vòm miệng, dị dạng bẩm sinh ở chân, tràn dịch não, khuyết tật ống thần kinh, tật dính ngón (ngón chân/tay bị dính lại), dị tật cơ bắp và bệnh bại liệt và một số khuyết tật phát triển khác

Dioxin là chất hữu cơ tồn lưu độc hại kéo dài nhiều thập kỷ, không tan trong nước và không thoái hóa dễ dàng Chất này bám vào các phân tử đất được nước chảy từ các đập tràn hoặc các vùng bị phun rải đưa xuôi xuống dưới và lắng đọng dưới đáy ao hồ, chất này được hấp thụ vào các loài cá, loài thân mềm và vịt ngan, dễ dàng len lỏi vào chuỗi thực phẩm của con người

Dioxin ổn định về mặt hóa học và được giữ trong tế bào mỡ của người, nó thay đổi sự cân bằng hóa chất và tế bào tổng hợp trong quá trình sinh sản và hoạt động chức năng của cơ thể con người

Tác động bất lợi của nó có thể được cải thiện bằng cách phẫu thuật, sử dụng thuốc hoặc bằng vật lý trị liệu phục hồi chức năng trong hầu hết các trường hợp nếu

phát hiện sớm, nhưng một số trường hợp thì không thể khắc phục được cho dù tốn bao nhiêu thời gian và tiền bạc

Tác động về gen có thể bỏ qua một thế hệ và lại tái hiện trong thế hệ thứ ba hoặc các thế hệ sau [2]

Khoảng từ 2,1 đến 4,5 triệu người Việt Nam đã sống trong những vùng bị phun rải chất diệt cỏ có nhiễm dioxin tại thời điểm phun rải Bộ Cựu Chiến Binh

Mỹ cho rằng trong số 2,8 triệu cựu chiến binh Mỹ đã đặt chân lên đất Việt Nam

từ 1962-1975 đều bị phơi nhiễm chất diệt cỏ có chứa dioxin, bao gồm chất độc

Để đánh giá các nguy cơ lâu dài đối với sức khoẻ do các chất này, nên đánh giá tổng lượng hoặc trung bình hàng tháng Các chuyên gia đã thiết lập một liều lượng hàng tháng được chấp nhận tạm thời (PTMI) là 70 picogram / kg mỗi tháng Mức này là lượng dioxins có thể ăn được trong suốt đời mà không có những ảnh hưởng sức khoẻ có thể phát hiện được.WHO, phối hợp với FAO, thông qua Ủy ban Tiêu chuẩn Thực phẩm Codex, đã thành lập "Quy tắc Thực hành về Phòng ngừa và Giảm ô nhiễm PCBs và Dioxin trong Thực phẩm và Thức ăn" Tài liệu này hướng dẫn các cơ quan quốc gia và khu vực về các biện pháp phòng ngừa [17]

9

Giới hạn môi trường chung ở hầu hết các nước là 1,000 ppt TEQ (độ độc) trong đất và 100 ppt trong trầm tích Hầu hết các nước công nghiệp hóa có nồng độ dioxin trong đất thấp hơn 12 ppt [18]

Cơ quan Đăng ký các Chất độc và Bệnh tật của Mỹ đã xác định rằng hàm lượng cao hơn 1000 ppt TEQ trong đất cần phải có sự can thiệp như: giám sát, nghiên cứu, nghiên cứu về sức khỏe, giáo dục cộng đồng và y học, và các điều tra

Hậu quả của chất độc hóa học, mà chủ yếu do chất da cam có chứa dioxin –

do Mỹ tiến hành cuộc chiến tranh hóa học ở Việt Nam không chỉ cho tác động trực tiếp, phải tính đến ảnh hưởng lâu dài đến môi trường sinh thái và những di chứng cho các thế hệ nạn nhân chất độc da cam, số nạn nhân ngày một tăng theo thời gian Đối với dân thường, qua phân tích mô mỡ những người sống trong vùng bị nhiễm độc ở miền Nam Việt Nam, nồng độ dioxin cao hơn so với người thường là 3-4 lần

Do đó, nó là nguyên nhân gây nên xáo trộn về di truyền như: quái thai, ung thư, chết yểu…Thực tế sau chiến tranh, tại những vùng bị nhiễm chất độc dioxin, tỉ lệ sinh con quái thai cao gấp 10 lần, sinh con chết hay sẩy thai cao gấp 6 lần [2],[3],[7] Chất độc da cam cũng là nguyên nhân của nhiều bệnh ung thư khác cũng như các bệnh như rối loạn chuyển hoá gây tử vong, tổn thương hệ thần kinh và rối lọan chức năng da Sản phẩm phụ hình thành trong quá trình điều chế chất da cam, là nguyên nhân gây ra các bệnh hiểm nghèo Chỉ cần 1g dioxin cũng đủ giết 8 triệu người Thế nhưng chất da cam rải xuống đồng ruộng, làng mạc Việt Nam chiếm tới 60% (trên 40 triệu lít) tổng khối lượng chất độc diệt cây mà quân đội Mỹ

đã sử dụng Dioxin gây nhiễm độc qua đường hô hấp, tiêu hóa với các triệu chứng:

da và niêm mạc mắt bị kích thích, nhức đầu, nôn mửa, tổn thương gan, phổi, hệ tim mạch, cơ thể suy nhược; biến loạn thể nhiễm sắc, tăng ung thư gan, nguyên phát và

dị tật ở con cái, sẩy thai [4] Năm 2002, các nhà nghiên cứu Mỹ phát hiện một bộ phận dân số Việt Nam những người đã chịu đựng việc tiếp xúc nhiều với loại hóa chất này có hàm lượng dioxin cao hơn mức trung bình 33 lần và cao gấp 206 lần đối với một số cá nhân Tại một số làng, cứ mười đứa trẻ thì có một bị dị tật bẩm sinh, bao gồm cả chậm phát triển cả về thể chất và trí tuệ, mất hoặc biến dạng chi, hoặc gặp phải các bệnh khác như là gai đôi cột sống và bại não [6],[20] Ngoài ra có rất nhiều giai thoại về hậu quả của chất độc da cam và bất kỳ một ai đến Việt Nam đều

có thể dễ dàng nhận thấy tình trạng dị tật bẩm sinh ở trẻ em rất cao, nhất là ở miền Trung và các tỉnh phía Nam Việt Nam Rõ ràng cả về mặt vật chất và chính trị, di sản của cuộc chiến tranh vẫn như một bóng ma tiếp tục ám ảnh người dân Việt Nam Thiệt hại cho hệ sinh thái môi trường theo số liệu ban đầu, quân đội Mỹ đã sử dụng 72 triệu lít chất độc diệt cây nhưng mới đây có tài liệu công bố là 100 triệu lít, trong đó đáng chú ý là trên 40 triệu lít chất độc da cam có chứa dioxin Kết quả, khoảng 5 triệu người Việt Nam bị nhiễm chất độc, 3.340.000 ha đất bị hủy diệt, 44% đất canh tác hoang hóa Những khảo sát của các nhà khoa học 20 năm sau chiến tranh cho thấy vẫn còn 22% rừng tự nhiên và 31% đất trồng thuộc vùng bị nhiễm chất độc hóa học Nồng độ các chất độc hóa học được rải trong các phi vụ thường cao hơn gấp từ 20 - 40 lần nồng độ dùng trong nông nghiệp Các chất diệt

cỏ và phát quang thông thường được phân huỷ sau một tháng đến dưới một năm, riêng hợp chất dioxin có trong chất da cam rất bền vững, với thời gian bán phân huỷ được ước tính khoảng 15 đến 20 năm hoặc lâu hơn nữa [22] Theo các nhà khoa học, việc phun các chất diệt cỏ trong chiến tranh gây ra các hậu quả lâu dài với môi trường thiên nhiên Các chất độc hóa học rải trên quy mô lớn với một nồng độ cao làm thay đổi thành phần của đất, tiêu huỷ các vi sinh vật có ích, làm cho đất khô cằn, chỉ còn tồn tại các loài cỏ dại hay một số loài thực vật thứ sinh, không có giá trị kinh tế; các loại gặm nhấm, trung gian truyền các dịch bệnh; chứng tích để lại là từ

11

các rừng nhiệt đới xanh tươi um tùm rậm rạp, sinh học đa dạng, phong phú trở thành đồi núi trơ trụi hoặc đất phèn chua cằn cỗi; ngoài ra còn làm thay đổi về khí hậu do sự mất cân bằng sinh thái của thiên nhiên Các chất độc hóa học rải xuống đất sẽ bị phân huỷ và bị lôi cuốn xuống các vùng đất trũng, xa nơi được rải xuống

Sự tồn lưu của dioxin trong thiên nhiên rất bền vững, chu kỳ bán huỷ khoảng 15 đến

20 năm và có thể hơn nữa Việc khôi phục đất trồng và rừng cần phải hàng chục năm, thậm chí hàng thế kỷ và tốn kém khá nhiều tiền của Với số lượng rất lớn chất độc hoá học đã rải, lặp đi lặp lại nhiều lần trong quãng thời gian dài với nồng độ cao, không những đã làm chết cây cối, động vật mà còn gây ô nhiễm môi trường trong một thời gian dài và làm đảo lộn các hệ sinh thái tự nhiên Chất độc hoá học

đã được rải từ vĩ tuyến 17 cho đến tận Mũi Cà Mau Nhiều loại rừng ở miền Nam Việt Nam đã bị hủy diệt, nhiều loại tài nguyên bị tiêu hủy, gây tác động bất lợi lớn cho sự phát triển bền vững của cả nước Qua nhiều thập kỷ, diện tích rừng có nhiều biến đổi theo chiều hướng suy giảm do nhiều nguyên nhân khác nhau Riêng trong khoảng năm 1950 đến năm 1972, chiến tranh, nhất là chiến tranh hoá học của Mỹ,

đã để lại một hậu quả tàn khốc lên tài nguyên rừng Rừng nội địa bị phá vỡ cấu trúc, chức năng bị đảo lộn Chỉ tính riêng rừng ngập mặn và ứng phèn, có đến 240.000 ha

bị phá hủy Chiến tranh hóa học làm cho tài nguyên lâm sản bị cạn kiệt, tính ra có tới 75 triệu m3 gỗ bị đốt cháy thành than Dioxin là loại hoá chất độc hại nhất mà loài người đã tìm ra cho đến nay [6],[22]

1.3 Các loại bệnh do dioxin gây ra

Các bệnh lý do chất độc da cam/ dioxin gây ra đã được các nhà khoa học Việt Nam nghiên cứu từ nhiều thập kỷ qua, bao gồm nhiều công trình trong nước,

hay kết hợp với nước ngoài (Ban Chỉ đạo Quốc gia khắc phục hậu quả chất độc

hoá học do Mỹ sử dụng trong chiến tranh Việt Nam, 2002)

Báo cáo của Viện Y học Mỹ tháng Bảy năm 2009 đã trích dẫn đầy đủ bằng chứng về sự liên hệ giữa việc bị phơi nhiễm chất độc da cam/dioxin với năm loại

bệnh: ung thư mô mềm, u lym phô lành tính, bệnh bạch cầu u lym phô mãn tính (bao gồm cả bệnh bạch cầu mô lông, bệnh ung thư và chứng ban clor)

Trên cơ sở các bằng chứng khoa học quốc tế và trong nước, Bộ Y tế nước ta

đã công nhận 17 bệnh do ảnh hưởng chất diệt cỏ (dioxin) gây ra

Trong đó, có 14 bệnh (từ số 1-14) đã được Viện Y học, Hoa Kỳ (Institute of Medicine, 2013) trước đó và gần đây bổ sung, công nhận là có bằng chứng đủ để kết luận rằng có sự có liên quan đến sự phơi nhiễm thuốc diệt cỏ (dioxin) Các bệnh

có liên quan chặt chẽ được liệt kê dưới đây:

1 Ung thư phần mềm (Soft tissue sarcoma)

2 U lympho không Hodgkin (Non – Hodgkin’s lymphoma)

3 U lympho Hodgkin (Hodgkin’s disease)

4 Ung thư phế quản - phổi (Lung and Bronchus cancer)

5 Ung thư khí quản (Trachea cancer)

6 Ung thư thanh quản (Larynx cancer)

7 Ung thư tiền liệt tuyến (Prostate cancer)

8 Ung thư gan nguyên phát (Primary liver cancers)

9 Bệnh đa u tủy xương ác tính (Kahler’s disease)

10 Bệnh thần kinh ngoại biên cấp tính và bán cấp tính (Acute and subacute peripheral neuropathy)

11 Tật gai sống chẻ đôi (Spina Bifida)

12 Bệnh trứng cá do clo (Chloracne)

13 Bệnh đái tháo đường type 2 (Type 2 Diabetes)

14 Bệnh Porphyrin xuất hiện chậm (Porphyria cutanea tarda)

15 Các bất thường sinh sản (Unusual births)

13

16 Các dị dạng, dị tật bẩm sinh (đối với con của người bị nhiễm chất độc hóa học/dioxin)

17 Rối loạn tâm thần (Mental disorders)

Ngoài 17 bệnh đã nêu ở trên, còn có 22 bệnh khác có các bằng chứng mang

tính gợi ý hoặc bằng chứng không đầy đủ về sự ảnh hưởng của CĐDC/dioxin

Việt Nam có khoảng 5 triệu người bị nhiễm dioxin mà hậu quả là các chứng bệnh ung thư, từ ung thư gan đến ung thư dạ dày, ung thư buồng trứng Bên cạnh

đó còn có gần 150 nghìn trẻ em sinh ra bị dị tật như không có mắt; hệ cơ, xương không hoạt động hoặc hoàn toàn không nhận thức được với cuộc sống quanh mình [2] Hiện nay chưa có tài liệu nào xác nhận, công bố chính xác ngưỡng gây bệnh của dioxin với cơ thể con người, chỉ biết rằng giới hạn dioxin an toàn trong con người khoảng dưới 5 ppt Các biểu hiện nhiễm độc tức thời và lâu dài do dioxin gây nên đã được y văn thế giới mô tả đầy đủ và tỉ mỉ, trong đó có các biểu hiện được coi

là đặc thù của sự nhiễm độc như: Chloracne (là một bệnh ngoài da mãn tính có các mụn trứng cá do clo, làm biến dạng mặt, được coi là một biểu hiện bệnh lý đặc trưng gây nên bởi dioxin), sạm da chậm, suy nhược cơ thể, ung thư (sacôm mô mềm, u lym pho không Hodgkin, bệnh Hodgkin, ung thư vú, đặc biệt là ung thư gan

và đường hô hấp) [6],[8],[20] Trong bệnh học của người, mỗi cá nhân phản ứng lại với các tác nhân gây bệnh một cách khác nhau và có những biểu hiện khác nhau, làm cho việc đánh giá thống kê gặp nhiều khó khăn Các nhà khoa học trên thế giới

và Việt Nam đều thống nhất cho rằng các chất diệt cỏ đã gây ra tác động lên nhiễm sắc thể của người, gây các biến cố sinh sản, các dị dạng ở thai nhi và các ung thư cũng như các dị tật bẩm sinh khác Các cựu chiến binh ở Việt Nam bị nhiễm chất độc hóa học (CĐHH) một thời gian dài trong các năm chiến tranh có thể truyền lại cho thế hệ thứ hai các dị tật bẩm sinh (DTBS) Tỷ lệ sinh quái thai trong các gia đình cựu chiến binh Việt Nam cao hơn trong các gia đình bình thường CĐDC/dioxin tác động trên cơ thể con người gây ra các tai biến sinh sản trầm trọng như chửa trứng- ung thư màng nuôi, sẩy thai tự nhiên, thai đẻ non, thai chết lưu, tỷ

lệ đẻ con bị DTBS ở những vùng bị rải nhiều cao gấp 5 đến 10 lần những vùng không bị rải [22],[24] CĐDC/dioxin làm giảm sức đề kháng con người, do đó các bệnh mãn tính và nhiễm trùng phát triển mạnh hơn, ví dụ các bệnh nội tiết (đái đường, bướu giáp trạng), ung thư (gan, đường hô hấp) Dioxin khi vào cơ thể người sẽ làm các nhiễm sắc thể bị gẫy, biến dạng mà bản chất là sự thay đổi cấu trúc axit amin (ADN, ARN) dẫn tới hiện tượng dị tật, dị dạng và di truyền cho các thế hệ con cháu sau này Bình thường, dị tật trong xã hội nào cũng có, nhưng dị tật

ở vùng bị rải CĐDC có đặc điểm: đa dị tật trong một cơ thể; xảy ra ở nhiều trẻ trong một gia đình; tính chất dị tật nặng; có khả năng truyền cho các thế hệ sau Trên thực

tế ở Việt Nam mới chỉ quan sát được sự di truyền này ở đời con, cháu (F1, F2) của các cựu chiến binh vì chưa xuất hiện F3 (chắt) nên chưa quan sát được Ở những vùng bị rải CĐDC, tỷ lệ chết của trẻ em dưới 1 tuổi tăng cao (đây là một trong những thước đo để đánh giá độ nhiễm dioxin) Dị tật nứt gai cột sống ở những con của cựu chiến binh sống trong vùng bị rải ở tuổi trưởng thành cao gấp 1,5 đến 2 lần

so với con những cựu chiến binh sống ở vùng không rải CĐDC Đây là một DTBS

đã được thế giới công nhận gây ra do ảnh hưởng của CĐDC Có thể thống kê các loại DTBS thường gặp ở các nạn nhân bị hậu quả CĐDC là: chậm phát triển trí tuệ; câm- điếc; hội chứng Down; điếc; lác mắt; câm; động kinh; chậm phát triển thể lực; không mọc tóc; sần mặt; bạc tóc; sứt môi- hở vòm miệng; sụp mi mắt; không có tai;

dị dạng các chi (khoèo, teo cơ, liệt, dị dạng các chi, vẹo bàn chân, thừa ngón, thiếu ngón, thừa- dính ngón) [25],[26] Các loại ung thư: Phế quản, thanh quản, phổi, khí quản (trong vòng 30 năm kể từ ngày rời khỏi Việt Nam); tuyến tiền liệt, Hodgkin, Non Hodgkin lymphoma, đa u tuỷ, ung thư mô mềm, phế nang, mạch máu, tế bào sáng của gân, biểu mô, ung thư trẻ em có tính di truyền, u ác người lớn (không đòi hỏi thời gian) Những bệnh khác ngoài ung thư đòi hỏi thời gian: thần kinh ngoại biên cấp và bán cấp (các triệu chứng xuất hiện sau 1 tháng tiếp xúc CĐDC và đã được điều trị trong vòng 2 năm kể từ khi có triệu chứng đầu tiên); bệnh nhiễm Chloracne (1 năm phục vụ ở Việt Nam); vàng da chậm (1 năm phục vụ ở Việt Nam); tật của trẻ em là con các cựu chiến binh có thời gian phục vụ ở Việt Nam;

bị rải CĐDC và những người đi vào vùng bị rải trong khoảng thời gian từ 1961 đến

1971 đều bị nhiễm CĐDC, tức là nạn nhân của CĐHH, nhưng không phải tất cả đều

bị hậu quả CĐDC Bởi chất dioxin chỉ có tác động trên một cơ thể đã có biến đổi sẵn, nghĩa là suy yếu hoặc có sẵn những yếu tố bất thường có thể phối hợp tác động với dioxin, tác động như một chất gây ung thư cộng hưởng với một chất men gây ung thư có sẵn trong cơ thể Còn trên một cơ thể khoẻ mạnh, tác động của dioxin chưa rõ rệt Các cựu chiến binh miền Nam và cựu chiến binh ở miền Bắc phục vụ chiến trường miền Nam trong những năm kháng chiến, cũng như nhân dân sống trên các địa phương khác nhau ở miền Nam Việt Nam đều có nồng độ dioxin cao hơn rõ rệt so với người không bị tiếp xúc như cư dân ở các tỉnh miền Bắc không bị tác hại của cuộc chiến hóa học [23],[24]

1.4 Thiểu năng trí tuệ

Thiểu năng trí tuệ hay trí tuệ chậm phát triển là một dạng khiếm khuyết trí não, phát triển tinh thần dưới mức trung bình Có nhiều nguyên nhân giải thích cho tình trạng thiểu năng trí tuệ ở trẻ Đầu tiên phải kể đến những yếu tố tác động trong quá trình mang thai, và sau khi sinh Tiếp theo do trẻ mắc một số chứng bệnh ảnh hưởng đến sự phát triển của não bộ như bệnh suy giáp, thiểu năng tuyến giáp, sốt cao, chấn thương Nguyên nhân do yếu tố di truyền cũng được kể đến như hội chứng Down, khiếm khuyết nhiễm sắc thể, đột biến gen, dị tật bẩm sinh Người ta chia thiểu năng trí tuệ làm 4 mức độ chậm phát triển trí tuệ là: nhẹ, trung bình, nặng

và rất nặng/nghiêm trọng (rất nặng với IQ dưới 20 hoặc 25, nặng IQ từ 20 đến 40, trung bình với IQ từ 35 đến 55 và thể nhẹ với IQ từ 50 đến xấp xỉ 70 [25] Ở Việt

Nam, thiểu năng trí tuệ có tỉ lệ cao, phần nhiều do ô nhiễm dioxin từ chiến tranh hóa học của Mỹ để lại

Bệnh này được định nghĩa là một suy giảm đáng kể các chức năng nhận thức

và thích ứng Thiểu năng trí tuệ (ID) là bệnh rối loạn của hệ thần kinh gây ảnh hưởng và cản trở hoạt động của não bộ, do đó nó gây ra sự phát triển không bình thường về tinh thần Người bị bệnh thiểu năng trí tuệ có chỉ số IQ dưới 70, bị thiếu hụt hoặc khiếm khuyết ít nhất hai trong số các hành vi thích ứng như giao tiếp, tự chăm sóc, sống tại gia đình, kĩ năng xã hội, liên cá nhân, sử dụng tiện ích công cộng, tự định hướng, kĩ năng học đường, chức năng giải trí lao động Thiểu năng trí tuệ có thể chia thành 2 nhóm: nhóm phi hội chứng là chỉ có một đặc điểm lâm sàng

ở những bệnh nhân, trong khi nhóm hội chứng xảy ra với sự kết hợp của nhiều đặc điểm lâm sàng [26],[27]

Trẻ bị thiểu năng trí tuệ có tri giác và thị giác rất hạn chế, không có khả năng phân biệt hay bắt chước các hình dạng Do tri giác nghèo nàn nên gây khó khăn cho

sự định hướng trong hoàn cảnh mới, khó khăn trong việc phân biệt hóa, khó khăn trong việc quan sát hay kể lại những gì quan sát được

Mức độ phát triển chú ý ở nhóm đối tượng này rất thấp, trẻ không thể chú ý hay tập trung vào việc gì đó trong thời gian dài dẫn đến khó khăn trong việc giao tiếp của trẻ

Trẻ ID thường chậm nhớ, mau quên, không biết lấy ra các kiến thức và kĩ năng đúng lúc, tái hiện không chính xác, quên bất thường do ức chế bảo vệ, trí nhớ máy móc, trí nhớ ý nghĩa yếu, không gắn được kí hiệu cho nội dung ghi nhớ, không tách được nội dung chính cần ghi nhớ, khó khăn trong ghi nhớ và liên hệ logic bên trong, các lý giải bằng lời trừu tượng, không biết cách ghi nhớ và tái hiện có mục đích, ghi nhớ không chính xác

Mức độ phát triển tư duy ở trẻ mắc ID thường đặc biệt thấp, các thao tác tư duy hình thành không trọn vẹn, khó có tư duy khái quát, tư duy không theo trình tự, vai trò điều khiển của tư duy yếu Trẻ khó khăn trong việc thể hiện những suy nghĩ

17

của mình trong giao tiếp với người khác, lời nói nghèo nàn và sai do chức năng kết nối não yếu Động thái các quá trình thần kinh bị rối loạn do đó khó tạo các động hình Tiếp nhận lời nói không phân thành thành phần Tri nhận từ và trật tự âm không chính xác do phân tích quan thính giác chậm phát triển Phát âm không chính xác, ngọng, lắp do bộ máy vận động lời nói chậm phát triển Chậm phản ứng với lời nói của người khác, sử dụng từ không đúng nghĩa và câu không liền mạch Đặc điểm về nhận thức “trẻ chậm hiểu – mau quên” nên rất khó khăn trong việc tiếp thu các từ mới và hiểu nghĩa của từ

Trẻ mắc ID có rối loạn trong quá trình phát triển tâm lý và thể chất ảnh hưởng lớn đến sự phát triển tình cảm và cảm xúc của trẻ Một trong những biểu hiện đặc trưng là ở trẻ xuất hiện nhiều loại phản ứng mang tính xúc cảm khác nhau như

tự vệ - công kích, tự vệ - thụ động Ở một số trẻ là sự hung dữ, hành động không nhất quán và thiếu suy nghĩ Ở một số trẻ là sự nhút nhát, hay khóc nhè, thiếu tự tin,

đa nghi, thiếu việc biểu hiện tính sáng tạo và niềm đam mê Trẻ ID thường tự đánh giá cao, có tính ích kỷ, thiếu tính yêu lao động, không có khả năng đồng cảm và tự hạn chế, có xu hướng về bệnh cảm xúc mạnh Do ảnh hưởng của sự rối loạn trí tuệ nên ở nhóm trẻ này thường không có những khái niệm về bản thân, về những người xung quanh trẻ, trẻ không biết thiết lập mối quan hệ và bày tỏ thái độ tích cực của mình với người khác

Rất nhiều năm sau chiến tranh, các nghiên cứu cho thấy nồng độ dioxin trong cơ thể người dân sống tại các vùng sinh thái bị nhiễm chất độc hóa học nặng vẫn còn rất cao Điều này gây ảnh hưởng nghiêm trọng cho các thế hệ tiếp theo của người việt nam về sự hủy hoại sức khỏe, bệnh di truyền, ung thư, các bất thường sinh sản, dị tật bẩm sinh, rối loạn tâm thần và nhiều bệnh hiểm nghèo khác

1.5 Công nghệ giải trình tự gen thế hệ mới

Trong một vài thập kỉ qua, các nhà khoa học đã bắt đầu tìm ra những gen có khả năng gây thiểu năng trí tuệ do xảy ra hiện tượng đột biến gen Đó là những sự rối loạn chuyển hóa, mất cân bằng sinh hóa trong cơ thể do đột biến trên các gen

chức năng gây ra Mặc dù tiến bộ gần đây trong công nghệ giải trình tự gen thế hệ mới (next generation sequencing) trên toàn bộ genome, exome đã đẩy nhanh tốc độ phát hiện nhiều gen trên nhiều bệnh khác nhau trong đó có gen về thiểu năng trí tuệ cũng đã được phân tích trên từng cá thể cũng như trong phạm vi gia đình [28], tuy nhiên vẫn chưa nhiều các gen thiểu năng trí tuệ được xác định rõ ràng

Một đánh giá gần đây cho thấy khoảng 60 gen là thiểu năng trí tuệ dạng phi hội chứng ở gen lặn trên NST, nhưng con số có thể tăng lên trong tổng số 2500 gen của NST bệnh thiểu năng trí tuệ trên gen lặn [28] Một số các gen trong bệnh thiểu năng trí tuệ liên quan tới sự phát triển và chức năng của hệ thống thần kinh trung ương như: thiểu năng trí tuệ liên quan tới methyltransferases NSUN2, EHMT1[25] cũng không thể không nhắc tới các gen trên NST X liên quan tới bệnh thiểu năng trí tuệ, chúng chiếm khoảng 10-15% các trường hợp ở nam giới Các nghiên cứu vẫn còn đang được tiếp tục trên thế giới cũng như bước đầu nghiên cứu trong nước Chính vì thế, cho đến nay, sự tương quan giữa kiểu hình, kiểu gen của bệnh và sự tương tác giữa những yếu tố di truyền và hoàn cảnh môi trường vẫn chưa được hiểu một cách đầy đủ Trí tuệ là một tính trạng cực kì phức tạp do nhiều gen quy định, vì vậy nghiên cứu ảnh hưởng thay đổi của các gen liên quan đến trí tuệ, dẫn đến thiểu năng trí tuệ cần được tiến hành ở mức độ hệ gen, nhất là hệ gen biểu hiện (exome)

1.6 Các nghiên cứu ở mức độ phân tử trên bệnh nhân dioxin ở Việt Nam đến nay

Tại Việt Nam cũng đã có nhiều đề tài nghiên cứu về ảnh hưởng của bị phơi nhiễm dioxin trên người Từ năm 2005 – 2007, Nông Văn Hải và cs., Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tiến hành nghiên cứu đề tài độc lập cấp nhà nước “Nghiên cứu xác định bằng chứng khoa học

về ảnh hưởng của chất da cam/dioxin trên các đối tượng nạn nhân” Đề tài đã nghiệm thu và có nhiều kết quả tốt như đã khảo sát, lựa chọn, thu thập và xác định nồng độ dioxin của nhiều mẫu máu nạn nhân; phân tích trình tự các gen liên quan

và hệ protein huyết thanh tổng số của các nạn nhân; triển khai lắp đặt và phân tích nồng độ dioxin trong máu Năm 2012, Nguyễn Minh Phương thuộc Học viện Quân

Y đã tiến hành đề tài thuộc chương trình KC10 TN11/11-15: “Nghiên cứu tạo dòng

19

tế bào cảm biến sinh học đặc hiệu để ứng dụng phát hiện dioxin trong máu” Năm

2015, Trần Văn Khoa và cộng sự tại Học viện Quân Y cũng bảo vệ thành công đề tài nghiên cứu: “Nghiên cứu sự biến động về sức khỏe, bệnh tật và nồng độ dioxin ở người có nồng độ dioxin cao; đề xuất giải pháp điều trị” Ngoài ra Đại học Y Hà Nội cũng đã hoàn thành dự án đề tài nghiên cứu về tình hình tai biến sinh sản và dị tật bẩm sinh, tại một số vùng phun rải chất da cam/dioxin trong chiến tranh Đề tài của Nông Văn Hải và cs., Viện nghiên cứu hệ gen, viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tiến hành nghiên cứu đề tài thuộc chương trình KHCN-33/11-15

“Nghiên cứu biến đổi gen, nhiễm sắc thể ở những người có nồng độ dioxin trong máu cao” Đề tài đã tến hành thu thập được hàng trăm mẫu máu và hồ sơ bệnh án, qua đó lựa chọn được 20 gia đình bệnh nhân có nồng độ dioxin trong máu cao (được xác định chính xác bằng sắc kí khí – khối phổ có độ phân giải cao HR-GC/MS); đã tách chiết và tinh chế DNA/RNA tổng số từ các mẫu trên; đã nhân và xác định trình tự một số gen có liên quan; đã tiến hành giải trình tự và phân tích toàn bộ hệ gen của 10 gia đình nạn nhân Kết quả của đề tài sẽ có những đóng góp mới cho khoa học về cơ chế tác động của chất độc da cam/dioxin ở mức độ gen lên sức khỏe con người Năm 2015, Nguyễn Trung Nam và cs.,Viện công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tiến hành nghiên cứu đề tài : “Nghiên cứu sự thay đổi biểu hiện gen Aryl hydrocarbon receptor (AHR) ở mức độ phiên mã của người nhiễm dioxin ở Việt Nam và đánh giá mối liên quan của gen AHR với bệnh lý do dioxin gây ra” Nghiên cứu đã xây dựng được phương pháp xác định sự biểu hiện ở mức độ phiên mã của AHR trong máu của người nhiễm dioxin; xác định được mối liên quan tiềm năng giữa thay đổi biểu hiện của AHR và một số bệnh lý trên những người nhiễm dioxin Đây là nghiên cứu đầu tiên của Việt Nam khảo sát sự biểu hiện của gen AHR giữa người nhiễm dioxin và người không nhiễm dioxin sử dụng phương pháp realtime-PCR, cũng như đánh giá

về mối liên quan tiềm năng giữa biểu hiện của AHR và các bệnh liên quan đến ngườ nhiễm dioxin Đưa ra được đề xuất sử dụng gen AHR là một chỉ thị phân tử để chẩn đoán, sàng lọc người nhiễm dioxin ở Việt Nam

CHƯƠNG II PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Phương pháp thu mẫu máu

Những người tham gia vào nghiên cứu sau khi hoàn tất các thông tin chi tiết

về hồ sơ bệnh án, được lấy máu tĩnh mạch theo các bước sau [8],[9],[10]:

- Ghi tên tuổi, giới tính và kí hiệu bệnh nhân lên ống đựng máu chứa chất chống đông EDTA;

- Đeo găng tay vô khuẩn;

- Để bệnh nhân nằm trong tư thế toàn thân duỗi thẳng trên giường;

- Chọn tĩnh mạch thích hợp để lấy máu (thường ở vị trí nếp khuỷu tay) và đặt gối dưới vị trí định lấy máu;

- Buộc dây garo cách vị trí lấy máu 3 – 5cm về phía trên;

- Xé bao đựng bơm kim tiêm, kiểm tra lại đốc kim;

- Sát khuẩn vị trí lấy máu bằng bông tẩm cồn 700

hai lần, từ trong ra ngoài với đường kính 10cm;

- Chọc kim qua da vào tĩnh mạch, kéo nhẹ piston để lấy lượng máu cần thiết một cách từ từ;

- Tháo dây garo, rút kim nhanh, căng da cầm máu và sát khuẩn vị trí lấy máu;

- Giữ bông cồn ở vị trí lấy máu trong vài phút;

- Tháo kim tiêm khỏi bơm kim tiêm, bơm máu từ từ vào thành ống heparin để tránh vỡ hồng cầu và lắc nhẹ trong 30 giây;

- Thải bỏ bơm kim tiêm vào thùng đựng chất thải y tế dành cho vật sắc nhọn;

- Ống máu được bảo quản ở -200C trước khi lưu giữ ở -800C để phục vụ cho các thí nghiệm tiếp theo

21

2.2 Hóa chất

- Các hóa chất pha đệm chạy điện di DNA của các hãng Sigma, Merck Hóa chất dùng cho PCR: dNTPs, Tag DNA polymerase của hãng Fermentas và Sigma Kit tách chiết DNA tổng số của hãng Qiagen

- Mồi được tự thiết kế cho gen FAT1 dựa vào trình tự gen FAT1 tham chiếu

của người trên cơ sở dữ liệu ENSEMBL (www.ensembl.org) với mã số ENSG00000083857 Đoạn gen được nhân lên với cặp mồi dài khoảng 700 bp:

- FA-F-5’- CGTGCCTATTGG AACAG AG ATAG -3’

- FA-R-5’- GAATCAGCATCCG TGG TACTT -3’

- Các bộ kit đặc biệt dùng trong giải trình tự gen thế hệ mới của Illumina như: kit BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing, bộ kit Truseq DNA nano (350 và 550) và Truseq DNA PCR-free (350bp insert và 550 bp insert), kit SureSelect XT Library Prep

2.3 Trang thiết bị

- Các thiết bị sử dụng cho nghiên cứu bao gồm: Máy giải trình tự gen thế hệ mới Illumina, máy giải trình tự Sanger, tủ lạnh sâu - 200

C, - 800C (Sanyo), Pipetman các loại (Gilson), cân phân tích (MetllerToledo), máy đo pH (Mettler), máy ly tâm (Eppendorf), máy điện di và nguồn điện PowerPac 300 (Bio-Rad), máy chụp ảnh GelDoc (Amersham BioSciences), SEQ8000 Genetic Analyzer (Beckman Coulter Fullerton, CA),

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Tách chiết DNA tổng số

Trong nghiên cứu này, DNA tổng số được tách chiết từ máu bệnh phẩm bằng bộ Kit DNAamp Blood Mini của hãng QIAGEN Qui trình tách chiết DNA tổng số được tiến hành theo hướng dẫn của nhà sản xuất như sau:

- Hút 20 µl Proteinase K vào ống eppendorf 1.5 ml sạch đã ghi thông tin mẫu;

- Chuyển 200 µl dung dịch chứa mẫu bệnh phẩm vào ống eppendorf;

- Bổ sung 200 µl Buffer AL vào mỗi ống eppendorf;

- Chuyển hỗn hợp trong bước trên vào cột lọc;

- Chuyển toàn bộ hỗn hợp trong ống vào ống chứa cột lọc Qiamp tương ứng Ly tâm 8000 vòng/phút trong 1 phút Chuyển cột sang ống thu 2 ml mới;

- Bổ sung 500 µl Buffer AW1 Ly tâm 8000 vòng/phút trong 1 phút Chuyển cột sang ống thu 2 ml mới;

- Bổ sung 500 µl Buffer AW2 Ly tâm 14000 vòng/phút trong 3 phút Chuyển cột sang ống thu 2 ml mới Ly tâm 14000 vòng/phút trong 1 phút;

- Đặt cột vào ống 1,5 ml mới đã được đánh số và ghi tên mẫu tương ứng;

- Bổ sung 200 µl Buffer AE Ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 phút;

- Ly tâm 8000 vòng/phút trong 1 phút để thu hồi ADN tinh sạch;

Sản phẩm DNA tổng số được tiến hành điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8% và đo quang phổ để xác định nồng độ cùng với độ tinh sạch

2.4.2 Điện di DNA trên gel agarose

- Chuẩn bị gel agarose: cân 0,8 g agarose cho vào 100 ml dung dịch đệm TAE 1X Đun trong lò vi sóng cho agarose tan hoàn toàn Để nguội xuống khoảng 500

C, đổ dung dịch agarose vào khay điện di có cài sẵn lược Sau khoảng 30 phút, gỡ lược ra và đặt bản gel vào bể điện di Đổ đệm TAE 1X vào

bể để dung dịch ngập cách mặt gel 1 - 2 mm

- Bổ sung mẫu DNA: Lấy mẫu khoảng 5-10 μl mẫu DNA trộn với 3 μl đệm

2.4.3 Đo quang phổ DNA

Dung dịch chứa DNA tổng số được đo quang phổ ở bước sóng 260 nm.Phương pháp đo quang phổ dựa vào sự hấp thu mạnh ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 260nm của các base Purine và Pyrimidine, độ hấp thụ này tỷ lệ với nồng độ DNA Dựa vào tính chất này mà người ta có thể xác định được hàm lượng các nucleic acid bằng phương pháp đo quang phổ hấp thụ ở bước sóng 260nm (OD260nm – Optical Density260nm) Mỗi đơn vị OD ở bước sóng 260 nm kí hiệu là A260nm

- Khi đó, công thức chung tính nồng độ DNA tổng số:

C DNA (ng/μl)= A 260nm X 50 X độ pha loãng

Trong đó:

C DNA: nồng độ DNA tổng số (ng/μl)

A 260 nm: mật độ quang ở bước sóng 260 nm

2.4.4 Giải trình tự gen thế hệ mới

2.4.4.1 Tạo thư viện DNA

Sử dụng bộ kit SureSelect target enrichment system để tạo thư viện cDNA bao gồm các bước như hình sau:

Hình 2.1: Quy trình tạo thư viện DNA 2.4.4.2 Giải trình tự bằng máy Illumina

Illumina (Nextseq 500) được tiến hành từ 4 loại nucleotide được đánh dấu huỳnh quang Mỗi một chu trình đọc trình tự đều có sự tham gia của cả 4 loại nucleotide, đảm bảo độ chính xác cao hơn phương pháp chỉ có 1 loại nucleotide tham gia trong cùng 1 thời điểm Chu trình này lặp đi lặp lại nhiều lần, cho một hình ảnh kết quả duy nhất ở mỗi cụm cụ thể Các bước giải trình tự trên máy Illumina được thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất gồm các bước như sau:

Bước 1: Chuẩn bị và kiểm tra chất phản ứng reagent cartridge và flow cell;

25

Bước 2: Chạy máy giải trình tự;

Bước 3: Đọc dữ liệu thô từ máy giải trình tự;

Bước 4: Đánh giá chất lượng (Phred quanlity score chart);

Bước 5: Tiền xử lý số liệu;

Bước 6: Kiểm định chất lượng gióng hàng các mẫu giải trình tự;

Bước 7: Phân tích, xác định, chú giải và sàng lọc các biến thể;

a- Xác định và chú giải biến thể: Sử dụng bộ công cụ GATKvà SnpEff

b- Sàng lọc các gen chứa biến thể liên quan đến bệnh thiểu năng trí tuệ do dioxin Bước 7.1: Các gen liên quan đến bệnh thần kinh;

Bước 7.2: Các biến thể thuộc gen có tiềm năng gây bệnh có điểm MQ>40;

Bước 7.3: Đánh giá ảnh hưởng của biến thể đến chức năng của protein bằng 2

công cụ phân tích SIFT_Pred và Polyphen 2;

Bước 7.4: Biến thể bị đánh giá có ảnh hưởng chức năng

Hình 2.2: Các bước giải trình tự gen thế hệ mới

2.4.5 Nhân gen bằng kĩ thuật PCR

Nguyên tắc của PCR là sử dụng DNA polymerase chịu nhiệt để tổng hợp trong ống nghiệm các DNA mới, từ mạch khuôn trong môi trường dư thừa dNTP

và các cặp mồi đặc hiệu Các đoạn DNA mới hình thành lại được sử dụng làm khuôn để tổng hợp cho các chu kỳ tiếp theo Như vậy số lượng bản sao sẽ tăng gấp 2 sau mỗi chu kỳ và sau n chu kỳ, tính theo lý thuyết số lượng bản sao là 2n