Nghiên cứu tạo gelatinase tái tổ hợp và ứng dụng trong thủy phân gelatin da cá Tra (Luận án tiến sĩ)

Nghiên cứu tạo gelatinase tái tổ hợp và ứng dụng trong thủy phân gelatin da cá Tra (Luận án tiến sĩ)Nghiên cứu tạo gelatinase tái tổ hợp và ứng dụng trong thủy phân gelatin da cá Tra (Luận án tiến sĩ)Nghiên cứu tạo gelatinase tái tổ hợp và ứng dụng trong thủy phân gelatin da cá Tra (Luận án tiến sĩ)Nghiên cứu tạo gelatinase tái tổ hợp và ứng dụng trong thủy phân gelatin da cá Tra (Luận án tiến sĩ)Nghiên cứu tạo gelatinase tái tổ hợp và ứng dụng trong thủy phân gelatin da cá Tra (Luận án tiến sĩ)Nghiên cứu tạo gelatinase tái tổ hợp và ứng dụng trong thủy phân gelatin da cá Tra (Luận án tiến sĩ)Nghiên cứu tạo gelatinase tái tổ hợp và ứng dụng trong thủy phân gelatin da cá Tra (Luận án tiến sĩ)Nghiên cứu tạo gelatinase tái tổ hợp và ứng dụng trong thủy phân gelatin da cá Tra (Luận án tiến sĩ)

VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP

Người hướng dẫn khoa học: (1) PGS TS PHẠM CÔNG HOẠT

(2) GS TS LÊ HUY HÀM

HÀ NỘI, 2018

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Phạm Công Hoạt, Bộ Khoa học và Công nghệ và GS.TS Lê Huy Hàm, Viện Di Truyền Nông Nghiệp, những người thầy đã định hướng, truyền dạy những kiến thức khoa học, động viên và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi vượt qua những khó khăn và trở ngại trong suốt quá trình thực hiện luận án

Tôi trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Di Truyền Nông Nghiệp, Viện Khoa học Nông Nghiệp Việt Nam, Ban Đào tạo của Viện Khoa học Nông Nghiệp Việt Nam đã tạo mọi điều kiện thuận lợi về cơ sở vật chất và giúp tôi hoàn thành mọi thủ tục cần thiết trong quá trình làm luận án

Đặc biệt, Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Ban lãnh đạo Trường Đại học Vinh, Viện Nông Nghiệp và Tài Nguyên đã tạo điều kiện giúp tôi hoàn thành tốt nhiệm vụ công tác, học tập và nghiên cứu trong bốn năm qua

Tôi xin chân thành cảm ơn đến Khoa Công nghệ sinh học -Viện Đại học Mở Hà Nội, Trại thủy sản mặn lợ - Nghi Xuân của Trường Đại học Vinh

đã hỗ trợ, giúp đỡ, hướng dẫn tôi trong suốt quá trình thực hiện luận án

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè và người thân đã luôn bên cạnh chia sẻ, và tạo điều kiện cho tôi học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án của mình

Hà Nội, ngày…… tháng năm 2018

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan:

- Luận án là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả này cộng tác với các cộng sự khác

- Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực, một phần đã được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả

Hà Nội, ngày… tháng năm 2018

Tác giả luận án

Phạm Mỹ Dung

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

LỜI CAM ĐOAN ii

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT v

DANH MỤC CÁC BẢNG vii

DANH MỤC CÁC HÌNH ix

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5

1.1 GELATIN 5

1.1.1 Cấu trúc và tính chất gelatin 5

1.1.2 Gelatin có nguồn gốc từ da cá 6

1.2 GELATINASE 11

1.2.1 Đặc điểm, chức năng của gelatinase 11

1.2.2 Phân loại gelatinase 13

1.2.3 Cấu trúc và cơ chế hoạt động của gelatinase 16

1.2.4 Tính chất chung của gelatinase 19

1.2.5 Nguồn sản xuất gelatinase 25

1.3 NGHIÊN CỨU VỀ GELATINASE TÁI TỔ HỢP 27

1.3.1 Gen mã hóa gelatinase 27

1.3.2 Sản xuất gelatinase tái tổ hợp 32

1.4 NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT VÀ ỨNG DỤNG GETATINASE TẠI VIỆT NAM 41

1.4.1 Nghiên cứu sản xuất gelatinase 41

1.4.2 Nghiên cứu ứng dụng gelatinase vào thủy phân da cá 42

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 50

2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 50

2.2 HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 50

2.2.1 Hóa chất 50

2.2.2 Thiết bị 51

2.3 MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY 52

2.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 52

2.4.1 Phương pháp sàng lọc nguồn gen mã hóa gelatinase 52

2.4.2 Phương pháp tạo chủng tái tổ hợp 55

2.4.3 Phương pháp nghiên cứu điều kiện biểu hiện rGEL 61

2.4.4 Phương pháp thu hồi, tinh sạch và đặc tính của rGEL 63

2.4.5 Ứng dụng rGEL thủy phân gelatin da các tra 65

2.4.6 Phương pháp thu thập và xử lý số liệu 71

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 72

3.1 SÀNG LỌC NGUỒN GEN MÃ HÓA GELATINASE 72

3.1.1 Tuyển chọn các chủng vi khuẩn sinh tổng hợp gelatinase cao 72

3.1.2 Đặc điểm sinh học, sinh lý, sinh hóa và định tên của chủng vi khuẩn lựa chọn 74

3.2 TẠO CHỦNG TÁI TỔ HỢP 79

3.2.1 Thiết kế mồi khuếch đại gen gelE mã hóa gelatinase từ chủng E faecalis MD4 79

3.2.2 Nhân dòng gen gelE mã hóa gelatinase 79

3.2.3 Giải trình tự và phân tích gen gelE 81

3.2.4 Thiết kế vector tái tổ hợp cho biểu hiện gen gelE trong E coli BL21(DE3) 84

3.2.5 Tạo chủng E coli tái tổ hợp mang gen gelE 86

3.3 ĐIỀU KIỆN BIỂU HIỆN rGEL 87

3.3.1 Ảnh hưởng của pH đến biểu hiện rGEL 88

3.3.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến biểu hiện rGEL 89

3.3.3 Ảnh hưởng của IPTG đến biểu hiện rGEL 93

3.3.4 Động thái quá trình lên men sinh tổng hợp gelE tái tổ hợp 95

3.4 THU HỒI, TINH SẠCH VÀ ĐẶC TÍNH CỦA rGEL 96

3.4.1 Thu hồi và tinh sạch rGEL 96

3.4.2 Đặc tính của gelatinase tái tổ hợp 99

3.5 ỨNG DỤNG rGEL THỦY PHÂN GELATIN DA CÁ TRA 106

3.5.1 Kết quả xác định các điều kiện thủy phân gelatin da cá Tra bằng rGEL 106

3.5.2 Đánh giá hiệu quả bổ sung chế phẩm axit amin vào thức ăn ương cá Mú chấm đen 111

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 118

TÀI LIỆU THAM KHẢO 121

PHỤ LỤC 145

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt Tên đầy đủ

ADG : Average daily growth

ADN : Acid deoxyribonucleic

AMP : Ampicillin

ARN : Acid ribonucleic

BLAST : Basis Local Aligment Search Tool

EDTA : Ethyllene diamine tetraacetic acid

EtBr : Ethidium Bromide

FCR : Feed change rate

IPTG : Isopropyl β-D- thiogalactoside

kDa : Kilo Dalton

PCR : Polymerase Chain Reactions

rGelE : recombinant gelatinase enzyme (enzyme gelatinase tái tổ hợp)

RE : Restriction enzyme (enzyme giới hạn)

S : Cơ chất

SDS-PAGE : Sodium dodecyl sulfate polyarcrylamide gel electrophoresis SGR : Special growth rate

sprE : serine proteinase

TAE : Tris - acetate - EDTA

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Thành phần axit amin của gelatin từ da cá da trơn (Clarias

gariepinus) 8

Bảng 1.2 Các thành phần axít amin chủ yếu trong gelatin da một số loại cá và bì lợn (thành phần trong 1000g) 10

Bảng 1.3 Một số loại enzym thuộc nhóm MMPs 14

Bảng 2.1 Thành phần dinh dưỡng thức ăn 68

Bảng 2.2 Thành phần dinh dưỡng các công thức thức ăn thí nghiệm 69

Bảng 2.3 Thành phần axit amin trong các loại thức ăn thí nghiệm 69

Bảng 3.1 Hoạt tính phân giải gelatin của dịch lên men 11 chủng vi khuẩn phân lập phân lập từ các mẫu cá nước ngọt bị bệnh sau 48 giờ nuôi cấy 72

Bảng 3.2 Khả năng đồng hoá nguồn carbon và nitơ và đặc điểm sinh trưởng của chủng MD4 sau 2 ngày nuôi cấy ở 37°C 75

Bảng 3.3 Độ tương đồng trình tự gen 16S rRNA của vi khuẩn MD4 với trình tự gen tương ứng của các chủng được đăng ký trên Genbank (NCBI) 77

Bảng 3.4 Mức độ tương đồng trình tự nucleotit của gen gelE của chủng E faecalis MD4 với các gen gelE tương ứng cả các vi khuẩn được đăng kí trên GenBank 81

Bảng 3.5 Mức độ tương đồng trình tự axít amin suy diễn của gen gelE của chủng E faecalis MD4 với các gen gelE tương ứng cả các vi khuẩn được đăng kí trên GenBank 84

Bảng 3.6 Ảnh hưởng của nồng độ chất cảm ứng đến sinh trưởng và biểu hiện GEL 93

Bảng 3.7 Hiệu suất tinh sạch của GEL tái tổ hợp 97

Bảng 3.8 Ảnh hưởng của các ion kim loại và hóa chất đến hoạt tính của GEL tái tổ hợp 103

Bảng 3.9 Ảnh hưởng của tỷ lệ nước khảo sát đến hiệu suất thủy phân 106

Bảng 3.10 Thành phần axít amin của sản phẩm thủy phân từ gelatin da cá Tra 110

Bảng 3.11 Diễn biến các yếu tố môi trường nước trong quá trình ương cá Mú chấm đen 111 Bảng 3.12 Tốc độ tăng trưởng trung bình ngày của cá Mú chấm đen theo khối lượng ở các mức bổ sung chế phẩm axit amin khác nhau 113 Bảng 3.13 Tốc độ tăng trưởng trung bình ngày của cá Mú chấm đen theo chiều dài ở các mức bổ sung chế phẩm axit amin khác nhau 114 Bảng 3.14 Hệ số chuyển đổi thức ăn của cá Mú ở các mức bổ sung chế phẩm axit amin khác nhau 116 Bảng 3.15 Hệ số biến động của cá Mú chấm đen giai đoạn giống 117

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Cấu trúc điển hình của gelatinase A, B có nguồn gốc từ người 17

Hình 1.2 Cấu trúc của các enzym gelatinase 18

Hình 1.3 Sơ đồ trình tự axit amin dự đoán của gelatinase 28

Hình 1.4 A) Hệ thống điều hòa sự biểu hiện của gen gelE bởi operon 31

Hình 2.1 Đồ thị đường chuẩn xác định nồng độ protein 61

Hình 2.2a Cá Mú chấm đen (Epinephelus malabaricus) 67

Hình 2.2b Hệ thống giai ương thí nghiệm 67

Hình 2.3 Thức ăn công nghiệp dùng cho cá Mú chấm đen 68

Hình 3.1 Khả năng thủy phân gelatin (nồng độ 7,5 g/l) sang dạng lỏng của chủng MD4 73

Hình 3.2 Vòng phân giải cơ chất gelatin của chủng vi khuẩn 73

Hình 3.3 Hình ảnh khuẩn lạc trên môi trường MPA (a), tế bào MD4 dưới kính hiển vi điện tử quét (b) và nhuộm Gram (c) 75

Hình 3.4 Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại gen 16S rDNA trên gel agarose 1,0% 76

Hình 3.5 Cây phát sinh chủng loại dựa trên việc so sánh trình tự gen 16S rRNA của chủng MD4 với các trình tự gen tương ứng của các chủng khác trên GenBank 78

Hình 3.6 Điện di đồ sản phẩm khuếch đại gen gelE từ DNA của E faecalis MD4 80

Hình 3.7 Điện di đồ kiểm tra plasmid đã mang gen 80

Hình 3.8 Điện di đồ sản phẩm cắt plasmid tách dòng bằng enzym giới hạn 80 Hình 3.9 So sánh trình tự nucleotide của gen gelE từ chủng E faecalis MD4 với trình tự của các gen gelE được đăng ký trên GenBank 83

Hình 3.10: Trình tự axit amin suy diễn của gelE của chủng E faecalis MD4 84 Hình 3.11 Điện di đồ sản phẩm gen tinh sạch từ vector tách dòng và cắt mở vòng vector biểu hiện pET-22b(+) 85

Hình 3.12 Điện di đồ DNA plasmid từ thể biến nạp (a) và plasmid tái tổ hợp được xử lý bằng HindIII và SalI (b) 85

Hình 3.13 Điện di đồ protein tái tổ hợp trên SDS-PAGE 86

Hình 3.14 Hình ảnh sàng lọc các dòng E coli BL21(DE3)[pET22b(+)-gelE]

trên môi trường thạch và hình ảnh kiểm tra hoạt tính GEL của các dòng trên

đĩa thạch đục lỗ 87

Hình 3.15 Ảnh hưởng của pH đến biểu hiện gelE tái tổ hợp 88

Hình 3.16 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến biểu hiện gelE tái tổ hợp 90

Hình 3.17 Điện di đồ GEL biểu hiện ở 37oC (a) và 34oC(b) trên gel SDS-PAGE 91

Hình 3.18 Điện di đồ protein GEL tái tổ hợp biểu hiện ở các nồng độ IPTG khác nhau trên gel SDS-PAGE 94

Hình 3.19 Động thái quá trình lên men sinh tổng hợp rGEL 95

Hình 3.20 Điện di đồ protein tái tổ hợp trước và sau tinh sạch GEL bằng cột sắc ký ái lực 97

Hình 3.21 Quy trình thu nhận gelatinase tái tổ hợp từ chủng E coli BL21 (DE3) ) [pET 22(b+) –GelE]……… …97

Hình 3.22 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của rGEL ………… 100

Hình 3.23 Độ bền nhiệt của rGEL 100

Hình 3.24 Ảnh hưởng của pH tới hoạt động xúc tác của GEL 101

Hình 3.25 Ảnh hưởng của pH đến độ bền của GEL tái tổ hợp 102

Hình 3.26 Ảnh hưởng của các chất tẩy rửa đến hoạt tính của rGEL 105

Hình 3.27 Biến đổi vận tốc phản ứng theo nồng độ gelatinase (a) và đồ thị Lineaweaver -Burk của gelatinase tái tổ hợp với cơ chất gelatin (b) 106

Hình 3.28 Hiệu quả thủy phân gelatin ở các nồng độ gelatinase khác nhau 107 Hình 3.29 Hiệu suất thủy phân gelatin bằng gelatinase ở các mức nhiệt độ khác nhau 108

Hình 3.30 Hiệu suất thủy phân gelatin bằng gelatinase ở các mức thời gian thủy phân 109

Hình 3.31 Tỷ lệ sống của cá Mú chấm đen khi kết thúc thí nghiệm 113

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của luận án

Gelatinase (GEL) là một trong những enzym được nghiên cứu nhiều hiện nay với tác dụng thủy phân gelatin, pheromone, collagen, casein và fibrinogen thành các đoạn peptit ngắn và các axít amin Gelatinase là enzym chứa kim loại, thuộc nhóm protease ngoại bào sử dụng trong ngành công nghiệp hóa chất, y học, công nghệ thực phẩm

Gelatinase tự nhiên được thu nhận từ nhiều loài vi khuẩn thuộc các chi

khác nhau như Staphylococcus, Pseudomonas, Aerromonas, Enterobacter,

Bacillus… Tuy nhiên, phần lớn vi khuẩn sinh gelatinase nói trên là các đối

tượng vi sinh vật (VSV) gây bệnh có thể gây hại đối với con người, động vật nên không được sử dụng trực tiếp để sản xuất gelatinase Ngoài ra, các vi khuẩn tự nhiên sinh gelatinase có hoạt tính không cao

Để khắc phục những tồn tại trên đối với nguồn gelatinase tự nhiên, hướng nghiên cứu sản xuất gelatinase tái tổ hợp đã và đang được các nhà khoa học, doanh nghiệp quan tâm nghiên cứu nhằm nâng cao hoạt tính enzym, sản xuất ở quy mô lớn và ứng dụng rộng rãi Ngoài ra, gelatinase tái

tổ hợp sản xuất được sẽ loại trừ tính độc của các chủng vi khuẩn tự nhiên, hạn chế tác dụng gây hại tới con người hay động vật

Một trong những phương pháp hiệu quả được chú trọng phát triển trên thế giới là ứng dụng kỹ thuật di truyền và công nghệ lên men tạo ra các chủng VSV tái tổ hợp có khả năng sinh tổng hợp gelatinase tái tổ hợp (rGEL) hoạt tính cao, sản lượng lớn và có khả năng ứng dụng trong công nghiệp Trong nhiều công bố, hoạt tính rGEL thu được cao hơn nhiều lần so với GEL từ

VSV tự nhiên Trong số các hệ biểu hiện rGEL, Escherichia coli được xem là

một trong những hệ biểu hiện nhanh, hiệu quả rGEL và tạo cơ sở khoa học cho

nghiên cứu đặc tính enzym để phát triển nghiên cứu sâu hơn Các nghiên cứu

trước đây đã công bố rGEL được biểu hiện từ E coli BL21 (DE3) cho hoạt

tính gelatinase đạt 38,14 U/mg và thể hiện khả năng ứng dụng hiệu quả trong thủy phân

Gelatinase là một trong những enzym quan trọng thuộc metalloproteases và chúng được sử dụng rộng rãi không chỉ trong hóa học, y

tế và các ngành công nghiệp mà còn trong thực phẩm và khoa học sinh học cơ bản Cụ thể, trong lĩnh vực nghiên cứu về sinh hóa và chẩn đoán ung thư: các enzym của họ metalloproteinase này có khả năng làm giảm hầu hết các thành phần ngoại bào và đó là chất trung gian quan trọng trong việc tái tạo mô sinh

lý và trong quá trình bị bệnh lý chẩn đoán ung thư Còn trong công nghiệp thực phẩm, gelatinase được ứng dụng để thủy phân da bò, da cá thành các axít amin

Theo Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn, cả nước có diện tích trên 6.078 ha nuôi cá Tra đạt sản lượng xuất khẩu hơn 1,11 triệu tấn/năm và

có tổng giá trị xuất khẩu cá tra của Việt Nam đạt 1,78 tỷ USD năm 2017 Sản phẩm xuất khẩu chủ yếu là cá phi-lê dạng miếng, nhưng theo ước tính cứ 2 ÷ 2,5 kg cá nguyên liệu sẽ chế biến được 1 kg cá phi-lê, phụ thuộc vào kỹ thuật chế biến và tùy sản phẩm cụ thể, còn lại 1 ÷ 1,5 kg sẽ nằm trong phần phụ phẩm chế biến, trong đó da cá chiếm từ 4 ÷ 6% trên tổng lượng phụ phẩm Từ

da cá có thể tạo ra những sản phẩm khác có giá trị kinh tế cao hơn và có nhiều ứng dụng hơn trong thực tế, giảm thiểu ô nhiễm môi trường Vì thế, trong những năm gần đây, nhiều công ty cổ phần Việt Nam như Công ty Vĩnh Hoàn, công ty Nam Việt…đã tăng cường đầu tư các công nghệ để tối đa hóa giá trị của các phụ phẩm từ nhà máy chế biến cá Tra như sản xuất dầu, collagen, gelatin, thức ăn cho động vật

Hơn thế, gelatin có thể được thủy phân trong môi trường kiềm hoặc axit Tuy nhiên, các công nghệ sản xuất này yêu cầu thiết bị có tính chịu nhiệt, chịu axit hoặc base, đồng thời có thể gây ô nhiễm môi trường Hơn nữa, việc sử dụng các dung dịch base hoặc axit để thủy phân gelatin sẽ rất dễ gây hiện tượng làm chuyển dạng đồng phân của các axít amin, đây là nguyên nhân

làm mất hoạt tính của axít amin Vì vậy, công nghệ enzym được lựa chọn như giải pháp an toàn

Mặt khác, hiện nay nghề nuôi cá biển đang phát triển mạnh ở nước ta, nguồn thức ăn của cá biển rất cần bổ sung các axít amin thiết yếu vào bằng thức ăn bởi bản thân cá biển không tự tổng hợp được

Xuất phát từ cơ sở thực tiễn như trên, chúng tôi đã tiến hành đề tài

“Nghiên cứu tạo gelatinase tái tổ hợp và ứng dụng trong thủy phân gelatin da

cá Tra”

2 Mục tiêu của luận án

Tạo được chủng Escherichia coli tái tổ hợp sinh tổng hợp gelatinase có nguồn gốc từ Enterococcus faecalis và ứng dụng gelatinase tái tổ hợp thủy

phân gelatin da cá Tra thành chế phẩm axít amin bổ sung vào thức ăn cho cá

Mú chấm đen giai đoạn ương giống có hiệu quả

3 Nội dung của luận án

- Sàng lọc nguồn gen gelE mã hóa GEL từ vi khuẩn phân lập tại Việt Nam

- Tạo chủng E coli tái tổ hợp sinh gelatinase và nghiên cứu điều kiện

lên men biểu hiện rGEL

- Lựa chọn điều kiện thu hồi sản phẩm rGEL kỹ thuật và nghiên cứu đặc tính của rGEL

- Ứng dụng rGEL trong thủy phân gelatin da cá Tra

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

Ý nghĩa khoa học

Kết quả của luận án góp phần cung cấp thêm dữ liệu về nguồn gen các

chủng vi sinh vật tổng hợp gelatinase tự nhiên Từ đó tạo chủng E coli tái tổ

hợp sinh tổng hợp gelatinase hiệu quả và ứng dụng gelatinase trong thủy phân

da cá Tra tạo nguồn axít amin bổ sung vào thức ăn nuôi cá Mú giống

Ý nghĩa thực tiễn

Đưa ra khảo sát ứng dụng gelatinase tái tổ hợp để thủy phân da cá Tra thành bột axít amin và ứng dụng bổ sung vào thức ăn ương nuôi cá Mú chấm đen nhằm nâng cao hiệu quả

5 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

5.1 Đối tượng nghiên cứu

- Chủng vi khuẩn MD4 sinh gelatinase tại Bộ sưu tập vi sinh vật của Khoa Công nghệ sinh học – Viện Đại học Mở Hà Nội; Các chủng E coli

BL21(DE3), XL1-blue, nhận từ phòng thí nghiệm Genomics, Khoa Vi sinh vật học, Trường đại học quốc gia Kyungpook, Hàn Quốc.- Da cá Tra được thu tại công ty

cổ phần Vĩnh Nguyên, Khu công nghiệp Trà Nóc, Thành phố Cần Thơ Mẫu sau khi thu gom được bảo quản trong tủ đông ở nhiệt độ -20 ± 2°C cho đến khi xử lý và phân tích

Cá Mú chấm đen ( Epinephelus malabaricus ): khỏe mạnh, đồng đều kích

cỡ 7 cm/con, khối lượng cá trung bình 7,067 g/con được thu mua từ Trại ương

cá Nghi Hợp – Nghi Lộc – Nghệ An

5.2 Phạm vi nghiên cứu

- Nghiên cứu tạo gelatinase tái tổ hợp, ứng dụng thủy phân gelatin da

cá tra với quy mô phòng thí nghiệm, triển khai tại phòng thí nghiệm công nghệ sinh học – Viện Đại học Mở HN

- Nghiên cứu ứng dụng bổ sung chế phẩm axit amin triển khai ở phạm

vi mô hình thử nghiệm, được triển khai tại Trại Thực Nghiệm nuôi Hải sản – Trường Đại học Vinh

5.3 Thời gian nghiên cứu

Nghiên cứu được tiến hành từ năm 2013 đến năm 2017

6 Những đóng góp mới của luận án

- Là luận án đầu tiên phân lập nguồn gen gel mã hóa GEL từ nguồn vi khuẩn Enterococcus faecalis phân lập tại Việt Nam

- Đã tạo được chủng E coli BL21[pET22(b)-gelE] tái tổ hợp sinh

gelatinase

- Ứng dụng hiệu quả rGEL trong thủy phân gelatin da cá Tra tạo chế

phẩm axít amin bổ sung vào thức ăn cho cá Mú chấm đen giai đoạn giống

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 GELATIN

1.1.1 Cấu trúc và tính chất gelatin

Gelatin là hỗn hợp không đồng nhất các protein hòa tan trong nước có trọng lượng phân tử cao (Budavari, 1996) Theo Karim và cộng sự (2009) gelatin là một polymer sinh học có nguồn gốc từ collagen, là thành phần chủ yếu của da, xương và mô liên kết động vật Với trọng lượng khô cơ bản, gelatin bao gồm từ 98 đến 99% protein Trọng lượng phân tử của gelatin lớn, dao động từ 20.000 đến 300.000 Dalton (Keenan và cộng sự, 1994; Boran và cộng sự, 2010)

Trong các dung dịch nước, gelatin là hỗn hợp các chuỗi polypeptit khác biệt bao gồm các thành phần α, x (dimers của α-chain) và γ (trimers α-chain)

có khối lượng khoảng 90, 180 và 300 x 103 g/mol tương ứng (Rbii và cộng sự, 2011) Giống như collagen, gelatin có cấu trúc dạng chuỗi gồm những phân tử

có kích thước nhỏ liên kết với nhau bằng liên kết hydro tạo thành mạng lưới Trong đó, mỗi phân tử gelatin là các chuỗi axít amin được liên kết bằng liên kết peptit Trình tự axít amin của gelatin chủ yếu là Gly-Pro-Hyp (Poppe, 1997) Hàm lượng axít amin của gelatin tương đối cao: glycine (Gly) 26-34%; Proline (Pro) 10-18%; và hydroxy proline (Hyp) 7-15% (Veis, 1964, Poppe, 1997) Các axít amin quan trọng khác bao gồm: Alanin (Ala) 8-11%; Arginine (Arg) 8-9%; axít aspartic (Asp) 6-7%; và glutamic(Glu)10-12% (Hudson, 1994, Poppe, 1997) Gelatin không chứa Tryptophan và chứa ít Isoleucin, Threonin và Methionin (Potter và Hotchkiss, 1998)

Các tính chất quan trọng nhất của gelatin có thể được chia thành ba nhóm: i) đặc tính liên quan đến hoạt động của chất gel, ví dụ: sự hình thành gel, tăng cường kết cấu và tăng cường khả năng phụ thuộc nước, ii) Các tính chất hydrat hóa cơ bản như sưng và tan iii) các tính chất liên quan đến hoạt động bề mặt của chúng, bao gồm nhũ tương, tạo thành bọt, tính ổn định, sự bám dính, sự gắn kết, chức năng keo và khả năng tạo màng

1.1.2 Gelatin có nguồn gốc từ da cá

Gelatin được sản xuất nhiều nhất từ da lợn (46%), da trâu, bò (29,4%), thịt lợn và xương gia súc (23,1%) Gelatin cá chiếm dưới 1,5% tổng sản lượng gelatin trong năm 2007, tỷ lệ này tăng gấp đôi vào năm 2002, cho thấy xu hướng sản xuất gelatin từ các động vật không phải là động vật có vú ngày càng gia tăng Gelatin từ cá loại bỏ nguy cơ lây nhiễm bệnh bò điên và có thể

sử dụng cho các cộng đồng không sử dụng các sản phẩm tư gia súc như lợn,

bò (Gómez-Guillén và cộng sự, 2011; Ahmad & Benjakul, 2011 )

Gelatin có nguồn gốc từ cá có thể được chiết xuất từ da và xương của cá Phụ phẩm và chất thải trong quá trình chế biến thủy sản chiếm đến 75% tổng khối lượng nguyên liệu sản xuất gelatin từ cá (Shahidi, 1995) Khoảng 30% chất thải của da và xương có hàm lượng collagen cao có thể được sử dụng để sản xuất gelatin (Gómez-Guillén và cộng sự, 2002) Việc chiết xuất gelatin từ

da cá có thể cung cấp sản phẩm thay thế phục vụ cộng đồng Hồi giáo và nâng cao giá trị ngành sản xuất cá tuyết (Gudmundsson và Hafsteinsson, 1997;Montero và cộng sự, 1999), cá megrim (Montero và Gómez-Guillén., 2000) và cá rô phi (Grossman và Bergman., 1992; Jamilah và Harvinder., 2002) Năng suất và chất lượng gelatin bị ảnh hưởng không chỉ bởi các loài hoặc mô cá mà còn vào độ pH, nhiệt độ và thời gian trong quá trình tiền xử lý

và chiết xuất (Montero và Gómez-Guillén, 2000)

Da cá là sản phẩm phụ chủ yếu của ngành công nghiệp chế biến cá, gây lãng phí, ô nhiễm môi trường và có thể cung cấp một nguồn gelatin có giá trị (Badii và Howell, 2006) Da cá chứa một lượng lớn collagen Nagai và Suzuki (2000) công bố rằng hàm lượng collagen trong phụ phẩm da cá của cá Vược Nhật Bản, cá chẻ và cá mập lần lượt là 51,4%, 49,8% và 50,1% (khối lượng khô) Năm 2002, Gómez-Guillén và cộng sự đã công bố rằng 30% chất thải của cá ở dạng xương và da có collagen cao

Từ những năm 1960, gelatin đã được sản xuất quy mô công nghiệp sử dụng axit làm tác nhân thủy phân (Norland, 1990) Năm 1992, quy trình sản

xuất gelatin từ cá và đặc tính gelatin thu được đã được mô tả bởi Grossman và Bergman (1992) Kể từ đó, gelatin cá được chiết xuất từ da và xương của nhiều cá nước lạnh khác nhau như cá tuyết,cá hồi và các loài cá nước ấm như

cá ngừ, cá da trơn, cá rô phi, cá Nile, cá mập và cá biển

Gelatin được sản xuất qua ba giai đoạn: tiền xử lý nguyên liệu thô, chiết xuất gelatin và làm sạch kết hợp làm khô Tùy thuộc vào phương pháp mà collagen được xử lý trước, hai loại gelatin có thể được sản xuất Chất gelatin loại A (điểm đẳng điện áp ở pH 6÷9) được sản xuất từ collagen được xử lý bằng axít và gelatin loại B (điểm đẳng điện khoảng pH 5) được sản xuất từ collagen bằng phương pháp xử lý kiềm (Stainsby, 1987) Xử lý axít là thích hợp nhất cho collagen được tìm thấy trong da lợn hoặc cá, xử lý kiềm phù hợp cho các collagen phức tạp hơn được tìm thấy trong da bò

Gelatin từ da cá đã được chiết xuất bằng một số cách khác nhau Thông thường, da cá được xử lý trong điều kiện axit yếu trước khi chuyển qua công đoạn tạo gelatin Gómez-Guillén và Montero (2001) đã công bố quy trình sản xuất gelatin từ da cá bao gồm các công đoạn: tiền xử lý colagen trong dung dịch axit yếu, tiếp đó trích xuất trong nước ở nhiệt độ vừa phải (45oC) và xử

lý nhiệt ở nhiệt độ trên 40oC, toàn bộ quá trình mất khoảng 24 giờ Theo Yang

và cộng sự (2007) gelatin được tạo thành từ cá da trơn bằng cách tiền xử lý da bằng dung dịch kiềm NaOH, tiếp theo là dung dịch axít acetic, sau đó 30g da được rửa sạch, xử lý với NaOH theo tỷ lệ 1: 6 ( w/v) cho thời gian biến đổi

và rửa bằng nước máy lặp lại hai lần trước khi mẫu được xử lý bằng axit acetic (1: 6 w/v) Loại bỏ nước và rửa mẫu bằng nước máy theo tỉ lệ (1: 6 w/v), bước này lặp lại ba lần Sau các bước xử lý trên, bổ sung nước không chứa ion vào mẫu và bảo quản ở 4°C

Năm 2008, quy trình tách chiết da cá da trơn được hai nhóm nghiên cứu cùng đưa ra Theo quy trình đó, da cá da trơn được ngâm trong dung dịch 50-mmol /L axít acetic theo tỉ lệ 1:8 v/w ở 15oC trong 18 giờ Da được tiếp tục

xử lý rửa bằng nước cất cho đến khi độ pH đạt 3,5÷4,0 Quá trình tách chiết

có sự tham gia của pepsin Sự tách chiết gelatin được thực hiện trong nước cất

ở 45oC trong 7 giờ (Nalinanon và cộng sự, 2008; Liu và cộng sự, 2008) Theo Sanaei Ardekani và cộng sự (2013) đã công bố điều kiện tối ưu cho chiết xuất gelatin từ da cá da trơn thu được bằng cách sử dụng 0,13 mol/L NaOH và 0,09 mol/L axit axetic xử lý trong thời gian 1 giờ và tiếp theo là chiết xuất nước nóng ở 64,92°C trong 3 giờ Và nhóm nghiên cứu này cũng công bố rằng gelatin da cá da trơn khi được thủy phân với 6 mol/L HCl ở 110ºC trong 16 giờ Sau đó, dịch thủy phân được hòa tan trong nước khử ion

và được lọc Thành phần axit amin đã được xác định bằng sắc ký lỏng hiệu suất cao (HPLC) Kết quả thành phần axit amin của gelatin da cá da trơn

(Clarias gariepinus) được trình bày ở bảng 1.1

Bảng 1.1 Thành phần axit amin của gelatin từ da cá da trơn (Clarias

gariepinus) (Sanaei Ardekani và cộng sự, 2013)

Theo Kim và cộng sự (2000), khi thủy phân protein cá với các enzym thích hợp như alcalase, pronase, collagenase, pepsin, papain, protamex, bromelain, chymotrypsin và trypsin thu được các peptit hoạt tính sinh học và các axít amin Ưu điểm chính của enzym thủy phân protein là nó cho phép định lượng aspargine và glutamine và các thành phần có số lượng ít, thường

bị phá hủy khi thủy phân protein bằng axít và kiềm Theo Wachirattanapongmettee và cộng sự (2009) protein cá da trơn sẽ bị thủy phân hoàn toàn tạo thành các axit amin khi được trộn với với nước cất theo tỉ lệ 1: 1,5 (w / v) và bổ sung enzym protex 0,5; 1,5 hoặc 3% v/w trong thời gian 60,

120 và 180 phút Năm 2011, Alemán và cộng sự đã thử nghiệm thủy phân gelatin từ cá ngừ, cá bơn và mực để sản xuất chất chống oxy hóa Gelatin 2,5% được hòa tan trong dung dịch đệm phosphate (0,01 M; pH 8) và bổ sung alcalase vào với tỷ lệ enzym/cơ chất gelatin là 1:20 và thủy phân ở 50oC trong 3 giờ Gelatin từ mực và cá ngừ được thủy phân bằng enzym trypsin ở

37oC và trong dung dịch nước pH 7,5 và pepsin ở 37oC và trong dung dịch

nước pH 4 Sau khi thủy phân các enzym bị bất hoạt bằng cách gia nhiệt ở

90oC trong 10 phút

Quá trình thuỷ phân collagen bằng Neutrase cho hiệu suất thủy phân cao nhất khi nồng độ cơ chất là 200 g/L, tỷ lệ E/S là 39,45 U/g protein, nhiệt độ thuỷ phân là 50oC, tại pH 7,0 và thuỷ phân trong thời gian là 3 giờ Mức độ thuỷ phân tại điều kiện trên đạt 11,02% Khi thuỷ phân collagen bằng neutrase kết hợp với sóng siêu âm, với thời gian xử lý sóng siêu âm là 6 phút, cường độ sóng siêu âm 150W/ 20ml mẫu, cho hiệu suất thủy phân là 14,92% Sản phẩm thuỷ phân bằng enzym kết hợp sóng siêu âm có phân tử lượng thấp hơn so với khi thuỷ phân bằng enzym Hiệu suất thủy phân neutrase thu được

có phân đoạn 19 ÷ 31 kDa, còn khi kết hợp neutrase và sóng siêu âm thì thu được phân đoạn 8,5 ÷12 kDa và 12 – 18kDa Theo nghiên cứu của Karim và Bhat (2009), Go´mez-Guille´n và cộng sự (2002); Zhou và cộng sự (2006); Sarabia và cộng sự (2000); Eastoe và Leach (1977) đã công bố thành phần axít amin chủ yếu trong gelatin da một số loại cá và bì lợn cho kết quả ở bảng 1.2 cho thấy các loại axít amin chính và hàm lượng của chúng ở da cá tương đương với các thành phần trong gelatin từ da lợn

Bảng 1.2 Các thành phần axít amin chủ yếu trong gelatin da một số loại cá và

bì lợn (thành phần trong 1000g)

Loại axít amin Da cá

tuyết a

Da cá Alaska pollock b

Hake a Megrim a Cá rô

Methione 17 16 15 13 9 4

Ghi chú: a: Gómez-Guillén và cộng sự (2002); b: Zhou và cộng sự (2006);

c: Sarabia và cộng sự (2000); d: Eastoe và Leach (1977)

Nghiên cứu của các tác giả trên cũng chỉ rõ: glycine là axít amin chiếm hàm lượng cao nhất trong thành phần thủy phân gelatin trong da cá là yếu tố tạo nên cầu nối của cấu trúc sợi collagen, vì vậy nó có thể được sử dụng như tác nhân chống lại hiện tượng mất cấu trúc sợi collagen ở các cơ biểu mô Bên cạnh đó, trong cơ thể glycine chuyển hoá thành betanine là chất có tác dụng biến homocystein thành methionine

Tuy nhiên, các công nghệ sản xuất gelatin bằng axit hay kiềm thường yêu cầu thiết bị có tính chịu nhiệt, chịu axit hoặc kiềm, đồng thời có thể gây ô nhiễm môi trường Hơn nữa, việc sử dụng các dung dịch kiềm hoặc axit để thủy phân gelatin sẽ rất dễ gây hiện tượng làm chuyển dạng đồng phân của các axít amin, đây là nguyên nhân làm mất hoạt tính của axít amin và mất khả năng thẩm thấu qua màng tế bào Vì vậy, công nghệ enzym được lựa chọn như giải pháp tối ưu

1.2 GELATINASE

1.2.1 Đặc điểm, chức năng của gelatinase

Gelatinase và collagenase là một trong những enzym có cofactor là ion kim loại quan trọng và được sử dụng rộng rãi trong hóa học, y tế, các ngành công nghiệp, thực phẩm và khoa học sinh học cơ bản (Hisano và cộng sự, 1989) Năm 1994, Makinen và cộng sự đã công bố gelatinase là một protease ngoại bào phụ thuộc kim loại (kẽm) có khả năng thủy phân gelatin và một số chất khác như pheromone, collagen, casein và fibrinogen thành các polypeptit, peptit và các axít amin

Gelatinase được tìm thấy nhiều ở người, động vật và vi khuẩn Ở vi khuẩn, rất nhiều nghiên cứu được tiến hành về gelatinase sinh tổng hợp bởi

chủng Enterococcus faecalis (Bourgogne và cộng sự, 2006; Nakayama và cộng sự, 2006; Del Papa và cộng sự, 2007) Ngoài ra, rất nhiều chủng vi

khuẩn khác như Bacillus spp (Evans và Wardlaw, 1953), B subtilis PE-11 (Qadar và cộng sự, 2009 ), Bacillus halodurans (Ibrahim và Al-Salamah, 2009), B subtilis BS1 (Shaheen và cộng sự, 2008), Proteus

mirabilis, Serratia marcescens, Escherichia coli, Salmonella typhi, Klebsiella oxytoca, Klebsiella pneumoniae, Shigella flexneri và Serratia liquefaciens cũng có khả năng thủy phân gelatin Theo nghiên cứu của

Shanmugasundaram và cộng sự (2012), Bacillus spp tiết ra hai loại

proteinase đóng vai trò quan trọng trong công nghiệp gồm subtilisin hoặc protease kiềm và metalloprotease protease trung tính

Trong số các gelatinase từ vi khuẩn, gelatinase từ chủng E faecalis được nghiên cứu nhiều nhất Gelatinase từ E faecalis thuộc họ

metalloendopeptidases M4, là enzym chịu nhiệt, có thể thủy phân casein, hemoglobin, insulin, fibrinogen, collagen, gelatin và một số các loại protein/peptide (Makinen và cộng sự, 1989) Gelatinase là tác nhân hỗ trợ cho các vi sinh vật gây bệnh trên nhiều cơ thể, bao gồm viêm phúc mạc ở chuột, chứng đau thắt ngực ở thỏ và diệt tuyến trùng Ngoài gelatin, một số các cơ

chất khác như các kích thích trong ruột kết và một số cơ chất trong cơ thể in

vitro như insulin B, endothelin, hemoglobin, fibrinogen, fibronectin, collagen

và laminin là cơ chất của gelatinase Ngoài ra, gelatinase tham gia cùng với hệ miễn dịch bảo vệ cơ thể bằng cách bất hoạt hoạt tính của các peptit kháng khuẩn LL-37 và α-defensin Gần đây, gelatinase đã được chứng minh là có

liên quan đến quá trình xâm nhập của E faecalis trên mô hình in vitro qua các

tế bào tương tự tế bào T84 ở người ( Del Papa và cộng sự, 2007)

Ở người, gelatinase là metalloproteinase (MMP2 và 9) có liên quan đến quá trình phá vỡ mạng lưới ngoại bào trong các quá trình sinh lý bình thường như sự phát triển phôi thai, sinh sản và tái tạo mô Gelatinase có khối lượng phân tử 92kDa (MMP9) được sử dụng để sàng lọc chất ức chế hoạt động của

enzym và trong chẩn đoán bệnh, gelatinase còn được dùng như là yếu tố chỉ thị để chẩn đoán sớm sự di căn của khối u Đối với lĩnh vực sản xuất thực phẩm, gelatinase, collagentinase là những men tiêu hoá protid gân, bạc nhạc

và protid liên kết thành những mạch peptide và axít amin (Makinen và Makenin, 1994)

1.2.2 Phân loại gelatinase

Các công bố đầu tiên về gelatinase từ vi khuẩn xuất hiện 4 thập kỷ trước

Chủng Streptococcus (nay là Enterococcus) faecalis var liquefaciens có khả

năng sản xuất metalloprotease (protease phụ thuộc kim loại) ngoại bào có khả năng thủy phân (hóa lỏng) gelatin, do vậy người ta gọi là streptococcal gelatinase Một số nghiên cứu trước đây gọi enzym này là metalloendopeptidase II và protease từ vi khuẩn Các nghiên cứu trước đây cho thấy enzym này có khả năng thủy phân casein, gelatin, hemoglobin và

sữa đông Enzym này sau đó được phân lập từ chủng E faecalis var

liquefaciens OG1-10 phân lập từ người bệnh, được xếp vào nhóm

endopeptidase phụ thuộc kẽm và được đặt tên cococlysin (EC.3.4.24.30)

Trình tự nucleotide của gen mã hóa gelatinase (gelE) được công bố lần đầu

năm 1991 (Rawlings và Salvesen, 2013)

Gelatinase từ vi khuẩn, điển hình là gelatinase của E faecalis thuộc họ

enzym phụ thuộc kim loại M4, đại diện là enzym thermolysin từ chủng

Bacillus thermoproteolyticus và aureolysin từ Staphylococcus Enzym M4

chứa vùng xúc tác đặc trưng bởi chuỗi trình tự bậc 1 HExxH chịu trách nhiệm liên kết với Zn tại tâm xúc tác và liên kết với 3 hoặc 4 nguyên tử Ca, có tác dụng làm bền cấu trúc và ổn nhiệt (Del Papa và cộng sự, 2007) Gelatinase có khả năng thủy phân casein, hemoglobin, insulin, fibrinogen, collagen, gelatin (Makinen và cộng sự, 1989) Các enzym M4 của vi khuẩn được hình thành dưới dạng tiền enzym không có hoạt tính (preproenzyms) Enzym hoàn thiện được hình thành sau quá trình tự phân hủy (cắt đi một số trình tự ở đầu tận cùng C) để tạo thành dạng hoạt hóa Dạng propeptide vận hành như một

chaperone nội bào kích thích quá trình gấp nếp tạo cấu trúc khơng gian dạng hoạt động của enzym (Del Papa và cộng sự, 2007)

Geltinase từ E faecalis var liquefaciens là một protein chuỗi đơn cĩ

kích thước xấp xỉ 31,5 kDa, pKi 4,6 (Rawlings và Salvesen, 2013) Năm

2007, theo báo cáo của nhĩm nghiên cứu Del Papa thu được gelatinase từ E

faecalis cĩ khối lượng phân tử 33 kDa Trong khi một nghiên cứu của Su và

cộng sự (1991) thu được gelatinase dạng hoạt động từ E faecalis subsp

liquefaciens chứa 318 axít amin và cĩ khối lượng phân tử 34,58 kDa Bên

cạnh đĩ, một số nghiên cứu khác như của nhĩm nghiên cứu Steck và cộng sự

(2011) đã tách metalloprotease gelatinase cĩ khối lượng 31,5 kDa từ E

faecalis OG1RF , nhĩm nghiên cứu của Gữz và cộng sự (2001) thu được

gelatinase từ H pylori trong dạ dày người cĩ khối lượng phân tử xấp xỉ 35

kDa

Gelatinase từ người thuộc nhĩm matrix metalloproteinase (MMPs), là các endopeptidases phụ thuộc kim loại chứa kẽm và canxi (Verma và Hansch, 2007) MMPs thuộc họ metzincin chứa ion kẽm ở vị trí tâm hoạt động Các MMPs là endopeptide ngoại bào, cĩ khả năng thủy phân các protein ngoại bào, ví dụ như collagen, proteoglycan, elastin hoặc fibronectin Trong số các MMP, gelatinase (MMP-2 và MMP-9) là những enzym được khảo sát nhiều nhất Bảng 1.3 trình bày một số enzym trong MMPs

Bảng 1.3 Một số loại enzym thuộc nhĩm MMPs (Zitka và cộng sự, 2010)

MMP Metalloproteinase

Khối lượng (kDa)

Lselectin;

IL-1proteoglycanes; entactin; ovostatin; MMP-2; MMP-9

laminin-1; MMP-1; MMP-9; MMP-13

Gelatinase type IV

MMP-2

66 Collagenase

MMP-9 Gelatinase B 92 EC3.4.24.35

Collagens (IV,V,VII,X và XIV); gelatin; entactin; aggrecan; elastin;

fibronectin; osteonectin; plasminogen; MBP; IL-1b

osteonectin; MMP-9 MMP-

18 Collagenase-4

Collagens (I,II,III,VIII a X); gelatin; aggrecan,

Gelatinase từ người gồm có 2 loại, Gelatinase A (EC 3.4.24.24) hay còn gọi là matrix metalloproteinase 2 (MMP2) và Gelatinase B (EC 3.4.24.35) hay là matrix metalloproteinase 9 (MMP9) Cả MMP2 và MMP9 đều có khả năng phân hủy gelatin và một loạt các phân tử của tế bào khác bao gồm colagen loại IV, V và XI, laminin, aggrecan, vv… Chỉ riêng MMP2 có thể thủy phân collagen loại I, II và III như colagenase (Nagase và cộng sự, 2006) Gelatinase A có kích thước 72 kDa, xúc tác phản ứng thủy phân gelatin loại I

và colagen loại IV, V Enzym này cũng có khả năng cắt chuỗi axít amin gần giống colagen có trình tự axít amin như Pro-Gln-Gly-Ile-Ala-Gly-Gln (Murphy và cộng sự, 1985) Gelatinase B có khối lượng phân tử 92 kDa, có chức năng tương tự gelatinase A nhưng có vùng chức năng rộng hơn Vùng chức năng này có khả năng liên kết với gelatin, laminin, colagen loại I và colagenase IV không có vùng liên kết này (Van den Steen và cộng sự, 2002)

1.2.3 Cấu trúc và cơ chế hoạt động của gelatinase

Đại diện của họ enzym này là thermolysin (EC 3.4.24.27), protease phụ thuộc kim loại có khối lượng phân tử xấp xỉ 34,6 kDa được tiết ra bởi vi

khuẩn B thermoproteolyticus Trình tự axít amin và cấu trúc không gian của

thermolysin lần đầu tiên được công bố vào năm 1972 Từ đó, thermolysin và các protease có cấu trúc tương tự thermolysin được sử dụng như mô hình để

nghiên cứu về các enzym protease phụ thuộc kẽm Các enzym M4 có chứa

ion kẽm liên kết với 3 axít amin và 1 phân tử nước (Holmes và Matthews, 1982) Các nhà nghiên cứu cũng chỉ ra rằng enzym phụ thuộc kẽm từ vi khuẩn có vùng xúc tác có cấu trúc tương tự với các enzym phụ thuộc kim loại nội bào khác như các MMPs (Roques, 1993; Adekoya và Syltle, 2009) Các enzym metalloproteases này chứa chuỗi trình tự bảo thủ HExxH, trong đó 2 gốc histidine đóng vai trò là phối tử thứ nhất và thứ 2 của nguyên tử Zn Dựa vào phối tử thứ 3, phân nhóm M4 ra các nhóm nhỏ hơn, đó là thermolysin, serrlysin và neurotoxin Các enzym thuộc nhóm thermolysin được tổng hợp dưới dạng tiền chất không có hoạt tính với đầu N propeptide và enzym thành thục được hình thành sau 1 vài bước chế biến khác (Gao và cộng sự, 2010) Propeptit trong nhóm M4 và 1 vài serine protease được coi như 1 chaperone nội bào giúp kiến tạo vùng xúc tác nhưng không tham gia vào quá trình xúc tác (Gao và cộng sự, 2010)

Trình tự cDNA chỉ ra gelatinase chứa chuỗi trình tự tín hiệu tại đầu tận cùng N và chuỗi propeptit tại đầu tận cùng C Bằng kĩ thuật đọc trình tự đầu tận cùng N và gây đột biến điểm tại vị trí cắt đầu tận cùng N, xác định vị trí cắt tại đầu tận cùng N là His191 (His 191↓Val – Gly – Ser- Glu – Val ) và

Asp 495 tại đầu tận cùng C (Asp 495↓ Ile – Gln) (thứ tự được đánh dấu theo trình tự đầy đủ) Gelatinase được coi là peptidase duy nhất trong họ M4 có chuỗi propeptit tại đầu tận cùng C Có giả thuyết rằng sprE peptidase, serine proteinase được đồng biểu hiện với gelatinase có thể cũng chứa chuỗi propeptide tại đầu tận cùng C Phối tử dự đoán của nguyên tử kẽm là His 237, His 331 và Glu 351 Glu 328 được dự đoán là gốc xúc tác Gelatinase từ vi khuẩn có tính kị nước mạnh với tỉ lệ các axít amin kị nước chiếm ít nhất 43% toàn bộ phân tử (Rawlings và Salvesen, 2013)

Hình 1.1 Cấu trúc điển hình của gelatinase A, B

có nguồn gốc từ người (Opdenakker và cộng sự, 2001)

Gelatinase là những protein có cấu trúc tương đồng nhau, có thể chia thành 6 nhóm chính: collagenases, stromelysins, matrilysins, gelatinases, MT-MMPs (Membrane-type MMPs) và MMPs không có nhóm chỉ định Dựa vào nghiên cứu tinh thể học và cộng hưởng từ có thể xác định được cấu trúc của nhiều MMPs MMPs là các endopeptidases phụ thuộc kẽm và canxi, được đặc trưng bởi phân tử Zn+2 nằm ở vị trí hoạt động được liên kết với ba gốc Histidne Các enzym này được tổng hợp dưới dạng proenzym và được tiết ra

ngoài tế bào nhưng ở dạng bất hoạt (trừ MT-MMPs) (Nagase và cộng sự, 1999; Susanna và cộng sự, 2006)

Hầu hết MMP bao gồm 3 phần chức năng chính (1)- vùng peptit bất hoạt, (2) vùng xúc tác liên kết với một peptit với chiều dài thay đổi (hay còn gọi là vùng bản lề) và (3) là vùng hemopexin- like (Hpx) (Nagase và cộng sự, 2006)

Hình 1.2 Cấu trúc của các enzym gelatinase (Visse & Nagase 2003)

Vùng peptit nhận diện nằm ở đầu gần vùng peptit bất hoạt, là đoạn peptit chứa khoảng 17÷ 20 axít amin, có vai trò trong đáp ứng tín hiệu tiết Vùng peptit nhận diện có ở tất cả các MMPs trừ MMP-17 (Nagase và cộng

sự, 1999) Vùng peptit bất hoạt gồm khoảng 80 axít amin, chức năng của vùng này tạo ra các zymogen, vùng peptit bất hoạt khi bị phân cắt sẽ kích hoạt proMMP (Nagase và cộng sự, 1999) Vùng hoạt động (active site) gồm khoảng 170 axít amin, với 2 ion kẽm (Zn2+) và 2 hoặc 3 ion canxi (Ca2+) trong trung tâm hoạt động Ion Zn2+ đầu tiên nằm ở vị trí hoạt động tham gia trực tiếp vào quá trình xúc tác Ion Zn2+ thứ hai (kẽm cấu trúc) và ion Ca2+ cách ion (Zn2+) xúc tác một khoảng 12 nm Chức năng của các ion Ca2+ là ổn định cấu trúc của vùng xúc tác (Nagase và cộng sự, 1999; Maria và cộng sự, 2007)

Vùng hemopexin-like (hay còn được gọi là vùng C-terminal) có cấu trúc tương tự với protein họ hemopexin, gồm khoảng 200 axít amin Vùng

này có diện tích bề mặt tương đối lớn cho các tương tác giữa protein với protein (Nagase và cộng sự, 1999) Cấu trúc β-propelle trong đầu tận cùng C

có vị trí nhận diện cơ chất/ chất ức chế TIMP (Nagase và cộng sự, 2006) Giống như các enzym khác trong họ MMPs, MMP-2, MMP-9 đều được tiết ra dưới dạng tiền enzym (proenzym) Vùng propeptit chứa một chuỗi cysteine bảo thủ có khả năng liên kết với Zn thông qua nhóm thiol của nó qua

cơ chế “công tắc cystein” (cysteine – switch) để duy trì cơ chế độ trễ enzym Trong quá trình xúc tác, chuỗi propeptit được dời đi và 1 phân tử nước sẽ thay thế vào vị trí của nhóm thiol như 1 phối tử cho tâm xúc tác Zn Vùng tâm xúc tác là 1 vùng có trật tự bảo thủ với chuỗi peptit không đổi có trật tự HexxH nằm ở vị trí liên kết với phân tử Zn trong một số proteinase chứa Zn Cả 2 enzym MMP-2 và MMP-9 chứa vùng liên kết với gelatin/collagen duy nhất (CBD), gọi là fibronectin type II, được chèn vào miền xúc tác, bao gồm 3 mô-đun có cấu trúc fibronectin chứa 58 axít amin (Susanna và cộng sự, 2006) Ngoài ra, giữa vùng hemopexin-like và vùng xúc tác có vùng bản lề ( hinge region) (vùng O-glycosyl): là vùng giống collagen type V, đặc trưng bởi 64 axít amin liên kết với 22 gốc proline, 6 gốc glycine và từ 12÷14 liên kết Oglycosidic Vùng này có chức năng định hướng cho hoạt động của vùng hemopexin-like, rất quan trọng trong tương tác với protein ngoại sinh (các cơ chất của MMP9) và tham gia vào nhiều quá trình như: kiểm soát cơ chất đặc hiệu cũng như quá trình xâm nhập của MMP9, quá trình tương tác với TIMP

và định vị trên bề mặt tế bào Vùng này tạo điều kiện cho hoạt động của MMP-9 với các đại phân tử, tháo dỡ và phân tách collagen bằng các enzym khác, cho phép MMP-9 là chất phân hủy trung gian (Van den Steen và cộng

sự, 2006; Farina và Mackay, 2014) Nếu loại bỏ vùng này sẽ giảm độ đặc hiệu của MMP-9 với các đại phân tử cơ chất bao gồm cả gelatin (Vandooren và cộng sự, 2013)

1.2.4 Tính chất của gelatinase

1.2.4.1 Cơ chất đặc hiệu và động học xúc tác của gelatinase

Gelatinase từ vi khuẩn cắt chuỗi peptit chứa ít nhất 6 gốc axít amin (chuỗi 5 axít amin pentapeptit Leu – enkephalin bị thủy phân rất chậm) Các enzym phụ thuộc kim loại, trong đó có gelatinase có thể thủy phân các cơ chất

kị nước không tan Gelatinase thủy phân đặc biệt hiệu quả với cơ chất azocoll

và gelatin Collagen không tan và tan một phần cũng bị thủy phân bởi gelatinase nhưng với tốc độ rất chậm Insulin B bị thủy phân ở liên kết giữa Phe24 và Phe 25, tiếp đó là đến liên kết giữa His 5 và Leu 6 và một vài liên

kết khác: FVNQH↓ LCGSH↓LVEA ↓LYLVCGERGF ↓F ↓YTPKA

(Rawlings và Salvesen, 2013)

Gelatinase từ vi khuẩn thủy phân tốt nhất các cơ chất chứa liên kết giữa gốc kị nước, đặc biệt khi các axít amin ở vị trí P1’ là Leu, Phe, Ile và Ala Các

cơ chất điển hình là các peptit pheronome của E faecalis, bradykinin

(Arg-Pro-Pro- Gly↓Phe – Ser – Pro ↓Phe – Arg), cơ chất P (Arg – Pro – Lys – Pro – Gln – Gln ↓Phe↓Phe – Gly↓Leu – Met), endothelin 1 từ người (ưu tiên cắt tại liên kết Ser↓Leu, sau đó là liên kết His↓Leu), angiotensin I (Asp-Arg-Val-Tyr↓Ile-His-Pro↓Phe-His-Leu) Angiotensin II chỉ bị cắt tại liên kết Tyr↓Ile E-cadherin từ chuột bị gelatibase cắt tại các axít amin Ile, Leu, Pro và Val nằm tại vị trị P1’ Gelatinase cũng có khả năng thủy phân chuỗi alpha của C3

từ người giải phóng ra protein tương tự C3b Gelatinase còn thủy phân chất kháng sinh cecropin dạng peptit tách từ bướm đêm Gelatinase vi khuẩn không có khả năng thủy phân các chuỗi peptit tổng hợp có trình tự ngắn Hai

cơ chất của collagenase như Pz –Pro- Leu – Gly – Pro – D – Arg và 2 FA – Leu – Gly – Pro – Ala không bị thủy phân bởi gelatinase Nhìn chung, tính đặc hiệu của gelatinase từ vi khuẩn tương tự thermolysin (EC 3.4.24.4) từ

Bacillus stearothermophilus (Rawlings và Salvesen, 2013)

Nhìn chung, trung tâm hoạt động và liên kết đặc hiệu của các MMPs khá giống nhau Tuy nhiên, một số nghiên cứu đã xác định được trình tự vị trí cắt đối với protein cơ chất của gelatinase A và gelatinase B Cả hai gelatinase có

độ tương đồng cấu trúc cao và quá trình phân hủy các cơ chất cao phân tử là

như nhau (Xia và cộng sự, 1996; Sternlicht và Werb, 2001) Chúng ưu tiên phân hủy các cơ chất peptit chứa tối thiểu chuỗi 6 axít amin (Gly-X-Y-Gly-X-Y) và phân hủy các phân tử không tích điện mạnh hơn các phân tử tích điện (Xia và cộng sự, 1996)

Gelatinase A cắt liên kết giữa glycine và axít amin kỵ nước Trong trình

tự thực tế xung quanh vị trí phân cắt, hydroxyproline luôn ở vị trí P'5 và hầu như không đổi tại P5 Gelatinase A phân cắt một số liên kết peptit như Gly-Var, Gly -Leu, Gly-Asn và Gly-Ser trong phân tử collagen biến tính tạo ra các peptit khối lượng phân tử nhỏ Phân tích động học phản ứng của gelatinase B

sử dụng cơ chất do decylpeptide (AcGluHypGlyProAlaGly ValArgGlyGlu HypGlyNH) và các peptit collagen khác cho thấy có sự biến động lớn về giá

trị Km và Vmax (Xia và cộng sự, 1996) Thêm vào đó, gelatinase B ít hiệu quả

hơn nhiều so với gelatinase A và mức độ phân hủy của gelatin khác nhau với

2 loại enzym Người ta xác định được 3 loại cơ chất chủ yếu của gelatinase B Nhóm lớn nhất chứa chuỗi Pro – X – X – Hy – (Ser/Thr) (Trong đó X là gốc axít amin bất kỳ, Hy là gốc kỵ nước), thường được tìm thấy trong các cơ chất giống collagen Nhóm cơ chất thứ hai chứa liên kết Gly-Leu- (Lys / Arg) trong phân tử Các thành viên của nhóm cơ chất thứ ba là chúng có chứa duy nhất axít amin Arg Cả hai loại gelatinase có khả năng phân hủy tất cả các loại colagen sau khi chúng được phân cắt qua bởi collagenase (Nagase và Woessner, 1999) Gelatinase A có thể thủy phân colagen loại I tạo ra các đoạn đầu N và ¼ C (Aimes và Qiugley, 1995) Các cơ chất tiềm năng khác bao gồm laminin -5, amyloid và vitronectin (Hu và cộng sự, 2007)

Tính đặc hiệu cơ chất của gelatinase B tương tự như gelatinase A, mặc

dù nó không làm phân cắt collagens loại I-III như gelatinase A Gelatinase B được xem như là collagenase loại IV vì khả năng phân cắt collagen IV thành đoạn rời rạc Gelatinase B không chỉ cắt collagens, nó cũng có thể thủy phân aggrecan, một proteoglycan sụn Gelatinase B cũng thể hiện hoạt tính elastase phân cắt được fibronectin Gelatinase B cũng có thể cắt aggrecan, myelin cơ

bản, protein gắn galactoside (CBP20, CBP 35), amyloid β-peptide, chất ức chế α1-protease, α1-antitrypsin và α1-antichymotrypsin (Van den Steen và cộng sự, 2000) Gelatinase A phân hủy một vài thành phần của ma trận ngoại bào (extracellular matrix – ECM), các yếu tố tăng trưởng và cả pro-MMP-1, pro-MMP-2 và pro-MMP-13 (McCawley và Matrisian., 2001) công bố rằng gelatinase A có khả năng cắt troponin I trong quá trình chấn thương cơ tim và góp phần làm giảm sự co bóp cơ Hơn nữa, gelatinase trong tế bào trong tế bào tim có thể phân hủy chuỗi troponin I myosin mạch ngắn và poly (ADP-ribose) polymerase (PARP), thành phần gây rối loạn chức năng tim Gelatinase B có thể cắt nhiều thành phần không thuộc ma trận ngoại bào, bao gồm pro-TGF-β2, plasminogen và pro-TNF-α (McCawley và Matrisian, 2001)

1.2.4.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ, pH đến hoạt tính của enzym

* Ảnh hưởng của pH

Nói chung, gelatinase hoạt động trong vùng pH kiềm, dao động từ pH 5,5÷9 và tối ưu trong khoảng pH kiềm nhẹ (pH7÷8,5) (Shanmugasundaram và cộng sự, 2012; https://www.brenda-enzyms.org/enzym.php?ecno=3.4.24.24;

https://www.brenda-enzymees.org/enzyme.php?ecno=3.4.24.35; Manjula và

cộng sự., 2014) Theo Stack và Gray (1990), khoảng pH thích hợp cho hoạt

động của gelatinase là khoảng từ 5 ÷ 10 Một số nghiên cứu trước đây đã tinh chế và xác định được tính chất của nhiều protease serin collagenase ở hệ tiêu hoá của nhiều loài cá và thuỷ sản khác nhau như tôm càng (Baranowski và cộng sự, 1984), tôm đất, cá tuyết Atlantic Các enzym này thể hiện hoạt tính cao nhất ở khoảng pH 6,5 ÷ 8,0 và hầu như mất hoạt tính ở pH nhỏ hơn 6,0 (Haard và Simpson, 1994)

Gelatinase A và gelatinase B có pH tối ưu khác nhau khi sử dụng cơ chất gelatine, gelatinase A hoạt động tốt nhất ở pH 7,1 (Monaco và cộng sự, 2007) trong khi gelatinase B ở pH 8,3 (Dragutinovic và cộng sự, 2007) Gelatinase

từ chủng E faecalis hoạt động tối ưu pH 8 (Patrícia và cộng sự, 2010)

Gelatinase từ chủng B subtilis hoạt động tối ưu ở pH 7,5 đạt hoạt tính 2,5

U/ml (Shanmugasundaram và cộng sự, 2012) Trong công trình của mình, Manjula và cộng sự (2014) đã công bố gelatinase hoạt động tối ưu ở pH 8 (hoạt tính gelatinase đạt 68,8 U/mL) Ở pH 9,0 hoạt tính giảm còn một nửa so với ở pH 8,0 Ở pH trung tính 7,0 và ở pH kiềm hoạt tính enzym giảm mạnh (14 U/mL ở pH 10 và 6 U/ml ở pH 11) Theo Mei – Shiuan Yu và cộng sự

(1999) collagenase từ Vibrio parahaemolyticus biểu hiện trong E coli tối ưu

ở pH 7,5

Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzym còn phụ thuộc vào sự có mặt của ion Ca2+ có mặt trong dịch đệm Khi tăng pH phản ứng từ 7,4 ÷ 9,8, hoạt tính thủy phân của enzym giảm khoảng 35% khi có 1 mM Ca2+ Tuy nhiên, khoảng 95% hoạt tính mất đi khi không có Ca2+ (Bu và cộng sự, 1995)

* Nhiệt độ

Khoảng nhiệt độ hoạt động của gelatinase dao động phụ thuộc vào nguồn gốc gelatnase Gelatinase A hoạt động tốt nhất trong khoảng 22÷40oC Gelatinase B từ người và động vật có xương sống hoạt động tối ưu trong khoảng nhiệt độ 25÷37oC (http://www.brenda-enzymes.org /enzyme.php? ecno=3.4.24.35)

Năm 2012, nhóm tác giả Shanmugasundaram đã công bố gelatinase từ

chủng B subtilis, xúc tác trong khoảng nhiệt độ 20 ÷ 50oC, tối ưu ở 35oC với hoạt tính 2,55 U/ml Theo Manjula và cộng sự (2014) cũng khảo sát hoạt tính gelatinase ở các nhiệt độ khác nhau trong khoảng từ 20°C đến 80°C và độ bền enzym sau 30 phút, 1 giờ, 2; 4; 6; 8; 10; 12 và 24 giờ Kết quả cho thấy enzym này hoạt động ổn định (giữ được 99% hoạt tính) ở 40°C sau 4 giờ

Alderton và cộng sự (2004 ), sự dư thừa CaCl2, MgCl2 và ZnCl2 và có mặt đủ của EDTA làm giảm hoạt tính, thậm chí ức chế hoạt động của gelatinase Gelatinase cũng bị ức chế bởi chất ức chế từ côn trùng IMPI được tách từ hệ

miễn dịch của bướm đêm (Galleria mellonella) (Clermont và cộng sự, 2004) Metallo-protease từ Bacillus bị ức chế bởi EDTA, DTT và B-

mercaptoethanol EDTA và DTT ở nồng độ 10 mM ức chế lần lượt 95% và 90% hoạt tính enzym trong khi ở nồng độ 5 mM 75 và 51% hoạt tính enzym

bị mất đi B-Mercaptomethanol ở nồng độ 10 mM và 5 mM làm giảm lần lượt 80% và 48% hoạt tính của enzym (Saxena và Singh, 2011)

Chất ức chế MMP tự nhiên (MMPI) là TIMP, α2-M và ovostatins Ở người α2-M là một glycoprotein huyết tương có khối lượng phân tử 725 kDa bao gồm bốn tiểu đơn vị giống nhau có trọng lượng 180 kDa Nó ức chế hầu hết proteinase bằng cách nhốt chúng trong lồng, sau đó giải phóng phức hợp α2-M-proteinase LRP (protein liên quan đến tiếp nhận lioprotein mật độ thấp) TIMP được chia làm 4 loại: ký hiệu từ TIMP -1 đến TIMP -4, có trình

tự protein tương đồng tới 40% và chứa chuỗi bảo thủ gồm 12 cysteines Chúng bao gồm 184 ÷ 194 axít amin và được xắp xếp tại đầu N và một đầu C Đầu N được cấu tạo như một đơn vị độc lập với có khả năng ức chế MMP Mỗi một chất trong bốn loại TIMP phản ứng MMP theo tỷ lệ 1:1 (Brew và cộng sự, 2000)

TIMP đầu tiên được mô tả vào năm 1975 như là một protein, trong môi trường nuôi cấy của nguyên bào sợi người và trong huyết thanh của con người, có thể ức chế hoạt động của collagenase (Woolley và cộng sự, 1975) Gen mã hóa TIMP-1 – TIMP4 được tìm thấy trong nhiễm sắc thể Xp11.3- Xp11.23, 17q25, 22q12.1-q13.2 và 3p25 Kích thước của mRNA phiên mã của TIMP01 là 0,9 kb Hai đoạn phiên mã mRNA của TIMP-2 có kích thước 2,4 và 2,6 kb cũng đã được tìm thấy trong khi của TIMP-4 là 1,4 kb (Gómez

và cộng sự, 2001) Cấu trúc protein bậc 1 của TIMPs gồm 6 cặp cystein mà mỗi cặp này được liên kết với nhau để tạo ra 6 cầu disulfide Cấu trúc bậc 4

của TIMP-1 và TIMP-2 được nghiên cứu bằng tai X-ray và phổ NMR (Williamson và cộng sự, 1994; Gomis- Ruth và cộng sự, 1997) Ở đầu N của các phân tử TIMP, 4 gốc Cys1- Thr – Cys – Val4 và gốc Glu67-Ser- Val – Cys70 (của TIMP-1) được nối với nhau bằng 1 liên kết disulfide và nó sẽ chèn vào vị trí hoạt động của phân tử MMPs

TIMP-1 protein là 1 glycoprotein có khối lượng phân tử khoảng 28,5 kDa, chứa 2 vị trí N- glycosyl hóa TIMP-1 protein được tìm thấy trong ngà

và cao răng TIMP-3 tâm hoạt động của MMP-3 bị khóa bởi 2 cầu disulfide TIMP-1 Cys 1- Val4 và Ser 68- Val 69 (Cys 70) tạo với S1-S3’ và S2-S3 TIMP-2 là 1 protein không bị glycosyl hóa chứa 194 axít amin có khối lượng phân từ 21 kDa Cấu trúc đầu N của TIMP-2 qua phân tích phổ NMR cho thấy phân tử này chứ 5 β-sheet không song song tạo ra 1 xoắn β và 2 chuỗi xoắn ngắn α Trình tự polypeptit của TIMP-2 có độ tương đồng với trình tự TIMP-1 và TIMP-2 là 37 và 42%

TIMP-3 chứa 188 axít amin và có vị trí bảo thủ bị glycosyl hóa gần đầu

C TIMP-3 tái tổ hợp từ người gồm 2 loại: một loại có kích thước 27-kDa bị glycosyl hóa và một loại kích thước 24 –kDa không bị glycosyl hóa

TIMP-4 chứa 195 axít amin và có khối lượng phân tử 22 kDa TIMP-4

có trình tự polypeptit trùng khớp 37% với trình tự của TIMP-1 và 51% với TIMP-2 và TIMP-3 TIMP-4 là protein trung tính nhất trong 4 chất ức chế TIMPs, với điểm đẳng điện là 7,4 trong khi của TIMP-1, TIMP-2 và TIMP3

lần lượt là 8; 6,45; 9,04 TIMP-4 được chiết từ sụn người

1.2.5 Nguồn sản xuất gelatinase

Trong tự nhiên, gelatinase có thể được sinh ra từ vi khuẩn, tế bào động vật và người Rất nhiều nghiên cứu được tiến hành về khả năng sinh tổng hợp

gelatinase từ vi sinh vật như: Bacillus spp (Evans và wardlaw, 1953);

Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Clostridium perfringens và Serratia marcescens cũng có khả năng sinh tổng hợp gelatinase (Sternlicht và

cộng sự, 2001); Proteus mirabilis, Serratia marcescens, E coli, S typhi,

Klebsiella oxytoca, Klebsiella pneumoniae, Shigella flexneri và Serratia

liquefaciens (Sharma và cộng sự, 2006); B subtilis BS1 (Shaheen và cộng

sự, 2008); E faecalis (Bouças và cộng sự, 2008); B subtilis PE-11 (Qadar và cộng sự, 2009), B halodurans (Ibrahim và Al-Salamah., 2009); S aureus, B

subtilis, Clostridium perfringens, Corynebacterium sp, Proteus spp, P aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Peudomonas anguilliseptica, Serratiarubidaea, Serratialiquefaciens, Serratiaplymuthica, Enterococcus sp

(Shanmugasundaram và cộng sự, 2012); Bacillus amyloliquefaciens (Sai-Ut và cộng sự, 2013); xạ khuẩn Streptomyces pseudogrisiolus NRC-15 (Sayed và

cộng sự, 2012)

De Clerck và cộng sự (2004) đã phân lập được 1129 chủng từ 73 thùng

chứa gelatin của 6 dây chuyền sản xuất khác nhau Một số chủng đại diện

được nghiên cứu và xác định là Bacillus cereus, B coagulans, B

fumarioli, B amyloliquefaciens, B licheniformis, B pumilus, B sonorensis, B subtilis, B gelatini, B thermoamylovorans, Anoxybacillus contaminans, A flavithermus, Brevibacillus agri, Brevibacillus borstelensis và Geobacillus stearothermophilus Tất cả các loài được phân lập từ gelatin bán

thành phẩm ngoại trừ Bacillus thermoamylovorans và Geobacillus stearothermophilus đều có hoạt tính gelatinase Sau đó, vào năm 2012, nhóm

tác giả này tiếp tục công bố các chủng Bacillus licheniformis, các chủng thuộc nhóm B cereus, B coagulans, B fumarioli, B badius, B subtilis, Brevibacillus

agri, Alicyclobacillus acidocaldarius và Paenibacillus cookie được tìm thấy

bị nhiễm trong quy trình sản xuất gelatin tại Bỉ

Ở Việt Nam, theo công bố của nhóm nghiên cứu Trần Quốc Đảm (2013)

đã sàng lọc được một số chủng Bacillus từ môi trường có khả năng sinh

gelatinase cao Theo Phạm Công Hoạt và cộng sự (2012) nghiên cứu đã phân

lập được một số chủng vi khuẩn Pseudomonas từ môi trường nước có khả

năng tổng hợp gelatinase cao có ứng dụng vào thủy phân phụ phẩm chăn nuôi

Ở người, gelatinase được chia thành hai loại, đó là: gelatinase A và gelatinase B Gelatinase A hay gelatinase 72 kDa còn được gọi là collagenase

72 kDa loại IV thuộc nhóm MMP-2, còn gelatinase B hay gelatinase 92 kDa còn được gọi là collagenase 92 kDa loại IV thuộc nhóm MMP-9 Enzym này chủ yếu được sinh ra bởi các tế bào đại thực bào, tiểu cầu, bạch cầu đa nhân,

bạch cầu trung tính, xơ phôi và tế bào sừng (Tong và cộng sự, 2003)

Gelatinase được cho rằng có liên quan đến quá trình phân hủy các chất ngoại bào trong các quá trình sinh lý bình thường cũng như trong một số bệnh, đặc biệt là di căn khối u Gelatinase được coi là đóng vai trò quan trọng quá trình thoái hóa mô liên quan đến di căn khối u nên được rất nhiều nhà khoa học cứu

quan tâm nghiên cứu

Ngoài ra, hiện nay để sản xuất gelatinase còn được sản xuất bằng phương pháp công nghệ sinh học, tạo ra gelatinase tái tổ hợp (Đào Thị Hồng Vân, 2015)

1.3 NGHIÊN CỨU VỀ GELATINASE TÁI TỔ HỢP

1.3.1 Gen mã hóa gelatinase

Gen mã hóa gelatinase (gelE) từ chủng Enterococus faecalis subsp

liquefanciens OG1-10 được nhân dòng vào E coli – Enterococus và giải trình

tự nucleotit Trình tự DNA mã hóa khung đọc mở (ORF) với 509 axít amin Khung đọc mở chứa chuỗi trình tự tín hiệu ở đầu tận cùng N, trong khi chuỗi trình tự axít amin đầu tận cùng N xác định trình tự proteinase ngoại bào tinh sạch lại bắt đầu ở axít amin thứ 192 tính từ vị trí khung đọc mở Điều này cho thấy gelatinase được sinh tổng hợp dưới dạng tiền peptit (prepropeptit) hoặc tiền enzym (prezymogen) Gelatinase trưởng thành chứa 318 axít amin (khối lượng phân tử 34582 Dalton) và có độ tương đồng cao với proteinase trung

tính từ các chủng Bacillus và elastase từ P aeruginosa (Su và cộng sự, 1991) Theo Del Papa và cộng sự (2007) gelE mã hóa protein chứa 509 axít amin với

chuỗi peptit tín hiệu chứa 29 axít amin Chuỗi propeptit kéo dài từ axít amin

30 đến 191, gelatinase trưởng thành từ gốc axít amin thứ 192 Khối lượng phân tử của protein trưởng thành thực tế thu được là 33.030 Da, chênh lệch

1500 Da (tương đương 14 axít amin) với khối lượng phân tử dự đoán (34.570 Da) Khi xác định trình tự đầu tận cùng N, tác giả nhận thấy rằng protein trưởng thành bắt đầu từ chuỗi VGSEV đã được xác định trước đó, do vậy sự chênh lệch khối lượng phân tử 1.500 Da đến từ sự sai khác trình tự tại đầu tận

cùng C Các thí nghiệm gây chủng đột biến cho thấy gelatinase trưởng thành từ

E faecalis phải trải qua quá trình cắt axít amin tính từ đầu tận cùng C để kích

hoạt hoạt tính

PROTEASE TRƯỞNG THÀNH (MATURE

PROTEASE)

Khối lượng phân tử dự đoán: 34.570 Da

Khối lượng phân tử xác định: 33.027 Da

Khối lượng phân tử khác: 1.543 Da

C-terminal 14 axít amin: IQVNQPSESVLVNE

Khối lượng dự đoán: gần 1556 Da

Hình 1.3 Sơ đồ phân tích cấu trúc trình tự axit amin dự đoán của gelatinase

(Del Papa và cộng sự, 2007)

Trong công trình của mình, Gútiez và cộng sự (2014) nhân dòng các gen

mã hóa gelatinase (gelE) và serine proteinase (sprE), 2 enzym ngoại bào sinh tổng hợp bởi E faecalis DBH18, trong vertor biểu hiện pMG36c, chứa

promoter P32, tạo ra các plasmid tái tổ hợp pCG, pCSP và pCGSP mã hóa các

gen gelE, sprE (gen mã hóa serine proteinase) và gelE-sprE tương ứng

Chuyển các plasmid này vào các chủng chủ không có hoạt tính thủy phân