Nghiên cứu xác định đột biến gen CYP11B1 ở bệnh nhân tăng sản thượng thận bẩm sinh do thiếu hụt 11betahydroxylase

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGUYỄN THỊ PHƯƠNG MAI NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN GEN CYP11B1 Ở BỆNH NHÂN TĂNG SẢN THƯỢNG THẬN BẨM SINH DO THIẾU

VIỆN HÀN LÂM VÀ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGUYỄN THỊ PHƯƠNG MAI

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN

GEN CYP11B1 Ở BỆNH NHÂN

TĂNG SẢN THƯỢNG THẬN BẨM SINH

DO THIẾU HỤT 11 BETA HYDROXYLASE

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Hà Nội – 2018

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGUYỄN THỊ PHƯƠNG MAI

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN

GEN CYP11B1 Ở BỆNH NHÂN

TĂNG SẢN THƯỢNG THẬN BẨM SINH

DO THIẾU HỤT 11 BETA HYDROXYLASE

Chuyên ngành: Di truyền học

Mã số: 9 42 01 21

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: 1 PGS.TS Nguyễn Huy Hoàng

2 PGS.TS Nông Văn Hải

Hà Nội - 2018

i

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin được bày tỏ lời cảm ơn chân thành và chia sẻ tới các bệnh nhân và gia đình họ Đó là những người đang ngày đêm phải chống chọi với bệnh tật Họ là động lực giúp tôi luôn có khát khao được giúp đỡ, được sẻ chia và phấn đấu trong nghiên cứu khoa học

Tôi xin được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới PGS TS Nguyễn Huy Hoàng và PGS TS Nông Văn Hải, là những người thầy hướng dẫn khoa học, đã tận tình truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm vô cùng quý báu để tôi có thể hoàn thành được luận án này

Tôi xin chân thành cảm ơn Viện Công nghệ sinh học; ThS Bùi Thị Hải

Hà - phụ trách đào tạo Viện Công nghệ sinh học; Viện Nghiên cứu hệ gen, Phòng nghiên cứu hệ gen học chức năng- Viện Nghiên cứu hệ gen, đã giúp

đỡ, tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành nghiên cứu thí nghiệm Tôi xin gửi lời cảm ơn tới GS Rita Bernhardt, bộ môn Hóa sinh, trường ĐHTH Saarlandes, CHLB Đức đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho chúng tôi tiến hành thí nghiệm

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Ban Giám đốc, các phòng ban chức năng Bệnh viện Nhi trung ương, Khoa Nội tiết-Chuyển hoá-Di truyền và Khoa Di truyền và Sinh học phân tử, Bệnh viện Nhi trung ương, cùng toàn thể các đồng nghiệp trong khoa, là nơi tôi công tác, đã đồng hành và chia sẻ, giúp đỡ, tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi có thể hoàn thành luận án

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến TS BS Vũ Chí Dũng, trưởng khoa Nội tiết-Chuyển hóa-Di truyền và TS BS Ngô Diễm Ngọc, trưởng khoa

Di truyền và Sinh học phân tử đã giúp đỡ, tạo mọi điều kiện và chia sẻ những kinh nghiệm quý báu để tôi hoàn thành luận án

ii

Tôi xin được bày tỏ sự kính trọng, tình yêu thương vô bờ bến đối với bố

mẹ, gia đình, Minh Anh và bạn bè tôi, đã ủng hộ và cổ vũ cho tôi trong suốt thời gian học tập và làm việc

Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn và tình yêu thương sâu sắc tới chồng tôi, BS Đào Trung Dũng và hai con gái, Phương Linh-Minh Châu Tình yêu,

sự chia sẻ, ủng hộ và những hy sinh thầm lặng của họ là chỗ dựa vững chắc, giúp tôi thêm nghị lực để hoàn thành luận án này

Lời cuối cùng, tôi xin dành tặng tới Người Người đã cho tôi thấy tôi là

ai, con đường tôi đang đi và sẽ đi, để tôi thấy trong tôi luôn có một tình yêu thương vô điều kiện và nhiệt huyết trong cuộc sống và công việc

Hà Nội, ngày tháng năm 2018

Nguyễn Thị Phương Mai

iii

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan:

Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các cộng sự khác

Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả

Phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Hà Nội, ngày tháng năm 2018

Tác giả

Nguyễn Thị Phương Mai

iv

MỤC LỤC

Trang

MỞ ĐẦU……… 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU……… 4

1.1 Lịch sử nghiên cứu bệnh thiếu hụt 11β-hydroxylase……… 4

1.1.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới……… 4

1.1.2 Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam……… 6

1.1.3 Dịch tễ học bệnh thiếu hụt 11β-hydroxylase……… 7

1.2 Định nghĩa, cơ sở hóa sinh và sinh lý bệnh học của TSTTBS do thiếu hụt 11β-hydroxylase……… 12

1.2.1 Định nghĩa TSTTBS và các enzyme tham gia tổng hợp

cortisol……… 12

1.2.2 Cơ sở hóa sinh của bệnh TSTTBS……… 13

1.2.3 Sinh lý bệnh TSTTBS do thiếu 11β-hydroxylase……… 15

1.3 Di truyền phân tử của bệnh thiếu hụt 11β-hydroxylase…… 16

1.3.1 Gen CYP11B1……… 16

1.3.2 11β-hydroxylase……… 18

1.4 Đặc điểm lâm sàng bệnh thiếu hụt 11β-hydroxylase……… 22

1.4.1 Thể cổ điển……… 22

1.4.2 Thể không cổ điển……… 26

1.4.3 Người mang gen/dị hợp tử……… 27

1.4.4 Một số các đặc điểm lâm sàng khác……… 27

1.5 Điều trị bệnh thiếu hụt 11 β hydroxylase……… 34

1.5.1 Liệu pháp thay thế glucocorticoid……… 34

1.5.2 Điều trị hạ huyết áp……… 35

1.5.3 Chẩn đoán và điều trị trước sinh……… 35

1.6 Các phương pháp phân tích đột biến gen CYP11B1………… 36

1.6.1 Phương pháp giải trình tự gen CYP11B1………

1.6.2 Phương pháp phân tích sự ảnh hưởng của đột biến mới

36

v

tới cấu trúc và chức năng của enzyme CYP11B1……… 37

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 39 2.1 Đối tượng nghiên cứu……… 39

2.1.1 Tiêu chuẩn chọn bệnh nhân……… 39

2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ……… 40

2.2 Đạo đức trong nghiên cứu……… 40

2.3 Hóa chất và thiết bị nghiên cứu……… 41

2.3.1 Hóa chất nghiên cứu……… 41

2.3.2 Thiết bị nghiên cứu……… 41

2.4 Phương pháp nghiên cứu……… 43

2.4.1 Quy trình thu thập và tách chiết mẫu nghiên cứu……… 45

2.4.2 Phương pháp giải trình tự gen CYP11B1……… 46

2.4.3 Phương pháp phân tích đột biến mới……… 47

2.4.4 Các phương pháp tin sinh học……… 52

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU……… 54

3.1 Kết quả xác định đột biến gen CYP11B1……… 54

3.1.1 Đặc điểm chung của nhóm nghiên cứu……… 54

3.1.2 Kết quả khuếch đại gen CYP11B1……… 54

3.1.3 Kết quả xác định đột biến gen CYP11B1……… 56

3.1.4 Mối tương quan kiểu gen- kiểu hình các đột biến mới… 58

3.1.5 Mối tương quan kiểu gen p.R43Q- kiểu hình……… 68

3.2 Nghiên cứu sự ảnh hưởng của các đột biến mới trên gen CYP11B1 tới hoạt tính enzyme CYP11B1……… 73

3.2.1 Đột biến p.R51K……… 73

3.2.2 Đột biến p.E147D-p.N152K……… 75

3.3 Phân tích sự ảnh hưởng của đột biến mới trên gen CYP11B1 tới cấu trúc enzyme CYP11B1……… 77

3.3.1 Kết quả mô hình cấu trúc 3 chiều của enzyme CYP11B1 77

3.3.2 Ảnh hưởng của đột biến mới tới cấu trúc của enzyme CYP11B1……… 80

vi

3.3.3 Đột biến vùng trượt gen IVS6+5G>T……… 83

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN KẾT QUẢ……… 84

4.1 Các đột biến phát hiện trên gen CYP11B1 ở các bệnh nhân nghiên cứu……… 84

4.2 Sự ảnh hưởng của các đột biến mới tới hoạt tính enzyme CYP11B1……… 88

4.2.1 Đột biến p.R51K……… 88

4.2.2 Đột biến p.E147D/p.N152K……… 89

4.2.3 Đột biến Y395X……… 91

4.3 Sự ảnh hưởng của các đột biến mới tới cấu trúc enzyme CYP11B1……… 92

4.3.1 Đột biến thay thế axit amin……… 93

4.3.2 Đột biến vùng trượt gen……… 98

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ……… 104

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI LUẬN ÁN……… 106

TÓM TẮT LUẬN ÁN BẰNG TIẾNG ANH……… 107

TÀI LIỆU THAM KHẢO……… 115

PHỤ LỤC Phụ lục 1 Danh sách các bệnh nhân nghiên cứu……… 1

Phụ lục 2 Mẫu bệnh án nghiên cứu……… 3

Phụ lục 3 Kết quả đo nồng độ và độ tinh sạch các mẫu DNA tách từ máu ngoại vi của các bệnh nhân……… 6

Phụ lục 4 Kiểu gen và kiểu hình bệnh nhân nghiên cứu……… 7

vii

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

11βOH 11β-hydroxylase, enzyme

CYP11B1, 11-beta-hydroxylase 11βOHD 11β-hydroxylase deficiency Thiếu hụt 11β-hydroxylase 17-CS 17-cetosteroid

CYP Cytochrome P450

DHEA Dehydroepiandrosterone

DHEAS DHEA sulfate

DMEM Dulbecco’s modified Eagle’s

medium

E.Coli Escherichia coli

EDTA Ethylenedinitrilotetraacetic acid

FBS Fetal Bonvine serum

ffDNA Fetal free-DNA DNA thai nhi lưu hành tự do

trong máu mẹ FSH Follicle stimulating hormone Hormone kích thích nang

trứng GC-MS Gas chromatography-mass

spectrometry HGMD Human gene mutations database Dữ liệu đột biến gene người

HPTLC High performance thin layer

ix

phosphate

NHĐT Simple virilization Nam hoá đơn thuần

POR P450 oxidoreductase

PWM Position weight matrix

RNA Ribonucleic acid

TART Testicular adrenal rest tumors U t inh hoàn xuất phát từ tế

bào có nguồn gốc thượng thận

Taq Thermus aquaticus

x

DANH MỤC BẢNG

Trang Bảng 1.1 Các thể bệnh TSTTBS và thiếu hụt tổng hợp cortisol do thiếu

enzyme vỏ thượng thận……… 8

Bảng 1.2 Phân loại các đột biến trên gen CYP11B1 dựa trên các nghiên cứu in-vitro……… 19

Bảng 1.3 Các triệu chứng lâm sàng, xét nghiệm hoá sinh và đặc điểm di truyền của các bệnh liên quan tới thiếu hụt isozyme 11β-hydroxylase……… 33

Bảng 2.1 Trình tự đoạn Oligonucleotides……… 42

Bảng 2.2 Thành phần dung dịch đệm RF1, RF2……… 48

Bảng 2.3 Thành phần gel tách/gel cô polyacrilamide……… 50

Bảng 3.1 Kiểu đột biến gen CYP11B1 phát hiện trên các bệnh nhân nghiên cứu……… 56

Bảng 3.2 Kiểu gen- kiểu hình của các bệnh nhân có đột biến mới…… 57

Bảng 3.3 Xét nghiệm hóa sinh bệnh nhân MS CYP11B1-010………… 59

Bảng 3.4 Xét nghiệm hóa sinh bệnh nhân MS CYP11B1-011………… 62

Bảng 3.5 Xét nghiệm hóa sinh bệnh nhân MS CYP11B1-006 và MS CYP11B1-008……… 64

Bảng 3.6 Xét nghiệm hóa sinh bệnh nhân MS CYP11B1-004………… 67

Bảng 3.7 Xét nghiệm hóa sinh bệnh nhân MS CYP11B1-012………… 69

Bảng 3.8 Xét nghiệm hóa sinh bệnh nhân MS CYP11B1-005………… 71

Bảng 3.9 Xét nghiệm hóa sinh bệnh nhân MS CYP11B1-002………… 73

Bảng 4.1 Một số đột biến thay thế amino acid trên gen CYP11B1 dẫn đến sự ảnh hưởng hoạt tính 11β-hydroxylase trong tế bào động vật……… 97

Bảng 4.2 Đột biến trượt gen đã được phát hiện trên gen CYP11B1… 98

Bảng 4.3 Chỉ số đánh giá trượt gen của các đột biến vùng splicing đã được phát hiện trên gen CYP11B1……… 101

xi

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Trang

Hình 1.1 Con đường tổng hợp hormone steroid từ cholesterol của vỏ

thượng thận……… 14

Hình 1.2 Các phản ứng xúc tác bởi enzyme CYP11B1……… 15

Hình 1.3 Vị trí gen CYP11B1 và gen CYP11B2 trên NST số 8……… 17

Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu……… 44

Hình 2.2 Sơ đồ nhân đoạn gen CYP11B1……… 46

Hình 2.3 Cấu trúc của vector pSVL……… 47

Hình 3.1 Phân loại kiểu hình các bệnh nhân nghiên cứu……… 54

Hình 3.2 Sản phẩm PCR khuếch đại gen CYP11B1… 55

Hình 3.3 Phân bố các đột biến trên gen CYP11B1 trong nghiên cứu 56

Hình 3.4 Đột biến p.R51K ở bệnh nhân MS CYP11B1-010……… 58

Hình 3.5 Bệnh nhân MS.CYP11B1-010……… 59

Hình 3.6 Đột biến p.E147D và p.N152K ở bệnh nhân MS CYP11B1-011……… 60

Hình 3.7 Bệnh nhân MS CYP11B1-011……… 61

Hình 3.8 Đột biến IVS6+5G>T bệnh nhân MS CYP11B1-006…… 63

Hình 3.9 Bệnh nhân MS CYP11B1-006……… 64

Hình 3.10 Đột biến IVS6+5G>T ở bệnh nhân MS CYP11B1-008… 65

Hình 3.11 Đột biến p.Y395X bệnh nhân MS CYP11B1-004………… 66

Hình 3.12 Bệnh nhân MS CYP11B1-004……… 67

Hình 3.13 Kiểu hình các bệnh nhân có đột biến dị hợp tử p.R43Q…… 68

Hình 3.14 Bệnh nhân MS CYP11B1-012……… 70

Hình 3.15 Bệnh nhân MS CYP11B1-005……… 71

Hình 3.16 Bệnh nhân MS CYP11B1-002……… 72

Hình 3.17 Đột biến p.R51K biểu hiện trong tế bào động vật COS-1… 74

Hình 3.20 Phân tích hoạt tính của 11β-hydroxylase có đột biến

p.E147D và p.N152K ở tế bào động vật COS-1……… 76

Hình 3.21A So sánh trình tự axit amin CYP11B1 và CYP11B2 của

người, bò, chuột, lợn và bằng chương trình CLUSTALW1 77

Hình 3.21B So sánh trình tự axit amin CYP11B1 và CYP11B2 của

người, bò, chuột, lợn và bằng chương trình CLUSTALW1 78

Hình 3.21C So sánh trình tự axit amin CYP11B1 và CYP11B2 của

người, bò, chuột, lợn và bằng chương trình CLUSTALW1 79

Hình 3.21D So sánh trình tự axit amin CYP11B1 và CYP11B2 của

người, bò, chuột, lợn và bằng chương trình CLUSTALW1 80

Hình 3.22 Mô hình cấu trúc 3D của đột biến p.R51K……… 81

Hình 3.23 Mô hình cấu trúc 3D của đột biến p.E147D……… 82

Hình 3.24 Mô hình cấu trúc 3D của đột biến p.N152K……… 83

Hình 4.1 Vị trí đột biến p.R43Q trên mô hình protein CYP11B1…… 85

Hình 4.2 Vị trí các đột biến trên gen CYP11B1 đã được công bố trên

Hình 4.3 Mô hình cấu trúc không gian của enzyme CYP11B1 và vị

trí các đột biến được phát hiện trong nghiên cứu………… 94

Hình 4.4 Mô hình cấu trúc 3D CYP11B1 ở người……… 95

1

MỞ ĐẦU

Tăng sản thượng thận bẩm sinh (TSTTBS) là một nhóm các bệnh di truyền lặn trên nhiễm sắc thể thường do sự khiếm khuyết một phần hoặc hoàn toàn của một trong số các enzyme tham gia tổng hợp cortisol từ cholesterol ở tuyến thượng thận Đặc điểm lâm sàng và hoá sinh của bệnh phụ thuộc vào khiếm khuyết enzyme đặc hiệu (Speiser và cs, 2010) Những nghiên cứu đầu tiên về bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh được nhà giải phẫu học người Italy, Luigi Crecchio, đưa ra vào cuối thế kỉ XIX khi ông phát hiện ra những biểu hiện nam hóa ở những bệnh nhân nữ mà ông tiến hành phẫu thuật (Delle Piane và cs, 2015) Những bệnh nhân đó không có đường cong ở nữ giới, có râu, cơ bắp phát triển, âm vật bị biến đổi tuy nhiên họ vẫn có âm đạo, tử cung, ống dẫn trứng và buồng trứng bình thường Vào giữa thế kỉ XX, nhiều nghiên cứu về hormone tuyến thượng thận trong cơ thể người đã được tiến hành và thuật ngữ “tăng sản thượng thận bẩm sinh” (Congenital Adrenal Hyperplasia - CAH) đã ra đời để giảm đi sự mơ hồ về bệnh này và nhấn mạnh những biến đổi sinh lý do bệnh gây ra

Khoảng 90-95% các trường hợp mắc TSTTBS là do thiếu hụt 21- hydroxylase; 5-8% trường hợp TSTTBS bắt nguồn từ sự suy giảm 11β-hydroxylase (Zachmann và cs, 1983) Còn lại là các trường hợp TSTTBS do

sự suy giảm các enzyme hiếm gặp khác như 17- hydroxylase (17-OH), 3β- hydroxysteroid dehydrogenase (3β-HSD) và 20/22 Desmolase Bệnh TSTTBS với các dấu hiệu suy thượng thận cấp có thể dẫn đến tử vong ở thể mất muối hay trẻ có các biểu hiện nam tính hoá ở trẻ gái, giả dậy thì sớm ở trẻ trai gây ảnh hưởng nặng nề đến sự phát triển chiều cao, chức năng sinh dục, sinh sản và tâm lý (Arlt và Krone, 2007, Merke và Bornstein, 2005, Ogilvie

và cs, 2006, White và Speiser, 2000)

2

TSTTBS do thiếu hụt 11β-hydroxylase là bệnh hiếm gặp di truyền lặn trên nhiễm sắc thể thường Bệnh do sự thiếu hụt hoặc mất hoàn toàn hoạt tính của enzyme 11β-hydroxylase (CYP11B1) dẫn đến sự thiếu hụt các hormone tuyến thượng thận Đặc điểm lâm sàng phổ biến nhất của hội chứng thiếu hụt 11β-hydroxylase là bất thường bộ phận sinh dục ngoài, tăng nhanh sự phát triển xương dẫn đến tình trạng lùn của trẻ, dậy thì sớm ngoại biên, hạ kali máu và tăng huyết áp Các xét nghiệm hoá sinh thường dựa trên mức độ tăng lên của 11-deoxycortisol và 11-deoxycorticosterol huyết thanh kết hợp với sự

gia tăng nồng độ của adrogen thượng thận

TSTTBS do thiếu hụt 11β-hydroxylase có các dấu hiệu đặc trưng nhưng cũng còn nhiều thách thức trong vấn đề chẩn đoán và điều trị Sự đa dạng về kiểu hình, tỷ lệ phát hiện thấp là những lý do làm chậm chẩn đoán 11β-

hydroxylase Hiện nay, trên thế giới và ở Việt Nam còn ít nghiên cứu về sự

ảnh hưởng của các loại đột biến tới chức năng hoạt động của

11β-hydroxylase Xuất phát từ thực tiễn đó, đề tài “Nghiên cứu xác định đột biến

gen CYP11B1 ở bệnh nhân tăng sản thượng thận bẩm sinh do thiếu hụt

11 beta hydroxylase” được thực hiện nhằm góp phần phát hiện và làm sáng

tỏ nguyên nhân gây bệnh rối loạn chuyển hoá 11β-hydroxylase ở người Việt Nam Nghiên cứu này sẽ giúp cho các nhà nghiên cứu di truyền học giải thích được cơ chế gây bệnh và các bác sĩ lâm sàng điều trị bệnh hiệu quả, đúng hướng để nâng cao chất lượng cuộc sống Hơn nữa, kết quả nghiên cứu cũng được ứng dụng phòng bệnh thông qua thực hành tư vấn di truyền, là cơ sở cho chẩn đoán và điều trị trước sinh khi có chỉ định

Mục tiêu của đề tài:

1 Sàng lọc các đột biến trên gen CYP11B1 trên các bệnh nhân TSTTBS do

thiếu 11β-hydroxylase

Nội dung nghiên cứu:

1 Giải trình tự gen CYP11B1 trên các bệnh nhân nghi ngờ mắc TSTTBS thể

thiếu 11β-hydroxylase

2 Chứng minh sự biểu hiện 11β-hydroxylase trong tế bào động vật bằng phương pháp Western blot

3 Tách chiết hormone steroid, đánh giá hoạt tính 11β-hydroxylase

4 Sử dụng phần mềm spdbv, ViewerLite, MAXent phân tích vị trí các đột biến mới

Những đóng góp mới của luận án:

1 Phát hiện 06 đột biến trên gen CYP11B1 ở các bệnh nhân được chẩn đoán

lâm sàng là TSTTBS thể thiếu 11β-hydroxylase trong đó có 05 đột biến mới p.R51K, p.E147D, p.N152K, IVS6+5G>T, p.Y395X

2 Các đột biến mới p.R51K, p.E147D, p,N152K làm giảm hoạt tính của hydroxylase tương ứng là 29%, 48% và 36%

11β-3 Dự báo đột biến IVS6+5G>T có khả năng ảnh hưởng tới cấu trúc mRNA bằng phần mềm MaxEnt

4 03 đột biến mới p.R51K, p.E147D, p.N152K đều có ảnh hưởng đến liên kết hydro với axit amin bên cạnh trong mô hình cấu trúc ba chiều của 11β-hydroxylase

4

CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 LỊCH SỬ NGHIÊN CỨU BỆNH THIẾU HỤT 11 BETA HYDROXYLASE

1.1.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Năm 1951, các nhà khoa học đã nhận thấy có một số lượng bệnh nhân TSTTBS có dấu hiệu như tăng huyết áp, có các triệu chứng của thiếu hụt aldosterone, tăng natri, hạ kali máu Các bệnh nhân này sau đó được phát hiện

có sự thiếu hụt 11- hydroxylase Đây là các dấu hiệu phân biệt giữa bệnh nhân TSTTBS do thiếu hụt 11- hydroxylase với các bệnh nhân TSTTBS do thiếu hụt 21 hydroxylase (Eberlein và Bongiovanni, 1955, Shepard và Clausen, 1951, Wilkins và cs, 1952, Wilkins và cs, 1951)

Năm 1956, Eberlein và Bongiovanni đã miêu tả hiện tượng TSTTBS có kèm theo triệu chứng cao huyết áp (Eberlein và Bongiovanni, 1955) Glenthoj

và cộng sự đã chẩn đoán 3 bệnh nhân TSTTBS do thiếu hụt 11β-hydroxylase

mà trước đó, 3 bệnh nhân này đã được chẩn đoán TSTTBS do thiếu hụt hydroxylase (Glenthoj và cs, 1979) Năm 1982, Rosler và cộng sự đã báo cáo

21-26 bệnh nhân TSTTBS do thiếu hụt 11β-hydroxylase ở 18 gia đình Do Thái

từ Morocco, Tunis, Thổ Nhĩ Kỳ và Iran Trong đó có 7 gia đình kết hôn cận huyết Các bệnh nhân có triệu chứng tăng huyết áp nặng Các bệnh nhân nữ

có triệu chứng lâm sàng đa dạng, từ âm vật phì đại đến thể nam hoá nặng 10/14 bệnh nhân nữ được nuôi dưỡng giống như các trẻ trai và việc chẩn đoán muộn ở giai đoạn dậy thì (Rosler và cs, 1982) Triệu chứng tăng huyết áp dẫn đến tình trạng tử vong do bệnh tim mạch chỉ xuất hiện ở các bệnh nhân nam hoá ở mức độ trung bình, thể nam hóa nặng có ngoại hình giống hoàn toàn người nam ở các bệnh nhân nữ thì đôi khi lại có huyết áp bình thường Sáu bệnh nhân có hạ kali máu Năm 1985, Hochberg và cộng sự đã mô tả 15 trẻ

5

gái và 9 trẻ trai có thiếu hụt 11β-hydroxylase Các bệnh nhân này đều là người Do thái di cư từ Morocco và Iran Chiều cao cuối cùng của các bệnh nhân đã bị ảnh hưởng nghiêm trọng Trẻ trai có hiện tượng dậy thì sớm, phát triển tuyến vú Tất cả các bệnh nhân đều được nuôi dưỡng như các bé trai, mặc dù có 2 bệnh nhân có kết quả nhiễm sắc thể 46,XX (Hochberg và cs, 1985) Năm 1992, Rosler và cộng sự mô tả đặc điểm của 38 bệnh nhân thiếu hụt 11β-hydroxylase từ 25 gia đình trong vòng 39 năm 19 gia đình đến từ Morocco, và 2 gia đình khác có bố hoặc mẹ đến từ Morocco (Rosler và cs, 1992) Cũng năm 1992, Helmberg đã báo cáo 1 ca bệnh là trẻ trai 8 tuổi người Thổ Nhĩ Kỳ, bố mẹ kết hôn cận huyết Bệnh nhân được chẩn đoán mắc bệnh TSTTBS do thiếu hụt 11β-hydroxylase Bệnh nhân có tăng huyết áp, giả dậy thì sớm, chiều cao và cân nặng hơn 97 bách phân vị, nam hoá hoàn toàn (Prader type IV, lỗ đái thấp, phì đại âm vật) Bốn anh chị của bệnh nhân đã tử vong ngay sau đẻ (Helmberg và cs, 1992) Năm 1995, Al-Jurayyan báo cáo 78 trẻ Ả rập mắc TSTTBS trong vòng 10 năm Trong số đó, có 20 (25,6%) bệnh nhân từ 11 gia đình có tiền sử mắc TSTTBS do thiếu hụt 11β-hydroxylase Hiện tượng dậy thì sớm giả ở trẻ nam và các mức độ nam hoá ở trẻ gái đã dẫn đến 7 bệnh nhân bị chẩn đoán nhầm về giới tính (58,3%) 3 trẻ sơ sinh ở thể mất muối trước khi được điều trị (Al-Jurayyan, 1995) Năm 2000, Clark đã

mô tả 2 bệnh nhân mắc TSTTBS do thiếu hụt 11β-hydroxylase thể không cổ điển (P A Clark, 2000) với tỷ lệ nam hoá bào thai và cao huyết áp thấp hơn

so với thể cổ điển Bệnh nhân đầu tiên là trẻ trai 6 tuổi có triệu chứng dậy thì sớm ngoại biên Bệnh nhân có chiều cao trung bình so với tuổi và có huyết áp

ở giới hạn trên của bình thường Bệnh nhân thứ 2 là trẻ gái 1 tháng tuổi với triệu chứng âm vật phì đại nhưng không có bìu chẻ đôi Bệnh nhân có huyết

áp bình thường so với tuổi và có nồng độ 11-deoxycortisol tăng

6

1.1.2 Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam

Từ những năm 2000, một số tác giả đã ứng dụng kỹ thuật sinh học phân

tử để sàng lọc các đột biến trên gen CYP21A2 gây bệnh TSTTBS như tác giả

Võ Kim Huệ, Thái Thiên Nam đã ứng dụng kỹ thuật PCR để sàng lọc đột biến mất 8bp ở các bệnh nhân mắc TSTTBS ở Việt Nam cũng như các thành viên trong gia đình của bệnh nhân này (Thái Thiên Nam, 2002, Võ Kim Huệ, 2000) Năm 2006, tác giả Trần Kiêm Hảo cũng ứng dụng kỹ thuật PCR để sàng lọc một số đột biến phổ biến trên các bệnh nhân TSTTBS tại Bệnh viện Nhi trung ương (Trần Kiêm Hảo, 2006) Năm 2017, tác giả Vũ Chí Dũng công bố chẩn đoán phân loại thể thiếu các enzyme đặc hiệu khác nhau trên

715 bệnh nhân TSTTBS bao gồm 375 (52%) trẻ trai và 340 (48%) trẻ gái tại bệnh viện Nhi trung ương (Bùi Phương Thảo Vũ Chí Dũng, Nguyễn Ngọc Khánh, Cấn Thị Bích Ngọc, 2015) Trong đó, thể thiếu 21-hydroxylase là 703 (98,3%) bệnh nhân; thiếu 11β-hydroxylase là 9 (1,3%) bệnh nhân; và thiếu 3β-hydsroxysteroid dehydrogenase type 2 là 3 (0,4%) bệnh nhân Nghiên cứu cho thấy, số bệnh nhân mắc TSTTBS ở Việt Nam là rất lớn Đa số các bệnh nhân mắc bệnh TSTTBS thể thiếu 21-hydroxylase Tuy nhiên, còn rất ít các nghiên cứu TSTTBS thể hiếm gặp Gần đây, đã có một số nghiên cứu TSTTBS thể hiếm gặp bằng các phương pháp sinh học phân tử và phân tích

sự ảnh hưởng của các đột biến mới Năm 2012, tác giả Lê Bắc Việt mô tả một bệnh nhân mắc bệnh thiếu hụt 11β-hydroxylase Bệnh nhân có đột biến dị hợp

tử kép R43Q và A386V (Lê Bắc Việt, 2012) Đột biến A386V là đột biến làm thay đổi axit amin Alanine thành Valine Đột biến này xảy ra tại vị trí axit amin thứ 386 và không nằm trên vùng quan trọng Hai axit amin này đều là axit amin trung tính, không làm thay đổi liên kết hydro trong phân tử protein

Vì thế, tác giả dự đoán rằng, đột biến này không làm ảnh hưởng đến hoạt tính protein Những nghiên cứu sau đó của tác giả về sự biểu hiện của đột biến cho

7

thấy, đột biến này hoàn toàn không làm ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme hydroxylase Năm 2015, tác giả Vũ Chí Dũng và cộng sự công bố 3 bệnh nhân TSTTBS thể thiếu 3β-hydroxysteroid dehydrogenase type 2 đều được

11β-khẳng định bằng phân tích đột biến gen HSD3B2 và đã phát hiện các bệnh

nhân này mang đột biến mới đồng hợp tử của gen (Bùi Phương Thảo Vũ Chí Dũng, Nguyễn Ngọc Khánh, et al, 2015) Những nghiên cứu này là rất cần thiết và sẽ cung cấp các thông tin toàn diện hơn về các thể bệnh TSTTBS do thiếu các enzyme khác nhau đang lưu hành tại Việt Nam

1.1.3 Dịch tễ học bệnh thiếu hụt 11β-hydroxylase

Tỷ lệ mắc bệnh thiếu hụt 11β-hydroxylase thống kê trong các quần thể còn rất hạn chế Thông thường, tỷ lệ thiếu hụt 11β-hydroxylase chiếm khoảng 5-8% tổng số các bệnh nhân mắc hội chứng TSTTBS (Merke và Bornstein,

2005, White và Speiser, 2000, Zachmann và cs, 1983) Nghiên cứu tại Anh (Arlt và cs, 2010) cho thấy chỉ có 3/203 bệnh nhân TSTTBS mắc bệnh thiếu hụt 11β-hydroxylase (1,5%), và các bệnh nhân này chỉ chiếm khoảng 3-5% ở thể cổ điển Tuy nhiên, nghiên cứu quốc gia tại Thuỵ Điển nghiên cứu trên 90% các bệnh nhân TSTTBS, chỉ có 1/612 bệnh nhân TSTTBS do thiếu hụt 11β-hydroxylase (0,2%) (Gidlof và cs, 2013, Strandqvist và cs, 2014) Sự khác biệt về tỷ lệ có thể do cách chọn mẫu hoặc do đặc trưng của quần thể nghiên cứu Tần suất bệnh TSTTBS ở trẻ sơ sinh khoảng 1/200.000 (White và

cs, 1994) Tần suất bệnh TSTTBS do thiếu hụt 11β-hydroxylase thay đổi từ 0,8-8% trong các nghiên cứu trên các phụ nữ mắc hội chứng rậm lông và cường androgen (Azziz và cs, 1991, Eldar-Geva và cs, 1990) Tần suất trẻ mắc bệnh TSTTBS do thiếu hụt 11β-hydroxylase cao nhất được tìm thấy ở Israel trên người Do Thái di cư từ Morocco Tần suất mắc bệnh ở nhóm người này khoảng từ 1/5000-7000 trẻ đẻ sống và tỷ lệ người mang gen từ 1,2-1,4% (Rosler và cs, 1992, Rosler và White, 1993)

8

Bảng 1.1 Các thể bệnh TSTTBS và thiếu hụt tổng hợp cortisol do thiếu enzyme vỏ thượng thận

Enzyme thiếu hụt Gen/NST Tỷ lệ mới mắc và

chủng tộc Triệu chứng lâm sàng Dấu ấn sinh học

<1:1000 Gặp nhiều hơn ở Ashkenazi Jews và Yupik Eskimo

Thể cổ điển: 46,XX Phì đại âm vật, suy thượng thận, mất muối, nam hoá sau sinh ở các mức độ khác nhau

Thể không cổ điển: cường androgen trong từ thời thơ ấu đến trưởng thành, có thể không có triệu chứng

17OHP; AD; T

CYP21A2 và TNXB

CAH-X: ngoài các triệu chứng như trên, còn có tăng động, đau liên hoàn, sai khớp

đa chỗ, thiếu hụt đường giữa bao gồm cả khả năng có thể

Thể cổ điển: 46,XX; phì đại

âm vật, tăng huyết áp ở hầu hết các bệnh nhân, hạ kali máu, nam hoá sau sinh

Thể không cổ điển: cường androgen, có thể không có triệu chứng

DOC 11-deoxycortisol AD; T

3β-hydroxysteroid

dehydrogenase type 2

HSD3B2/1p13.1 Hiếm Thể cổ điển: mất nước, hạ

natri máu, tăng kali máu

46,XX: nam hoá 46,XY: nam hoá kém

Pregnenolone 17OH-pregnenolone DHEA; DHEAS

và Châu Á

Thể cổ điển: Kiểu hình nữ (46,XX hoặc 46,XY nhưng nam hoá kém), tăng huyết áp,

hạ kali máu, thiểu năng sinh

Progesterone, DOC; corticosterone; LH

và FSH

Thể cổ điển: kiểu hình nữ (46,XX hoặc 46,XY có giới tính đảo ngược) Suy thượng thận, thượng thận phì đại, thượng thận bị thâm nhiễm lipid, cả hai giới có bộ phận sinh dục ngoài giống nữ

Thể không cổ điển: 46,XY biểu hiện mơ hồ giới tính các

Giảm tất cả các steroid

11

mức độ khác nhau, Cholesterol side-chain

cleavage enzyme

(P450scc)

CYP11A1

15q23-24

Hiếm Thể cổ điển: kiểu hình nữ

(46,XX hoặc 46,XY có giới tính đảo ngược), suy thượng thận, có thể không có tuyến thượng thận, mất muối

Thể không cổ điển: 46,XY mơ

hồ giới tính ở các mức độ khác nhau, suy thượng thận

Giảm tất cả các steroid

Giảm thể tích tuần hoàn, dị tật xương (Antley-Bixler); nam hoá ở mẹ

46,XX: nam hoá nhẹ đến trung bình

46,XY: nam hoá kém

Mức độ cao khác nhau, thiếu hụt một phần nhiều steroid

(Nguồn: Hannah Shmouni và cs, 2017; Turcu và Auchus 2015)

12

1.2 ĐỊNH NGHĨA, CƠ SỞ HOÁ SINH VÀ SINH LÝ BỆNH HỌC CỦA TSTTBS DO THIẾU HỤT 11Β-HYDROXYLASE

1.2.1 Định nghĩa TSTTBS và các enzyme tham gia tổng hợp cortisol

Tăng sản thượng thận bẩm sinh (TSTTBS) bao gồm một nhóm các bệnh

di truyền lặn nhiễm sắc thể thường, do khiếm khuyết một phần hoặc hoàn toàn của một trong số các enzyme tham gia tổng hợp cortisol từ cholesterol ở tuyến thượng thận Kiểu hình lâm sàng và hóa sinh phụ thuộc vào khiếm khuyết enzyme đặc hiệu

Cytochrome P450 là thuật ngữ chung chỉ một nhóm các enzyme oxy hoá, tất cả các enzyme nhóm này đều có khoảng 500 axit amin và có một nhóm HEME đơn độc Các enzyme này được gọi là P450 (Pigment 450) vì tất

cả đều hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 450nm Hệ gen người bao gồm 57 enzyme thuộc nhóm cytochrome P450 Một vài hệ thống danh pháp quốc tế

đã được đề xuất cho các gen và các enzyme nhóm này trong các thập kỷ qua

Hiện nay, các gen có thuật ngữ chính thức là các gen CYP và có một hệ thống

danh pháp hợp lý cho các enzyme và các gen này đã được mô tả (http://drnelson.uthsc.edu/cytochromeP450.html) Các protein được mã hoá bởi các gen có thể có cùng tên nhưng không viết nghiêng (Miller và Auchus, 2011)

Các enzyme tham gia tổng hợp cortisol vỏ thượng thận: P450scc

(CYP11A1); P450c17 (CYP17A1), P450c21 (CYP21A2), P450c11

(CYP11B1), 3β-HSD (HSD3B2) Ngoài ra, ngay ở bước đầu tiên của tổng hợp

steroid thượng thận, cholesterol đi vào trong ty thể nhờ protein vận chuyển

StAR Thêm vào đó, đột biến bất hoạt gen POR mã hoá enzyme cho điện tử

P450 oxidoreductase cũng gây ra các biểu hiện của TSTTBS với các triệu chứng kết hợp của thiếu P450cc17 và P450c21 (Krone và Arlt, 2009, Miller

và Auchus, 2011, Speiser và cs, 2010, Turcu và Auchus, 2015) (Hình 1.1;

13

Bảng 1.1) Thiếu hụt enzyme 21-hydroxylase và 11β-hydroxylase chỉ gây tổn thương tổng hợp steroid thượng thận, trong khi thiếu 17α-hydroxylase và 3β-hydroxysteroid dehydrogenase type 2 cũng gây tổn thương tổng hợp steroid ở tuyến sinh dục

1.2.2 Cơ sở hoá sinh của bệnh TSTTBS

Sinh tổng hợp steroid được bắt đầu từ nguyên liệu cholesterol không ester hoá, đây là một phân tử gồm 27 carbon có nguồn gốc từ lipoprotein trọng lượng phân tử thấp (LDL) lưu hành trong tuần hoàn (Higashijima và cs, 1987) Cholesterol được vận chuyển từ bào tương vào màng trong của ty thể thông qua protein StAR (Miller, 2007) Enzyme tách nhánh bên P450

(CYP450scc) có tên gen là CYP11A1 xúc tác chuyển hoá cholesterol thành

steroid trung gian là pregnenolone bằng cách hydroxyl hoá carbon 20 và 22, sau đó tách liên kết giữa hai carbon hydroxyl hoá này (Parker và Schimmer, 1995) Pregnenolone vì không phải là cơ chất trong ty thể nên đi ra lưới nội bào và tại đây được chuyển thành các steroid đặc hiệu phụ thuộc vào enzyme

và các yếu tố đồng vận đặc hiệu

Tuyến thượng thận có vai trò thiết yếu cho sự sống sẽ sản xuất ra các steroid tại phần vỏ Vỏ thượng thận được chia thành 3 lớp riêng biệt, khác nhau về cấu trúc mô học là lớp cầu ngoài cùng, lớp bó (lớp giữa) và lớp lưới (lớp trong cùng) Mỗi lớp này sở hữu những enzyme khác nhau để tổng hợp các steroid đặc hiệu Sản xuất steroid thượng thận bị kích thích bởi hormone thuỳ trước tuyến yên là ACTH Hormone giải phóng corticotropin (CRH) được sản xuất bởi vùng dưới đồi điều khiển hoạt động của thuỳ trước tuyến yên tiết ACTH theo nhịp (Yau và cs, 2016)

corticosterone dưới sự điều hoà của ACTH

(B) Trường hợp thiếu hụt enzyme 11β-hydroxylase dẫn đến giảm tổng hợp corticosterone và cortisol dẫn đến tăng ACTH và dẫn đến chuyển hướng tăng tổng

hợp androgen

(Nguồn: El Maouche và cs, 2017)

Cortisol được tổng hợp từ cholesterol ở vùng bó của vỏ thượng thận Quá trình này bao gồm năm phản ứng chuyển hoá dưới sự xúc tác của các enzyme tương ứng: phân cắt chuỗi cholesterol thành pregnenolone; hydroxyl hoá 17-OH pregnenolone; dehydroxyl hoá 3β-dehydrogel hoá thành 17-hydroxyprogesterone và các phản ứng hydroxyl hoá lần lượt ở các vị trí 21 và

15

11β Con đường 17-deoxy cũng được diễn ra ở vùng bó (phản ứng hydroxyl hoá không xảy ra), và sản phẩm cuối cùng là corticosterone (Hình 1.1) Một con đường 17-deoxy tương tự xảy ra ở vùng cầu, không có sự xúc tác của 17α-hydroxylase; tuy nhiên, corticosterone không phải là sản phẩm cuối cùng Corticosterone lần lượt được hydroxyl hoá và oxy hoá ở vị trị C18

17α-để tạo thành aldosterone

1.2.3 Sinh lý bệnh của TSTTBS do thiếu 11β-hydroxylase

Khi thiếu hụt enzyme đặc hiệu tổng hợp cortisol thì nồng độ thấp của cortisol kích thích sản xuất quá mức CRH ở vùng dưới đồi và ACTH của tuyến yên, và kích thích liên tục tuyến thượng thận gây tăng sinh mô của tuyến Tuỳ thuộc vào enzyme nào bị thiếu hụt mà việc tổng hợp các hormone steroid bị thiếu hụt khác nhau

Hình 1.2 Các phản ứng xúc tác bởi enzyme CYP11B1

(Nguồn: Cerny et al 2015) TSTTBS thiếu 11β-hydroxylase là do đột biến trên gen CYP11B1 Gen CYP11B1 mã hoá cho 11β-hydroxylase (enzyme CYP11B1) Đây là enzyme

biểu hiện chủ yếu ở vùng bó vỏ thượng thận, có chức năng chuyển hoá deoxycortisol thành cortisol và deoxycorticosterone thành corticosterone dưới

11-16

sự điều hoà của ACTH (Hình 1.2) Khi các phản ứng 11-hydroxylase hoá giảm dẫn đến giảm tổng hợp corticosterone và cortisol dẫn đến tăng ACTH và dẫn đến chuyển hướng tăng tổng hợp androgen Bình thường, corticosterone

và deoxycorticosterone trong vùng bó rất ít, nhưng nồng độ deoxycorticosterone có thể tăng lên dưới sự tác động của ACTH Deoxycorticosterone là một corticoid muối khoáng yếu, nhưng khi nồng độ của deoxycortisone tăng sẽ ức chế hệ thống renin-angiotensin, dẫn đến tăng khối lượng dịch ngoại bào, tăng huyết áp, hoạt tính renin huyết tương thấp, nồng độ aldosterone thấp mặc dù khả năng tổng hợp aldosterone vẫn còn Ảnh hưởng của việc ức chế hệ thống renin-angiotensin có thể không xảy ra ở giai đoạn sơ sinh vì có đề kháng kháng corticoid muối khoáng ở thận trong những tháng đầu đời Về mặt lâm sàng, bệnh nhân TSTTBS thiếu 11β-hydroxylase cũng có các biểu hiện tương tự như các bệnh nhân TSTTBS thiếu 21-hydroxylase như triệu chứng cường androgen, nhưng bệnh nhân thiếu 11β-hydroxylase thường có cao huyết áp hơn là triệu chứng mất muối Thể TSTTBS không cổ điển do thiếu 11β-hydroxylase rất hiếm gặp

1.3 DI TRUYỀN PHÂN TỬ CỦA BỆNH THIẾU HỤT 11Β-HYDROXYLASE

1.3.1 Gen CYP11B1

Năm 1987, gen CYP11B1 đã được xác định trong bộ gen người và có vị

trí trên cánh dài của nhiễm sắc thể số 8 (White và cs, 1987) (Hình 1.3) Nghiên cứu này được thực hiện bằng phương pháp lai tại chỗ và phân tích Southern blot DNA từ các tế bào lai somatic người và chuột Tác giả Chua và cộng sự đã phân lập được dòng tế bào cDNA thượng thận người có liên quan

đến gen CYP11B1 (Chua và cs, 1987)

Năm 1989, Mornet và cộng sự đã tách dòng gen CYP11B1 và thấy cấu

trúc protein gồm 502 axit amin bao gồm 24 vị trí trình tự tín hiệu của ty thể

Nhóm tác giả cũng công bố cấu trúc gen CYP11B1 là Cytochrome P450, họ

17

11, phân lớp B, polypeptide 1 Gen CYP11B1 có độ lớn khoảng 6.5 kb: bao gồm 9 exon và 8 intron (Mornet và cs, 1989) Họ gen CYP11B gồm 2 gen CYP11B1 và CYP11B2 Hai gen này có trình tự tương đồng giống nhau đến 95% ở vùng mã hoá và giống nhau đến 90% ở vùng intron Hai gen CYP11B1

và CYP11B2 đều nằm trên nhiễm sắc thể số 8 (8q22) (Hình 1.3)

Hình 1.3 Vị trí gen CYP11B1 và gen CYP11B2 trên NST số 8

(Nguồn: http://ghr.nlm.nih.gov/gen) Gen CYP11B1 mã hóa 11β-hydroxylase có chức năng chủ yếu trong ty

thể nằm trên vùng bó vỏ thượng thận, enzyme này xúc tác phản ứng chuyển hóa 11-deoxycortisol thành cortisol và 11-deoxycorticosterone thành

corticosterone Đột biến trên gen CYP11B1 mang tính di truyền lặn, là nguyên nhân gây nên sự suy giảm 11-hydroxylase Gen CYP11B2 mã hoá cho

steroid 11/18-beta-hydroxylase và thường chỉ chủ yếu biểu hiện ở vùng cầu

vỏ thượng thận, enzyme này tham gia xúc tác tổng hợp các aldosterone muối khoáng ở 3 phản ứng: phản ứng 11-beta-hydroxylase hoá của 11-deoxycorticosterone (DOC) thành corticosterone (B); phản ứng 18-hydroxylase hoá của corticosterone thành 18-hydroxycorticosterone (18-

Năm 1980, Levine và cộng sự đã đưa ra các bằng chứng cho thấy hệ thống enzyme 11β-hydroxylase ở vùng bó và vùng cầu là riêng biệt Nhóm tác giả cũng tìm thấy các bằng chứng cho rằng các hoạt động của enzyme 11β- và 18-hydroxylase của vùng bó có chức năng liên quan đến nhau và có thể bao gồm các enzyme tham gia tổng hợp kết hợp khác Cả hai loại enzyme 11β- và 18-hydroxylase đều ít biểu hiện ở vùng bó nhưng lại biểu hiện đầy đủ

ở vùng cầu (Levine và cs, 1980)

20

1.3.2.1 Cấu trúc enzyme CYP11B1

Cấu trúc bậc ba là dạng không gian của cấu trúc bậc hai, làm cho phân tử protein có hình dạng gọn hơn trong không gian, tạo nên trung tâm hoạt động của phần lớn các loại enzyme Sự thay đổi cấu trúc bậc ba dẫn đến sự thay đổi hướng xúc tác của enzyme hoặc mất khả năng xúc tác hoàn toàn Cấu trúc bậc III được giữ vững nhờ các cầu disulfua, tương tác VanderWaals, liên kết hidro, lực ion Vì vậy khi phá vỡ các liên kết này phân tử duỗi ra đồng thời làm thay đổi một số tính chất của enzyme, đặc biệt là tính tan và hoạt tính xúc tác

Trong nghiên cứu tách dòng và phân tích enzyme CYP11B1, White và cộng sự đã phân lập một gen trao đổi chéo, và xác định được trình tự của gen

CYP11B2 có tỷ lệ 95% giống so với gen CYP11B1 trong vùng mã hóa exon

và 90% trong vùng không mã hóa intron (White P.C và cs, 1989) Để tìm hiểu

về mối quan hệ giữa cấu trúc và chức năng của enzyme CYP11B1 đòi hỏi phải nghiên cứu về cấu trúc không gian của enzyme này Năm 2001, Belkina

và cộng sự lần đầu tiên đưa ra được mô hình cấu trúc của 3D của enzyme CYP11B1 và enzyme CYP11B2 Trong nghiên cứu này, nhóm tác giả dựa trên trình tự của P450 của vi khuẩn là CYP102, CYP108 để mô phỏng cấu trúc của CYP11B ở người (Belkina N.V và cs, 2001)

Các nghiên cứu đã đưa ra một góc nhìn khoảng 20° ở giữa những heme sắt của hai protein này, thấy rằng các vị trí heme sắt phụ thuộc vào sự tương tác giữa những chuỗi bên và định hướng kết nối của các chuỗi Trong trường hợp của enzyme CYP11B1, một nhóm heme sắt propionat tạo thành các liên kết hydro với Arg448 và thứ hai là tương tác với Arg348, trong khi đó ở enzyme CYP11B2, toàn bộ nhóm heme sắt propionate đều tham gia tạo liên kết hydro ở Arg448 Cả 2 đột biến ở Arg448 và Arg348 đã được tìm thấy trên enzyme CYP11B1 ở bệnh nhân mắc bệnh TSTTBS (Curnow K M và cs,

21

1993) Tất cả những đột biến đã được biết đến ở vị trí codon 348 và 448 đều dẫn đến sự mất hoàn toàn hoạt tính enzyme, phần lớn có thể là do sự mất ổn định của các holoprotein Kết quả của việc tạo ra những liên kết hydro khác nhau xung quanh vị trí Arg348, Arg448 và nhóm heme sắt propionate là vùng trung tâm hoạt động của CYP11B2 được cho là nhỏ hơn so với enzyme CYP11B1 Năm 2005, Ulmshneider và cộng sự đã có những nghiên cứu về sự tương tác của một số chất làm bất hoạt cấu trúc và chức năng protein (Ulmschneider S và cs, 2005) Mô hình enzyme CYP11B1 của Roumen và cộng sự mang đến sự tìm hiểu sâu hơn đối với các vùng được lựa chọn nghiên cứu, các cấu tử ở các enzyme và sự tương tác giữa các cấu tử này (Roumen L

và cs, 2007)

1.3.2.2 Chức năng của enzyme CYP11B1

Enzyme CYP11B1 có khả năng hydroxyl hoá 11 deoxycortisosterone (DOC) thành corticosterone trong các nghiên cứu in-vitro (Krone và Arlt,

2009, Nimkarn và New, 2008, Schiffer và cs, 2015), chức năng này đã được chứng minh bởi sự biểu hiện cDNA trong các dòng tế bào nuôi cấy (Curnow

và cs, 1991, Kawamoto và cs, 1992) và được tìm thấy sau khi tinh sạch từ các khối u có tích luỹ aldosterone (Ogishima và cs, 1991) Enzyme này cũng xúc tác quá trình chuyển hoá 11-deoxycorticosterone thành corticosterone (sản phẩm chủ yếu) hoặc 18-hydroxy, 11-deoxycorticosterone, và xúc tác phản ứng 18-hydroxyl hoá thành một lượng nhỏ corticosterone Tuy nhiên, enzyme CYP11B1 không thể xúc tác chuyển hoá coticosterone thành aldosterone (White, 2001) Aldosterone được sản xuất nhờ sự xúc tác của enzyme CYP11B2 (aldosterone synthase), enzyme này biểu hiện ở vùng cầu Enzyme CYP11B2 xúc tác phản ứng 11β-hydroxylase hoá DOC thành corticosterone

và phản ứng 18-hydroxylase, 18-oxidase trong các bước cuối cùng của quá trình tổng hợp aldosterone ở vùng cầu (Nimkarn và New, 2008) Trong khi

22

deoxycorticosterone được chuyển hoá thành aldosterone, phân tử steroid có cấu trúc tương tự còn lại kết hợp với enzyme cho ba phản ứng xúc tác mà không giải phóng các sản phẩm ngay lập tức Enzyme CYP11B2 chuyển hoá 11-deoxycortisol thành 18-oxycortisol Thông thường, phản ứng này xảy ra ở cấp độ đặc biệt vì enzyme CYP11B2 không biểu hiện ở vùng bó nhưng phản ứng này lại rất quan trọng với bệnh nhân mắc bệnh cường aldosterone kìm hãm glucocorticoid (glucocorticoid-suppressible hyperaldosteronism)

Mặc dù enzyme CYP11B1 và CYP11B2 có cấu trúc khác nhau ở 33 axit amin, các nghiên cứu về sự kết hợp của hai enzyme này trên các bệnh nhân mắc bệnh cường aldosterone kìm hãm glucocorticoid đã đưa ra giả thuyết là phần còn lại đặc biệt của enzyme CYP11B2 tăng xúc tác tối đa cho hoạt động của enzyme 18-hydroxylase và 18-oxidase Vị trí đó nằm trên đoạn giữa vùng C-terminal của enzyme (Pascoe và cs, 1992)

1.4 ĐẶC ĐIỂM LÂM SÀNG BỆNH THIẾU HỤT 11Β-HYDROXYLASE

1.4.1 Thể cổ điển

1.4.1.1 Cường Androgen

Dấu hiệu của hiện tượng cường androgen trên các bệnh nhân thiếu hụt 11β-hydroxlyase có thể được nhận biết ở bất kỳ thời điểm nào từ giai đoạn sơ sinh đến giai đoạn trưởng thành, một số trường hợp còn phát hiện ở giai đoạn muộn hơn (Al-Jurayyan, 1995, Burren và cs, 1996, Parajes và cs, 2010, Riedl

và cs, 2008, Rosler và cs, 1992, Rosler và cs, 1982, White, 2001, Zachmann

và cs, 1983)

Trẻ gái có biểu hiện nam hoá ở các mức độ khác nhau và xuất hiện ngay

từ thời kỳ bào thai, bất thường bộ phận sinh dục bao gồm phì đại âm vật, bìu chẻ đôi một phần hoặc hoàn toàn (Bảng 1.3) Các trẻ gái 46,XX có hiện tượng phì đại âm vật và các môi lớn dính nhau rất khó phân biệt với các trẻ trai 46,XY có tinh hoàn lạc chỗ (Russell và cs, 1994) Ngược lại, với sự bất

ở trẻ trai (Hochberg và cs, 1985, White và cs, 1994)

Trong một nghiên cứu về người Do Thái gốc Ma Rốc và Iran, 24 bệnh nhân (15 trẻ gái và 9 trẻ trai) mắc bệnh thiếu hụt 11β-hydroxylase được theo dõi trong 15 năm (Hochberg và cs, 1985) 42% số trẻ được chẩn đoán trước 1 tuổi (2 trẻ trai, 8 trẻ gái); 42% (5 trẻ trai, 5 trẻ gái) được chẩn đoán từ 1 đến 4

24

tuổi, 13% (2 trẻ trai, 1 trẻ gái) được chẩn đoán sau 4 tuổi, và 1 bệnh nhân được chẩn đoán lúc 8 tuổi Chiều cao, cân nặng và tuổi xương được theo dõi phát triển bình thường trong 4 tháng đầu đời nhưng tuổi xương bắt đầu tăng nhanh lúc 11 tháng tuổi từ 2 đến 5 tuổi, chiều cao giữ nguyên ở trị số 4 SDs

so với chỉ số tương đương với tuổi nhưng tốc độ phát triển dậy thì lại chậm hơn bình thường Nghiên cứu cho thấy có sự khác biệt về sự phát triển giữa trẻ trai và trẻ gái, có thể do nguyên nhân chẩn đoán chậm ở trẻ trai Hơn nữa, giai đoạn dậy thì ở trẻ trai sớm hơn so với bình thường

1.4.1.2 Tăng huyết áp

Khoảng hai phần ba các bệnh nhân thiếu hụt 11β-hydroxylase thể cổ điển nặng có hiện tượng tăng huyết áp (Rosler và cs, 1992), thường bắt đầu triệu chứng từ những năm đầu đời (Mimouni và cs, 1985) Mặc dù cao huyết

áp thường diễn biến từ vừa phải đến nặng, một phần ba các bệnh nhân có triệu chứng phì đại tâm thất trái có kèm theo hoặc không kèm theo bệnh võng mạc, hiện tượng tử vong do đột quỵ đã được ghi nhận ở một số các ca bệnh Các dấu hiệu của dư thừa hormone muối khoáng như hạ Kali máu, yếu cơ hoặc chuột rút, xuất hiện ở một số ít bệnh nhân và không có hiện tượng cao huyết

áp Hoạt độ renin huyết thanh thường bị hạn chế với các trẻ lớn hơn, dẫn đến hậu quả là nồng độ aldosterone thấp mặc dù khả năng tổng hợp aldosterone thực tế vẫn bình thường Ở thể thiếu hụt 11OH cổ điển, DOC hoạt động một hormone corticoid muối khoáng và bị tăng cao Tuy nhiên, các nghiên cứu thí nghiệm cho thấy DOC là hormone muối khoáng hoạt động yếu ở người và động vật (Brown và cs, 1972, Vinson, 2011, White, 2001) Hơn nữa, chưa thấy mối liên quan giữa mức độ huyết thanh DOC với mức độ nặng của triệu chứng tăng huyết áp (White và cs, 1994, Zachmann và cs, 1983) Điều này đặt

ra câu hỏi về cơ chế gây tăng huyết áp của nhóm bệnh này Thêm vào đó, mức độ nam hoá và các dấu hiệu tăng tích trữ các hormone corticoid muối

25

khoáng cũng chưa được làm rõ (Rosler và cs, 1992, Rosler và cs, 1982) Theo các nghiên cứu, DOC là một corticoid muối khoáng ít hoạt lực hơn so với các hormone có thành phần 18-hydroxyl và DOC có thể được tích trữ và là nguyên nhân gây tăng huyết áp ở bệnh thiếu hụt 11β-hydroxylase Nghiên cứu trên một nhóm ca bệnh (Zachmann và cs, 1983) cho thấy có sự liên quan giữa tuổi chẩn đoán với bất thường huyết áp tâm thu Tất cả các ca bệnh đều có dấu hiệu nghèo nàn trong kiểm soát huyết áp và điều trị thay thế quá mức hormone glucocorticoids có thể ảnh hưởng bất lợi đến các triệu chứng chuyển hoá tim mạch Đã có một số nghiên cứu cho thấy có sự tổn thương thứ phát với mức độ nặng của triệu chứng tăng huyết áp bao gồm phì đại tâm thất trái, tăng áp võng mạc, bệnh tim mạch do thiếu máu cục bộ, tai biến mạch máu não, các bệnh về não và có khả năng gây tử vong ở các bệnh nhân thiếu hụt 11β-hydroxylase (Chabre và cs, 2000, Glenthoj và cs, 1980, Hague và Honour, 1983, Melcescu và cs, 2012, Rosler và cs, 1992, Rosler và cs, 1982, Sathya và cs, 2012)

Ngược lại, triệu chứng tăng huyết áp ở thể thiếu hụt 21 hydroxylase hiếm gặp nhưng hiện tượng tăng huyết áp kéo dài thường thấy trên các bệnh nhân đang điều trị, hiện tượng này có giả thuyết cho rằng do điều trị quá mức glucocorticoids và/hoặc mineralococorticoids, thận chí cả ở trẻ nhỏ (Arlt và

cs, 2010, Falhammar và cs, 2015, Mooij và cs, 2011, Williams và cs, 2010) Tuy nhiên, các thể khác của thiếu hụt enzyme 21OH không có nguy cơ về cao huyết áp (Bouvattier và cs, 2015, Falhammar và cs, 2007, Falhammar và cs,

2011, Sartorato và cs, 2007)

Năm 1985, de Simone và cộng sự đã báo cáo các mức độ kích thích ACTH của 11-deoxycorticosterone (DOC) tăng lên đối với bệnh nhân tăng huyết áp so với nhóm đối chứng (De Simone và cs, 1985) Hơn nữa, sự thay đổi trong các marker của quá trình hydroxyl hoá như tăng nồng độ

26

deoxycortisol (Connell và cs, 1996) hoặc tăng nồng độ tetrahydrodeoxylcortisol trong nước tiểu (Barr và cs, 2007, Keavney và cs, 2005) cũng được tìm thấy trên bệnh nhân tăng huyết áp Một số kiểu hình trong quá trình tổng hợp aldosterone có thể di truyền được (Ganapathipillai và

cs, 2005, Imrie và cs, 2006) có liên quan đến các sự thay đổi của gen

CYP11B2 và/hoặc vị trí gen CYP11B2 Những bằng chứng này cho thấy mục

đích của sự chuyển hoá 11-deoxycortisol thành cortisol sẽ dẫn đến sự tăng sinh mạn tính trong quá trình điều khiển ACTH đến vỏ thượng thận Kết hợp với các yếu tố di truyền hoặc môi trường, sự thay đổi này có thể dẫn đến sự tổng hợp aldosterone theo một cách khác có liên quan đến angiotensin II, vì vậy sẽ dẫn đến tăng huyết áp (Padmanabhan và cs, 2012) Tuy nhiên, giả thuyết này vẫn cần phải được nghiên cứu thêm (New và Wilson, 1999)

1.4.1.3 Mất muối

Mặc dù tăng huyết áp là đặc điểm đặc trưng của thiếu hụt hydroxylase, một số bệnh nhân khi còn nhỏ, còn có các dấu hiệu thiết hụt các hormone muối khoáng (mineralocorticoid) như tăng kali, hạ natri và giảm dung lượng tuần hoàn máu (Mimouni và cs, 1985, Zachmann và cs, 1983) Ở một số trẻ có thể được điều trị sớm bằng liệu pháp glucocorticoid để loại bỏ

11β-sự tích luỹ dư thừa deoxycorticosterone ở vùng vùng bó Do vùng cầu có chức năng chủ yếu là tăng tích luỹ lượng deoxycorticosterone trước khi điều trị, và giảm đột ngột lượng deoxycorticosterone do sự tăng tích luỹ lượng aldosterone tương ứng (Rainey, 1999)

1.4.2 Thể không cổ điển

Thể không cổ điển có đặc trưng âm vật không phì đại lúc mới sinh nhưng trẻ có triệu chứng dậy thì sớm hoặc các dấu hiệu của cường androgen khi lớn lên hoặc lúc trưởng thành như mọc mụn, rậm lông, và/hoặc vô kinh