Ứng dụng kỹ thuật PCR phát hiện bệnh greening trên cây cam ở một số tỉnh miền bắc việt nam

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TRƯƠNG THỊ THU Tên đề tài: ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR PHÁT HIỆN NHANH BỆNH GREENING TRÊN CÂY CAM Ở MỘT SỐ TỈNH MIỀN BẮC VIỆT NAM KHÓA LUẬN TỐ

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

TRƯƠNG THỊ THU

Tên đề tài:

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR PHÁT HIỆN NHANH BỆNH GREENING

TRÊN CÂY CAM Ở MỘT SỐ TỈNH MIỀN BẮC VIỆT NAM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ sinh học

THÁI NGUYÊN - 2017

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

TRƯƠNG THỊ THU

Tên đề tài:

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR PHÁT HIỆN NHANH BỆNH GREENING

TRÊN CÂY CAM Ở MỘT SỐ TỈNH MIỀN BẮC VIỆT NAM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ sinh học

thành khóa luận này ngoài sự nỗ lực của bản thân em còn nhận được nhiều sự giúp

đỡ của Ban giám hiệu trường Đại học Nông Lâm-Đại học Thái Nguyên, Ban chủ nhiệm Khoa CNSH-CNTP, cùng các thầy cô giáo đã tận tình giảng dạy cho em suốt

4 năm học

Trước hết em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới Ban giám hiệu trường Đại học Nông Lâm-Đại học Thái Nguyên, Ban chủ nhiệm Khoa CNSH-CNTP, cùng các thầy cô giáo đã tận tình giảng dạy cho em suốt 4 năm học vừa qua

để em có thể hoàn thành khóa luận

Đặc biệt, em xin được bày tỏ lòng kính trọng, lòng biết ơn sâu sắc tới

TS.Nguyễn Văn Duy và TS.Nguyễn Tiến Dũng, người đã tận tình hướng dẫn em

trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân và bạn bè đã quan tâm, ủng hộ và động viên em trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu giúp em hoàn thành tốt khóa luận này

Do điều kiện và thời gian có hạn nên đề tài khó tránh khỏi những thiếu sót Kính mong thầy cô giáo và các bạn sinh viên đóng góp ý kiến xây dựng để đề tài của em được hoàn thiện hơn

Em xin chân thành cảm ơn!

Thái Nguyên, ngày 31 tháng 5 năm 2017

Sinh Viên

Trương Thị Thu

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1: Các loài cam, quýt có ý nghĩa trong thực tiễn sản xuất 5

Bảng 2.2: Tình hình sản xuất cam, quýt ở các châu lục trên thế giới giai đoạn 2012 -2014 11

Bảng 2.3: Tình hình sản xuất cam, quýt của nước ta giai đoạn 2010-2015 12

Bảng 2.4: Tình hình sản xuất cam, quýt ở các vùng của nước ta năm 2014 13

Bảng 3.1: Trình tự cặp mồi để phát hiện tác nhân gây bệnh Greening Hung và cs (1999), Hung và cs (2004) [33], [34] 24

Bảng 3.2: Các trang thiết bị máy móc dùng trong thí nghiệm 25

Bảng 3.3: Bảng thu thập mẫu tại các địa phương 26

Bảng 3.4: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR 28

Bảng 4.1: Kết quả đánh giá mẫu cam sành huyện Hàm Yên, tỉnh Tuyên Quang 31

Bảng 4.2: Kết quả đánh giá mẫu cam sành và cam chanh Bố Hạ ( Bắc Giang) 31

Bảng 4.3: Kết quả đánh giá mẫu cam Canh và cam Vinh tại xã Quyết Thắng, TP Thái Nguyên, tỉnh Thái Nguyên 32

Bảng 4.4: Nồng độ DNA tổng số của các mẫu tách từ mô lá cam đã thu thập 34

Bảng 4.5: Kết quả phát hiện bệnh vàng lá Greening trên các mẫu cam phân tích 38

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 2.1: Rầy chổng cánh Diaphorina citri 15

Hình 2.2: Triệu trứng nhiễm bệnh vàng lá Greening trên cây có múi 16

Hình 4.1: Hình ảnh thu thập mẫu lá tại một số địa phương 30

Hình 4.2: Kết quả tách chiết DNA tổng số 33

Hình 4.3: Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu của phản ứng PCR phát hiện bệnh Greening 35

Hình 4.4: Kết quả kiểm tra sản phẩm của phản ứng PCR sử dụng các nồng độ DNA khuôn khác nhau 36

Hình 4.5: Kết quả điện di sản phẩm PCR mẫu lá giám định Greening 37

RNA : Ribonucleic Acid VAC : Vườn ao chuồng

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN 1

DANH MỤC CÁC BẢNG ii

DANH MỤC CÁC HÌNH iii

DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT iv

MỤC LỤC v

Phần 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu của đề tài 2

1.2.1 Mục tiêu tổng quát 2

1.2.2 Mục tiêu cụ thể 2

1.3 Ý nghĩa của đề tài 3

1.3.1 Ý nghĩa khoa học của đề tài 3

1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài 3

Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

2.1 Tổng quan về cây cam 4

2.1.1 Nguồn gốc và phân loại 4

2.1.2 Giá trị của cây cam 5

2.1.3 Đặc điểm thực vật học của cây cam 6

2.1.4 Yêu cầu sinh thái của cây cam 9

2.1.5 Tình hình sản xuất cây cam 10

2.2 Bệnh vàng lá Greening trên cây có múi 14

2.2.1 Lịch sử của bệnh 14

2.2.2 Nguyên nhân và triệu chứng của bệnh 14

2.2.3 Phương pháp chẩn đoán bệnh vàng lá Greening 17

2.2.4 Một số biện pháp phòng tránh 18

2.3 Cơ sở khoa học của việc ứng dụng kỹ thuật PCR phát hiện bệnh vàng lá Greening 19

2.4 Tình hình nghiên cứu về phát hiện bệnh Greening trên cây có múi 19

2.4.1 Các nghiên cứu về phát hiện bệnh trên thế giới 20

2.4.2 Các nghiên cứu về phát hiện bệnh ở Việt Nam 22

Phần 3 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

3.1 Vật liệu nghiên cứu 24

3.1.1 Vật liệu thực vật 24

3.1.2 Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm 24

3.2 Phạm vi, địa điểm và thời gian nghiên cứu 25

3.2.1 Phạm vi nghiên cứu 25

3.2.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 25

3.3 Nội dung nghiên cứu 26

3.4 Phương pháp nghiên cứu 26

3.4.1 Phương pháp thu thập mẫu vật liệu 26

3.4.2 Phương pháp xác định sự biểu hiện của bệnh Greening 27

3.4.3 Phương pháp phát hiện bệnh Greening trên cây có múi bằng kỹ thuật PCR 27

3.4.4 Phương pháp sử lý số liệu 29

Phần 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30

4.1 Kết quả thu thập mẫu vật liệu 30

4.2 Tách chiết DNA tổng số mẫu lá 32

4.3 Thử nghiệm phản ứng PCR phát hiện bệnh Greening trên cây cam 35

4.4 Xác định độ nhạy của phản ứng PCR trong phát hiện bệnh Greening 36

4.5 Kết quả phát hiện bệnh Greening trên cây cam bằng phản ứng PCR 37

Phần 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40

5.1 Kết luận 40

5.2 Kiến nghị 40

TÀI LIỆU THAM KHẢO 41

Phần 1

MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Cây cam thuộc họ Rutaceae, là nhóm cây ăn quả quan trọng trong sản xuất

nông nghiệp ở nước ta Cây cam là loại cây trồng có giá trị dinh dưỡng và giá trị kinh tế cao Trong 100g thịt quả tươi có chứa 6-12% đường, vitamin C từ 40-90mg acid hữu cơ từ 0,4-1,2%, các chất khoáng và dầu thơm [4] Tất cả các bộ phận của cây cam đều có thể sử dụng: Lá, hoa, vỏ quả cung cấp tinh dầu, làm dược liệu, quả

để ăn, cây để làm cảnh [44] Cam không chỉ là hàng hóa đáp ứng cho tiêu thụ nội địa mà còn là mặt hàng xuất khẩu có tiềm năng lớn Ngoài ra, cây cam là loại cây lâu năm, chóng cho thu hoạch (khoảng 2-3 năm) và cho thu hoạch trong thời gian dài (25-30 năm) Theo ước tính, năng suất trung bình của cam quýt đạt 15-20 tấn/ha, các sản phẩm của cây có múi được bán trên thị trường với giá dao động khoảng 15.000-20.000 đồng/kg mang lại thu nhập từ 300-400 triệu đồng [4] Vì vậy cây cam được chú trọng đầu tư và phát triển mạnh mẽ

Cây cam có sự phân bố rộng do khả năng dễ thích nghi với nhiều môi trường sống khác nhau, dễ lai tạo những giống mới có khả năng thích nghi cao Trên thế giới, cây cam được trồng chủ yếu ở các nước thuộc vùng nhiệt đới, á nhiệt đới và ôn đới Ở Việt Nam cây cam được trồng ở cả ba miền Bắc, Trung và Nam Năm 2014, diện tích đất trồng cam ở Việt Nam là 75.600 ha với sản lượng đạt 736.100 tấn (Theo Bộ NN & PTNT [1]) Song sự đa dạng khí hậu ở các vùng trồng trọt là điều kiện phát sinh nhiều loại sâu bệnh hại trên cây cam như: bệnh thối rễ, ghẻ nhám, vàng lá, nấm bồ hóng trên lá…đặc biệt là bệnh vàng lá Greening Đây được coi là một trong những nhân tố gây trở ngại chính để phát triển cây cam Bệnh lan truyền với tốc độ nhanh và gây hại nghiêm trọng cho nhiều vùng trồng cam, là nguyên nhân ảnh hưởng trực tiếp đến năng suất và chất lượng quả [8] Bệnh do 2 dòng vi

khuẩn Gram âm gây ra Dòng châu á có tên là Candidatus liberibacter asiaticus, dòng châu phi có tên là Candidatus liberibacter africanus Các dòng vi khuẩn này

sống trong mạch libe của cây và lây truyền từ cây này sang cây khác thông qua các

mắt ghép và môi giới truyền bệnh là rầy chổng cánh (Diaphorina citri) ở châu Á và rầy cam (Trioza erytreae) ở châu Phi [33] Đặc điểm của bệnh Greening là có thời

gian ủ bệnh dài, nên khó phát hiện bệnh ở giai đoạn đầu và thường hay nhầm lần với bệnh khác như khi cây bị thiếu kẽm (Zn) [8] Đến khi bệnh biểu hiện rõ ràng thì cây đã bị bệnh nặng và các biện pháp chữa trị gần như vô nghĩa, rất nhiều biện pháp

đã được thực hiện nhưng vẫn không mang lại hiệu quả Vì vậy, việc phát hiện nhanh bệnh vàng lá Greening trong giai đoạn đầu là vô cùng quan trọng đối với việc phòng và điều trị bệnh

Những nghiên cứu bước đầu về bệnh ở Việt Nam đã được tiến hành, xong những vấn đề về phòng trừ bệnh vẫn chưa được tìm hiểu một cách đầy đủ Hiện nay việc ứng dụng kỹ thuật Sinh học phân tử hiện đại cho phép chẩn đoán các bệnh trên cây có múi mang lại hiệu quả cao với nhiều ưu điểm như: độ nhạy cao, chính xác và tốn ít thời gian Có thể kể đến một số phương pháp như: PCR, real-time PCR, các kỹ thuật lai phân tử [12] Kết quả thu được từ những nghiên cứu chẩn đoán bằng sinh học phân tử là cơ sở để sớm đưa ra những giải pháp phòng

tránh bệnh Xuất phát từ thực tiễn đó, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: ‘‘Ứng dụng kĩ thuật PCR phát hiện nhanh bệnh Greening trên cây cam ở một số

tỉnh miền Bắc Việt Nam’’

1.2 Mục tiêu của đề tài

- Tách chiết DNA tồng số trong mẫu mô lá cam

- Thử nghiệm phản ứng PCR phát hiện nhanh bệnh Greening trên mẫu lá cây cam

- Ứng dụng kỹ thuật PCR phát hiện nhanh bệnh Greening trên các mẫu cam

Bố Hạ (Bắc Giang), và một số giống cam khác như cam Vinh, cam Sành, cam Canh

1.3 Ý nghĩa của đề tài

1.3.1 Ý nghĩa khoa học của đề tài

- Xác định được phương pháp chẩn đoán nhanh bệnh Greening trên các giống cam bằng kĩ thuật PCR từ đó sàng lọc các cây cam sạch bệnh phục vụ các nghiên cứu tiếp theo

1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài

- Thông qua việc phát hiện nhanh bệnh Greening trên cây có múi sẽ góp phần giúp sàng lọc cây sạch bệnh phục vụ khai thác và phát triển

Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tổng quan về cây cam

2.1.1 Nguồn gốc và phân loại

2.1.1.1 Nguồn gốc

Các tác giả Bùi Huy Đáp (1960) [5], Trần Thế Tục (1967) [19], Reuther W

(1973) [38], Wakana (1998) [43], Rether Walter (1978) [39] cho thấy các loại cây

ăn quả, cùng với cây nho, cây có múi có lịch sử trồng trọt lâu đời nhất Phần lớn kết quả nghiên cứu đều thống nhất cây có múi có nguồn gốc ở miền Nam châu Á, trải dài từ Ấn Độ qua Hymalaya, Trung Quốc xuống vùng quần đảo Philippin, Malaysia, miền Nam Indonesia hoặc kéo dài đến lục địa châu Úc

2.1.1.2 Phân loại

Cam quýt thuộc: Giới Plantae

Bộ Rutales

Họ Rutaceae Chi Citrus Được phân chia làm 130 giống (genera) nằm trong các họ phụ khác nhau [17]

Hiện nay tồn tại hai hệ thống phân loại cam quýt được nhiều người áp dụng, theo

Tanaka (Nhật Bản) cam quýt gồm 160-162 loài (Species) Tanaka đã quan sát, ghi

chép tỷ mỉ đặc điểm hình thái của các giống đã biến dị này và phân chúng thành một loài mới hoặc giống mới có tên khoa học được bắt đầu bằng tên giống hay tên loài đã phát sinh ra chúng và kết thúc bằng chữ “Horticulturre‟‟ Swingle đã chia cam quýt ra làm 16 loài [8] Tuy nhiên, các nhà khoa học vẫn phải sử dụng hệ thống phân loại của Tanaka để gọi tên các giống cam quýt vì bảng phân loại này chi tiết

tới từng giống Theo Tanaka có 10 nhóm quan trọng nhất trong nhóm True Citrus group, đây là những loài được trồng phổ biến và có ý nghĩa với con người, có thể

được mô tả trong bảng sau [8]

Bảng 2.1: Các loài cam, quýt có ý nghĩa trong thực tiễn sản xuất

STT Tên loài Tên tiếng anh Tên tiếng việt

1 C.sisnensis Osbeck Sweets Orange Cam ngọt

6 C.aurantifolia Swingle Lime Chanh vỏ mỏng

(Đường Hồng Dật, 2003) [4]

2.1.2 Giá trị của cây cam

Sản phẩm của cây cam là một trong những sản phẩm có giá trị được nhiều người ưa chuộng và được sản xuất ở nhiều nước trên thế giới

- Thành phần dinh dưỡng trong thịt quả tươi bao gồm: đường, axit hữu cơ, vitamin C Trong 100g phần ăn được có chứa 88-94% nước; 6-12% chất khô chủ yếu là đường, axit hữu cơ chiếm 0,4-1,4% chủ yếu là axit citric; 0,9% pectin, 40- 90mg% vitamin C; 0,07mg vitamin B1; 0,06mg vitamin B6; 0,1mg vitamin E, 2µg vitamin A [11] Ngoài ra còn chứa các chất khoáng cần thiết như Ca, P, Mg, Fe…

và dầu thơm Người ta còn phân tích được có 0,7-1,3g protein trong 100g thịt quả, trong đó chứa nhiều axit amin không thay thế như aspatic (26,8mg), alanin (6mg), valin (2,2mg), phenylalanin (3,4mg), lysin (90,8mg), leucin (1,2mg) và ocnithin (3,4mg) [13]

- Giá trị công nghiệp và dược liệu: Vỏ quả có chứa tinh dầu Tinh dầu được cất từ vỏ, quả, lá, hoa được dùng trong công nghiệp thực phẩm và công nghiệp mỹ phẩm Ở nhiều nước trên thế giới, người ta đã dùng các loại quả thuộc chi Citrus

làm thuốc chữa bệnh Ở thế kỷ XVI, các thầy thuốc Trung Quốc, Ấn Độ đã dùng quả cam quýt để phòng ngừa bệnh dịch hạch, chữa trị bệnh phổi và bệnh chảy máu dưới da Ở Mỹ vào những năm 30 của thế kỷ XX, các thầy thuốc đã dùng các quả cam quýt kết hợp với insulin để chữa trị bệnh đái tháo đường Ở Nga bắt đầu từ thế kỷ XI, các loại quả cây có múi đã được sử dụng để phòng ngừa và chữa trị trong y học dân gian Ở nước ta, nhân dân đã dùng cây ăn quả có múi để phòng và chữa trị một số bệnh từ lâu [4]

- Giá trị kinh tế: Cây cam là một trong những loại cây lâu năm, nhanh cho thu hoạch Một số loài có thể cho thu hoạch quả ở năm thứ 2 sau khi trồng Ở nước ta, năng xuất trung bình của cam quýt ở thời kỳ 8 tuổi có thể đại tới 16 tấn/ha Cây cam quýt có thể sống và cho thu hoạch quả trong vòng 15-30 năm Trong trường hợp đất tốt, được chăm sóc đầy đủ và áp dụng các biện pháp kỹ thuật thâm canh cao, trong các điều kiện khí hậu thích hợp và không bị sâu bệnh gây hại nặng, tuổi thọ của cam quýt có thể kéo dài trên 50 năm [4]

- Giá trị sinh thái, môi trường: Cây cam là cây ăn quả lâu năm được trồng trong các vườn cây của gia đình hộ nông dân hoặc trồng trên đồi tại các trang trại Trong quá trình sinh sống, các loại cam, quýt, bưởi tiết ra oxy trong không khí làm không khí trở nên trong lành, dịu mát Trong những chừng mực nhất định các chất bay hơi từ cây cam quýt có tác dụng diệt một số loài vi khuẩn làm cho không khí trở nên sạch hơn, môi trường sống của con người tốt hơn Cam quýt trồng trên các đồi đất, bên cạnh việc cho quả còn có tác dụng phủ xanh đất, giữ nước ngăn cản dòng chảy mạnh trên mặt đất sau các trận mưa lớn, do đó có ý nghĩa lớn trong việc làm giảm quá trình xói mòn, rửa trôi đất Ở vùng trung du và miền núi, cam quýt được trồng trong các vườn rừng, vườn đồi trong các hệ thống VAC là phương thức canh tác được áp dụng rộng rãi tại các trang trại nông nghiệp và đã thể hiện nhiều ưu điểm trong việc thực hiện nền nông nghiệp bền vững [4]

2.1.3 Đặc điểm thực vật học của cây cam

Cây cam là cây ăn quả thân gỗ lâu năm, tán rộng, lá xanh quanh năm, cây trưởng thành có thân, tán lớn, hạt đơn phôi…

- Rễ: Nhìn chung cam có bộ rễ ăn nông, trên biểu bì của rễ non có nấm cộng sinh Nấm có tác dụng tốt cho rễ như vai trò của lông hút với các cây trồng khác Sự phân bố rễ của cây ăn quả có múi phụ thuộc vào đặc tính của giống, mực nước ngầm và chế độ canh tác, chăm bón nhưng nhìn chung rễ cam

mẹ thì số cành quả nhiều và tỷ lệ đậu quả cũng cao

+ Cành dinh dưỡng: Cành không ra hoa, quả, chỉ có lá xanh có nhiệm vụ chính

là quang hợp, giữa cành mẹ và cành dinh dưỡng không có giới hạn rõ, năm nay là cành dinh duỡng, sang năm sau có thể là cành mẹ

+ Cành quả: Tuỳ giống cây ăn quả có múi mà cành quả có độ dài từ 3-25

cm, thông thường từ 3-9 cm Cành quả có lá thường đậu quả tốt hơn cành quả không có lá

- Lá gồm 3 phần chính: Phiến lá, eo lá và cuống lá Lá thường có 2 mặt (mặt lá và lưng lá), mặt lá có mô dậu, chứa nhiều nhu mô diệp lục làm nhiệm

vụ quang hợp Độ dày của mô diệp lục thay đổi tuỳ theo giống Lưng lá có mô xốp, nhiều khí khổng tập trung, phân bố ở mặt lưng lá (mật độ khí khổng phụ thuộc vào từng giống như chanh có 650 khí khổng/mm2, cam khoảng 480-

500 khi khổng/mm2) Thường mật độ khí khổng càng cao thì nhu cầu nước và

ẩm độ của giống đó càng lớn Trong năm cây thường ra 4 đợt lá, lá mùa xuân,

lá mùa hè, lá mùa thu và lá mùa đông Trong đó lá mùa xuân chiếm tỷ lệ cao

nhất, thường từ 60-70%, lá mùa xuân thường dài và hẹp, còn lá mùa hè, thu ngắn và rộng Tuổi thọ, kích thước của lá tuỳ thuộc vào điều kiện khí hậu, chế

độ chăm sóc và khả năng dinh dưỡng của cây Tuổi thọ của lá cam quýt từ 2-

3 năm tuỳ theo vùng sinh thái, vị trí lá và tình trạng sinh trưởng của cây, vị trí cấp cành…[14]

- Lá: Là một chỉ tiêu để phân loại giữa các giống, tuổi thọ của lá thay đổi tuỳ thuộc vào điều kiện khí hậu và điều kiện dinh dưỡng của cây Lá cây có múi có eo

lá phụ thuộc vào từng loài, eo lá là đặc điểm để phân biệt giữa các giống Ở Việt Nam tuổi thọ trung bình của lá là 15-24 tháng, ở vùng Á nhiệt đới có thể dài hơn, nhưng hết thời kỳ sinh trưởng sẽ rụng rải rác trong năm và thường rụng nhiều vào mùa đông Tuỳ theo giống và tuỳ theo mùa, lá có thể khác nhau về hình dạng, độ lớn, màu sắc, mật độ khí khổng, mật độ túi tinh dầu Lá có quan hệ chặt chẽ với sản lượng, nhất là với trọng lượng quả [21]

- Hoa: Là loại hoa lưỡng tính có khả năng tự thụ, tràng hoa thường có màu trắng riêng hoa chanh có màu tím Hoa thường có 5 cánh, nhị nhiều có từ 20-40 nhị Hoa được phân hóa từ mùa đông năm trước trong điều kiện khô và nhiệt độ thấp [21]

- Quả: Cam thuộc loại quả mọng, vỏ quả dày, mỏng khác nhau tùy từng loài Khi còn xanh chứa nhiều acid đến khi chín thì lượng acid giảm, hàm lượng đường và chất tan tăng lên Cấu tạo quả gồm hai phần vỏ quả và vỏ thịt [7]

+ Vỏ quả: Gồm vỏ ngoài và vỏ giữa

+ Thịt quả: Bộ phận chính của thịt quả là tép, mầu sắc của thịt quả phụ thuộc vào sắc tố vàng da đỏ Trong dịch nước quả còn có các hạt dầu thơm quyết định hương vị của quả

Quả có hai đợt rụng sinh lý:

+ Đợt 1: Sau khi ra hoa được khoảng 1 tháng (tháng 3-4) quả còn nhỏ khi rụng mang theo cả cuống

+ Đợt 2: Khi quả đạt đường kính 3-4cm (cuối tháng 4) quả rụng không mang theo cuống

Sau hai lần rụng quả sinh lý này, quả lớn rất nhanh (tốc độ trung bình 0,5-0,7 mm/ngày) tốc độ lớn chậm lại ít ngày vào lúc trước khi hình thành hạt sau đó lại tăng dần cho tới khi thu hoạch [23]

- Hạt: Tuỳ theo giống mà có sự khác nhau về kích thước, số lượng màu sắc và phôi hạt Các loại quả thuộc cây có múi phần lớn là hạt gồm nhiều phôi từ 1-7 phôi, gọi là hiện tượng đa phôi, trong đó có 1 phôi hữu tính cón các phôi khác gọi là phôi

vô riêng cây bưởi là hạt đơn phôi [7]

2.1.4 Yêu cầu sinh thái của cây cam

- Nhiệt độ: Phần lớn cây cam sinh trưởng thích hợp nhất ở nhiệt độ 25-27oC, cam sinh trưởng ở nhiệt độ 23-29oC Một số loài có thể chịu được nhiệt độ -5oC trong thời gian ngắn Những giống thích ứng với điều kiện nhiệt độ thấp thường có phẩm vị ngon, hấp dẫn, mẫu mã đẹp Ở nhiệt độ 40oC với thời gian kéo dài nhiều ngày, cây ngừng sinh trưởng, lá rụng, cành bị khô héo.Tuy nhiên, có những loài chỉ

bị hại khi nhiệt độ lên tới 50-57oC [8]

- Ánh sáng: Cây cam thích hợp với ánh sáng có cường độ 10.000-15.000 lux (tương ứng thời gian chiếu sáng 16-17h/ngày), cây có múi ưu ánh sáng tán xạ, không ưu ánh sáng trực xạ Các giống cam khác nhau có yêu cầu khác nhau về ánh sáng: Cam cần ánh sáng nhiều hơn quýt, quýt cần nhiều ánh sáng hơn chanh [10]

- Nước: Ẩm độ không khí là một yếu tố khá quan trọng ảnh hưởng tới sinh trưởng của cây cam, khi ẩm độ không khí cao làm cây ít thoát hơi nước, ít tiêu hoa năng lượng cho quá trình hút nước Nếu độ ẩm quá cao sẽ tạo điều kiện cho bệnh hại phát triển Ẩm độ không khí phù hợp nhất vào khoảng 70-75% [3] Theo viện

NC Cây ăn quả Miền Nam (2004), cây có múi cần nhiều nước, nhất là trong thời kì

ra hoa và kết quả nhưng cũng rất sợ ngập úng Ẩm độ thích hợp nhất là 70-80% Lượng nước cần khoảng 1000-2000mm/năm

- Gió: Theo GS Trần Thượng Tuấn năm 1992 [18], gió nhẹ với vận tốc 10km/h có tác dụng giảm nhiệt độ của vườn cây trong mùa hè, làm thoáng mát tránh được một số sâu bệnh hại Khi làm vườn chú ý hướng gió, giúp vườn cây được thông khí, tránh làm cây bị gẫy đổ, thụ phấn tốt trong mùa hoa nở

5 Đất: Các yếu tố đất đai quan trọng khi lựa chọn đất trồng cây có múi đó là tầng sâu đất, đất dễ thoát nước, mực nước ngầm sâu hoặc ổn định Mực nước ngầm phải tối thiểu sâu 1,5m dưới mặt đất Độ pH thích hợp với sinh trưởng của cam quýt từ 5,5-5,6 Đất quá chua sẽ có nhiều dinh dưỡng bị rửa trôi, và cũng có thể gây ngộ độc một số nguyên tố như đồng (Cu) Đất quá kiềm làm cây thiếu hụt một số nguyên tố nên có biểu hiện thiếu kẽm (Zn), sắt (Fe) Nhìn chung, đất phù hợp với trồng cây có múi là đất phù sa, phù sa cổ, đất bồi tụ, đất đỏ bazan, đất mùn đá vôi [3].

- Dinh dưỡng: Để phát triển tốt cây cam cần cung cấp đầy đủ và cân đối các nguyên tố dinh dưỡng đa lượng N, P, K cũng như các nguyên tố khoáng vi lượng

Cu, Mg, B

2.1.5 Tình hình sản xuất cây cam

2.1.5.1 Tình hình sản xuất trên thế giới

Hiện nay, cây cam là một trong những loại cây ăn quả chủ lực và được trồng tại nhiều nước và vùng lãnh thổ trên thế giới

Bảng 2.2: Tình hình sản xuất cam, quýt ở các châu lục trên thế giới

(Nguồn: FASTAT/FAO Statistics- năm 2015) [30]

Năm 2012 diện tích cam, quýt của toàn thế giới là 1.430.769 ha, năng suất trung bình đạt 8,6786 tấn/ha, sản lượng đạt 12.417.487 tấn Đến năm 2015 diện tích giảm xuống 1.361.449 ha nhưng do kĩ thuật chọn giống và canh tác tốt năng suất đạt 9,1617 tấn/ha từ đó sản lượng tăng lên 12.473.164 tấn

Châu Á có diện tích trồng cam quýt lớn nhất thế giới, kế tiếp tới châu Mỹ, châu Phi và châu Âu Châu đại dương là châu lục có diện tích trồng cam quýt nhỏ nhất (năm 2014 là 1270 ha)

2.1.5.2 Tình hình sản xuất ở Việt Nam

Ở nước ta, cây cam là cây trồng được thâm canh từ lâu đời, cho đến nay đã chọn ra được nhiều giống có năng suất và chất lượng cao đem trồng ở hầu hết các vùng trên cả nước

Từ những năm 1960, nước ta có khoảng 3000 ha cam quýt và phát triển khá mạnh, sản lượng hàng năm đã đạt vài nghìn tấn, năng suất bình quân vào khoảng 135-140 tạ/ha Thời kỳ từ những năm 1975 trở lại đây ở miền Bắc diện tích và sản lượng cam có xu hướng giảm dần, tuy nhiên ở miền Nam diện tích và sản lượng cam quýt lại tăng lên, các tỉnh có diện tích trồng cam nhiều như Vĩnh Long, Tiền Giang, Đồng Tháp Trong những năm trở lại đây diện tích, năng suất và sản lượng cam quýt trên cả nước được tăng lên rất mạnh mẽ và ổn định

Bảng 2.3: Tình hình sản xuất cam, quýt của nước ta giai đoạn 2010-2015

(Nguồn: Niên giám thống kê năm 2015) [9]

Kết quả thống kê cho thấy diện tích sản xuất cam quýt nhìn chung tăng từ năm 2010- 2015, từ năm 2010 đến năm 2012 giảm 7,8 (nghìn ha) Từ năm 2012 đến năm

2015 tăng vọt từ 67,5 (nghìn ha) lên 85,8 (nghìn ha) Diện tích cho thu hoạch có xu hướng không ổn định, năm 2010 đạt 64,1 (nghìn ha) đến năm 2012 giảm xuống 55,6 (nghìn ha) Sản lượng thu hoạch không đều, năm 2010 đạt 728,6 (nghìn tấn), sau đó giảm xuống năm 2013 đạt 706,0 (nghìn tấn) Sản lượng thu hoạch cao nhất là

năm 2014 đạt 758,9 (nghìn tấn) Năng suất năm 2010 đạt 11,4 (tấn/ha) đến năm

2015 đạt 12,6 (tấn/ha)

Bảng 2.4: Tình hình sản xuất cam, quýt ở các vùng của nước ta năm 2014

STT Vùng trồng

Diện tích gieo trồng (nghìn ha )

Diện tích thu hoạch (nghìn ha)

Năng suất (tấn/ha)

Tổng sản lượng (Nghìn tấn)

hoạch là 58,3 (nghìn ha), tổng sản lượng đạt 736,1 (nghìn tấn) và năng suất đạt 12,6 (tấn/ha)

2.2 Bệnh vàng lá Greening trên cây có múi

2.2.1 Lịch sử của bệnh

- Bệnh vàng lá Greening là dịch hại nguy hiểm nhất trên cây có múi, bệnh do

vi khuẩn Liberibacter asiaticus gây nên Bệnh vàng lá Greening đã được ghi nhận

từ năm 1992 ở Trung Quốc, với nhiều tên gọi khác nhau như Huanglongbing hay chồi vàng ở Nam Trung Quốc và được tài liệu hóa năm 1943, Greening ở Nam Phi (năm 1947), Likkubin (Đài Loan, năm 1951), Leaf mottle yellows ở Philippines, Greening ở Myanmar (năm 1970), Greening ở Việt Nam, Lào, Campuchia (năm 1980), Huanglongbing ở Brazil (năm 2004) và ở Frorida, Hoa Kỳ (năm 2005) Đến nay chưa được ghi nhận ở Ostraylia [8]

- Tại Việt Nam, bệnh Greening phát triển mạnh qua hai giai đoạn:

+ Giai đoạn 1: Vào các năm 1970 tại hầu hết các nông trường cam phía Bắc + Giai đoạn 2: Từ đầu thập kỷ 1990 tại các vùng trồng cam quýt quan trọng trong cả nước: Hà Giang, Tuyên Quang, Nghệ An, Đồng Tháp, Vĩnh Long Người sản xuất đa phần chưa hiểu biết những kỹ thuật trồng và thâm canh cây có múi, do

đó tạo ra những vườn cây kém chất lượng

2.2.2 Nguyên nhân và triệu chứng của bệnh

2.2.2.1 Nguyên nhân gây bệnh

Bệnh vàng lá Greening do hai dòng vi khuẩn Liberibacter gây ra, dòng châu Á

có tên là Liberibecter asiaticum và dòng châu Phi có tên là Liberibacter africanum

Dòng châu Á là dòng chịu nhiệt, chịu được nhiệt từ 27-32oC, dòng châu Phi là dòng ưu nhiệt, chịu được nhiệt từ 22-24oC [33]

Bệnh Greening lan truyền theo hai cách:

+ Do chiết ghép và nhân giống từ các cây bị bệnh

+ Lây truyền qua môi giới là rầy chổng cách Diaphorina citri ở châu Á và rầy Trioza erytrea ở châu Phi Rầy chổng cánh Diaphorina citri Là loại rầy có kích

thước dài 3,2- 3,5 mm, toàn thân màu xám tro, hơi phớt xanh Mắt kép nhỏ, râu đầu

có 9 đốt hai đốt cuối màu đen Đỉnh đầu có hai mảnh nhọn nhô ra phía trước như lưỡi kéo Cánh màu trong đục, có nhiều đốm nâu nhỏ

Rầy non và rầy trưởng thành chích hút dịch trên cây, lá non, lá bánh tẻ Thời gian phát triển của trứng từ 4-12 ngày, rầy non từ 10-35 ngày, rầy trưởng thành vũ hóa sau 6-7 ngày thì đẻ trứng Rầy trưởng thành sống được từ 50-60 ngày Ở điều kiện miền Bắc nước ta rầy chổng cánh phát sinh 9-10 lứa trong một năm [40]

Hình 2.1: Rầy chổng cánh Diaphorina citri

A – Rầy trưởng thành; B – Trứng và rầy non

(Nguồn: Brlansky.R.H và Rogers.M.E, 2007) [29]

2.2.2.2 Triệu chứng của bệnh vàng lá Greening

Bệnh rất phổ biến, là bệnh hại quan trọng nhất của nhất trên cây ăn quả có múi ở các vùng trên thế giới Tuy nhiên, triệu chứng bệnh biểu hiện với mức độ khác nhau tùy thuộc vào từng chủng loại, giống cây trồng, môi giới truyền bệnh, tuổi của cây, chủng vi khuẩn gây bệnh cũng như kĩ thuật canh tác, chăm sóc, bảo

vệ cây trồng Song triệu chứng chung nhất của bệnh là cây còi cọc, phiến lá ngắn, hẹp, gân lá bị xanh, những mô lá liền kề bị vàng hoặc đốm vàng, đôi khi gân lá bị hóa bần [10]

Khi cây bị nhiễm bệnh vàng lá Greening vi khuẩn không gây hại mạch gỗ nhưng gây các vết chết hoại trong mạch libe, sự vận chuyển đường đến các bộ

phận của cây bị cản trở Lá nhỏ, tuổi thọ của lá bị rút ngắn, sự phân chia tế bào luôn xảy ra khiến gân lá bị sưng Vi khuẩn cũng hiện diện nhiều ở cuống quả và làm quả bị lệch tâm, quả nhỏ, khối lượng quả giảm và hàm lượng đường trong quả thấp dẫn đến chất lượng của quả giảm [27] Rễ cây bị bệnh làm nghẽn mạch dẫn, rễ bị hoại tử nhiều, rễ tơ không hút được dinh dưỡng để nuôi cây Cây nhiễm bệnh bị rụng quả cùng với sự phát triển của bệnh, cây sẽ chết sau 2-5 năm tùy theo mức độ nhiễm [28].

Đỗ Đình Đức năm 1991 [6] đã chia triệu chứng bệnh làm bốn dạng:

- Dạng thứ nhất xuất hiện trên một vài lá, một vài cành hay một phần của tán cây, những cành khác vẫn xanh tốt bình thường, gân chính và gân phụ của lá xanh đậm, thịt

lá giữa các gân vàng hay xanh lốm đốm, kích thước lá phát triển bình thường

- Dạng thứ hai bệnh biểu hiện trên toàn cây, gân và thịt lá vàng, lá uốn cong hình thìa, nhỏ và dày, cây lùn xơ xác, thân cây nơi tiếp hợp phình to, phần gỗ có nhiều gai nhỏ hay lỗ nhỏ, hoa nở sớm, dị hình, kéo dài, rễ tơ bị thối

- Dạng thứ ba bệnh chỉ biểu hiện trên giống cam Sông Con ghép trên gốc bưởi

và đặc biệt là gốc cam Voi Quảng Bình

- Dạng triệu chứng thứ tư bệnh biểu hiện trên lộc xuân của giống cam Sông Con và Washington Navel, dọc theo gân chính thịt lá màu xanh thẫm hơn, rìa vết bệnh màu vàng nhạt [6]

A

B

Hình 2.2: Triệu trứng nhiễm bệnh vàng lá Greening trên cây có múi

(Nguồn: Brlansky.R.H và Rogers.M.E, 2007) [29]

2.2.3 Phương pháp chẩn đoán bệnh vàng lá Greening

Bệnh có thể được phát hiện và chẩn đoán dựa trên các dạng triệu chứng trên đồng ruộng, tuy nhiên các dạng triệu chứng này sẽ thay đổi theo từng đối tượng và giai đoạn khác nhau và có thể nhầm lẫn với một số bệnh thiếu dưỡng chất như thiếu Zn… Mặt khác sự biểu hiện của triệu chứng bệnh còn phụ thuộc vào số lượng vi khuẩn trong cây, khi số lượng vi khuẩn trong cây thấp thì cây vẫn không biểu hiện triệu chứng nên không thể phát hiện được [8]

Xác định tác nhân bằng kính hiển vi điện tử: Dưới kính hiển vi điện tử có thể quan sát được vi khuẩn có lông cứng, kích thước 350-550 × 600-1500 nm, vách tế bào có hai lớp, độ dày từ 20-25 nm Hình dạng của vi khuẩn thường có hình gậy, thon dài và được thay đổi từ lúc tế bào non đến lúc thành thục [35] Bằng phương pháp cắt lát siêu mỏng và soi dưới kính hiển vi điện tử, Kim J.S và cs năm 2009 đã nghiên cứu sự xâm nhập của tác nhân gây bệnh greening và cho thấy phần mạch dẫn (phloem) tích tụ tinh bột dẫn đến thoái hóa mạch dẫn, lục lạp trong lá bị ảnh hưởng nghiêm trọng Dẫn đến lá bị bệnh thường không có khả năng quang hợp, hấp thu và vận chuyển dinh dưỡng theo mạch dẫn [37] Phương pháp này cũng được Lê Mai Nhất năm 2014 sử dụng để giám định các tác nhân gây bệnh vàng lá Greening tại một số địa phương phía Bắc Việt Nam và cho kết quả tương tự [8]

Cho đến năm 1992, kính hiển vi điện tử đã được sử dụng rộng rãi để xác định tác nhân gây bệnh Tuy nhiên, sử dụng kính hiển vi điện tử không thể phân biệt được các dòng vi khuẩn châu Á và châu Phi [8]

Xác định tác nhân gây bệnh bằng phương pháp sinh học phân tử là phương pháp đã và đang được đẩy mạnh nghiên cứu, trong đó PCR là kỹ thuật được sử dụng rộng rãi nhất trong công tác chẩn đoán các tác nhân gây bệnh Hung và cs năm

1999 đã sử dụng cặp mồi đặc hiệu để chẩn đoán bệnh vàng lá Greening, sản phẩm thu được có kích thước 226 bp Phương pháp PCR cũng được sử dụng để phát hiện

Liberibacter asiaticum trong cơ thể rầy chổng cánh Diaphorina citri [32] Bằng kỹ

thuật này năm 2004 người ta đã phát hiện được dòng vi khuẩn châu Mỹ là

Liberibacter americanum đã có mặt tại 46 điểm của bang Sao Paulo-Brasil, và chỉ

một năm sau đã lên tới 79 điểm Kết quả này cho thấy sự lan truyền nhanh chóng

của vi khuẩn gây bệnh thông qua rầy chổng cánh Diaphorina Citri Kỹ thuật lai DNA là phương pháp cho độ chính xác cao với vi khuẩn Liberibacter asiticum đặc

biệt là trong côn trùng môi giới [32] Việc chẩn đoán tác nhân gây bệnh bằng kỹ thuật PCR cho kết quả với độ chính xác cao, tuy nhiên phương pháp đòi hỏi trình độ

kỹ thuật cao và chi phí tốn kém Vì vậy mà ngày nay các nhà khoa học đã phát triển

bộ Kit Iodine để chẩn đoán nhanh tác nhân gây bệnh dựa trên nguyên tắc Iodine có thể phản ứng với tinh bột trong lá cây bị nhiễm bệnh và tạo màu nhạt hoặc đen

Su H.J năm 2008 [41] đã sử dụng phương pháp cây chỉ thị kết hợp với Công nghệ Sinh học để xác định các chủng gây bệnh hại trên cây có múi ở Đài Loan Từ các mẫu bệnh được thu thập, vi khuẩn được làm sạch và sử dụng để lây nhiễm vào các giống cây có múi khác nhau được dùng để làm cây chỉ thị như quýt Ponkan, cam Liucheng, bưởi Wentan và chanh Eureka Cho đến nay đã xác định được bốn chủng vi khuẩn gậy bệnh khác nhau:

Chủng I: gây bệnh trên cam ngọt và quýt

Chủng II: có độ độc cao nên đã gây bệnh ở cả bốn giống cam, chanh, quýt, bưởi Chủng III: chỉ gây hại ở mức trung bình nên chỉ biểu hiện ở cam ngọt, quýt và biểu hiện nhẹ trên bưởi

Chủng IV: gây bệnh trên cam ngọt và quýt nhưng triệu chứng ẩn và phải sử dụng đến phương pháp PCR để phát hiện bệnh, tuy nhiên chủng này ít gặp trên đồng ruộng [41]

2.2.4 Một số biện pháp phòng tránh

 Sử dụng cây giống sạch bệnh:

+ Hệ thống vườn ươm giống sạch bệnh: Tuyển chọn cây đầu dòng, tạo cây sạch bệnh bằng kĩ thuật vi ghép đỉnh sinh trưởng Phân phối mắt ghép sạch bệnh cho vườn ươm[16]

+ Vi ghép đỉnh sinh trưởng: Năm 2000 Viện bảo vệ thực vật đã ứng dụng thành công kĩ thuật vi ghép đỉnh sinh trưởng để sản xuất giống cây sạch bệnh [16]

 Biện pháp canh tác:

+ Chặt bỏ các cây bị nhiễm bệnh và hủy bỏ hoàn toàn các vườn cây bị nặng