DƯỢC LIỆU CHỨA ALKALOID VÀ DƯỢC LIỆU CHỨA GYCOSID TIM

Nhỏ 3 giọt thuốc thử Bouchardat cho vào ống nghiệm 1 sau đó để nghiêng ống khoảng 30 đến 45o rồi cho từ từ từng giọt thuốc thử Bouchardat chảy dọc theo thành ống nghiệm cho đến khi xuất

BÀI BÁO CÁO THỰC HÀNH BUỔI 1

*****

Bài 1: ĐỊNH TÍNH ALKALOID BẰNG PHƯƠNG

PHÁP HÓA HỌC VÀ SKLM

I Chiết xuất, tinh chế (loại tạp)

- DM: 20ml cồn 90° + 5ml (H 2 SO 4 5%)

- Δ/BM 05', lọc qua bông

Chiết nóng 1 lần

Thu dịch chiết acid

Bột DL Tâm sen (3g)

Hòa tan

- Δ/BM

- H 2 O (10ml x 2 lần), lọc Cắn

Dịch chiết 1

½ DC 1

½ DC 1 - Kiềm hóa = NH4OH đđ (pH ≈ 10)

- Chiết với 10ml CHCl 3

Dịch chiết 2

Định tính =

tt chung

Định tính = SKLM

❖ Các bước thực hiện

- Cân chính xác 3g dược liệu (tâm sen) cho vào bình nón 50ml, thêm vào 20ml cồn 900+ 5ml H2SO4 (5%), đun cách thủy trong 5 phút sau đó lọc qua bông, ta thu được dịch chiết acid

- Đem dịch chiết thu được đun cách thủy đến khi thu được cắn

- Hòa tan cắn thu được với nước đã đun sôi (10ml X 2 lần), sau đó đem lọc ta thu được dịch chiết 1

- Lấy ½ dịch chiết 1 định tính bằng thuốc thử chung:

+ TT Bouchardat

Bouchardat Mayer Dragendorff

+ TT Mayer

+ TT Dragendorff

1 Kết quả thí nghiệm

a Thuốc thử Bouchardat

Nhỏ 3 giọt thuốc thử Bouchardat cho vào ống nghiệm 1 sau đó để nghiêng ống khoảng 30 đến 45o rồi cho từ từ từng giọt thuốc thử Bouchardat chảy dọc theo thành ống nghiệm cho đến khi xuất hiện tủa thì ngừng

➔ Kết quả : xuất hiện tủa nâu dưới đáy ống nghiệm, phản ứng xảy ra chậm, dung dịch bị đục

*Kết luận: Dương tính

*Đánh giá: ++

b Thuốc thử Mayer :

Nhỏ 3 giọt thuốc thử lần lượt Valse – Mayer vào cho vào ống nghiệm 2 sau đó để nghiêng ống khoảng 30 đến 45o rồi cho từ từ từng giọt thuốc thử Mayer chảy dọc theo thành ống nghiệm cho đến khi xuất hiện tủa thì ngừng

➔ Kết quả : xuất hiện tủa trắng, phản ứng xảy ra ngay lập tức, tốc độ phản ứng nhanh, dung dịch bị đục

*Kết luận: Dương tính

*Đánh giá: ++++

c Thuốc thử Dragendorff :

Cho 3 giọt Dragendorff cho vào ống nghiệm 3 sau đó để nghiêng ống khoảng 30 đến 45o rồi cho từ từ từng giọt thuốc thử Dragendorff chảy dọc theo thành ống nghiệm cho đến khi xuất hiện tủa thì ngừng

➔ Kết quả thí nghiệm: xuất hiện tủa vàng cam, phản ứng xảy ra ngay lập tức, dung dịch trong

*Kết luận: Dương tính

*Đánh giá: +++

2 Sắc ký lớp mỏng

a Chuẩn bị

- Bản mỏng silica gel

- Mẫu chuẩn

- Mẫu thử ( dịch chiết 2)

- Dung môi khai triển S2=CHCl3-MeOH-NH4OH(20: 3,6: 0,4)

- Tiến hành sắc ký

- Kẽ một đường thẳng cách mép dưới của bảng mỏng từ 1-1,5 cm, chấm 2 điểm: 1 điểm kí hiệu là T (bên trái), điểm còn lại kí hiệu là C (bên phải)

- Bảng nhỏ sắc kí bằng phương pháp chấm điểm, bảng lớn sắc kí bằng phương pháp chấm vạch

- Phát hiện vết

b bước thực hiện:

- Kiềm hóa dung dịch về pH = 10 bằng NH 4 OH:

• Lấy một mảnh giấy quỳ rồi chia đều ra thành từng mảnh nhỏ đặt lên mặt kính đồng hồ để định pH dung dịch

• Nhỏ vài giọt NH4OH vào phần 2 , dùng đũa thủy tinh chấm vào dung dịch trong trong phần 2 rồi chấm lên những mảnh quỳ tím trên mặt kính đồng hồ, nếu giấy quỳ vẫn còn màu đỏ thì tiếp tục nhỏ NH4OH và chấm thử lên quỳ tím cho đến khi màu giấy quỳ giống với màu của pH = 10 ( màu xanh đen) trên thang đo pH thì ngừng

• Cho phần 2 vào bình lắng gạn cùng với 10ml dd CHCl3 ,đậy nắp bình lại và đem đi lắc 3 lần ( lưu ý lắc nhẹ nhàng tránh lắc mạnh dễ gây tạo nhũ ) sau đó đem bình đi chiết lấy phần dịch chiết 2 để chấm SKLM

c Phát hiện vết trên bản mỏng bằng máy soi UV:

❖ Ánh sáng thường:

*Kết quả:Không phát hiện vết ở ánh sáng thường

❖ Ánh sáng ở bước sóng 254nm:

 Kết quả: Vết di chuyển xéo, vết có màu tím

 Sắc ký đồ :

• Cách làm hiện vết bằng thuốc thử Dragendorff: dùng kẹp gắp lần lượt

hai bản mỏng nhúng vào thuốc thử Dragendorff rồi để khô sẽ thấy xuất hiện vết trên bản mỏng

❖ Ánh sáng ở bước sóng 365nm:

 Kết quả: Vết di chuyển không hoàn toàn, không nhìn rõ màu của vết

 Kết quả Rf:

Rf1 =

8 5

Rf2=

8

5 , 6

Biện pháp khắc phục đối với các hiện tượng ngoại ý:

+ Vết di chuyển xéo: Thay bản mỏng khác hoặc thay bình sắc ký khác

+ Vết di chuyển không hoàn toàn: Loại tạp kỹ trước khi chấm lên bảng

II Câu hỏi lượng giá

1 Những lưu ý khi tiến hành định tính alkaloid bằng thuốc thử chung:

- Khi thực hiện phản ứng với thuốc thử chung phải cho từ từ từng giọt thuốc thử ống nghiệm

- Không nên cho quá nhiều thuốc thử vào ống nghiệm vì một số thuốc thử có tủa và tủa tan lại trong một lượng thuốc thử thừa

2 Ý nghĩa của việc dùng NH4OH trong hệ dung môi:

- Khi cho NH4OH vào thì pH của dung dịch lớn hơn pHa +2, các alkaloid chuyển về một dạng nhất định (alkaloid base), các vết sắc ký gọn, đều và đẹp

- Khi cho NH4OH thì mẫu ở dạng alkaloid base (kém phân cực) cho Rf cao

và làm độ chín xác cao hơn

3 Nếu các vết có Rf quá thấp trên sắc kí đồ, hướng giải quyết để có sắc ký đồ tốt hơn:

- Thay thế hệ dung môi

- Chấm dung dịch thử với một lượng vừa đủ

- Trong quá trình khai triển, để dung môi khai triển chạy quãng đường càng dài càng tốt mà gần mép bản mỏng không quá 0,5 cm

- Chuyển dạng của alkaloid

4 Bằng sắc kí lớp mỏng có thể kết luận sơ bộ hai chất nào đó là khác nhau (hoặc đồng nhất)

5 Để kết luận một chất X nào đó có trong thành phần của hỗn hợp Y cần làm sắc kí như sắc kí lớp mỏng

• Nếu Rf của X bằng với độ dài Rf bất kì có trong thành phần của hỗn hợp Y thì có thể kết luận

• Để có độ chính xác cao hơn có thể làm với nhiều hệ dung môi khác nhau hoặc xử lý 2 chất có cùng Rf sau đó cho chạy với một hệ dung môi khác nếu vẫn cùng Rf kết luận là chất X có trong thành phần của hỗn hợp Y

Bài 5: Dược Liệu Chứa Glycosid Trợ Tim

1 Chiết xuất và tinh chế glycoside tim từ lá Trúc đào

Lấy 5g bột lá Trúc đào ngâm trong một bình nón 100ml với 30ml ethanol 25% trong 24 giờ Sau đó đun nóng 5-10 phút (thỉnh thoảng lắc) trên bếp cách thủy đun sôi Gạn lấy dịch lọc vào 1 bucher

Phần bã còn lại được chiết tiếp trên bếp cách thủy đun sôi như trên thêm 2 lần nữa, mỗi lần với 15ml ethanol 25% Gộp chung cách dịch lọc

Thêm vào dịch chiết 10ml dung dịch chì acetat 30%, khuấy kỹ, để lắng rồi gạn và lọc qua giấy lọc Kiểm tra việc loại tạp, khi dung dịch lọc được khoảng 20ml, bằng cách nhỏ thêm vào dịch lọc1 giọt dung dịch chì acetat , nếu còn xuất hiện kết tủa thì phải cho thêm dung dịch chì acetat và lọc lại

Thêm vào dung dịch lọc trên 10ml dung dịch natri sulfat 15%, khuấy kỹ, để lắng rồi gạn và lọc qua bông gòn Kiểm tra việc loại chì acetat, khi dung dịch lọc được khoảng 15ml, bằng 1 giọt dung dịch natri sulfat, nếu còn xuất hiện kết tủa thì phải cho thêm dung dịch natri sulfat và lọc lại

Dịch lọc sau khi đã loại hết muối chì thừa được lắc với CHCl3 (10ml x 2 lần) trong bình lắng gạn, lấy lớp dưới (phần dung dịch trong suốt) Gộp các dịchCHCl3

và làm khan bằng bột Na2SO4 khan

Chia dịch CHCl3 thành 6 phần trong 6 ống nghiệm Bốc hơi CHCl3 trong 4 ống nghiệm trên cách thủy cho đến cắn khô Dung dịch trong ống nghiệm 5 được dùng ngay để làm phản ứng Liebermann – Burchard

Sơ đồ chiết xuất và tinh chế glycoside tim:

Bột lá Trúc đào (5g)

Dịch chiết (30 ml)

Dịch lọc 1

Dịch lọc 2

1 giọt Pb(CH3COO)2

10ml Pb(CH3COO)2 30%

Khuấy kỹ →Để yên (10-15 phút) → Lọc qua giấy lọc

10ml Na2SO4 15%

Khuấy kỹ →Để yên →Lọc qua bông

Ngâm cồn 25% (24h)

BM (5-10 phút Lọc

BM

1 giọt Na2SO4

lắng gạn) (10ml x 2 lần)

Dịch glycosid

Làm khan = Na2SO4 khan

Chia làm 6 ống

5

4

3

2

Sử dụng để định tính glycoside tim

2 Định tính glycisod tim

2.1 Phản ứng của phần đường

Phản ứng Kaller – Kiliani

Cho vào phần cắn trong ống nghiệm 1ml thuốc thử Kelller, khuấy kỹ cho tan Thêm nhẹ nhàng 1ml thuốc thử Kiliani dọc theo thành ống nghiệm

Phản ứng dương tính khi ở mặt ngăn cách của 2 lớp thuốc thử xuất hiện một vòng màu

đỏ hoặc đỏ nâu và có màu xanh lá khuyếch tán dần trên lớp trên.

Phản ứng dương tính

2.2 Phản ứng của phần aglycon

2.2.1 Phản ứng của khung steroid

Phản ứng Liebermann – Burchard (thực hiện trong tủ hút)

Cho 1ml dung dịch anhydrid acetit vào ống nghiệm khô có chứa sẵn dung dịch glycoside tim trong CHCl 3 , lắc đều

Để ống nghiệm nghiêng vào giá hoặc vào 1 becher, cho nhẹ nhàng theo thành ống

nghiệm khoảng 2ml dung dịch acid sulfuric đậm đặc

Phản ứng đương tính khi giữa 2 lớp thuốc thử xuất thử xuất hiện 1 vòng ngăn cách, sát dưới vòng này có một màu hồng hoặc tím, phía trên vòng này có màu xanh lá tới chàm

Phản ứng dương tính

2.2.1 Phản ứng của vòng lacton 5 cạnh

a Phản ứng Baljet

Cho thuốc thử Baljet ( dung dịch đồng lượng Baljet 1 + Baljet 2) vào 1 ống nghiệm rỗng làm mẫu chứng, 1 ống nghiệm có chứa cắn glycosid tim (mẫu thử) rồi khuấy hay lắc kỹ Phản ứng dương tính khi dung dịch trong ống nghiệm có chứa cắn glycosid tim có màu cam đậm hơn so với dung dịch trong ống chứng

Phản ứng dương tính

b Phản ứng Legal

Cho vào mỗi ống nghiệm, ống nghiệm chứa có chứa cắn glycosid tim, ống nghiệm chứng, 4 giọt cồn 90%

Thêm vào đó 1-2 giọt dung dịch KOH 10% trong cồn (hoặc pyridin), thêm tiếp dung dịch 1 giọt dung dịch natri nitroprussiat 0,5%

Phản ứng dương tính khi dung dung dịch mẫu có chứa cắn glycosid tim có màu đậm hơn

so với dung dịch trong ống chứng

Phản ứng dương tính