Nghiên cứu quy trình phân lập và nhân sinh khối nấm lim xanh ganoderma lucidum thu thập tại thanh hóa

14: Sự sinh trưởng của sinh khối nấm Lim xanh trên các môi trường khác nhau sau 6 ngày nuôi cấy.. Thành phần các hoạt chất sinh học trong nấm Lim xanh Các nghiên cứu về thành phần hoá h

TRIỆU THỊ KIM

Tên đề tài:

NGHIÊN CƢ́U QUY TRÌNH PHÂN LẬP VÀ NHÂN SINH KHỐI

NẤM LIM XANH Ganoderma lucidum THU THẬP TẠI THANH HÓA

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ sinh học

Khóa học : 2013 - 2017

Thái Nguyên – năm 2017

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

TRIỆU THỊ KIM

Tên đề tài:

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH PHÂN LẬP VÀ NHÂN SINH KHỐI

NẤM LIM XANH Ganoderma lucidum THU THẬP TẠI THANH HÓA

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành : Công nghệ sinh học

Người hướng dẫn 1 : ThS Nguyễn Thị Tình Người hướng dẫn 2 : ThS Vi Đại Lâm

Thái Nguyên – năm 2017

LỜI CẢM ƠN

Sau thời gian thực tập tại phòng thí nghiệm khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực Phẩm,Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên,cùng với sự cố gắng của bản thân và sự giúp đỡ của mọi người em đã hoàn thành khóa luận tốt luận tốt nghiệp của mình

Trước hết, em xin chân thành cảm ơn sâu sắc tới Th.S Nguyễn Thị Tình, giảng viên Khoa CNSH – CNTP,đã tạo điều kiện và tận tình giúp đỡ em hoàn thành khóa luận này,người hướng dẫn em cách thao tác thực hành và chỉ ra cho em những sai lầm giúp em hoàn thành tốt khóa luận

Em xin chân thành cảm ơn đến các thầy cô trong Khoa CNSH – CNTP, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đã tận tình chỉ bảo,giúp đỡ em trong quá trình học tập và hoàn thành khóa luận này

Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè, những người đã luôn ở bên cạnh động viên giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện khóa luận

Em xin chân thành cảm ơn!

Thái Nguyên, ngày tháng năm 2017

Người thực hiện

Triệu Thị Kim

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3 1: Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu 15 Bảng 3 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của độ pH đến khả năng phát triển hệ sợi nấm 20 Bảng 3 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của loại đường đến khả năng phát triển hệ sợi nấm Lim xanh 20 Bảng 3 4: Nghiên cứ u ảnh hưởng của hàm lượng cao nấm men đến khả năng phát triển hê ̣ sợi từ nấm từ mô thi ̣t 21 Bảng 3 5: Nghiên của ảnh hưởng của hàm lượng Pepton đến khả năng phát triển hệ sợi nấm từ mô thịt 21 Bảng 3 6: Nghiên cứ u ảnh hưởng của tốc đô ̣ lắc đến khả năng nhân sinh khối của

hê ̣ sợi nấm Lim xanh 22 Bảng 4 1: Đường kính sinh trưởng của hệ sợi nấm Lim xanh trên các môi trường PDA và PDA + 10% nước dừa 28 Bảng 4 2: Đường kính sinh trưởng của hệ sợi nấm Lim xanh ở các điều kiện pH khác nhau 30 Bảng 4 3: Đường kính sinh trưởng của hệ sợi nấm Lim xanh ở các loại đường khác nhau 32 Bảng 4 4: Đường kính sinh trưởng của hệ sợi nấm Lim xanh ở các môi trường có

bổ sung cao nấm men với tỷ lệ khác nhau 34 Bảng 4 5: Đường kính sinh trưởng của hệ sợi nấm Lim xanh ở các môi trường có

bổ sung pepton với tỷ lệ khác nhau 36 Bảng 4 6: Sinh khối nấm thu được trên các môi trường khác nhau 39 Bảng 4 7: Sinh khối nấm thu được trên các tốc độ lắc khác nhau 40 Bảng 4 8: Ảnh hưởng của dung môi tới hiệu quả trích ly polysaccharide trong nấm Lim xanh 42 Bảng 4 9: Ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu/dung môi đến hiệu quả trích ly

polysaccharide trong nấm Lim xanh 43 Bảng 4 10: Ảnh hưởng của nhiệt độ tới hiệu quả trích ly polysaccharide trong nấm Lim xanh 45

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 2.1: Hình thái quả thể nấm Lim xanh thu nhận từ Thanh Hóa và nuôi trồng tại

trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên 5

Hình 3.1: Quy trình phân lập giống nấm Lim xanh 18

Hình 3.2: Sơ đồ quy trình nuôi sinh khối hệ sợi nấm Lim xanh 22

Hình 3.3: Sơ đồ quy trình trích ly polysaccharide từ sinh khối nấm Lim xanh 25

Hình 4 1: Nấm lim xanh phát triển trên một số môi trường cơ bản(sau 13 ngày nuôi cấy) 27

Hình 4 2: Biểu đồ thể hiện sự sinh trưởng của hệ sợi nấm Lim xanh trên môi trường PDA và PDA + 10% nước dừa 29

Hình 4 3: Biểu đồ thể hiện sự sinh trưởng của hệ sợi nấm Lim xanh ở các điều kiện pH khác nhau 30

Hình 4 4: Sự sinh trưởng của nấm Lim xanh trên 3 môi trường có pH lần lượt là 4; 6,5; 8 (sau 12 ngày nuôi cấy) 32

Hình 4 5: Biểu đồ thể hiện sự sinh trưởng của hệ sợi nấm Lim xanh ở các loại đường khác nhau 33

Hình 4 6: Sự sinh trưởng của hệ sợi nấm Lim xanh ở các loại đường khác nhau (sau 12 ngày nuôi cấy) 33

Hình 4 7: Biểu đồ thể hiện sự sinh trưởng của hệ sợi nấm Lim xanh ở các môi trường có bổ sung cao nấm men với tỉ lệ khác nhau 34

Hình 4 8: Nghiên cứ u ảnh hưởng của hàm lượng cao nấm men đến khả năng phát triển hê ̣ sợi từ nấm từ mô thi ̣t (sau 6 ngày nuôi cấy) 35

Hình 4 9: Biểu đồ thể hiện sự sinh trưởng của hệ sợi nấm Lim xanh ở các môi trường có bổ sung Pepton với tỉ lệ khác nhau 36

Hình 4 10: Nghiên cứ u ảnh hưởng của hàm lượng Pepton đến khả năng phát triển hê ̣ sợi từ nấm từ mô thi ̣t (sau 6 ngày nuôi cấy) 37

Hình 4 11: Sơ đồ quy trình kiểm tra giống nấm Lim xanh đã phân lập 37 Hình 4 12: Hình thái quả thể nấm Lim xanh được thu thập từ Thanh Hóa và nấm

Lim xanh được nuôi trồng tại trường ĐH Nông Lâm Thái Nguyên 38

Hình 4 13: Biểu đồ thể hiện đường cong sinh trưởng của sinh khối nấm Lim xanh trên các môi trường khác nhau 39

Hình 4 14: Sự sinh trưởng của sinh khối nấm Lim xanh trên các môi trường khác nhau (sau 6 ngày nuôi cấy) 40

Hình 4 15: Biểu đồ thể hiện đường cong sinh trưởng của sinh khối nấm Lim xanh trên các tốc độ lắc khác nhau 41

Hình 4 16: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của dung môi đến quá trình trích ly polysaccharide trong nấm Lim xanh 42

Hình 4 17: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu/dung môi đến hiệu quả trích ly polysaccharide trong nấm Lim xanh 44

Hình 4 18: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ tới hiệu quả trích ly polysaccharide trong nấm Lim xanh 45

Hình 5 1: Sơ đồ quy trình phân lập giống nấm Lim xanh 47

Hình 5 2: Sơ đồ quy trình nuôi cấy sinh khối giống nấm Lim xanh 49

Hình 5 3: Sơ đồ quy trình trích ly polysaccharide từ sinh khối nấm Lim xanh 50

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ii

DANH MỤC CÁC BẢNG iii

DANH MỤC CÁC HÌNH iv

MỤC LỤC vi

PHẦN 1 MỞ ĐẦU 1

1.1.Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích nghiên cứ u 2

1.3 Yêu cầu 2

1.4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 3

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

2.1 Nấm Lim xanh 4

2.1.1 Nguồn gốc và phân loa ̣i nấm Linh xanh 4

2.1.2 Đặc điểm thực vật và phân bố 5

2.1.3 Thành phần các hoạt chất sinh học trong nấm Lim xanh 6

2.1.4 Tác dụng củ a nấm Lim xanh 6

2.2 Giới thiệu về polysaccharide 7

2.3 Tổng quan về phân lập 9

2.4 Nuôi cấy sinh khối nấm Lim xanh trong môi trường lỏng 9

2.4.1 Nuôi cấy hệ sợi nấm Lim xanh trong môi trường lỏng 9

2.4.2 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy lỏng tới sự phát triển của hệ sợi nấm Lim xanh 11

2.5 Tình hình nghiên cứu nấm Lim xanh trong và ngoài nước 12

2.5.1 Tình hình nghiên cứu nấm Lim xanh ngoài nước 12

2.5.2 Tình hình nghiên cứu nấm Lim xanh trong nước 13

Phần 3 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

3.1 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 15

3.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 15 3.3 Nội dung nghiên cứu 16 3.4 Phương pháp nghiên cứu 16 3.4.1.Phương pháp nghiên cứu nội dung 1: Nghiên cứu kỹ thuật phân lâ ̣p giống nấm Lim xanh Thanh Hóa ta ̣i trường Đa ̣i ho ̣c Nông Lâm Thái Nguyên 16 3.4.2 Phương pháp nghiên cứu nội dung 2: Nghiên cứu quy trình kỹ thuật nhân sinh khối sơ ̣i nấm Lim xanh bằng hê ̣ thống nuôi cấy lỏng 21 3.4.3 Phương pháp nghiên cứu nội dung 3: Nghiên cứu thu tách chiết

polysaccharides trong di ̣ch huyền phù tế bào nấm Lim xanh (thu sinh khối từ bào tử nấm lim xanh trong môi trường lỏng) 23 3.5 Phương pháp xử lý số liệu 26

PHẦN 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27

4.1 Nghiên cứu kỹ thuật phân lập giống nấm Lim xanh Thanh Hóa ta ̣i trường Đa ̣i học Nông Lâm Thái Nguyên 27 4.1.1 Nghiên cứ u ảnh hưởng của môi trường đến khả năng tạo hê ̣ sơ ̣i nấm từ mô thịt nấm 27 4.1.2 Nghiên cứ u ảnh hưởng của độ pH đến khả năng phát triển hê ̣ sơ ̣i từ nấm từ

mô thi ̣t 30 4.1.3 Nghiên cứ u ảnh hưởng của loại đường đến khả năng phát triển hê ̣ sơ ̣i từ nấm từ mô thi ̣t 32 4.1.4 Nghiên cứ u ảnh hưởng của hàm lượng cao nấm men đến khả năng phát triển

hê ̣ sợi từ nấm từ mô thi ̣t 34 4.1.5 Nghiên cứ u ảnh hưởng của hàm lượng Pepton đến khả năng phát triển hê ̣ sơ ̣i

từ nấm từ mô thi ̣t 35 4.1.6 Kiểm tra giống, chất lượng giống nấm Lim xanh đã phân lập 37 4.2 Nghiên cứu quy trình kỹ thuật nhân sinh khối sợi nấm Lim xanh bằng hệ thống nuôi cấy lỏng 38 4.2.1 Nghiên cứ u ảnh hưởng của môi trường đến khả năng nhân sinh khối của hê ̣

sơ ̣i nấm Lim xanh 38

4.2.2 Nghiên cứ u ảnh hưởng của tốc độ lắc đến khả năng nhân sinh khối của hệ sợi

nấm Lim xanh 40

4.3 Nghiên cứu thu tách chiết polysaccharides trong di ̣ch huyền phù tế bào nấm Lim xanh (thu sinh khối từ bào tử nấm lim xanh trong môi trường lỏng) 41

4.3.1 Khảo sát dung môi phù hợp 41

4.3.2 Khảo sát tỷ lệ dung môi/nguyên liệu 43

4.3.3 Khảo sát nhiệt độ chiết xuất 44

PHẦN 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 46

5.1 Kết luận 46

5.2 Kiến nghị 51

TÀI LIỆU THAM KHẢO 52

PHỤ LỤC

PHẦN 1

MỞ ĐẦU 1.1.Đặt vấn đề

Nấm phân bố trên toàn thế giới và phát triển ở nhiều dạng môi trường sống khác nhau,đa phần sống ở trên cạn,nhưng một số loài lại chỉ tìm thấy ở môi trường trong nước Dựa theo tỷ lệ giữa số loài nấm với số loài thực vật ở cùng một môi trường, người ta ước tính giới nấm có khoảng 1,5 triệu loài Hiện nay có khoảng

80000 loài nấm đã được các nhà phân loại học phát hiện và định danh Giới nấm ngày càng có ý nghĩa to lớn trong nền kinh tế quốc dân,trong khoa học cũng như trong vòng tuần hoàn vật chất Nấm đã được sử dụng trong dân gian từ hàng ngàn năm nay và một số có ý nghĩa rất quan trọng trong đời sống con người

Linh chi là loài dược liệu đã được chứng minh có nhiều đặc tính quý,rất tốt cho phòng và chữa bệnh Các chế phẩm từ nấm linh chi (Ganoderma) được dùng để

hỗ trợ điều trị nhiều bệnh như bệnh gan,tiết niệu,tim mạch,ung thư,AIDS Các hoạt chất tách chiết từ nấm lim xanh được dùng để hỗ trợ điều trị nhiều bệnh gan, tiết niệu,tim mạch,ung thư,AIDS và không gây dị ứng đối với cơ thể người và động vật Thanh hóa là tỉnh có diện tích rừng lớn, có khu bảo tồn Pù Hu, Quan Hóa, Mường Lát, Thanh Hóa, Khu bảo tồn thiên nhiên Xuân Liên, Khu bảo tồn thiên nhiên rừng sến, đây là tỉnh được đánh giá là có tính đa dạng sinh học rất cao, tại đây có chứa đựng nguồn lợi lớn giá trị kinh tế và giá trị trong nghiên cứu khoa học từ các loài động thực vật Trong đó có nguồn lợi lớn về nấm và có thể sử dụng chúng làm nguyên liệu tốt cho các ngành công nghiệp thực phẩm, dược phẩm

Nấm Linh chi mo ̣c trên gỗ lim người ta thường go ̣i là Nấm Lim Trong tự nhiên, nấm Lim xanh mọc ở nơi rừng râ ̣m , ít ánh sáng , đô ̣ ẩm cao và thường xuất hiê ̣n vào mùa mưa Nấm Lim xanh là loài thường niên , tai nấm chỉ phát triển trong

mô ̣t mùa Vì vậ y số lượng quần thể nấm Lim xanh rất ha ̣n chế , Các hoạt chất từ

Ganoderma lucidum có hiệu lực chống khối u cao, chúng được sử dụng trong điều

trị ung thư: ưng thư phổi, ung thư vú, ung thư dạ dày,

Do có chứa nhiều hoạt chất quý cùng với số lượng hạn chế và việc khai thác quá nhanh trong thời gian ng ắn đã dẫn đến tình tra ̣ng nguy cấp của loài nấm này trong tự nhiên và đã được liệt kê vào danh sách loài cần được bảo tồn và nghiêm cấm khai thác - trích lục sách đỏ Việt Nam - 2007

Để bảo tồn loài nấm này việc phân lập giữ giống và phát triển là rất cần thiết Việc gây trồng các giống nấm đã được nghiên cứu ở Việt Nam từ những năm 80 của thế kỷ XVI tuy nhiên để đáp ứng nhu cầu dược liệu của đất nước hàng năm Việt Nam vẫn phải nhập hàng nghìn tấn nấm không kiểm định được chất lượng từ các nước như Nhật Bản, Hàn Quốc, Triều Tiên, Trung Quốc và và một số lượng lớn nấm nhập khẩu theo con đường không chính thống như hàng hóa sách tay mang về Việt Nam Để phát triển các sản phẩm nấm của Việt Nam thành các sản phẩm chức năng có giá trị và được thực hiện ở quy mô lớn thì ngoài việc nuôi trồng theo phương pháp truyền thống việc nhân nhanh sinh khối

để tách các hoạt chất có giá trị là cần thiết Việc thu hoạt chất có giá trị từ sinh khối là công nghệ mới đã được ứng dụng ở các nước có trình độ sản xuất nấm tiên tiến như: Nhật, Hàn Quốc, Đài Loan,…tuy nhiên công nghệ này chưa được nghiên cứu ở Việt Nam Bằng các nghiên cứu chúng tôi thấy phương pháp này

có nhiều tính ưu việt như: Có khả năng kiểm soát được chất lượng, hàm lượng, thành phần hoạt chất do kiểm soát chặt chẽ được các điều kiện dinh dưỡng và môi trường nuôi cấy Chính vì vậy chúng tôi đã thực hiện đề tài:“

Nghiên cứu quy trình phân lập và nhân sinh khối nấm Lim xanh Ganoderma

Lucidum thu thập tại Thanh Hó a”

1.2 Mục tiêu c ủa đề tài

1.2.1 Mục tiêu tổng quát

Xây dựng thành công quy trình phân lập và nhân sinh khối nấm Lim xanh

Ganoderma Lucidum thu thập tại Thanh Hóa

1.2.2 Mục tiêu cụ thể

- Xây dựng được quy trình phân lâ ̣p nấm Lim xanh

- Xây dựng được quy trình nhân sinh khối sợi nấm Lim xanh trong dung dịch lỏng

- Xây dựng được quy trình tách chiết polysaccharide từ dịch huyền phù nấm Lim xanh

1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

1.3.1 Ý nghĩa khoa học của đề tài

- Giúp sinh viên củn g cố và hê ̣ thống la ̣i kiến thức đã ho ̣c vào thực tiễn Đồng thời tiếp cận công tác nghiên cứu khoa học phục vụ cho việc nghiên cứu

và công tác sau này

- Biết được phương pháp nghiên cứu m ột vấn đề khoa học , xử lý, phân tích số liê ̣u, trình bày một báo cáo tốt nghiệp

1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn

- Kết quả nghiên cứu của đề tài giúp xây dựng được quy trình phân lâ ̣p và thu hoạt chất polysaccharide từ sinh khối nấm L im xanh Ganoderma Lucidum Góp phần bảo tồn loài n ấm quý có giá trị của Việt Nam và ta ̣o nguồn vâ ̣t liê ̣u có ý nghĩa trong công tác nghiên cứu nấm

- Phát triển và thương mại hóa sản phẩm chức năng có giá trị

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Nấm Lim xanh

2.1.1 Nguồn gốc va ̀ phân loại nấm Linh xanh

* Nguồn gốc

Linh Chi (Ganoderma) là loại nấm gỗ mọc hoang trong thiên nhiên, có hàng

trăm các loài khác nhau, trong đó có 2 nhóm lớn là: Cổ Linh Chi và Linh Chi [12]

Linh Chi rất phong phú về chủng loại, ước tính trên toàn thế giới có 200 loài Linh Chi Riêng Trung Quốc có 84 loài, trong đó có 12 loài được dùng làm thuốc như Xích Linh Chi, Tử Linh Chi, Hắc Linh Chi [14],[16]

Theo sách bản thảo cương mục của Lý Thời Trần (1959) thì đại danh y của Trung Quốc đã phân loại Linh Chi theo màu sắc thành 6 loại:

Thanh chi hay Long chi: màu xanh, vị chua, tính bình, không độc

Hồng chi, Xích chi hay Đơn chi: màu đỏ vị đắng, tính bình, không độc Hoàng chi hay Kim chi: màu vàng, vị ngot, tính bình, không độc

Bạch chi hay Ngọc chi: màu trắng, vị cay, tính bình, không độc

Hắc chi hay Huyền chi: màu đen, vị mặn, tính bình, không độc

Tử chi hay Mộc chi: màu tím, vị ngọt, tính ôn, không độc

Trong đó nấm Lim xanh thuộc nhóm Hồng chi có tên khoa học là

Ganoderma lucidum, Hồng Chi có loài mọc trên giá thể gỗ Keo, Bồ Đề,

Phượng Vĩ,… có cả những loài mọc trên thân gỗ Lim đã mục, người ta gọi là nấm Lim xanh

* Phân loại

Nấm Lim xanh có vị trí phân loại được thừa nhận rộng rãi hiện nay [6],[7]

Tên khoa học: Ganoderma lucidum

- Lim xanh có cấu tạo 2 phần: Phần cuống và mũ nấm Cuống nấm biến dị rất lớn, từ rất ngắn (0,5cm), rất mảnh (0,2cm) cho đến dài cỡ hàng 5-10 cm hoặc rất dài 20-25cm Cuống có thể đính ở bên hoặc đính gần tâm do quá trình lên tán mà thành

- Mũ nấm dạng thận - gần tròn, đôi khi xoè hình quạt hoặc ít nhiều dị dạng Trên mặt mũ có vân gợn đồng tâm và có tia rãnh phóng xạ, màu vàng nâu, vàng cam, đỏ cam, đỏ nâu, nâu tím hoặc nâu đen, nhẵn bóng như láng vecni Kích thước tán biến động từ 2 - 30cm, dày 0,8 - 2,5cm

- Thịt nấm dày từ 0,4 - 1,8cm, màu vàng kem, nâu nhạt Nấm mềm, dai khi tươi và trở nên chắc cứng và nhẹ khi khô, đầu tận cùng của sợi phình hình chuỳ, màng rất dày đan khít vào nhau tạo thành lớp vỏ láng phủ trên mũ và bao quanh cuống [14]

Nấm Lim xanh được thu thập

từ Thanh Hóa

Nấm Lim xanh được nuôi trồng tại Trường ĐH Nông Lâm Thái Nguyên

Hình 2.1: Hình thái quả thể nấm Lim xanh thu nhận từ Thanh Hóa và

nuôi trồng tại trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên

2.1.3 Thành phần các hoạt chất sinh học trong nấm Lim xanh

Các nghiên cứu về thành phần hoá học của nấm Linh Chi đầu tiên được tiến hành vào đầu thế kỷ XX, khi các nhà khoa học nghiên cứu đến lớp vỏ láng của nấm

và đã phát hiện các chất như: esgosterol, các enzyme phenoloxidase và peroxidase

Theo phân tích của G Bing Lin thì thành phần hoá học của Ganoderma lucidum gồm các chất: Nước(12 - 13%), cellulose (54 - 56%), lignin (13 - 14%), monosaccharide (4,5 - 5%), lipid (1,9 - 2,0%), protein (0,08 - 0,12%), sterol (0,14 - 0,16%), các nguyên tố vô cơ như: Ag, Br, Ca, Fe, K, Na, Mg, Mn, Zn, Bi…[12]

Hiện nay người ta đã tìm được các hoạt chất sinh học trong nấm Lim xanh như: Hoạt chất Beta–D-glucan,D-6,… trong nhóm polysaccharide và hoạt chất ganoderic acid, oleic acid, lucidenol,…trong nhóm triterpenoid [12]

2.1.4 Tác dụng cu ̉ a nấm Lim xanh

Vai trò dược lý của nấm Lim xanh rất lớn nhờ sự có mặt của các hoạt chất sinh học Nấm Lim xanh được sử dụng như một dược liệu quý, để chữa trị nhiều bệnh Cho đến nay, kết quả nghiên cứu dược lý học hiện đại cho thấy, Lim xanh có tác dụng dược lý khá phong phú Tác dụng trên hệ tuần hoàn [19],[21],[22] Tác dụng trên hệ miễn dịch và chống ung thư [25] Chế phẩm nấm Lim xanh làm gia tăng quá trình sản xuất Interleukin-1 & 2, có tác dụng hạn chế sự phát triển của nhiều loại mô

có hại [22] Tác dụng phòng, chống bệnh tiểu đường [21], cholesterol và đường trong máu [19] Làm giảm đường huyết và điều chỉnh rối loạn lipid máu Nấm Lim xanh có chất Polysaccharides làm khôi phu ̣c tế bào tiểu đảo tuyến tu ̣y và từ đ ó thúc đẩy quá trình tiết insulin [12], Tác dụng ngăn chặn quá trình lão hóa, giúp cơ thể tráng kiện Trong thành phần nấm lim xanh có chứa Acid ganoderic (dẫn chất triterpenoid) có tác dụng như một chất oxy hóa khử các gốc tự do trong cơ thể chống lão hóa Ổn định và cải thiện chức năng sinh lý của màng tế bào, tăng cường năng lực tổng hợp DNA, RNA và protein [26] Nhóm steroid trong nấm Lim xanh

có tác dụng giải độc gan , bảo vệ gan ngưng tổng hợp cholesterol , ức chế nhiều loa ̣i

vi khuẩn gây bê ̣nh nên có hiê ̣u quả tốt đối với bê ̣nh về gan, mâ ̣t như: Viêm gan mãn tính, viêm gan cấp tín h, xơ gan, gan nhiễm mỡ [12] Nấm Linh Chi giúp bài tiết

các độc tố trong cơ thể , có tác dụng loại bỏ các sắc tố la ̣ trên da, làm cho da dẻ đẹp , hồng hào, chống la ̣i các bê ̣nh ngoài da như di ̣ ứng, trứng cá [23]

2.2 Giới thiệu về polysaccharide

Polysaccgaride là một hợp chất hữu cơ có chứa trong thực vật: quả, củ hoặc thân cây Trong thực vật, polysaccharide tồn tại dưới hai dạng: dạng không tan và dạng hòa tan Polysaacharide có trong thành phần một số thực vật điển hình như: nhân sâm, nấm lim xanh, nấm hương,… hợp chất cao phân tử có chứa hàng trăm thậm chí hàng nghìn mắt xích monoscacchride trong mỗi phân tử

Polysacharide là những polime được tạo ra từ thiên nhiên hoặc nó có thể là sản phẩm của phản ứng trùng ngưng các andozo hoặc xentozo Polysacharide tồn tại

ở các loại mạch như mạch hở, mạch không nhánh hoặc có nhánh, mạch vòng hay uốn khúc

Polysacharide thường được phân loại thành hai loại là homopolysacchride và heteropolysacchride Homopolysacchride được tạo thành từ một loại monosacchride như tinh bột, xenlluose, glycogen,… Heteropolysacchride được thành từ hai loại monosacchride trở lên như pectit, aga, hemixenllulose…

Trong dược tính của nấm nói chung và nấm linh chi nói riêng thì hoạt tính dược học của polysaccharide là quan trọng và được nghiên cứu nhiều nhất

Thành phần polysaccharide hoạt tính sinh học chủ yếu thuộc nhóm β-Glucan Các chất này trong nhóm hợp chất có hoạt tính sinh học có nguồn gốc từ tự nhiên,

là loại chất có khả năng điều chỉnh đáp ứng sinh học Là tác nhân điều hòa hệ thống bảo vệ miễn dịch tự nhiên quan trọng nhất, β - Gluccan từ nấm không giống với các loại sản phẩm từ tự nhiên khác mà β- Gluccan từ nấm được tinh khiết duy trì tác dụng sinh học cho phép chúng có hiệu quả ở mức độ phân tử và tế bào [20]

Năm 1980, tại Nhật Bản β- Gluccan trong nấm linh chi đã chứng minh được khả năng kích thích máu tương tự chủ yếu tố kích thích các bạch cầu hạt đơn nhân Các thí nghiệm đều cho thấy rằng, hiệu quả tác dụng vào tế bào ung thư rất tốt, có thể làm giảm 70-95% trọng lượng khối u so với chúng Tuy vậy, kết quả cho khả năng kháng, tác động tích cực tới khối u khi sử dụng kết hợp với chất kháng chống

ung thư, còn nếu sử dụng riêng lẻ thì không thể làm khối u biến mất Qua đó, β- Gluccan có thể làm giảm sự phát triển của khối u, ngăn chặn khối u di căn Trái ngược với vi sinh vật, tế bào khối u cũng như các tế bào vật chủ khác, β- Gluccan là một thành phần không thể thiếu là một thành phần bề mặt để kích hoạt thụ thể bổ sung bắt đầu gây độc tế bào và giết chết tế bào khối u Điều này chỉ xảy ra khi có mặt β- Gluccan [20],[28]

Các hoạt tính của Polysaccharide có tác dụng kháng virus và điều hòa miễn dịch là do có ligmin, các chất kháng sinh; Lentinan là một polysaccharide có tác dụng phục hồi tế bào Lympho T, tăng sản xuất interferol [8]

Hoạt tính tăng khả năng miễn dịch

Hoạt chất Polysaccharide còn được nghiên cứu trong nấm hương, kết quả nghiên cứu cho thấy có khả năng hoạt hóa miễn dịch tế bào thúc đẩy quá trình sinh trưởng và phát triển tế bào Lympho T, Lympho B từ đó góp phần tăng cường hệ miễn dịch ở bệnh nhân bị bệnh gan, giúp bệnh gan nhiễm mỡ máu chóng hồi phục các tế bào bị tổn thương nhanh chóng hơn [20]

Polysaccharide JSL-18 có trong nấm hương là tăng hoạt tính đại thực bào, tăng tiết IL-6 (Interleakin-6) Bên cạnh đó, trong nấm hương còn chứa các chất như Lentinacin, dezoxy lentinacin, 5’ –GMP, 5’ –AMP có tác dụng chống đông máu Ngoài ra, còn có chất eritadenine có hiệu quả làm giảm hàm lượng cholesterol trong máu [5]

Với nhiều tác dụng như vậy việc tách chiết Polysaccharide được quan tâm và nghiên cứu ở nhiều loài nấm trong đó có nấm linh chi Các nghiên cứu cho thấy Polysaccharides trong nấm tồn tại như một thành phần cấu trúc của vách tế bào nấm

và việc lựa chọn phương pháp trích ly phụ thuộc về cấu trúc tế bào Một số phương pháp trích ly thu polysaccharides thông thường như: Chiết bằng dung môi, bằng sử dụng nước nóng, giải pháp kiềm và phlyethylene glycol; và các phương pháp sử

dụng sóng siêu âm Ngoài ra Polysaccharide còn chiết bằng nước, kết tủa bằng

etanol với quy trình như sau: Quả thể nấm T microcaspus tươi (1kg) rửa sạch bằng nước Sau đó đun sôi nấm quả thế trong 250ml nước cất trong 12 giờ Hỗn hợp dịch

chiết được để qua đêm tại 4 độ C và được lọc qua vải lọc Sau đó, ly tâm ở 8000 rpm trong 45 phút tại 6 độ C để thu nhận dịch chiết sạch tạp chất Thu nhận lấy phần dịch nổi (200ml) và kết tủa trong ethanol theo tỉ lệ (1:5, v/v) ở nhiệt độ phòng

Để kết tủa qua đêm tại 4 độ C, sau đó ly tâm ở 6 độ C trong 1 giờ Phần kết tủa thu được rửa sạch với nước cất và thẩm tách qua ống thẩm tách trong 6 giờ để loại bỏ các vật liệu có trọng lượng phân tử thấp Phần còn lại đem băng khô

Môi trường phân lập là môi trường dinh dưỡng bao gồm ba thành phần cơ bản: Đường: 2 – 3 %, thạch: 2% và chất bổ sung: Nước chiết (lấy từ các nguồn

tự nhiên như khoai tây, nước giá, cà rốt…) và hóa chất (chủ yếu là các chất khoáng N, P, K…)

Khi có được giống thuần, cấy sợi nấm từ môi trường phân lập vào ống nghiệm chứa môi trường thạch nghiêng để giữ giống Môi trường giữ giống có thể giống với môi trường phân lập Khi giữ giống, bảo quản ống nghiệm trong tủ lạnh ở nhiệt độ 4 đến

10 độ C và mỗi tháng cấy lại một lần [3],[15]

2.4 Nuôi cấy sinh khối nấm Lim xanh trong môi trường lỏng

2.4.1 Nuôi cấy hệ sợi nấm Lim xanh trong môi trường lỏng

Phương pháp lên men chìm đối với vi sinh vật

Khái niệm: Là quá trình nhân nuôi vi sinh vật trong môi trường lỏng có sục khí để bổ sung thêm oxy hoặc nuôi tĩnh Giống vi sinh vật sau khi cấy vào môi trường lên men thì bắt đầu phát triển ở giai đoạn tiềm phát (pha lag) rồi chuyển sang phát triển qua pha lũy (pha log) Trong pha lũy thừa, vi sinh vật phát triển nhanh chóng và đạt cực đại, lượng vi sinh vật ngày càng tăng lên nhưng dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy nếu không được bổ sung thêm vào đó ở giai đoạn này thành phần môi trường dinh dưỡng giảm nhanh, nhu cầu oxy tăng, nhiệt độ tạo ra cao đồng thời bề mặt môi trường có thể trào ra khỏi bình men, làm mất bớt dịch và tăng khả năng nhiễm vi sinh vật lạ không mong muốn

Vi sinh vật trong quá trình lên men phát triển theo 4 pha: pha tiềm phát (pha lag) pha lũy thừa (pha log), pha ổn định, pha suy vong

Pha tiềm phát: Khi cấy các tế bào sinh vật từ môi trường này sang môi trường khác, khoảng thời gian đầu số tế bào không thay đổi Trong giai đoạn này vi sinh vật làm quen với môi trường để thích nghi dần với điều kiện môi trường mới

Pha log: Cuối pha tiềm phát các tế bào đã thích nghi với điều kiện sống mới

và bắt đầu phát triển mạnh mẽ, quần thể vi sinh vật chuyển sang lũy thừa, pha phát triển số lượng vi sinh vật mạnh nhất

Pha ổn định: Sau khi đồng hóa các chất dinh dưỡng hay sau khi tích lũy các sản phẩm trao đổi chất, sinh trưởng của vi sinh vật giảm xuống hay hoàn toàn ngừng lại Trong pha ổn định này sinh khối có thể còn tăng chậm hoặc không đổi

Pha suy tàn: Đặc trưng của pha này là các chất dinh dưỡng đã bị cạn kiệt Lượng chất dinh dưỡng trong môi trường bị suy giảm, có thể thiếu một số chất dinh dưỡng, trong khi chất thải từ vi sinh vật thải ra ngày càng tăng mà không được bổ sung thêm chất dinh dưỡng vào môi trường nuôi cấy, do đó các tế bào vi sinh vật chết dần

Lên men bổ sung ứng dụng cho các trường hợp sau: Nồng độ cơ chất khá thấp nhưng lại cần ổn định, nồng độ cơ chất cần khá cao và không đổi, cần bổ sung chất dinh dưỡng liên tục

Môi trường nuôi cấy hệ sợi nấm Lim xanh trong môi trường lỏng

Môi trường dinh dưỡng cần cho nấm Lim xanh và hệ sợi nấm Lim xanh phát triển cần một số nguồn dinh dưỡng thiết yếu như sau:

Về nguồn Cacbon: Nấm Lim xanh có thể đồng hóa rộng rãi nhiều nguồn cacbon khác nhau như đường đơn, đường kép, đường đa [4]

Về nguồn nitơ, nấm Lim xanh có thể sử dụng ni tơ hữu cơ như protein, peptide, acid amin hay ure hoặc đạm vô cơ như các muối amon[4]

Tỷ lệ C : N trong môi trường ở giai đoan nuôi sợi nên dùng tỷ lệ 25-40:1 Nhưng tỷ lệ C : N tối ưu cho sự phát triển của hệ sợi nấm là 30:1 Theo nghiên cứu của nhóm tác giả Rossi và CS khi sử dụng môi trường rỉ đường thì tỷ lệ C : N là 107:1, còn khi bổ sung thêm 40% cám gạo thì tỷ lệ C:N là 38:1

Về nhu cầu yếu tố khoáng, ngoài Mg, S, P, K nấm Lim xanh còn cần một số nguyên tố khoáng vi lượng như Fe, Zn, Mn…Mỗi lít dung dịch nuôi cấy nên bổ sung thêm khoảng 2mg đối với từng loại Fe, Zn, Mn [16]

Các môi trường nuôi cấy để nuôi hệ sợi cũng phải có đầy đủ nguồn cacbon, nito, chất khoáng…đáp ứng cho sự phát triển của hệ sợi nấm [16]

2.4.2 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy lỏng tới sự phát triển của hệ sợi nấm Lim xanh

Nấm Lim xanh thuộc nhóm nấm hoại sinh và hiếu khí, vì vậy trong quá trình nuôi hệ sợi nấm Lim xanh nên bổ sung oxy bằng thiết bị lắc, khuấy hay sục khí Bào tử nấm sau khi được cấy vào môi trường lên men thì bắt đầu phát triển ở giai đoạn tiềm phát (pha lag) khoảng 24 giờ, rồi chuyển sang phát triển trong pha lũy thừa (pha log) Cuối pha lag các bào tử nấm đã thích nghi với điều kiện sống mới và bắt đầu phát triển mạnh mẽ Ở giai đoạn này thành phần môi trường dinh dưỡng giảm nhanh, nhu cầu oxy tăng, nhiệt lượng tạo ra cao đồng thời bề mặt môi trường tạo thành bọt và lớp bọt tăng Nên phải cấp khí oxy bằng cách lắc ở quy mô phòng thí nghiệm và dùng thiết bị sục khí như khuấy, sục khí ở quy mô sản xuất để tăng hiệu suất lên men cao tạo sinh khối sợi nấm Lim xanh

Bào tử nấm Lim xanh nảy mầm tốt nhất ở nhiệt độ 22oC-26oC Trong điều kiện khô hạn ở 70oC bào tử đảm của nấm sẽ bị chết sau 5 giờ Nếu ở 80oC thì sẽ chết chỉ sau

10 phút Nhiệt độ có ảnh hưởng lớn đến sự phát triển của hệ sợi nấm Lim xanh

2.5 Tình hình nghiên cứu nấm Lim xanh trong và ngoài nước

2.5.1 Tình hình nghiên cứu nấm Lim xanh ngoài nước

Trung Quốc được coi là cái nôi phát hiện nấm Linh Chi Quốc gia này là

trung tâm lớn nhất thế giới về nuôi trồng và sản xuất nấm Linh Chi Hàng năm, trên

thế giới sản xuất 4300 tấn nấm Linh Chi, riêng Trung Quốc chiếm 3000 tấn, còn lại

là Hàn Quốc, Đài Loan, Nhật Bản, Thái Lan, Mỹ, Malaysia, Việt Nam, Indonesia và Srilanka Đến nay có rất nhiều công trình nghiên cứu về giá trị dược liệu của nấm Linh Chi Trước những lợi ích to lớn từ Linh Chi, nhiều cơ sở nuôi trồng nấm Linh Chi đã được xây dựng đặc biệt là Linh Chi đã được nuôi trồng trên quy mô công nghiệp ở Mỹ Ngoài ra tai Mỹ, Viện nghiên cứu nấm Linh Chi quốc tế đã được thành lập ở New York [27]

Nấm Linh Chi, từ nhiều ngàn năm nay đã được trọng dụng ở Á Đông, hiện nay Linh Chi là một trong những đề tài nghiên cứu và ứng dụng đang được quan tâm của ngành y dược Âu Mỹ Nấm Linh Chi được xếp vào nhóm thuốc bổ có khả năng giúp tăng lực sau khi sử dụng nấm Linh Chi Điều này không chỉ căn cứ vào cảm giác chủ quan của người dùng, mà dựa trên các tiêu chuẩn khoa học khách quan và theo kết quả của hàng trăm công trình nghiên cứu từ châu Á sang châu Âu

Trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu về trích ly và ứng dụng các hoạt chất sinh học trong nấm Linh Chi Theo công trình nghiên cứu, thành phần chủ yếu của các loại Linh Chi có: Acid amin, protid, steroid, polysaccharide, germanium, acid ganodenic [27]

Gần đây, theo tác giả Betra (2013) đã tiếp tục thử nghiệm các kỹ thuật nuôi cấy chìm để nuôi cấy sợi nấm và thu hàm lượng polysaccharide Linh chi Kết quả cho thấy, sinh khối nấm Linh chi cho kết quả tốt nhất ở nuôi cấy chìm, đã thu được 12,4 g/L sinh khối nấm khô sau 48 ngày

Theo tác giả Hyun Mi Kim (2006) đã nghiên cứu điều kiện tối ưu hóa môi

trường nuôi cấy chìm Ganoderma resinaceum để tăng cường sản xuất sinh khối và

exopolysaccharide (EPS) Sự tăng trưởng sợi nấm tối đa và sản xuất EPS trong môi trường có chứa 10g/l glucose, pepton 8g/l đậu nành và MnCl2 tại pH ban đầu 6,0 và nhiệt độ 31oC.Năm loại EPS khác nhau với trọng lượng phân tử khác nhau, từ 53.000

đến 5.257.000 g/mol thu được ở một trong hai giai đoạn tủa với ethanol Nồng độ tối

đa của sợi nấm sinh khối (42,2 g/l) và EPS (4,6 g/l) thu được vào ngày thứ 6 với hàm lượng đường bổ sung vào môi trường là 50g/l

2.5.2 Tình hình nghiên cứu nấm Lim xanh trong nước

Từ thập niên 80, nấm Linh Chi mới thực sự nuôi trồng nhiều ở Việt Nam Ngoài ra, còn thấy 15 loài nấm Linh Chi mọc hoang dại ở rừng Bắc Kạn, Thái Nguyên, Lào Cai, Lạng Sơn, Quảng Ninh, Lâm Đồng, Đồng Nai, Bình Phước, Gia Lai, Đăk Lắc Tại hội nghị kết quả công tác chuyển giao công nghệ nuôi trồng nấm

ăn và nấm dược liệu, theo tài liệu đã được công bố tới nay có 32/61 tỉnh thành có cơ

sở nuôi trồng nấm dược liệu (tháng 12/2001) Hiện nay có rất nhiều Viện, Trung tâm nghiên cứu về nấm Linh Chi ở cả Bắc và Nam nhằm lựa chọn những chủng có năng suất cao, phẩm chất tốt, phù hợp với khí hậu và đặc biệt có thể phổ biến đại trà cho các cơ sơ nuôi trồng ở một số nơi để tận dụng nguồn nguyên liệu cellulose có sẵn, tăng thu nhập cho người lao động Nhưng sản lượng nấm và sản phẩm nấm đã qua chế biến không đáp ứng đủ nhu cầu do Việt Nam mới chỉ tập trung vào điều tra, sưu tập, nêu đặc điểm phân loại, điều kiện sinh thái, các hoạt chất chính có trong nấm và chưa quan tâm nhiều đến kỹ thuật nuôi trồng ,trích ly các hoạt chất sinh học

có giá trị trong nấm linh chi và ứng dụng sản xuất thực phẩm chức năng

Hiện nay, Bộ nông nghiệp và phát triển nông thôn, các Trung tâm, viện nghiên cứu, doanh nghiệp sản xuất nấm đã đi sâu vào nuôi trồng, sản xuất thực phẩm chức năng từ nấm linh chi như: Bộ Nông nghiệp và phát triển Nông thôn đã đưa chương trình nấm quốc gia với mạng lưới lan rộng trong cả nước và kinh phí đầu tư xấp xỉ 70 tỷ đồng từ ngân sách nhà nước để hoàn thiện bộ giống nấm quốc gia và các quy trình sản xuất, chế biến nấm

Viện Di truyền là một trung tâm nghiên cứu nấm mạnh nhất cả nước, hiện tại viện đã phân lập và tạo ra nhiều giống nấm có giá trị cũng như làm chủ nhiều quy trình nuôi trồng Các giống nấm của viện đã được thương mại hóa trên toàn quốc

Hiện nay trong nước cũng rất quan tâm và có khá nhiều nghiên cứu về trích

ly và ứng dụng các hoạt chất sinh học trong nấm Linh Chi

Nhóm nghiên cứu Viện Công nghệ thực phẩm của T.S Trương Thị Hòa

trong nghiên cứu “Trích ly hoạt chất sinh học từ nấm Linh Chi” đã đã xác định

được phương pháp trích ly các hoạt chất sinh học sử dụng cho công nghệ sản xuất rượu bổ Phương pháp trích ly bằng ethanol với tỷ lệ dung môi / nguyên liệu là 1/10 đạt hiệu suất cao (8,8%) khi chiết lần 1 bằng ethanol 960

Theo kết quả của Nguyễn Thị Minh Tú trong nghiên cứu “Quy trình tách

chiết các hoạt chất sinh học từ nấm Linh Chi ” với dung môi là nước quá trình chiết

đạt tối ưu ở nhiệt độ 800

C, thời gian chiết 7h, tỷ lệ nguyên liệu/dung môi là 1/20 thì hàm lượng chất chiết thu hồi đạt 6,91% [12]

Phần 3 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

Đối tượng: Nấm Lim xanh thu thâ ̣p từ tỉnh Thanh Hóa

Vật liệu nghiên cứu:

- Mô thịt nấm Lim xanh được tách ra từ quả thể và cuống nấm

- Hệ sợi nấm sau khi phát triển trong môi trường nuôi cấy

3.2 Đi ̣a điểm và thời gian nghiên cứu

Phòng thí nghiệm nuôi cấy mô tế bào thực vật , Bô ̣ môn Công nghê ̣ sinh ho ̣c Khoa CNSH – CNTP, Trườ ng Đa ̣i ho ̣c Nông Lâm Thái Nguyên

Thời gian: Từ tháng 11/2016 đến tháng 05/2017

Hóa chất và thiết bị nghiên cứu

Hóa chất

Bảng 3 1: Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu

Các dụng cụ khác được sử dụng trong thí nghiệm bao gồm: Chai, bình tam giác, que cấy, đĩa petri, ống nghiệm, đèn cồn, giá đỡ ống nghiệp,…

3.3 Nội dung nghiên cứu

 Nô ̣i dung 1: Nghiên cứu phân lâ ̣p giống nấm Lim xanh Thanh Hóa ta ̣i trường Đa ̣i ho ̣c Nông Lâm Thái Nguyên

Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường đến khả năng phát

triển hệ sơ ̣i nấm từ mô thịt nấm

Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của độ pH đến khả năng phát triển hê ̣

sơ ̣i nấm từ mô thi ̣t

Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của loại đường đến khả năng phát triển

hê ̣ sợi nấm từ mô thi ̣t

Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lư ợng cao nấm men đến khả

năng phát triển hê ̣ sợi nấm từ mô thi ̣t

Thí nghiê ̣m 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lư ợng Pepton đến khả năng

phát triển hệ sợi nấm từ mô thịt

 Nô ̣i dung 2: Nghiên cứu nhân sinh khối sơ ̣i nấm Lim xanh bằng hê ̣ thống nuôi cấy lỏng

Thí nghiệm 6: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường đến khả năng nhân

sinh khối của hê ̣ sợi nấm Lim xanh

Thí nghiệm 7: Nghiên cứu ảnh hưởng của tốc đô ̣ lắc đến khả năng nhân sinh

khối của hê ̣ sợi nấm Lim xanh

 Nô ̣i dung 3: Tách chiết polysaccharide t ừ dịch huyền phù tế bào nấm Lim xanh

 Thí nghiê ̣m 8: Khảo sát dung môi phù hợp

 Thí nghiệm 9: Khảo sát tỷ lệ dung môi/nguyên liê ̣u

 Thí nghiệm 10: Khảo sát nhiệt độ chiết xuất

3.4 Phương pháp nghiên cứu

3.4.1 Nội dung 1: Nghiên cứu phân lâ ̣p giống nấm Lim xanh Thanh Hóa tại trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên

Phương pháp thu nhận và xử lý mẫu:

- Thu nhận quả thể còn tươi, không bị dập, nát và không bị thối nhũn

- Đưa quả thể vào túi bóng/ hộp đựng mẫu vô trùng, vận chuyển nhanh chóng

về phòng thí nghiệm

- Xử lý quả thể bằng cồn 70o trước khi tiến hành thí nghiệm

- Bảo quản quả thể nấm ở nhiệt độ 5oC

Phương pháp phân lập giống gốc:

- Có nhiều cách phân lập để tạo giống gốc như: phân lập bằng bào tử, phân lập từ thể quả, tách sợi nấm từ cơ chất có nấm mọc.Nhưng phân lập từ thể quả cho kết quả phân lập cao, hạn chế hiện tượng bị lẫn và nhiễm các vi sinh vật khác

 Xử lý quả thể bằng cồn 70o (mục đích loại bỏ một số loại nấm mốc, vi sinh vật và bụi bẩn)

 Dùng kéo và pank kẹp đã được hơ trên ngọn lửa đèn cồn để cắt quả thể thành những mảnh có kích thước khoảng 0.5 – 1 cm

 Chuyển nhanh lên môi trường đã được chuẩn bị sẵn ( môi trường thạch PDA)

Nuôi trong điều kiện không có ánh sáng, nhiệt độ 20 – 23oC, theo dõi sau 3 ngày sau cấy mẫu

Chúng tôi tiến hành phân lập giống nấm Lim xanh với quy trình như sau:

Hình 3.1: Quy trình phân lập giống nấm Lim xanh

Các thí nghiệm được bố trí như sau:

Thí nghiệm 1: Nghiên cư ́ u ảnh hưởng của môi trường đến khả năng tạo hê ̣ sợi nấm từ mô thịt nấm

với thành phần 200g/l khoai tây, 20g/l glucose, 4g/l pepton, 17g Agar, 10% nước dừa già, pH=6,5

Quả thể nấm Lim xanh

Mô thịt, cuống nấm Đổ môi trường ra đĩa

petri vô trùng để nguội

Loại bỏ những mẫu nhiễm khuẩn, nhiễm mốc, sợi phát triển yếu, chậm hơn so với những mẫu cấy cùng đợt

Nuôi sợi trong điều kiện

22oC – 28oC ánh sáng

mờ hoặc không có ánh sáng

Kiểm tra chất lượng giống sau 2 ngày cấy,định kỳ kiểm tra 2 – 3 ngày 1 lần, thời gian 12 -15 ngày

Giống gốc đạt tiêu chuẩn

Loại bỏ bụi bẩn ở quả thể nấm bằng cồn 70o

-

Môi trường khoai tây (PDA)

Phương pháp chuẩn bị môi trường nuôi cấy:

- Bước 1: Cân lấy 200g khoai tây đã được rửa sạch, gọt vỏ rồi cắt nhỏ thành hình khối khoảng 1cm

- Bước 2: Cho khoai vào nồi rồi thêm khoảng 800ml nước cất, đun sôi khoảng

10 - 15 phút

- Bước 3: lọc bỏ cặn

- Bước 4: Bổ sung đường, Agar, Pepton, rồi chuẩn lên 1 lít

- Bước 5: Chuẩn pH = 6,5

- Bước 6: Cho vào bình tam giác rồi hấp khử trùng (121oC trong 30 phút)

Môi trường ngô (CDA):

Môi trường PDA + 10% nước dừa (kí hiệu môi trường *)

Thành phần nguyên liệu: Nước dừa trưởng thành, khoai tây

1 Nước dừa già: 100 ml

2 Agar: 17g

Thí nghiệm tiến hành với các công thức:

Bảng 3 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của độ pH đến khả năng phát triển hệ sợi nấm

- Thí nghiệm được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn với 3 lần nhắc lại

Chỉ tiêu theo dõi : Khả năng phát triển của hệ sợi nấm từ mô thịt / môi trường phân

lâ ̣p, sự phát triển của hê ̣ sợi nấm, màu sắc hệ sợi nấm

Thí nghiệm 3: Nghiên cư ́ u ảnh hưởng của lo ại đường đến khả năng phát triển hê ̣ sợi từ nấm từ mô thi ̣t

Thí nghiệm gồm 1 nhân tố, bố trí thí nghiê ̣m hoàn toàn ngẫu nhiên (CRD)

Bảng 3 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của loại đường đến khả năng phát triển hệ

sợi nấm Lim xanh

Thí nghiệm 4: Nghiên cư ́ u ảnh hưởng của hàm lượng cao nấm men đến khả năng phát triển hệ sợi từ nấm từ mô thi ̣t

Bảng 3 4: Nghiên cư ́ u ảnh hưởng của hàm lượng cao nấm men đến khả năng

phát triển hệ sợi từ nấm từ mô thi ̣t

Công thức Hàm lượng Pepton/lít môi

trường(g)

- Thí nghiệm được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn với 3 lần nhắc lại

Thí nghiệm 5: Nghiên cư ́ u ảnh hưởng của hàm lượng Pepton đến khả năng phát triển hê ̣ sợi từ nấm từ mô thi ̣t

Bảng 3 5: Nghiên của ảnh hưởng của hàm lượng Pepton đến khả năng phát

triển hệ sợi nấm từ mô thịt

- Thí nghiệm được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn với 3 lần nhắc lại

3.4.2 Nội dung 2: Nghiên cứu nhân sinh khối sợi nấm Lim xanh bằng hê ̣ thống nuôi cấy lỏng

- Thí nghiệm 1: Nghiên cư ́ u ảnh hưởng của môi trường đến khả năng nhân sinh khối của hê ̣ sợi nấm Lim xanh

Nuôi cấy sinh khối nấm Lim xanh trong môi trường lỏng PD

- Môi trường dinh dưỡng rất quan trọng trong việc nuôi và để cho sinh khối nấm Lim xanh phát triển Chuẩn bị 10 bình trụ miệng nhỏ 500 ml có 250ml môi trường lỏng PD và CD (thành phần môi trường được nêu rõ ở phụ lục 3), môi trường trước khi nuôi cấy đã được hấp khử trùng Tiến hành cấy chuyển từ các sợi

Chỉnh pH= 6,5 Khử trùng ở 121oC

Giống cấp 2

Lắc 100 vòng/phút trong 7-12 ngày Nhiệt độ: 23oC

nấm trên đĩa thạch PDA sang môi trường lỏng PD và CD Nuôi cấy với tốc độ lắc

100 vòng/phút, tại 22oC, 3 ngày xác định khối lượng một lần, theo dõi trong 12 ngày, thí nghiệm lặp lại 2 lần

- Thí nghiệm 2: Nghiên cư ́ u ảnh hưởng của tốc độ lắc đến khả năng nhân sinh khối của hệ sợi nấm Lim xanh

- Chuẩn bị 10 bình trụ miệng nhỏ 500 ml có 250ml môi trường lỏng PD Môi trường trước khi nuôi cấy đã được hấp khử trùng Tiến hành cấy chuyển từ các sợi nấm trên đĩa thạch PDA sang môi trường lỏng PD Nuôi cấy với tốc độ lắc khác nhau, tại 22oC, 3 ngày xác định khối lượng một lần, theo dõi trong 12 ngày, thí nghiệm lặp lại 2 lần

Bảng 3 6: Nghiên cư ́ u ảnh hưởng của tốc đô ̣ lắc đến khả năng nhân sinh khối

của hệ sợi nấm Lim xanh

Công thức Tốc độ lắc( vòng/phút)

Chúng tôi xây dựng quy trình nuôi cấy sinh khối giống nấm lim xanh như sau:

Hình 3.2: Sơ đồ quy trình nuôi sinh khối hệ sợi nấm Lim xanh

Pha môi trường PD ( thành phần môi trường được nêu rõ ở phụ lục 3) chuẩn pH = 6,5

- Chia môi trường vào bình nuôi cấy 500ml ( mỗi bình nuôi cấy chauws 250ml môi trường ) sau đó hấp khử trùng ở 121oC trong 30 phút

- Dung pank đã vô trùng gắp hệ sợi nấm từ giống cấp 2 vào các bình môi trường (tiến hành trong box vô trùng)

- Nuôi lắc ở các điều kiện: 100 vòng/ phút, nhiệt độ 23oC trong 7 – 12 ngày

- Thu sinh khối nấm Lim xanh

3.4.3 Nội dung 3: Nghiên cứu thu tá ch chiết polysaccharides từ dịch huyền phù tế bào nấm Lim xanh (thu sinh khối từ bào tử nấm lim xanh trong môi trường lỏng)

Quy trình nghiên cứu

- Khảo sát dung môi phù hợp

Việc sử dụng loại dung môi nào cho trích ly là rất quan trọng, vì dung môi để hòa tan các chất cần trích ly và hạn chế hòa tan các tạp chất, do đó dung môi có ảnh hưởng lớn tới chất lượng của dịch chiết và thành phẩm Dựa trên tính chất vật lý( độ nhớt, sức căng bề mặt, độ phân cực) và đặc tính hòa tan chọn lọc của dung môi đối với các hoạt chất để lựa chọn dung môi Được biết các hoạt chất sinh học của nấm Lim xanh có cả chất phân cực và không phân cực, một số chất tan trong nước, một

số ít không tan trong nước mà tan trong các dung môi như methanol [18,19], ethanol [24] và ethyl acetate [11] Chọn dung môi cho việc trích ly, ngoài yếu tố hòa tan chọn lọc cao, độ nhớt thấp, sức căng bề mặt nhỏ, còn phải lưu ý đến tính độc của dung môi, quan tâm đến vấn đề kinh tế, rẻ tiền và dễ kiếm Do đó, chúng tôi chọn nước là dung môi cho quá trình trích ly nấm Lim xanh và sử dụng dung môi này cho các nghiên cứu tiếp theo

Dung môi: Methanol 90o; Ethanol 90o; Ethyl acetate 90o

+ Khối lượng mẫu: 1g

+ Thời gian: 90 phút và nhiệt độ: 80oC

+ Tỷ lệ nguyên liệu/dung môi là: 1/20, 1/30 và 1/40

+ Trích ly bằng thiết bị sóng siêu âm và bể ổn nhiệt

Dịch thô thu được đem lọc qua giấy lọc Sau đó sấy đến khối lượng không đổi ở

45oC đến 50o

C và tiến hành cân khối lượng đê xác định polysaccharide Thí nghiệm này xác định được dung môi phù hợp nhất và dùng cho các thí nghiệm tiếp theo

- Khảo sát tỷ lệ dung môi/nguyên liê ̣u

Để trích ly được tối ưu hiệu quả chiết xuất polysaccharides ra khỏi bã thì tỉ lệ giữa dung môi chiết/nguyên liệu rất quan trọng và cần thiết trong tính toán tính hiệu quả kinh tế trong quá trình trích ly polysaccharides Do đó,chúng tôi đã tiến hành trích ly ở các công thức giữa nguyên liệu/dung môi như sau:

+ 1/20; 1/30; 1/40

+ Khối lượng mẫu: 1g

+ Dung môi: Theo phần khảo sát dung môi phù hợp (chọn dung môi tối ưu nhất) + Nồng độ dung môi: 90%

+ Trích ly bằng bể ổn nhiệt và bể siêu âm

+ Thời gian trích ly: 90 phút

+ Nhiệt độ trích ly: 70oC

Dịch trích ly xong dùng giấy lọc đã sấy khô đến khối lượng không đổi để lọc dịch Khi lọc xong giấy lọc chưa dịch được sấy ở 50oC đến khối lượng không đổi

từ thí nghiệm này ta xác định được tỷ lệ nguyên liệu/dung môi tối ưu nhất

- Khảo sát nhiệt độ chiết xuất

Nhiệt độ trích ly là yếu tố quan trọng ảnh hưởng tới hiệu suất của quá trình trích ly các chất trong nấm Lim xanh Vì vậy trong thí nghiệm này chúng tôi khảo sát ở các nhiệt độ trích ly sau: 70oC; 80oC; 90oC

Để tiến hành thí nghiệm dễ dàng, chúng tôi cố định các điều kiện sau:

+ Trích ly bằng bể ổn nhiệt và bể siêu âm

+ Thời gian trích ly: 90 phút

Dịch trích ly xong dùng giấy lọc đã sấy khô đến khối lƣợng không đổi để lọc dịch Khi lọc xong giấy lọc chƣa dịch đƣợc sấy ở 50oC đến khối lƣợng không đổi

từ thí nghiệm này ta xác định đƣợc nhiệt độ tối ƣu cho hiệu quả trích ly cao nhất Chúng tôi tiến hành trích ly polysaccharide với quy trình nhƣ sau:

Hình 3.3: Sơ đồ quy trình trích ly polysaccharide từ sinh khối nấm Lim xanh

Lọc qua vải lọc 2

lần Nhiệt độ: 45-50oC

Thời gian: 36-48h

Nồng độ: 90%

Tỉ lệ nguyên liệu/dung môi: 1/30 Nhiệt độ: 80oC

Nhiệt độ: 45-50oC

Từ dịch nuôi cấy tiến hành lọc qua vải lọc 2 lần

- Sấy mẫu đã lọc ở nhiệt độ 45- 50oC trong thời 36-48h

- Nghiền nhỏ mẫu, tủa bằng ethanol 90% với tỉ lệ nguyên liệu/dung môi: 1/30

PHẦN 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Nghiên cứu kỹ thuật phân lâ ̣p giống nấm Lim xanh Thanh Hóa ta ̣i trường

Đa ̣i ho ̣c Nông Lâm Thái Nguyên

4.1.1 Nghiên cư ́ u ảnh hưởng của môi trường đến khả năng tạo hê ̣ sợi nấm từ

mô thịt nấm

Để nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường đến khả năng t ạo hê ̣ sợi nấm Lim xanh từ mô thịt, chúng tôi thực hiện cấy nấm lên trên 3 môi trường cơ bản là: PDA, CDA, PDA + 10%nước dừa ở cùng một điều kiện nuôi là 23oC, không chiếu sáng Kết quả cho thấy nấm Lim xanh sinh trưởng và phát triển trên các môi trường cơ bản có sự khác biệt khá rõ ràng (hình 4.1)

Hình 4 1: Nấm lim xanh phát triển trên một số môi trường cơ bản(sau 13 ngày

nuôi cấy)

Kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng nấm Lim xanh có sự sinh trưởng và phát triển trên các môi trường khác nhau

- Trên môi trường CDA: nấm Lim xanh sinh trưởng và phát triển kém hơn hẳn

so với môi trường PDA + 10%nước dừa và PDA, quan sát sau 5 ngày nuôi cấy cho thấy sợi nấm ngắn, các sợi nấm đan sát vào nhau Các ngày sau đó hệ sợi nấm phát triển rất chậm và sau 15, 20, 25 ngày nấm không phát triển thêm nữa Điều đó cho thấy môi trường CDA không thích hợp cho nấm phát triển

- Trên môi trường PDA, sau khoảng 3 ngày nuôi cấy, nấm Lim xanh đã bắt đầu phát triển hệ sợi và tạo khuẩn lạc, kích thước tăng dần theo thời gian Nhận thấy sợi nấm có màu trắng bông, mọc chằng chịt, ăn sát bề mặt thạch lan đều về các phía Tốc độ sinh trưởng đều, sau ngày 20, sợi nấm có màu ngả vàng và đậm dần trong các ngày tiếp theo

- Trên môi trường PDA + 10%nước dừa sợi nấm phát triển hơn hẳn so với 2 môi trường còn lại Do các thành phần hóa học trong nước dừa chúng có khả năng hỗ trợ sự phát triển của sợi nấm Nước dừa có chứa nhiều thành phần dinh dưỡng như: protein, sắt, nitơ, oxit canxi, vitamin, acid amin, enzyme, khoáng chất và chất kích thích sinh trưởng,… Qua đó, chúng tôi nhận thấy trên 2 môi trường PDA và PDA + 10%nước dừa sợi nấm phát triển và để xác định môi trường nào tốt hơn cho sự phát triển của nấm Lim xanh chúng tôi tiến hành so sánh giữa hai môi trường Kết quả được ghi lại trong bảng 4.1

Bảng 4 1: Đường kính sinh trưởng của hệ sợi nấm Lim xanh trên các môi

trường PDA và PDA + 10% nước dừa

Môi

trường

Đường kính sinh trưởng của hệ sợi sau các ngày nuôi ( mm )

3 ngày 6 ngày 9 ngày 12 ngày 15 ngày

Từ bảng 4.1 chúng tôi nhận thấy nấm Lim xanh sinh trưởng như sau:

Trên môi trường PDA + 10% nước dừa:

- Sau 3 ngày, đường kính sinh trưởng trung bình của hệ sợi nấm Lim xanh đạt 12,09 mm

- Sau 6 ngày, đường kính sinh trưởng trung bình của hệ sợi nấm Lim xanh đạt 22,55 mm

- Sau 9 ngày, đường kính sinh trưởng trung bình của nấm hệ sợi hệ sợi Lim xanh đạt 33,65 mm

- Sau 12 ngày, đường kính sinh trưởng trung bình của nấm hệ sợi Lim xanh đạt 40,36 mm

- Sau 15 ngày, đường kính sinh trưởng trung bình của nấm hệ sợi Lim xanh đạt 50,45 mm

Kết quả trên cho thấy nấm Lim xanh phát triển khá đều trên môi trường PDA + 10% nước dừa

Trên môi trường PDA: nấm phát triển khá đều trong mấy ngày đầu sau đó đã

có phần giảm tốc độ sinh trưởng so với môi trường PDA + nước dừa

- Sau 3 ngày, đường kính sinh trưởng trung bình của hệ sợi nấm Lim xanh đạt 10,22 mm

- Sau 6 ngày, đường kính sinh trưởng trung bình của hệ sợi nấm Lim xanh đạt 20,82 mm

- Sau 9 ngày, đường kính sinh trưởng trung bình của hệ sợi nấm Lim xanh đạt 30,36 mm

- Sau 12 ngày, đường kính sinh trưởng trung bình của hệ sợi nấm Lim xanh đạt 37,55 mm

- Sau 15 ngày, đường kính sinh trưởng trung bình của hệ sợi nấm Lim xanh đạt 43,67 mm

Để thuận tiện hơn cho sự đánh giá quan sát, chúng tôi đã vẽ biểu đồ thể hiện sự sinh trưởng của nấm Lim xanh trên 2 môi trường PDA và PDA + 10% nước dừa dưới đây:

Hình 4 2: Biểu đồ thể hiện sự sinh trưởng của hệ sợi nấm Lim xanh trên môi

trường PDA và PDA + 10% nước dừa

Từ hình 4.2 ta nhận thấy: Môi trường nuôi cấy khác nhau có ảnh hưởng khác nhau đến tốc độ của hệ sợi nấm Chúng tôi thấy môi trường PDA + 10% nước dừa cho

sự sinh trưởng của sợi nấm là cao nhất với giá trị trung bình là 50,45 mm trong thời gian quan sát Mặt khác, môi trường PDA cho thấy được sự phát triển của sợi nấm đều

Kết quả trên chỉ ra rằng môi trường nước PDA + 10% nước dừa là môi trường thích hợp và thuận lợi nhất cho sự phát triển của sợi nấm Lim xanh

4.1.2 Nghiên cư ́ u ảnh hưởng của đ ộ pH đến k hả năng phát triển hệ sợi nấm từ

mô thịt

Để xác định sự ảnh hưởng cảu pH môi trường đến sự sinh trưởng của hệ sợi nấm Lim xanh, chúng tôi đã tiến hành nuôi cấy trong các thang pH khác nhau Nấm được nuôi trên môi trường PDA + 10% nước dừa, ở nhiệt độ 23oC, không chiếu sáng Sự sinh trưởng của hệ sợi nấm các thang pH được thể hiện trong bảng 4.2 và hình 4.3

Bảng 4 2: Đường kính sinh trưởng của hệ sợi nấm Lim xanh ở các điều kiện

pH khác nhau

pH môi

trường

Đường kính sinh trưởng của hệ sợi sau các ngày nuôi (mm)

3 ngày 6 ngày 9 ngày 12 ngày 15 ngày