NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA TRONG ỐNG NGHIỆM CỦA TẢO SPIRULINA PLATENSIS SELEN HỮU CƠ DÙNG TRONG CHĂN NUÔI

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HỒ CHÍ MINH LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA TRONG ỐNG NGHIỆM CỦA TẢO SPIRULINA PLATENSIS SELEN HỮU CƠ DÙNG TRO

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HỒ CHÍ MINH

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA TRONG ỐNG

NGHIỆM CỦA TẢO SPIRULINA PLATENSIS SELEN HỮU CƠ

DÙNG TRONG CHĂN NUÔI

SVTH: NGUYỄN THỊ DUNG Ngành: DƯỢC THÚ Y

Niên khóa: 2004-2009

Tháng 09/2009

NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA TRONG ỐNG

NGHIỆM CỦA TẢO SPIRULINA PLATENSIS CHỨA SELEN

HỮU CƠ DÙNG TRONG CHĂN NUÔI

Tháng 09 năm 2009

XÁC NHẬN CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN

Họ và tên sinh viên thực tập: Nguyễn Thị Dung

Tên luận văn: “Nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa trong ống nghiệm của nguyên liệu chứa Selen hữu cơ dùng trong chăn nuôi” Đã hoàn thành luận văn theo

yêu cầu của giáo viên hướng dẫn và ý kiến nhận xét, đóng góp của Hội Đồng chấm thi tốt nghiệp Khóa ngày …./…./2009

LỜI CẢM ƠN

Em xin được gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc đến

- Bậc sinh thành đã sinh ra, chăm sóc, dạy dỗ em để có một Nguyễn Thị Dung hôm nay

- ThS Lê Văn Lăng – giảng viên Bộ môn Bào chế-Khoa Dược, Đại Học Y Dược

TP Hồ Chí Minh, BSTY Đặng Thị Xuân Thiệp - Khoa Chăn Nuôi Thú Y, Đại Học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh đã hướng dẫn em tận tình trong mọi công việc và hỗ trợ chu đáo tất cả mọi mặt để em hoàn thành tốt luận văn này

- Bộ môn bào chế và phân tích - Khoa Dược, Đại Học Y Dược TP Hồ Chí Minh đã

hỗ trợ trang thiết bị và môi trường làm việc chuyên môn cần thiết cho suốt quá trình nghiên cứu của em

- Ban giám hiệu của Đại Học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh và Đại Học Y Dược TP

Hồ Chí Minh đã giúp đỡ em có một môi trường học tập đầy đủ

- Các thầy, cô của Khoa Chăn Nuôi Thú Y nói riêng, Đại Học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh, đã dày công dạy dỗ, rèn luyện và truyền đạt cho em kiến thức, cho em một hành trang để vững bước vào đời

- Tất cả các bạn sinh viên trong lớp Dược Thú Y 30, Đại Học Nông Lâm TP HCM

đã giúp đỡ và động viên em trong suốt 5 năm đại học, các bạn sinh viên của Đại Học

Y Dược TP Hồ Chí Minh luôn nhiệt tình hỗ trợ em

Một lần nữa em xin chân thành biết ơn và gửi lời chúc sức khỏe-thành công-hạnh phúc đến tất cả mọi người

NGUYỄN THỊ DUNG

TÓM TẮT LUẬN VĂN

Đề tài: “Nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa trong ống nghiệm của nguyên liệu chứa selen hữu cơ dùng trong chăn nuôi”, được tiến hành trong thời gian từ tháng

3/2009 đến 7/2009, tại Phòng nghiên cứu – Bộ môn Bào Chế - Khoa Dược – Đại Học

Y Dược TP.HCM Đề tài là bước đầu nghiên cứu về các đặc tính cơ bản của nguyên liệu chứa selen hữu cơ (Selen-sa) Chúng tôi đã nghiên cứu trên 4 nguyên liệu: (1) mẫu chuẩn natri selenit (Na2SeO3), (3) tảo Spirulina platensis chứa Selen-sa có hàm lượng

Selen-sa khác nhau (0 mcg/ml - 0,2 mcg/g - 120 mcg/g Các phương pháp đã sử dụng trong đề tài gồm:

- Phương pháp chiết ướt để xử lý mẫu

- Phương pháp so màu để định tính, sơ bộ định lượng selen vô cơ trong các mẫu nguyên liệu tảo và định lượng selen hòa tan trong dịch chiết từ các mẫu tảo chứa Selen-sa

- Thử hoạt tính chống oxy hóa bằng hai phương pháp:

• Phương pháp đánh bắt gốc tự do DPPH (1,1-diphenyl-2-picryhydrazyl)

• Ngăn chặn hình thành gốc tự do trong kim loại chuyển tiếp sắt II (Fe2+) Æ sắt III (Fe2+)

Kết quả đã thu được như sau:

- Xác định nồng độ chất chiết được (cắn) trong dịch chiết các mẫu tảo

- Định tính và sơ bộ định lượng selen vô cơ trong nguyên liệu (2,5 mcg/g tảo - <20 mcg/g tảo).Định lượng selen hòa tan trong dịch chiết các mẫu tảo có chứa hàm lượng Selen-sa khác nhau (<50 mcg/ml dịch chiết)

- Chứng minh được natri selenit đã thể hiện được hoạt tính chống oxy hóa qua 2 phương pháp thử nghiệm

- Các mẫu tảo chứa Selen-sa và không chứa Selen-sa chưa thể hiện rõ hoạt tính chống oxy hóa trên invitro so với mẫu chuẩn

MỤC LỤC

XÁC NHẬN CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN ii

LỜI CẢM ƠN iii

TÓM TẮT LUẬN VĂN iv

MỤC LỤC v

CÁC CHỮ VIẾT TẮT viii

DANH MỤC CÁC BẢNG ix

DANH MỤC CÁC HÌNH x

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ xi

Chương 1: MỞ ĐẦU 1 U 1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích và yêu cầu 2

1.2.1 Mục đích 2

1.2.2 Yêu cầu 2

Chương 2: TỔNG QUAN 3

2.1 Đại cương về Selenium 3

2.1.1 Nguyên tố Selen 3

2.1.2 Tính chất hóa học 3

2.1.3 Định tính và định lượng 4

2.1.3.1 Định tính 4

2.1.3.2 Định lượng 5

2.1.4 Phân bố và dạng sử dụng 6

2.1.4.1 Phân bố trong tự nhiên 6

2.1.4.2 Dạng sử dụng 7

2.1.5 Chức năng sinh học của Selen trong cơ thể động vật 7

2.2 Tổng quan về nguyên liệu chứa Selen-sa – tảo Spirulina platensis 8

2.2.1 Lịch sử 8

2.2.2 Phân loại 9

2.2.3 Phân bố 9

2.2.5 Đặc điểm dinh dưỡng của Spirulina platensis 9

2.2.7 Thành phần hóa học trong Spirulina platensis (S platensis) 10

2.2.8 Quá trình trồng, thu hoạch và sản xuất nguyên liệu S platensis ở Việt Nam 11

2.2.9 Đặc điểm và vai trò của Selen-sa 11

2.2.9.1 Đặc điểm 11

2.2.9.2 Vai trò 12

2.2.10 Chỉ số xác định hoạt tính chống oxy hóa của selen-sa trên động vật thí nghiệm (invivo) 12

Chương 3: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 U 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 14

3.2 Đối tượng nghiên cứu 14

3.2.1 Nguyên liệu 14

3.2.2 Trang thiết bị 14

3.2.3 Hóa chất dùng trong nghiên cứu 15

3.3 Nội dung thực hiện 15

3.4 Phương pháp tiến hành 16

3.4.1 Xử lý mẫu - xác định nồng độ cắn trong dịch chiết thu được của 3 nguyên liệu mẫu thử tảo S platensis và mẫu chuẩn natriselenit (Na2SeO3) 16

3.4.2 Định tính selen vô cơ trong nguyên liệu tảo S platensis – định lượng Selen-sa trong dịch chiết thu được 16

3.4.2.1 Lập phương trình đường chuẩn của natri selenit qua phản ứng màu 16

3.4.2.2 Phản ứng định tính của selen tự do trong nguyên liệu tảo 17

3.4.2.3 Phản ứng định lượng của selen-sa trong dịch chiết của nguyên liệu tảo S platensis 17

3.4.3 Xác định hoạt tính chống oxy hóa (HTCO) của natri selenit và các dịch chiết thu được từ tảo S platensis 17

3.4.3.1 HTCO của natri selenit và các dịch chiết tảo S platensis thu được qua phản ứng đánh bắt gốc tự do DPPH (1,1-Diphenyl Picry Hydrazyl) 17

3.4.3.2 HTCO của natri selenit và các dịch chiết tảo S platensis thu được qua phản ứng ngăn chặn hình thành gốc tự do trong kim loại chuyển tiếp Fe2+ 20

Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22

4.1 Kết quả xử lý mẫu - xác định nồng độ cắn trong dịch chiết thu được của 3 mẫu

nguyên liệu tảo S platensis và mẫu chuẩn natriselenit (Na2SeO3) 22

4.1.1 Kết quả xử lý – xác định nồng độ của mẫu chuẩn natriselenit 22

4.1.2 Kết quả xử lý – xác định nồng độ cắn trong dịch chiết của các mẫu thử S platensis ở những môi trường khác nhau 22

4.2 Định tính selen vô cơ trong nguyên liệu tảo S platensis – định lượng Selen-sa trong dịch chiết thu được 24

4.2.1 Đường chuẩn màu của dung dịch chuẩn natri selenit 24

4.2.2 Phản ứng định tính – sơ bộ định lượng selen vô cơ trong mẫu thử 25

4.2.3 Định lượng Selen-sa trong dịch chiết của tảo ở các môi trường khác nhau 26

4.3 Kết quả hoạt tính chống oxy hóa (HTCO) của các dịch chiết nguyên liệu tảo S platensis 27

4.3.1 Kết quả HTCO của các dịch chiết tảo S platensis thu được qua phản ứng đánh bắt gốc tự do DPPH (1,1-Diphenyl Picry Hydrazyl) 27

4.3.1.1 Kết quả HTCO của mẫu chứng natri selenit 27

4.3.1.2 Kết quả HTCO của các mẫu thử chiết bằng methanol ở pH = 1,2 30

4.3.2 Kết quả HTCO của mẫu chuẩn và các mẫu thử qua phản ứng ngăn chặn hình thành gốc tự do gián tiếp trong kim loại chuyển tiếp Fe2+ 31

4.3.2.1 Phổ UV của Fe2+ (10 mcg/ml)với thuốc thử Ferren (2 mM/l) 31

4.3.2.2 Đường chuẩn của Fe2+ bị oxy hóa trong không khí 32

4.3.2.3 Kết quả sự ngăn chặn hình thành gốc tự do trong kim loại chuyển tiếp Fe2+ của mẫu chuẩn và các mẫu thử tảo 34

Chương 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 37

5.1 Kết luận 37

5.2 Đề nghị 37

TÀI LIỆU THAM KHẢO 39

PHỤ LỤC 41

CÁC CHỮ VIẾT TẮT

C : Mẫu tảo có Selen-sa cao

CCl4 : Tetra clorua cacbon

DPPH : 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl

GSSG : Glutathione disulfid

HTCO : Hoạt tính chống oxy hóa

Invitro : Nghiên cứu ở phòng thí nghiệm

Invivo : Nghiên cứu trên động vật thí nghiệm

K : Mẫu tảo không chứa Selen-sa

MDA : Malonyl dialdehyd

ODchứng : Độ hấp thu của mẫu đối chứng

ODthử : Độ hấp thu của mẫu thử

POL : Peroxy hóa lipid

Selen-sa : Selenium rich spirulina algae

T : Mẫu tảo có Selen-sa thấp

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Nồng độ selen hữu cơ trong mẫu thử 14 Bảng 3.2 Danh sách hóa chất dùng cho thí nghiệm 15 Bảng 3.3 Hỗn hợp phản ứng DPPH 19 Bảng 3.4 Hỗn hợp phản ứng ngăn chặn hình thành gốc tự do trong kim loại chuyển

7,0 – 6,8 29

Bảng 4.5 Kết quả HTCO của các mẫu thử về khả năng đánh bắt gốc tự do DPPH 30 Bảng 4.6 Kết quả quét phổ UV của Fe2+ (10 mcg/ml) với thuốc thử Ferren (2 mM/l) 32

Bảng 4.7 Kết quả sự oxy hóa của Fe2+ ngoài không khí theo thời gian 33

Bảng 4.8 Kết quả ngăn chặn hình thành gốc tự do trong kim loại chuyển tiếp Fe2+ của mẫu chuẩn và các mẫu thử 34

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 2.1 Tảo Spirulina platensis nhìn dưới kính hiển vi 9

Hình 2.2 Sơ đồ quy trình sản xuất nguyên liệu tảo Spirulina platensis ở Việt Nam 11

Hình 3.1 Máy đo quang UV-vis 18

Hình 4.1 Dịch chiết các mẫu thử thu được ở các môi trường khác nhau 22

Hình 4.2 Phản ứng màu của dung dịch selenit từ trái qua phải : dd 1mcg/20 ml - dd 10 mcg/20 ml - 20 mcg/20 ml - dd 30 mcg/20 ml - dd 50 mcg/20 ml - dd 100 mcg/20 ml 24

Hình 4.3 Phản ứng màu định lượng sơ bộ selen trong mẫu nguyên liệu (K,T,C) 25

Hình 4.4 Phản ứng màu định lượng Selen – sa trong dịch chiết các mẫu thử 26

Hình 4.5 Màu phản ứng oxy hóa Fe2+ ngoài không khí theo thời gian 32

Hình 4.6 Phản ứng ngăn chặn hình thành gốc tự do trong kim loại chuyển tiếp 36

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 4.1 Ảnh hưởng môi trường chiết lên nồng độ cắn thu được 23

Biểu đồ 4.2 Đồ thị đường chuẩn nồng độ của selenit ở dãy nồng độ tuyến tính 25

Biểu đồ 4.3 Ảnh hưởng môi trường chiết lên nồng độ Selen-sa trong mẫu thử 27

Biểu đồ 4.4 Phổ UV-vis của DPPH 28

Biểu đồ 4.5 Đồ thị đường chuẩn của selenit trong phản ứng với DPPH 28

Biểu đồ 4.6 Phổ UV của Fe2+ (10 mcg/ml)với thuốc thử Ferren (2mM/l) 31

Biểu đồ 4.7 Đồ thị phương trình đường chuẩn nồng độ (%) của Fe2+ 33

Biểu đồ 4.8 Đồ thị HTCO của selenit trong phản ứng ngăn chặn hình thành gốc tự do trong kim loại chuyển tiếp (Fe2+) 35

và cả cho con người

Do vậy, để đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm xu hướng hiện nay cho nông dân là sản suất thực phẩm sạch (thịt sạch, rau sạch,…) Có nhiều biện pháp để sản xuất thịt sạch như kiểm soát chặt việc sử dụng thuốc trong chăn nuôi, tăng sức đề kháng cho thú nuôi (vaccin, thức ăn dinh dưỡng,…), sử dụng cây thuốc trong chăn nuôi,… Trong đó, giải pháp đề xuất trong Hội thảo chuyên đề khu vực châu Á – Thái Bình Dương về vấn đề: “Chăn nuôi không cần kháng sinh” do tập đoàn Alltech Biotechnology tổ chức là rất đáng quan tâm Tại hội thảo, tập đoàn này đã đưa ra nhiều sản phẩm thức ăn cho gia súc, gia cầm, thủy sản,… để tăng năng suất vật nuôi, tăng tính an toàn cho thực phẩm và trong sạch môi trường Trong những sản phẩm đó có một sản phẩm sử dụng selen hữu cơ nhằm tăng sức đề kháng, tăng chất lượng thịt, hạn chế một số bệnh xảy ra trên động vật do thiếu selen gây ra

Hiện nay, selen hữu cơ đã được sản xuất thực nghiệm trong nước như selen trong men bia, selen trong Linh chi, selen trong tảo,… Nhóm nghiên cứu của trường Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh do ThS Lê Văn Lăng làm chủ trì đã sản xuất thành công selen hữu cơ ở qui mô nhỏ (pilot) và sắp tới đây sẽ đưa vào sản xuất công nghiệp phục

vụ cho con người và cả cho chăn nuôi Nguyên liệu đã và đang được thử nghiệm trên động vật và trên người Nhóm nghiêm cứu đã và đang có nhiều thử nghiệm selen hữu

cơ trên động vật và trên người nhưng chưa có một thử nghiệm nào chứng minh hiệu quả chống oxy hóa của selenium và selen hữu cơ trong ống nghiệm Vì thế, được sự đồng ý của Bộ môn Bào Chế - Khoa Dược, Trường Đai học Y Dược TP Hồ Chí Minh, dưới sự hướng dẫn của của ThS Lê Văn Lăng và sự giúp đỡ tận tình của BSTY Đặng Thị Xuân Thiệp Bô môn Nội Dược - Khoa Chăn Nuôi – Thú Y, Trường Đại học

Nông Lâm TP Hồ Chí Minh; chúng tôi đã thực hiện đề tài: “Nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa trong ống nghiệm của nguyên liệu chứa selen hữu cơ dùng trong chăn nuôi”

1.2 Mục đích và yêu cầu

1.2.1 Mục đích

Nghiên cứu bước đầu về những đặc tính cơ bản của selen hữu cơ trong ống nghiệm

của sinh khối tảo Spirulina platensis chứa Selen-sa được dùng làm thuốc cho người và

thức ăn dinh dưỡng cho động vật

Định lượng Selen-sa trong dịch chiết nguyên liệu tảo Spirulina platensis chứa

Selen-sa dựa vào phương trình đường mẫu chuẩn

Đánh giá khả năng chống oxy hóa trong ống nghiệm của Spirulina platensis chứa

Selen-sa

Chương 2

TỔNG QUAN 2.1 Đại cương về Selenium

2.1.2 Tính chất hóa học

Selen rất giống lưu huỳnh Trong hóa học vô cơ, cả lưu huỳnh và slelen đều thể hiện mức oxy hóa -2, +4, +6 tương ứng với các hợp chất: sulfid-selenid, sulfit-selenit, sulfat-selenat Với nhiều hợp chất hữu cơ của lưu huỳnh Selen có thể thay thế vị trí của lưu huỳnh trong các hợp chất đó, cho những hợp chất tương tự của selen như: cystein và selenocystein, methionin và selenomethionin, các enzym chứa nhóm –SeH tương tự như các enzym chứa nhóm –SH, …

Ở mức oxy hóa +4, selen tồn tại dạng selen dioxyd (SeO2), acid seleno (H2SeO3) và muối selenit (SeO32-) Selen nguyên tố cháy trong không khí thành dạng SeO2 Ở mức oxy hóa +6, selen tồn tại dạng acid selenic (H2SeO4) hoặc muối selenat (SeO42-)

H2SeO4 là dạng acid mạnh hình thành do quá trình oxy hóa selen hoặc H2SeO3 dưới xúc tác của các tác nhân oxy hóa mạnh như: NaBrO3/NaHCO3 hoặc Br2, Cl2,

H2O2/H2O

Khi ở dạng oxy hóa -2, Selen tồn tại dưới dạng Selenid (Se2-) Hydro Selenid (H2Se) là một acid khá mạnh Ở thể khí, nó không màu và độc tính khá cao H2Se được hình thành do sự thủy phân của hợp chất selenid kim loại hoặc do selen nguyên tố bị

phân hủy trong không khí ở điều kiện 400oC H2Se không bền trong không khí, nó dễ dàng phân hủy thành selen và nước

Các hợp chất selen đáng chú ý trong dinh dưỡng và sức khỏe là các dạng methyl hóa của selen như: (CH3)2Se, (CH3)2Se+, các dạng selen hữu cơ là các selenoacid amin như: selenocystin, selenocystein, selenomethionin,…

2.1.3 Định tính và định lượng

2.1.3.1 Định tính

( Phương pháp khử Selen (IV,VI) về Selen nguyên tố: khử các hợp chất của selen (IV) hoặc selen (VI) về trạng thái Se0 Nếu hàm lượng selen trong mẫu cao sẽ xuất hiện kết tủa đỏ Nếu hàm lượng selen trong mẫu thấp thì sẽ tạo thành dung dịch keo có màu từ đỏ - đỏ cam - vàng cam - vàng

Thí dụ: Phản ứng với SO2 trong môi trường acid mạnh: tạo dung dịch đỏ cam, thêm acid nitric (HNO3) dung dịch sẽ mất màu và trở nên trong suốt Dung dịch keo nói trên

sẽ ổn định trong vài tuần - phản ứng với thioure trong môi trường acid mạnh: tạo kết tủa đỏ và tan trong thioure thừa và phản ứng với iodid trong môi trường trung tính: cho kết tủa đỏ, khi thêm thioure thì màu đỏ vẫn không mất

( Phương pháp tạo phức

Với anonimolypdat: selen (IV) và selen (VI) tạo thành phức xanh lơ

Với các O-diamino thơm: Phản ứng nhạy và chọn lọc, nhất là sự tạo phức giữa selen (IV) với 3-3’ diaminobenzidin

( Phương pháp động học xúc tác

Selen xúc tác cho phản ứng khử xanh methylen bằng natri sulfid (Na2S), xanh methylen sẽ mất màu nhanh nếu mẫu thử có chứa vết selen (so với mẫu đối chứng)

2.1.3.2 Định lượng

( Phương pháp phân tích khối lượng

Nguyên tắc: chuyển những hợp chất selenat (SeO42-), selenit (SeO32-) trong các mẫu thử về selen nguyên tố kết tủa đỏ nhờ thuốc thử khác nhau như: SO2+, muối Fe2+,

Cu2+, thioure,…

Cách khác, có thể dùng thuốc thử O-diamino thơm tạo phức dipiazoselennol kết tủa, lại rửa tủa đó, sấy, cân tính kết quả

( Phương pháp đo quang

Đo quang dung dịch keo selen hoặc đo quang nhờ phản ứng tạo phức giữa selen (IV) với các thuốc thử O-diamino thơm

Nguyên tắc của phản ứng tạo phức: selen phản ứng rất nhạy và rất chọn lọc với các O-diamino thơm, tạo phức piazoselenol Trong các dung môi hữu cơ, phức này có cực đại hấp thu rất đặc trưng, do đó có thể đo quang để xác định hàm lượng Selen trong các mẫu thử Trong số các thuốc thử thì 3,3’-diaminobenzidin là được dùng phổ biến nhất Ngoài ra cũng có thể dùng 2,3-diaminonaphtalen (Dược điển Mỹ 24)

Tiến hành: selen (IV) trong môi trường vô cơ hóa được chuyển sang môi trường HCl 6N Điều chỉnh độ pH của dung dịch đến 2-3 bằng NH4OH (1:1) Thêm complexon (III) và HCOOH 2,5M Thêm dung dịch thuốc thử 3-3’-diaminobenzidin 0,5% vừa pha, để chỗ tối khoảng 1 giờ Nâng pH lên 8 và chiết bằng toluen Đo quang

ở bước sóng 420 nm để định lượng Selen

( Phương pháp huỳnh quang

Nguyên tắc: Phức piazoselenol tạo thành giữa selen (IV) và các O-diamino thơm phát huỳnh quang ở bước sóng thích hợp Do đó, có thể đo cường độ huỳnh quang để định lượng Selen

Với 3-3’-diaminobenzidin: selen (IV) sẽ tạo phức monopiazoselenol Trong dung môi hữu cơ, phức này phát huỳnh quang ở bước sóng 580 nm, với bước sóng kích thích là 436 nm

Với 2,3-diaminonaphtalen: Mẫu thử được nghiền nhỏ, vô cơ hóa trong bình Keldan bằng hỗn hợp HNO3 + HClO4, pha loãng dịch vô cơ hóa bằng nước cất Thêm vào đó dung dịch Trilon B 0,2M và dung dịch NH4OH 10%, đưa pH đến 2 Thêm dung dịch hydroxylamin 1% Sau đó thêm dung dịch thuốc thử 2,3-diaminonaphtalen Đậy dung dịch và giữ ở 800C trong 30 phút Chiết bằng n-hexan Phức piazoselenol phát huỳnh quang ở bước sóng 520 nm, với bước sóng kích thích là 380 nm

( Phương pháp cực phổ

Nguyên tắc: đưa selen trong mẫu về dạng selen (IV) rồi đem đo trên thiết bị cực phổ giọt thủy ngân với dung dịch điện ly nền là acid Dưới điện thế một chiều biến thiên từ 0 đến 1000 mV, selen bị khử ở catod cho 2 thế bán sóng Đem đo cường độ dòng khuếch tán giới hạn tại thế bán sóng thứ 2 sẽ xác định được nồng độ selen trong dung dịch đo, từ đó tính được hàm lượng selen trong mẫu thử

2.1.4 Phân bố và dạng sử dụng

2.1.4.1 Phân bố trong tự nhiên

Selen phân bố rộng rải trên quả đất với hàm lượng trung bình 0,09 ppm Ta thường gặp selen trong các loại đất đá, khoáng sản, trong nguyên liệu hóa thạch, nước và trong cây Hàm lượng selen trong đất thay đổi từ 0,1 - 2,0 ppm tùy thuộc vào lượng Hydroxyd sắt (Fe(OH)3) Ngoài ra còn phụ thuộc vào đất mùn hay đất chứa nhiều cacbonat Đặc biệt như ở Hawai hàm lượng selen có trong đất 6-15 ppm do đất ở vùng này có nhiều Fe(OH)3 Se6+ là dạng selen hòa tan chính trong đất

Theo tổ chức y tế thế giới qui định hàm lượng selen trong nước không được quá 10 μg/l Thực tế trong tự nhiên hàm lượng selen trong nước rất thấp, nhất là trong nước biển và đại dương chỉ khoảng 0,09 μg/l Điều này có thể giải thích là do sự lắng đọng giữa các muối selenit (SeO32-) với các oxyt kim loại

Ngoài ra selen còn phân bố trong thực vật (cây Astragalus species, cây trinh nữ - Mimosa pudica L, keo đậu – Leucaena glauca Benth), tảo (Spirulina), nấm (Saccharomyces cerivisiae) với hàm lượng thay đổi phụ thuộc vào nhiều yếu tố

2.1.4.2 Dạng sử dụng

Hiện nay, do tính an toàn, ít độc và dễ sử dụng mà người ta đang dần thay thế selen

vô cơ bằng những hợp chất selen hữu cơ Dạng selen hữu cơ thường dùng là:

selenomethionine, selenocystein, nấm men, tảo Spirulina platensis, nấm linh chi, …bổ

sung cho những vùng có nguy cơ thiếu selen trong tự nhiên và đáp ứng nhu cầu sinh lý cho cơ thể vật nuôi

2.1.5 Chức năng sinh học của Selen trong cơ thể động vật

Selen cần thiết cho sự sinh trưởng và sự thụ tinh Nhiều tác giả ghi nhận trường hợp bệnh lý trên động vật thí nghiệm được nuôi bằng khẩu phần ăn thiếu selen như: hoại tử gan trên chuột, thoái hóa cơ và gan trên heo cũng như bệnh cơ trắng trên bò Các triệu chứng này được phòng ngừa và điều trị bằng các hợp chất chứa selen

Selen là thành phần quan trọng của enzym Glutathione peroxidase Enzym này được tinh khiết hóa từ hồng cầu cừu, phân tử là một tứ hợp và mỗi đơn vị protein có chứa 0,34% selen Phản ứng sinh hóa học với sự xúc tác của Glutathione peroxidase

và cơ chất là Peroxide hydro xảy ra như sau:

2G-SH + H2O2 G-S-S-G + 2 H2O

2G-SH + ROOH G-S-S-G + ROH + H2O

Với cơ chế phản ứng hóa học này Glutathione ở dạng khử bảo vệ được màng Lipid

và các thành phần khác của tế bào như: bảo vệ Hemoglobin khỏi bị tác động hủy hoại của Peroxide hydro Glutathione ở dạng oxy hóa được phục hồi trở lại dạng khử như sau:

Ngoài ra, selen còn tham gia vào quá trình sinh hóa khác như cơ chế miễn dịch, sinh tổng hợp Ubiquinone và sinh tổng hợp ATP trong ty thể của tế bào động vật Selen có mối tương quan với vitamin E: nếu Vitamin E có tác dụng ngăn ngừa sự thành lập peroxide hydro từ các acid béo và tham gia vào quá trình biến dưỡng của các

acid amin chứa lưu huỳnh (như cystein tiền chất của glutathione) thì Selen có tác dụng phá hủy peroxide hydro trong mô bào động vật Điều này có ý nghĩa hết sức quan trọng trong việc bảo vệ màng tế bào tránh khỏi sự tấn công của các gốc tự do (FR), còn gọi là Peroxid, đây cũng là tác nhân gây ung thư

Selenium tham gia vào cấu tạo enzym glutathione peroxydase để phá hủy các peroxid sinh ra trong cơ thể, vì vậy selen bảo vệ được tổ chức tế bào thành mạch, tránh

sự oxy hóa trực tiếp gây hư hại Cũng vì thế selen có mối quan hệ tương tác cùng với vitamin E trong việc chống oxy hóa Vì thế khi thiếu selen thì triệu chứng thiếu vitamin E trở nên trầm trọng hơn Tuy nhiên, selen và vitanim E không thể thay thế cho nhau trong các chức năng sinh học

Sự hấp thu selen nói riêng và các khoáng vi lượng nói chung phải nhờ vào một phức hợp protein gọi là Chelate Nhờ sự gắn kết này mà các ion kim loại không bị kết tủa Selen hữu cơ (selenomethionine, selenocystein) được tổng hợp nhờ gắn vào cơ

chất như: nấm men, nấm Linh chi, tảo Spirulina platensis,… Chúng được đưa đến các

tổ chức mô bào để thực hiện chức năng sinh học một phần, một phần đi vào tổng hợp protein bắp cơ, protein mô, một phần khác tham gia cấu tạo nên enzym Glutathion-peroxydase

2.2 Tổng quan về nguyên liệu chứa Selen-sa – tảo Spirulina platensis

2.2.1 Lịch sử

Thời cổ xưa, 2 bộ tộc (Aztec – Mexico - Châu Mỹ; Kanembu - Châu Phi), thu rong

từ tự nhiên cho vào nuôi trong hồ và dùng làm thức ăn dinh dưỡng

Sự phát triển tảo này ra khắp thế giới cũng vào năm 1492, năm mà Christophe Colomb tìm ra Châu Mỹ

Tảo S platensis được phát hiện và sản xuất công nghiệp từ năm 1960 ở Mexico,

Mỹ và nhiều nước khác trên thế giới

Đến năm 1972 Viện Khoa học Việt Nam đã bắt đầu nhập Spirulina về nghiên cứu Cho đến nay, trên thế giới nói chung và ở Việt Nam nói riêng thì Spirulina đã rất phổ

biến trên người và đang có khuynh hướng chuyển sang thú y để sản xuất thịt sạch

2.2.2 Phân loại

Spirulina là tên gọi được đặt bởi nhà tảo học người Đức Deurben, năm 1927 dựa vào hình thái sợi xoắn Nó là một loài vi tảo xanh, có tên khoa học là Arthrospira platensis

Phân loại theo tên khoa

thường được phân tán nhờ Hồng Hạc cư trú theo mùa

2.2.4 Mô tả cấu tạo

Theo Fremy (1930), cơ thể hiển vi có dạng xoắn lò xo với 5 - 7 vòng xoắn đều nhau, không phân nhánh, không có bao, không có vách ngăn tế bào Trong tế bào có những hạt nhỏ phân bố sát màng tế bào, không có không bào khí Sợi nấm dài 1,5 mm, chiều rộng 5,5 - 6,5 micron, đầu sợi hơi thun lại

2.2.5 Đặc điểm dinh dưỡng của Spirulina platensis

Tảo Spirulina là sinh vật tự dưỡng bắt buộc, không thể sống hoàn toàn trong tối,

quang hợp nhờ ánh sáng mặt trời và có khả năng cố định đạm rất cao và sinh sản bằng cách phân chia - cắt đôi (Keeton, 1967)

Môi trường dinh dưỡng của Spirulina platensis:

- Các dưỡng chất: Carbon, nitơ, các khoáng đa lượng và vi lượng,… cũng nhạy với một số chất ức chế và kích thích tăng trưởng

- Các điều kiện lý hóa thích hợp: pH, áp suất thẩm thấu, ánh sáng, nhiệt độ, điều kiện khuấy trộn,…

- Các quy trình sản xuất sinh khối có thể là nhân tạo hoặc bán nhân tạo, bổ sung nước biển, nước suối khoáng, nước khoáng ngầm, giếng khoan,…

2.2.7 Thành phần hóa học trong Spirulina platensis (S platensis)

Theo Lê Văn Lăng (1999), Spirulina platensis chứa hơn 60% chất đạm (protein) là

nguồn cung cấp chất tạo hình cao hơn thịt bò (18%), gia cầm (19%), sữa tươi (3,7%)

và trứng (14%) Đặc biệt, đạm trong tảo Spirulina là tổng hợp của hơn 18 loại acid amin, trong đó có 8 loại là thiết yếu và tất cả đều dễ tiêu hóa (đến 95%) do bản chất làm đạm thực vật

S platensis còn là nguồn bổ sung nhiều loại vitamin như: Vitamin A, vitamin E,

vitamin B complex (B1, B2, B6, B12),… với hàm lượng B12 gấp đôi gan bò, lượng

beta - carotene cao hơn 20 lần trong cà rốt, lượng vitamin E thì gấp đôi mầm lúa mì S platensis giàu khoáng chất cần thiết cho cơ thể và xương khớp như kali, canxi, magiê,

sắt, kẽm,… và giàu axit béo thiết yếu và chất xơ

Ngoài ra, S platensis còn chứa nhiều chất chống lão hóa (để bảo vệ tế bào) quan trọng như: Phycocianin, chlorophyl và carotenoid,… đã góp phần làm cho S platensis

hoàn toàn khác biệt và độc nhất so với các loại thực phẩm thiên nhiên khác

2.2.8 Quá trình trồng, thu hoạch và sản xuất nguyên liệu S platensis ở Việt Nam

Sơ đồ quy trình:

Hình 2.2 Sơ đồ quy trình sản xuất nguyên liệu S platensis ở Việt Nam

Để tảo S platensis có chứa selen thì môi trường nuôi phải bổ sung hợp chất selenit

vào bể hóa chất với nồng độ phù hợp và theo dõi pH, nhiệt độ, chất dinh dưỡng, tốc độ khuấy trộn, theo dõi sự phát triển, thu sinh khối tảo

2.2.9 Đặc điểm và vai trò của Selen-sa

2.2.9.1 Đặc điểm

Selen-sa là một hình thức selen hữu cơ được sản xuất nhờ vào tảo S platensis sử

dụng selenium vô cơ chuyển hóa thành Selen-sa là những selenoamino và dạng liên kết với các axit amin giúp selen dễ dàng được hấp thu và dự trữ, đặc biệt ít gây độc tính ở liều cao

S platensis sử dụng Se vô cơ dạng Na2SeO3, gắn selen lên các đoạn pepid khác nhau và tổng hợp nên những selenium pepid có tác dụng chống oxy hóa (antioxidant)

và nhiều tác dụng khác

2.2.9.2 Vai trò

Theo Karl Dawson (http://www.chonongsan.net) - Giám đốc nghiên cứu toàn cầu của Alltech – tập đoàn đứng đầu về sản phẩm selen hữu cơ cho thấy những vài trò của Selen-sa như :

Là nguồn Selenium hữu cơ rất an toàn

Tăng độ hữu dụng sinh học của Selenium

Giúp tăng năng suất sinh sản ở heo nái (25 con/năm đến 30 con/năm)

Giúp tăng trưởng tốt cho heo

Cải thiện chất lượng quầy thịt

Cải thiện nguồn gen sinh sản

Cải thiện tốc độ mọc lông ở gà trống

Selen-sa là một yếu tố trong hệ thống enzym chống oxy hóa (Surai,2006)

2.2.10 Chỉ số xác định hoạt tính chống oxy hóa của selen-sa trên động vật thí nghiệm (invivo)

Để xác định hoạt tính chống oxy hóa có rất nhiều phương pháp như:

Trên ống nghiệm (invitro)

Khả năng bắt gốc tự do DPPH

Mô hình beta caroten

Ngăn chặn hình thành gốc tự do,

Trên invivo, người ta có thể dựa vào 2 chỉ số sau :

Malonyl dialdehyl (MDA)

Để đánh giá khả năng ức chế quá trình peroxyd hóa lipid (POL), chúng tôi đo hoạt tính chống oxy hóa (HTCO) invivo ở gan theo phương pháp của UI.A.Vladimirob và A.I.Archakob (1972)

Nguyên tắc: Các gốc tự do hay các dạng oxy hóa hoạt động tăng lên rất mạnh do

tổn thương màng và viêm hoại tử gan Sản phẩm cuối cùng của quá trình POL là MDA Chất này có thể xác định bằng cách cho tạo phức với acid thiobarbituric cho màu hồng bền vững Đo cường độ màu có thể xác định hàm lượng MDA trong mẫu Lượng MDA trong mẫu thử giảm đi so với mẫu chứng cho biết khả năng ức chế quá trình POL của chất thử được gọi là HTCO

Glutathion (GSH)

GSH là một tripeptid – một chuỗi 3 amino acid : Cystein, glycin và glutamic acid, được tìm thấy trong hàng loạt các mô, tế bào động vật GSH là yếu tố chống oxy hóa chủ yếu của cơ thể

GSH tồn tại dưới dạng khử và giữ cân bằng dưới dạng oxy hóa (GSSG) – một disulfid Hàm lượng GSH trong mẫu đo được xác định bằng thuốc thử 2,2’-dinitro-5,5’-dithio-dibenzoic acid với phép đo cường độ màu của sản phẩm hình thành ở λmax =

412 nm, theo phương pháp của G.A.Hazenton và C.A.Lang (1980)

Chương 3

NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

- Thời gian: Từ 17/ 3/ 2009 đến 31/ 7/ 2009

- Địa điểm: Phòng thí nghiệm Bộ môn Bào chế - Khoa Dược - ĐH Y Dược TP Hồ

Chí Minh (ĐHYD TP HCM) – Địa chỉ: 41 Đinh Tiên Hoàng, Quận 1, TP Hồ Chí

Minh

3.2 Đối tượng nghiên cứu

3.2.1 Nguyên liệu

Mẫu chuẩn: Na2SeO3 có nồng độ Selen vô cơ là 14900 (mcg/ml) (Lê Văn Lăng,

2009) Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh (ĐHYD TP HCM) cung cấp và đã được

kiểm định bởi Trung tâm dịch vụ phân tích thí nghiệm Mẫu thử gồm 3 mẫu: mẫu tảo

S platensis không chứa Selen-sa (K), mẫu tảo S platensis chứa Selen-sa nồng độ thấp

(T), mẫu tảo S platensis chứa Selen-sa nồng độ cao (C), thể hiện qua bảng 3.2

Bảng 3.1 Nồng độ Selen hữu cơ trong mẫu thử

Nồng độ Selen hữu cơ

Lê Văn Lăng,

Máy đo quang UV-vis

Micropipet 1000 mcl

Bình hút ẩm

Tủ sấy

3.2.3 Hóa chất dùng trong nghiên cứu

Bảng 3.2 Danh sách hóa chất dùng cho thí nghiệm

học Nguồn cung cấp

Thuốc thử 1,1-diphenyl-2-picryhydrazyl C18H12N5O6 Merck

Thuốc thử Ferren - dạng muối 2Na của

5,5’-

(3-(2-pyridyl)-1,2,4-triazin-5,6-diyl)-bis-2-furan sulfonic acid C

Merck

3.3 Nội dung thực hiện

- Xác định nồng độ chất chiết được hay còn gọi là cắn (selen vô cơ, Selen-sa và các

chất hòa tan khác) trong dịch chiết thu được của mẫu nguyên liệu tảo S platensis có

hàm lượng Selen-sa khác nhau (0 mcg/ml – 0,2 mcg/ml – 120 mcg/ml) và mẫu chuẩn natriselenit (Na2SeO3)

- Định tính selen vô cơ trong nguyên liệu tảo S platensis

- Định lượng Selen-sa trong dịch chiết thu được

- Thử HTCO của natri selenit và các dịch chiết tảo S platensis thu được

3.4 Phương pháp tiến hành

3.4.1 Xác định nồng độ chất chiết được trong dịch chiết thu được của 3 nguyên

liệu mẫu thử tảo S platensis và mẫu chuẩn natriselenit (Na2 SeO 3 )

( Mẫu chuẩn natriselenit (Na2SeO3)

Cân 1,5 g Na2SeO3 cho vào bình định mức 100 ml, thêm nước và định mức đến vạch, lấy 20 ml đem đi xác định nồng độ chính xác của selen ở Trung tâm dịch vụ phân tích thí nghiệm – Địa chỉ: Số 2 Nguyễn Văn Thủ, P ĐaKao, Quận 1, Tp HCM Sau đó pha loãng dung dịch bằng CH3OH và hiệu chỉnh về pH bằng 1,2; 7,0 và 6,8 ( Các mẫu thử

Các mẫu thử được cân cùng một lượng là 2 g, tẩm ẩm bằng dung môi (methanol

pH = 1,2 hay nước hay nước có bổ sung enzym), ủ ở 600C trong 15 phút, lấy ra để nguội và dùng dung môi chiết nhiều lần Dịch thu được đem lọc và xác định nồng độ chất chiết được bao gồm cả Selen-sa bằng cách hút chính xác 5 ml dịch thu được đem

cô cạn, rồi cân chính xác ± 0,0001 g, từ đó xác định nồng độ theo đơn vị mg/ml

3.4.2 Định tính selen vô cơ trong nguyên liệu tảo S platensis – định lượng

Selen-sa trong dịch chiết thu được

3.4.2.1 Lập phương trình đường chuẩn của natri selenit qua phản ứng màu

Pha giai mẫu từ dung dịch chuẩn selenit với các nồng độ sau:

1 – 10 – 20 – 30 – 50 – 100 mcg/20 ml

Lấy 10 ml dịch ở mỗi giai mẫu, thêm 1 ml dung dịch HNO330%, cách thủy ở 60oC trong 10 phút Thêm 3 mg ure, đun sôi, để nguội Thêm 1 ml dung dịch KI 10%