Nghiên cứu tạo sự kiện (event) ngô biến đổi gen chịu hạn đáp ứng về an toàn sinh học và có giá trị kinh tế

Tuy nhiên hàng năm nước ta vẫn phải nhập khẩu ngô với lượng khá lớn, 1,614 triệu tấn năm 2012 với giá trị hơn 500 triệu USD.[1] Từ những số liệu này cho ta thấy nhu cầu về ngô rất lớn, n

THÁI HỒNG QUANG

Tên đề tài:

ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG SINH TRƯỞNG PHÁT TRIỂN CỦA MỘT SỐ

DÒNG NGÔ CHUYỂN GEN CHỊU HẠN THẾ HỆ T5

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo : Chính quy Ngành/chuyên ngành : Công nghệ sinh học

Khoá học : 2013 - 2017

Thái Nguyên, năm 2017

THÁI HỒNG QUANG

Tên đề tài:

ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG SINH TRƯỞNG PHÁT TRIỂN CỦA MỘT SỐ

DÒNG NGÔ CHUYỂN GEN CHỊU HẠN THẾ HỆ T5

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo : Chính quy Ngành/chuyên ngành : Công nghệ sinh học

Khoá học : 2013 - 2017 Người hướng dẫn : 1 TS Nguyễn Văn Duy

2 TS Nguyễn Xuân Thắng

Thái Nguyên, năm 2017

Tôi xin chân thành cảm ơn quý thầy cô trong khoa Công Nghệ Sinh Học và Công Nghệ Thực Phẩm, trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, đã

có những góp ý quý báu và kịp thời cho tôi trong quá trình thực hiện đề tài này

Nhân dịp này, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè và người thân

đã luôn giúp đỡ, động viên và tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành đề tài

Thái Nguyên, ngày … tháng … năm 2017

Sinh Viên

Thái Hồng Quang

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Trình tự các mồi sử dụng trong nghiên cứu 19 Bảng 4.1 Kết quả đánh giá độ tinh sạch và nồng độ ADN tổng số các dòng ngô chuyển gen modiCspB của nguồn V152 bằng máy đo quang phổ 25 Bảng 4.2 Kết quả đánh giá độ tinh sạch và nồng độ ADN tổng số các dòng ngô chuyển gen modiCspB của nguồn C436 bằng máy đo quang phổ 25 Bảng 4.3 Kết quả PCR xác định sự có mặt gen CspB của cây dòng V152 28

ở thế hệ T5 thông qua phản ứng PCR 28 Bảng 4.4 Kết quả PCR xác định sự có mặt gen modiCspB của cây dòng C436 ở thế hệ T5 thông qua phản ứng PCR 29 Bảng 4.5 Thời gian sinh trưởng của các dòng ngô chuyển gen và dòng không chuyển gen tương ứng vụ Xuân 2017 31 Bảng 4.6 Chỉ tiêu về hướng lá, tai lá, màu sắc cờ và râu của các dòng ngô chuyển gen và không chuyển gen vụ Xuân 2017 32 Bảng 4.7 Một số đặc điểm hình thái của các dòng Vụ Xuân 2017 33 Bảng 4.8 Khả năng chống chịu của các dòng 37 Bảng 4.9 Chiều dài bắp, đường kính bắp, số hàng hạt và số hạt/hàng của các nguồn vật liệu vụ Xuân 2017 38 Bảng 4.10 Tỷ lệ hạt/bắp, trọng lượng 1000 hạt và năng suất của các dòng vụ Xuân 2017 40

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Sơ đồ cấu trúc biểu hiện mang gen modiCspB 8

Hình 4.1 Kết quả kiểm tra chất lƣợng ADN tổng số các dòng ngô chuyển gen modiCpsB của nguồn V152 thế hệ T5 trên gel agarose 1% 26

Hình 4.2 Kết quả kiểm tra chất lƣợng ADN tổng số các dòng ngô chuyển gen modiCpsB của nguồn C436 thế hệ T5 trên gel agarose 1% 26

Hình 4.3 Ảnh điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 2% kiểm tra sự có mặt của gen modiCspB của dòng V152 chuyển gen thế hệ T5 27

Hình 4.4 Ảnh điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 2% kiểm tra sự có mặt 29

Hình 4.5 Hình thái cây của dòng C436 34

Hình 4.6 Hình thái cây của dòng C436-modiCspB 34

Hình 4.7 Hình thái cây của dòng V152 34

Hình 4.8 Hình thái cây của dòng V152-modiCspB 34

Hình 4.9 Hình thái cờ của dòng C436 35

Hình 4.10 Hình thái cờ của dòng C436-modiCspB 35

Hình 4.11 Hình thái cờ của dòng V152 36

Hình 4.12 Hình thái cờ của dòng V152-modiCspB 36

Hình 4.13 Dạng bắp của dòng C436 39

Hình 4.14 Dạng bắp của dòng C436-modiCspB 39

Hình 4.15 Dạng bắp của dòng V152 39

Hình 4.16 Dạng bắp của dòng V152-modiCspB 39

DANH MỤC TỪ VÀ THUẬT NGỮ VIẾT TẮT

Từ, thuật ngữ viết tắt Nghĩa đầy đủ của từ, thuật ngữ

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

DANH MỤC CÁC BẢNG ii

DANH MỤC HÌNH iii

DANH MỤC TỪ VÀ THUẬT NGỮ VIẾT TẮT iv

MỤC LỤC v

Phần 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu của đề tài 2

1.2.1 Mục tiêu tổng quát 2

1.2.2 Mục tiêu cụ thể 2

1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 2

1.3.1 Ý nghĩa khoa học của đề tài 2

1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài 3

Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

2.1 Tình hình nghiên cứu và phát triển cây trồng biến đổi gen chịu hạn 4

2.2 Sự kiện cây ngô chuyển gen modiCspB 6

2.3 Các phương pháp đánh giá, phân tích cây chuyển gen 8

2.4 Một số khái niệm liên quan đến tính ổn định của cây trồng 11

2.4.1 Genotype và môi trường 11

2.4.2 Tương tác genotype và môi trường 11

2.4.3 Tính ổn định 12

2.5 Tính chịu hạn ở thực vật 12

2.6 Các hình thức chịu hạn ở thực vật 13

2.7 Cơ sở di truyền của tính chịu hạn 14

2.8 Ảnh hưởng của hạn đối với cây ngô 15

2.8.1 Hạn ảnh hưởng đến các đặc tính sinh lý của cây ngô ở mức độ tế bào 15

2.8.2 Hạn ảnh hưởng đến mức độ toàn cây ngô 16

2.8.3 Hạn ảnh hưởng đến năng suất ngô ở các giai đoạn sinh trưởng

khác nhau 17

Phần 3 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 3.1 Đối tượng nghiên cứu và phạm vi nghiên cứu 18

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 18

3.1.2 Phạm vi nghiên cứu 18

3.1.3 Hóa chất và thiết bị nghiên cứu 18

3.2 Nội dung nghiên cứu 19

3.3 Phương pháp nghiên cứu 19

3.3.1 Phương pháp tách chiết ADN tổng số từ lá ngô 19

3.3.2 Kỹ thuật PCR (Polymerase chain reaction) 21

3.3.3 Điện di kiểm tra sản phẩm PCR trên gel agarose 2% 22

3.3.4 Phương pháp đánh giá đặc điểm nông học của một số dòng ngô thuần chuyển gen và dòng tương ứng không chuyển gen 22

3.4 Các phương pháp xử lý số liệu 23

Phần 4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 24

4.1 Kết quả xác định sự có mặt của gen chịu hạn modiCspB trong các dòng ngô chuyển gen thế hệ T5 thông qua kỹ thuật PCR 24

4.1.1 Kết quả tách chiết và kiểm tra ADN tổng số 24

4.1.2 Kết quả PCR xác định sự có mặt của gen modiCspB ở thế hệ T5 của dòng V152 27

4.1.3 Kết quả PCR xác định sự có mặt của gen modiCspB ở thế hệ T5 của dòng C436 28

4.2 Kết quả khảo sát, đánh giá tính ổn định của các dòng ngô chuyển gen modiCspB ở thế hệ T5 thông qua các đặc điểm hình thái 30

4.2.1 Thời gian sinh trưởng của các dòng 31

4.2.2 Một số đặc điểm hình thái 32

4.2.3 Khả năng chống chịu 36

4.2.4 Các yếu tố cấu thành năng suất và năng suất của các dòng 38

Phần 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 43

5.1 Kết luận 43

5.2 Kiến nghị 43

TÀI LIỆU THAM KHẢO 44

Phần 1

MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Ngô là một trong ba cây ngũ cốc quan trọng của thế giới (lúa mì, lúa nước, ngô) được sử du ̣ng làm lương th ực cho người, thức ăn cho chăn nuôi, nguyên liệu cho công nghiệp, đặc biệt là nguyên liệu lý tưởng cho nhiên liệu sinh học, ngô còn là mặt hàng nông sản xuất khẩu có giá trị, ngô đã được hầu hết các nước và vùng lãnh thổ trên thế giới gieo trồng và phát triển liên tục Ở Việt Nam, ngô là cây lương thực chính đứng thứ hai sau lúa và là đối tượng chủ lực trong công cuộc xóa đói giảm nghèo, đặc biệt ở các tỉnh vùng núi Năm 2012, diện tích gieo trồng ngô của cả nước đạt gần 1,2 triệu ha với sản lượng 4,6 triệu tấn, năng suất đạt 40,09 tạ/ha Tuy nhiên hàng năm nước ta vẫn phải nhập khẩu ngô với lượng khá lớn, 1,614 triệu tấn năm 2012 với giá trị hơn 500 triệu USD.[1] Từ những số liệu này cho ta thấy nhu cầu về ngô rất lớn, nhất là trong điều kiện khá khắc nhiệt ở Việt Nam điển hình là hạn hán có ảnh hưởng rất nhiều đến năng suất cũng như tính ổn định năng suất của cây ngô Và từ trước đến nay đã có rất nhiều nỗ lực trong nghiên cứu chọn tạo giống để nâng cao năng suất và tính ổn định về năng suất thông qua chọn lọc truyền thống trong điều kiện khô hạn Tuy nhiên, chọn lọc tính chịu hạn theo phương pháp truyền thống thường hiệu quả không cao vì sự tương tác rất phức tạp giữa kiểu gen và môi trường Bởi vậy, tạo giống ngô chịu hạn bằng phương pháp chuyển gen là cần thiết và hiệu quả

Có hai phương pháp chuyển gen được áp dụng phổ biến là phương pháp chuyển gen trực tiếp bằng súng bắn gen và chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn

Agrobacterium Trong đó, phương pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium có nhiều ưu điểm như giá thành rẻ; tiện lợi; tần suất chuyển gen

bền vững cao Tuy nhiên, sự thành công việc chuyển gen vào cây ngô thông qua

vi khuẩn Agrobacterium phụ thuộc vào sự tương tác, tồn tại tương thích của gen

được chuyển với hệ genom của cây chủ (cây nhận gen) và sự biểu hiện, ổn định của dòng được chuyển gen qua các thế hệ Tại Bộ môn Công nghệ Gen thuộc

Viện nghiên cứu ngô đang thực hiện đề tài “Nghiên cứu tạo sự kiện (event) ngô biến đổi gen chịu hạn đáp ứng về an toàn sinh học và có giá trị kinh tế” và đã thu được các dòng cây chuyển gen modiCspB thế hệ T5 Nhiệm vụ

trong nghiên cứu của khóa luận này là xác định sự có mặt của gen modiCspB

trong các dòng ngô chuyển gen và đánh giá tính ổn định của các dòng ngô chuyển gen thông qua đặc điểm hình thái ở thế hệ T5

1.2 Mục tiêu của đề tài

1.2.1 Mục tiêu tổng quát

Đánh giá được sự có mặt của gene chuyển và tính ổn định của các dòng ngô chuyển gene nhằm thiết lập bộ dữ liệu phân tử và hình thái cho sự kiện ngô chuyển gen chịu hạn

1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

1.3.1 Ý nghĩa khoa học của đề tài

- Cung cấp bổ sung các dẫn liệu khoa học về phân tử và hình thái của các dòng ngô chuyển gen thông qua việc xác định gen chuyển và đánh giá tính ổn định của chúng

- Các kết quả của đề tài đóng góp dẫn liệu khoa học làm cơ sở khoa học

để tạo ra các giống ngô lai chịu được trong điều kiện khô hạn, phục vụ trực tiếp

cho việc mở rộng diện tích trồng ngô ở Việt Nam, góp phần giải quyết nhu cầu lớn về tiêu thụ ngô trong nước và xuất khẩu

1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài

Phục vụ cho việc nghiên cứu chọn tạo giống ngô chịu hạn bằng phương pháp chuyển gen để nâng cao năng suất, tính ổn định đáp ứng về an toàn sinh học và có giá trị kinh tế cao trong điều kiện bất lợi, phù hợp với điều kiện canh tác ở Việt Nam

Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tình hình nghiên cứu và phát triển cây trồng biến đổi gen chịu hạn

Đến nay các nhà khoa học trên thế giới đang tập trung nghiên cứu, phát triển cây trồng biến đổi gen cho 24 loại cây trồng khác nhau với 364 sự kiện (Event) chuyển gen đã được tạo ra, bao gồm các nhóm cây lấy hạt, lấy dầu, lấy củ, lấy quả, lấy sợi và cây hoa Trong số đó, cây ngô được nghiên cứu chủ yếu với 138 sự kiện, tiếp đến là cây bông vải (54), khoai tây (42), cải dầu (36)

và đậu tương (30) Trong tổng số 36 gen đã được chuyển vào cây trồng có 14 gen được ứng dụng rộng rãi hơn cả như: gen kháng kháng sinh, gen kháng côn trùng, gen kháng thuốc diệt cỏ, gen nâng cao khả năng chống chịu hạn, gen kháng bệnh virus, gen biến đổi màu sắc hoa,…[5]

Năm 1996 cây trồng BDG được canh tác đầu tiên, cho đến năm 2014 cây trồng BDG được canh tác tại rộng rãi tại 28 nước với tổng diện tích khoảng 181,5 triệu ha (số nước trồng cây biến đổi gen tăng 4 lần, diện tích tăng hơn

100 lần so với năm 1996), tỷ lệ tăng trưởng hàng năm khoảng 3 đến 4% Trong đó Mỹ là quốc gia đứng đầu về diện tích cây trồng chuyển gen trên thế giới (73,1 triệu ha, chiếm 40%), tiếp đến là Barazil (42,2 triệu ha), Argentina (24,3 triệu ha), Ấn Độ (11,6 triệu ha), Canada (11,6 triệu ha) Đáng chú ý lá

số quốc gia đang phát triển đưa cây trồng BDG vào canh tác ngày càng tăng trong khi các nước phát triển đặc biệt là các nước châu Âu rất hạn chế mở rộng diện tích Điều này cho thấy, cây trồng biến đổi gen đang đóng góp tích cực cho phát triển nông nghiệp và tăng trưởng kinh tế đặc biệt là các nước đang phát triển do giảm được chi phí sản xuất, nâng cao năng suất Giống ngô chuyển gen chịu hạn đầu tiên được thương mại hóa là Monsanto 87460 được phát triển từ dòng ngô chuyển gen DroughtGard Đặc điểm chịu hạn của dòng

ngô có được nhờ đưa gen CspB từ một loài vi khuẩn trong đất Bacillus subtilus Năm 2013, giống ngô này được trồng ở Hoa Kỳ với diện tích 50.000

ha, năm 2014 diện tích đã đạt 275.000 ha, tăng 5,5 lần Điều này phản ánh sự tiếp nhận của các hộ nông dân đối với giống ngô chịu hạn này.[6]

Từ năm 2011, Việt Nam chính thức gia nhập các nước trồng ngô chuyển gen và đã mua hạt giống ngô chuyển gen từ các công ty Syngenta, Dekalb, Pioneer mang tính kháng sâu và kháng thuốc diệt cỏ Các giống ngô BDG MON89034,NK603,MON89034xNK603,Bt11,GA21,Bt11xGA21,TC1507 là các giống ngô được phép trồng khảo nghiệm trên diện rộng với mục đích làm thức ăn gia súc Đây là các giống ngô được sử dụng rộng rãi ở Việt Nam trong thời gian sau khi khảo nghiệm xong theo Quyết định số 2940/BNN-VP ngày 11 tháng 10 năm 2011 của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn về khảo nghiệm ngô biến đổi gen ở Việt Nam

Ngày 03 tháng 11 năm 2014, Bộ Tài nguyên và Môi trường đã cấp Giấy chứng nhận an toàn sinh học cho ngô biến đổi gen mang sự kiện GA21 (Công

ty TNHH Syngenta Việt Nam) và NK603 (Công ty TNHH Dekalb Việt Nam) Các sự kiện ngô biến đổi gen được cấp Giấy chứng nhận an toàn sinh học nêu trên đều mang đặc tính chống chịu thuốc trừ cỏ Trước khi được cấp Giấy chứng nhận an toàn sinh học tại Việt Nam, ngô biến đổi gen mang sự kiện NK603 đã được 11 quốc gia phê chuẩn và sự kiện GA21 đã được 09 quốc gia cấp phép phóng thích vào môi trường Trong đó có thể kể đến các quốc gia phát triển như: Hoa Kỳ, Canada, Nhật Bản theo Quyết định số 2485 và 2486/QĐ-BTNMT ngày 3 tháng 11 năm 2014 của Bộ Tài nguyên và Môi trường về việc cấp Giấy chứng nhận an toàn sinh học cho ngô biến đổi gen GA21 (Công ty TNHH Syngenta Việt Nam) và NK603 (Công ty TNHH Dekalb Việt Nam)

2.2 Sự kiện cây ngô chuyển gen modiCspB

Protein CSPs (cold shock proteins) được mã hóa bởi csp là họ protein

phổ biến ở cả vi khuẩn Gram âm và Gram dương Theo nghiên cứu, đây là nhóm protein có kích thước nhỏ (~ 7,5 kD) và có tính axit (Jones et al, 1987;

Graumann et al,1997) Trong họ protein này, CspB là một protein điển hình

và lần đầu được phân lập từ vi khuẩn Bacillus subtillis vào năm 1992 bởi

Willimsky và cộng sự, gen CspB có kích thước 201bp mã hóa cho protein có

khối lượng phân tử là 7.365 kDa (Willimsky et a, l992) Với trình tự dài 67 amino acid, vùng CSD (cold shock domain) của CspB có cấu trúc bảo thủ cao với 5 chuỗi β cuộn gập cùng các vùng domain có khả năng nhận biết gắn với các trình tự ATTGG- và CCAAT hay còn gọi là Y-factor trên các sợi ssDNA/RNA (Graumann và Marahiel, 1994) Khi nhiệt độ môi trường giảm

mạnh, CspB có chức năng như một RNA chaperone, được tích lũy nhanh

chóng trong tế bào giúp cho các sợi mRNA có thể tồn tại ở dạng sợi đơn từ

đó đảm bảo quá trình dịch mã của tế bào được diễn ra liên tục, giúp tế bào chống chịu được ở nhiệt độ thấp.(Graumann và Marahiel, 1998)[7]

Từ nhiều năm trước Gen CspB (phân lập từ vi khuẩn B.subtillis) được

sử dụng trong chuyển gen thực vật Qua các thí nghiệm đã chứng minh thực

vật dược chuyển gen CspB tăng khả năng chống chịu trong các điều kiện

stress như: lạnh, nóng và thiếu nước Castiglioni và cs (2008) đã nghiên cứu

tạo cây ngô chuyển gen mang gen CspB có khả năng chống chịu tốt trong

điều kiện thiếu nước, so sánh với cây đối chứng không chuyển gen trong điều kiện thiếu nước thì cây chuyển gen Cspb có khả năng tăng 3,6% tốc độ phát triển lá Thậm chí, hai dòng chuyển gen biểu hiện mạnh protein này (CspB-

Zm 1 và 2) còn có tốc độ phát triển nhanh hơn 12% và 24% so với cây đối chứng Những ảnh hưởng tích cực đến năng suất của cây ngô trong điều kiện hạn chế về nước tưới đã chứng thực được những ưu điểm vượt trội của gen

CspB, khi tiến hành kiểm tra năng suất cho hạt của các dòng ngô chuyển gen

trong điều kiện thiếu nước, nhóm nghiên cứu đã chỉ ra rằng năng suất cho hạt của hai dòng CspB-Zm 1 và 2 cao hơn năng suất cho hạt của đối chứng không chuyển gen tương ứng là 20,4% và 10,9% (Castiglioni et al., 2008) Như vậy,

gen CspB (từ vi khuẩn B subtilis) là rất triển vọng trong phát triển cây ngô có

khả năng chịu hạn.[8]

Việc biểu hiện gen có nguồn gốc từ vi khuẩn nhiều lúc hiệu quả chưa cao do sự khác biệt về mã bộ ba Cho nên, Viện Nghiên cứu Hệ gen kếp hợp

với Viện nghiên cứu Ngô đã tiến hành tổng hợp gen modiCspB có các

nucleotide đã được cải biến để phù hợp hơn với sự biểu hiện trong thực vật và thiết kế các vector chuyển gen và tiến hành chuyển gen cho cây ngô dựa trên

trình tự các gen CspB được công bố trên ngân hàng Genbank và đã thu được kết quả khả quan Trong đó, gen modiCspB đã có 25 cặp bổ sung A-T được

sửa thành G-C, 20 cặp bổ sung T-A được sửa thành C-G được tổng hợp nhân tạo và chuyển vào vector tách dòng pIDTsmart-Kan Trình tự đoạn gen đích

modiCspB có kích thước 204bp bao gồm mã mở đầu ATG và mã kết thúc TGA, mã hóa cho đoạn protein gồm 67 amino acid Trình tự gen modiCspB được so sánh với các trình tự gen CspB đã công bố trên GenBank Các trình

tự được chọn để so sánh là gen CspB phân lập từ các chủng Bacillus ưa nhiệt

B.caldolyticus mã số X73373; ưa nhiệt trung bình B.subtilis mã số X59715; B.globigii mã số X73463; và ưa lạnh B.globisporus mã số X73374 Kết quả

so sánh cho thấy trình tự modiCspB tương đồng 75,9 % so với trình tự CspB của B.subtilis, 69,1% đối với CspB của B.caldolyticus, và lần lượt là 62,7%

và 62,8% đối với CspB của B.globigii vàB.globisporus Mặc dù, có sự khác

biệt về trình tự nucleotide của gen modiCspB với các trình tự gen CspB nhưng so sánh trình tự amino acid suy diễn từ gen modiCspB với trình tự amino acid được mã hóa bởi gen CspB của B.subtilis cho thấy sự tương

đồng là 99,89% Trong đó, trình tự của protein suy diễn vẫn giữ nguyên vùng CDS từ amino acid thứ 4 đến 65 là vùng chứa các domain hoạt động của

protein CspB Điều này sẽ đảm bảo các cấu trúc chức năng của protein không thay đổi Vì vậy, đoạn gen modiCspB được tổng hợp có đầy đủ đặc điểm mã hóa cho một protein CspB

Hình 2.1 Sơ đồ cấu trúc biểu hiện mang gen modiCspB

Hiện tại các dòng ngô chuyển gen modiCspB đã được duy trì tại Viện

Nghiên cứu Ngô ở thế hệ T5, đã và đang tiến hành phần tích ở mức độ phân tử cũng như đánh giá đặc điểm nông sinh học ngoài đồng ruộng.[2]

2.3 Các phương pháp đánh giá, phân ti ́ch cây chuyển gen

Kỹ thuật chuyển gen ở thực vật nói chung được hiểu đẩy đủ là: (i) gen ngoại lai (gen chuyển) phải được hợp nhất vào hệ gen tế bào chủ; (ii) gen chuyển phải được biểu hiện ở tế bào chủ; (iii) gen chuyển phải được di truyền cho các thế hệ sau; (iv) trong mỗi thế hệ sản phẩm của gen chuyển phải được biểu hiện,

và (v) sản phẩm của gen chuyển biểu hiện được chức năng sinh học

Phân tích sinh vâ ̣t chuyển gen là quá trình chọn lọc, phân tích sinh vâ ̣t chuyển gen trong mỗi thế hệ được thực hiện bằng (1) Hệ thống chọn lọc tế bào và mô chuyển gen, (2) Xác định sự có mặt của gen chuyển trong tế bào

cơ thể chủ; (3) Kiểm tra sự biểu hiện của gen chuyển thông qua xác định sản phẩm biểu hiện là mRNA, protein; và (4) Phân tích sự biểu hiện chức năng sinh học của gen chuyển

Việc xác định nguyên liệu thu được từ hệ thống tái sinh sau biến nạp gen

có phải là cây chuyển gen hay không là rất cần thiết, bao gồm các bước:

(1) Chọn lọc các thể biến nạp trong môi trường nuôi cấy in vitro bằng các chất cho ̣n lo ̣c, ví dụ: chất diê ̣t cỏ, chất kháng sinh ….

(2) Sử du ̣ng kỹ thuâ ̣t PCR, Southern blot vào viê ̣c phân tích sự có mặt của gen chuyển: i) Cở sở của viê ̣c phân tích s ự có mặt của gen chuyển: i) Gen chuyển được biến na ̣p vào mô tế bào chủ, mô tế bào tái sinh thành cơ thể; ii) gen chuyển hợp nhất vào hê ̣ gen tế b ào chủ; ii) PCR xác đi ̣nh được sự có mă ̣t c ủa gen chuyển trong sinh vâ ̣t chuyển gen; iii) Lai Southern xác đi ̣nh được số bản copy của gen chuyển trong sinh vâ ̣t chuyển gen;

(3) Phân tích sự biểu hiện của gen chuyển thông qua phiên mã: i) RT-PCR xác định định tính sự phiên mã của gen chuyển; ii) Lai Northern blot cho phép xác định trực tiếp sự có mặt các phân tử mRNA sản phẩm phiên mã của gen chuyển; iii) Real time RT-PCR đánh giá mức đô ̣ phiên mã của gen chuyển

(4) Phân tích sự biểu hiện của gen chuyển thông qua sản phẩm dịch mã: i) Điện di protein cho phép dự đoán xuất hiê ̣n protein tái tổ hợp, sản phẩm của gen chuyển; ii) Lai western cho phép khẳng đi ̣nh sản phẩm di ̣ch mã của gen chuyển

(5) Phân tích sự biểu hiện đặc tính sinh học của gen chuyển: Đánh giá sự biểu hiê ̣n chức năng sinh ho ̣c của gen chuyển trong điều kiê ̣n nhân ta ̣o , thử nghiê ̣m trên vâ ̣t liê ̣u thí nghiê ̣m.[3]

Phương pháp phân tích cây chuyển gen bằng PCR

Một trong những phương pháp phân tích sự hiện diện của gen ở mức độ phân tử là thông qua phản ứng PCR Phương pháp PCR có ưu điểm phân tích nhanh với số lượng mẫu lớn Đây là phương pháp trong ống nghiệm để tổng hợp DNA dựa trên mạch khuôn là một trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng bản sao của khuôn này thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzyme polymerase và một cặp mồi (primer) đặc hiệu cho đoạn DNA này Primer là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một mạch của đoạn DNA khuôn và nhờ hoạt động của DNA polymerase đoạn

primer này được kéo dài để hình thành mạch mới Kỹ thuật PCR được hình thành dựa trên đặc tính này của DNA polymerase, đoạn DNA nằm giữa hai primer sẽ được khuếch đại thành số lượng lớn bản sao đến mức có thể thấy được sau khi nhuộm bằng ethidium bromide và có thể thu nhận đoạn DNA này cho các mục đích khác nhau bằng các thao tác trên gel Như vậy, để khuếch đại một trình tự DNA xác định, cần phải có những thông tin tối thiểu

về trình tự của DNA, đặc biệt là trình tự base ở hai đầu đoạn DNA đủ để tạo các primer bổ sung chuyên biệt (trích dẫn bởi Hồ Huỳnh Thuỳ Dương, 2003)

Kỹ thuật PCR đơn giản dễ thực hiện với hầu hết các phòng thí nghiệm được trang bị máy PCR.Trong phân tích cây chuyển gen, gen chuyển đã được biết trình tự vì vậy chỉ cần sử dụng cặp mồi đặc hiệu cho gen đó và tách chiết ADN từ mẫu thực vật cần xác định làm khuôn là có thể tiến hành PCR Sử dụng plasmid mang gen chuyển làm đối chứng, nếu sản phẩm PCR khi điện

di có kích thước đúng như dự kiến và bằng với đối chứng thì mẫu phân tích được coi là dương tính Tuy nhiên, PCR dương tính không đồng nghĩa với chuyển gen thành công vì có nhiều cách để giải thích sự có mặt của ADN trong mẫu phân tích: (1) Vi khuẩn A tumefaciens mang gen chuyển có thể còn tồn tại trong khối mô hay trong các gian bào của mẫu phân tích Hiện tượng này xuất hiện ở nhiều loại đối tượng và được gọi là dương tính giả.Nếu mẫu phân tích của thực vật đã qua nhân giống hữu tính tức đã qua một vài thế

hệ thì hiện tượng này được loại trừ (2) Gen chuyển tồn tại tự do trong tế bào chất (có thể biến mất qua sinh sản hữu tính) (3) Gen chuyển không hoạt động, tức không được phiên mã và biểu hiện ra protein có chức năng sinh học Chính vì vậy, kỹ thuật PCR rất hữu dụng đối với việc phân tích phát hiện các mẫu thực phẩm biến đổi gen (genetic modify origanism-GMO) Để phục

vụ việc xác định GMO, PCR còn được phát triển còn thành kỹ thuật multiplex PCR (MPCR) (Matsuoka et al., 2001) Với việc sử dụng đồng thời nhiều cặp

mồi nhận biết các gen khác nhau (promoter, terminator, gen chọn lọc, gen đích…) trong một phản ứng, MPCR cho phép phát hiện đồng thời nhiều trình

tự đích nếu mẫu có mang các gen đó Thông thường các cặp mồi được sử dụng trong multiplex PCR là mồi P35S, TNOS, NPT-II, GUS, EPSPS.Nếu kết quả dương tính với bất cứ cặp mồi nào thì mẫu cần xác định rất có thể đã được chuyển gen.[4]

2.4 Một số khái niệm liên quan đến tính ổn định của cây trồng

2.4.1 Genotype và môi trường

Genotype (kiểu di truyền): ở đây muốn nói về một loại cây trồng thuần nhất về mặt di truyền như dòng thuần hoặc không thuần về mặt di truyền như quần thể thụ phấn tự do, chứ không phải là nền di truyền của từng cá thể

Môi trường, theo nghĩa rộng, là tập hợp tất cả các yếu tố khí hậu, đất đai, sâu bệnh, điều kiện canh tác-chăm sóc đối với từng thí nghiệm được tiến hành ở một địa điểm Môi trường thuận lợi khi ít bị bất thuận và có năng suất trung bình ở mức cao.Môi trường kém thuận lợi khi có nhiều bất thuận sinh học và phi sinh học và có năng suất trung bình thấp

2.4.2 Tương tác genotype và môi trường

Tương tác genotype và môi trường có thể diễn đạt là phản ứng khác nhau của kiểu di truyền với môi trường mà chúng được gieo trồng Tương tác genotype và môi trường xuất hiện khi có sự biến động lớn giữa các kiểu di truyền về đặc tính sinh lý hình thái liên quan đến tính chống chịu bất thuận về khí hậu, độ phì đất và kỹ thuật canh tác Tương tác genotype và môi trường xuất hiện khi có biến động lớn của các vật liệu về chống chịu hạn hay chín sớm và giữa các môi trường về mức độ hạn cuối vụ Đây là một một hiện tượng phổ biến trong nghiên cứu nông nghiệp, nếu nắm vững về bản chất và nguyên nhân của sự tương tác kiểu gen-môi trường sẽ giúp các nhà chọn

giống có thể xác định được hướng nghiên cứu, đánh giá được nguồn vật liệu tạo giống cũng như chọn được kiểu gen ưu tú, ổn định

Kiểu gen hay bản chất di truyền của sinh vật được định nghĩa bởi Falconer và Mackay (1996) , đó là tổ hợp các alen tại locus trên nhiễm sắc thể thường (autosome) trong sinh vật lưỡng bội Những biểu hiện về hình thái

- kết quả do tương tác giữa kiểu gen và môi trường gọi là kiểu hình Kiểu hình

có thể quan sát, đo đếm hay phân loại.[9]

Ngô được trồng rất rộng rãi ở nhiều khu vực sinh thái rất khác nhau, những biến đổi của các yếu tố môi trường tác động đến thứ bậc của kiểu gen

có ảnh hưởng lớn đến năng suất ngô Tương tác kiểu gen - môi trường bản chất là phản ứng khác nhau của kiểu gen đối với điều kiện môi trường là yếu

tố quan trọng xác định sự biểu hiện của giống Một số kiểu gen được mô tả bởi sự biểu hiện ổn định của kiểu hình trong khi các kiểu gen khác phản ánh

sự biến đổi khác nhau qua các môi trường

2.4.3 Tính ổn định

Tính ổn định của giống cây trồng là các tính trạng liên quan của giống cây trồng cũng như sự biểu hiện của kiểu gen đó vẫn giữ được những mô tả,biểu hiện ban đầu Không bị thay đổi sau mỗi vụ nhân giống hoặc sau mỗi chu kỳ nhân giống trong trường hợp nhân giống theo chu kỳ.[13]

2.5 Tính chịu hạn ở thực vật

Có nhiều hình thức chịu hạn ở thực vật :

- Giảm bề mặt lá và giảm thoát hơi nước Lượng nước cung cấp cho cây

ít làm lá sinh trưởng chậm lại, bề mặt lá thu hẹp thích nghi với điều kiện thiếu nước Ngoài ra, Stress nước còn làm đóng khí khổng nhờ tác dụng của axit abxixic và kích thích sự rụng lá do tác dụng của etylen

- Lá biến đổi về hình thái : lớp sáp dày, nhiều lông phủ trên lá, giảm số lượng khí khổng, lá có dạng hình kim

- Khi thiếu nước tăng trưởng của lá và quang hợp đều giảm khiến cho phần lớn sản phẩm quang hợp được chuyển xuống rễ làm cho bộ rễ phát triển mạnh, rễ thường có khuynh hướng phát triển theo chiều sâu do lớp đất mặt thương khô trước cho nên việc phát triển bộ rễ là hình thức thích nghi với hạn

- Khả năng điều chỉnh áp suất thẩm thấu để duy trì cân bằng giữa tế bào với môi trường là hình thức thích nghi với hạn hán của nhiều cây Khi đất khô hạn, áp suất thẩm thấu của dung dịch đất rất cao, cây muốn hút được nước vào phải điều chỉnh áp suất thẩm thấu theo hướng tăng lên cao hơn áp suất thấm thấu của môi trường để có thể hút được nước Sự điều chỉnh áp suất thẩm thấu bằng cách tích tụ các chất hoà tan trong tế bào làm tăng áp suất thẩm thấu của dịch bào Tích tụ ion để điều chỉnh áp suất thẩm thấu xảy ra chủ yếu trong không bào nhờ vậy các ion không ảnh hưởng đến hoạt động của các enzym trong tế bào chất.[14]

2.6 Các hình thức chịu hạn ở thực vật

Có nhiều hình thức thích nghi với chế độ nước trong môi trường như nhóm cây thủy sinh, nhóm cây ưa ẩm, nhóm cây trung sinh và nhóm cây hạn sinh Nhóm cây thủy sinh sống trong môi trường nước, nhóm cây ưa ẩm sống trong môi trường có độ ẩm cao cho nên những nhóm cây này 8 không thể sống trong môi trường khô hạn Nhóm cây trung sinh sống trong môi trường

có độ ẩm thích hợp, nếu thiếu nước nhóm cây này sinh trưởng phát triển chậm Nhóm cây hạn sinh có những đặc điểm thích nghi với môi trường khô hạn Trong nhóm cây hạn sinh có 4 hình thức chịu hạn khác nhau:

- Cây mọng nước (xuculen): Đây là nhóm cây vừa chịu hạn vừa chịu nóng rất cao, có thể sống trong vùng có khí hậu khô nóng kéo dài Hình thức thích nghi với hạn hán của nhóm cây này là tiêu giảm lá, rễ cây lan rộng, dự trữ nước trong cây, lớp cuticum trên lá dày giảm THN, độ nhớt cao và sử dụng nước tiết kiệm Một số cây chỉ mở khí khổng vào đêm (cây CAM)

- Cây nửa hạn sinh (hemi xerophit): Đây là nhóm cây chịu hạn trung bình Đặc điểm chính của nhóm cây này là bộ rễ phát triển để hút nước mạnh, thoát hơi nước cũng xảy ra mạnh, độ nhớt không cao

- Cây hạn sinh thực: là nhóm cây có khả năng chịu hạn cao, cây hạn sinh thực có độ nhớt nguyên sinh chất cao, áp suất thẩm thấu cao, tính đàn hồi của nguyên sinh chất cao, quá trình THN yếu Sử dụng nước tiết kiệm là những đặc điểm giúp nhóm cây này chịu hạn tốt

- Cây không điều tiết chế độ nước: Đây là nhóm thực vật có lối sống đặc biệt thích nghi với chế độ nước trong môi trường Khi khô hạn nhóm thực vật này sống ở trạng thái tiềm sinh hay sống ngầm Khi gặp mưa môi trường

đủ nước chúng tiến hành mọi quá trình sinh trưởng, phát triển mạnh mẽ và nhanh chóng kết thúc vòng đời.[14]

2.7 Cơ sở di truyền của tính chịu hạn

Các nghiên cứu về di truyền hiện nay đã chỉ ra rằng gen chịu hạn có thể được chia thành ba nhóm chính: (1) Các gen tham gia vào con đường truyền tín hiệu (STP) và kiểm soát phiên mã; (2) Các gen có chức năng bảo vệ màng

tế bào và protein ; (3) Các gen giúp quá trình vận chuyển nước, vận chuyển và hấp thu ion

Để cây thích nghi với điều kiện khô hạn các gen phải được quy định chặt chẽ nhằm đáp ứng từ các tín hiệu stress khô hạn, thay đổi tùy thuộc vào mức độ nghiêm trọng của tình trạng hạn hán hay các yếu tố môi trường khác

và loài cây Hiện nay, việc thành công về cải thiện di truyền tính chịu hạn do một hay một vài gen quy định hoặc mã hóa enzym tham gia vào những con đường truyền tín hiệu chẳng hạn như osmolytes /chất tan tương thích, chất chống oxy hóa, phân tử chaperone, chất bảo vệ và vận chuyển nước và ion

Sự khó khăn trong nỗ lực cải thiện tính chịu hạn của cây trồng song sog là sự thay đổi khác thường không mong muốn, giữa pleiotropic và kiểu hình, đó là

tính đa hướng - sự ảnh hưởng đồng thời của một gen được tạo ra đến nhiều hơn một tính trạng không liên quan rõ rệt Cho nên nếu chuyển được hệ thống gen điều khiển hoặc gen chức năng thì phản ứng của cây đối với môi trường cũng chỉ có thể biểu hiện ở một thành phần nào đó trong toàn bộ tính trạng chịu hạn Vì vậy, cơ chế tương tác giữa các gen và sản phẩm của gen vẫn còn rất phức tạp, cần được tiếp tục nghiên cứu.[10]

2.8 Ảnh hưởng của hạn đối với cây ngô

2.8.1 Hạn ảnh hưởng đến các đặc tính sinh lý của cây ngô ở mức độ tế bào

Khi gặp hạn, axit absisic (ABA) được sinh ra chủ yếu ở phần rễ rồi vận chuyển lên lá Ở lá, nếu nồng độ ABA quá giới hạn gây nên hiện tượng héo

lá, đóng khí khổng và đẩy nhanh tốc độ già hoá Hiện tượng này thậm chí xảy

ra trước khi mức độ trương của tế bào lá bị giảm Dường như ABA là tín hiệu

từ bộ rễ báo cho cây để hạn chế sự mất nước Vì vậy ABA là chất điều hoà sinh trưởng giúp cây sống sót qua điều kiện hạn nhưng nó không đóng góp cho việc tăng năng suất trong điều kiện hạn Nếu hàm lượng ABA được chuyển tới hạt trong quá trình đẫy hạt sẽ làm hạt bị lép

Khi hạn nặng bộ rễ khó có thể phát triển, những tế bào của cây không phân chia và phát triển, thậm chí khi ta tưới nước bổ sung trở lại các bộ phận vẫn bị ảnh hưởng mô và tế báo khó trở lại bình thường nhất là mô phân sinh

và mạch dẫn Dẫn đến bộ lá không phát triển song song là râu ngô ngừng sinh trưởng và không phun râu Điều chỉnh áp suất thẩm thấu khi cây tạo ra chất tan Betan ở không bào và nguyên sinh chất cho phép cây tận dụng được nước, duy trì được sức trương, chức năng của tế bào trong điều kiện cây bị hạn Ở một số cây cao lương, lúa mì, lúa nước điều chỉnh được áp suất thẩm thấu thế nước s tăng từ - 1 lên - 1,7MPa nhưng ở ngô thì chỉ tăng từ - 0,3 lên - 0,5MPa Prolime được sinh ra nhiều hơn khi cây bị hạn nặng, nó như một chất

điều hòa thẩm thấu và có tác dụng như một protein bảo vệ cấu trúc khi sức trương của tế bào giảm mạnh

Trong điều kiện cây bị hạn làm ảnh hưởng đến hệ thống quang photphoril hóa thứ hai thì quang oxy hóa khứ diệp lục xuất hiện Hệ thống quang photphoril hóa thứ hai hoạt động mạnh dẫn đến thừa electron tự do không liên kết, năng lượng cao ở trong lá mà sự vận chuyển electron làm đấy nhanh quá trình quang oxy hóa diệp lục làm mất khả năng quang hợp của lá hện tượng rõ ràng nhất là khi cây bị hạn trời lại nắng to sẽ thấy lá cây bị cháy Ngoài ra khi cây bị hạn thì hoạt động của hệ enzyme bị giảm Ví dụ như sự biến đổi saccaroza thành tinh bột của hạt bị giảm vì hoạt hóa enzyme biến đổi saccaroza thành đường hexoza bị trở ngại.[11]

2.8.2 Hạn ảnh hưởng đến mức độ toàn cây ngô

Nếu hạn xảy ra ngay sau trận mưa đầu vụ thì hạt reo xuống đất ngô mọc lên kém dồng đều hoặc không nảy mầm được Hạn ảnh hưởng mạnh nhất đến sinh trưởng của lá rồi đến là râu, thân, rễ, và cuối cùng là hạt Hạn ảnh hưởng đến việc đóng khí khổng làm giảm việc quang hợp dẫn đến đỉnh sinh trưởng không phân hóa ảnh hưởng phân hóa bắp và cờ dẫn tới làm giảm năng suất Hạn trong quá trình thụ phấn-kết hạt làm giảm sự vận chuyển các chất đồng hóa về các cơ quan sinh trưởng, giảm sinh trưởng của râu dẫn đến tình trạng chậm hoặc không phun râu được tăng sự chênh lệch về thời gian giữa tung phấn-phun râu Nặng hơn thì cây không có bắp, bắp không hạt hoặc ít hạt, cấu trúc sinh hóa của hoa cái bị ảnh hưởng nhiều hơn là bông cờ ở nhiệt

độ lớn hơn 38C sẽ cháy bông cờ và giai đoạn trỗ cờ-phun râu gặp hạn thì nhiệt độ không khí lớn hơn 35°C, độ ẩm không khí nhỏ 70% hạt phấn sẽ chết dẫn đến bắp không hạt, hiện tượng này xảy ra nhiều ở Việt Nam Hạn xảy ra ở thời kỳ trước trỗ, tỷ lệ rễ, thân lá tăng lên, khi hạn nặng lên thì tỷ lệ này giảm

và tốc độ hấp thụ dinh dưỡng từ đất cũng giảm, dẫn đến sự phân bố lại các

chất dự trữ trong thân nếu xảy ra cùng thời kỳ tích lũy chất khô vào hạt sẽ xảy

ra hiện tượng ngô bị chín ép, cây bị đổ non, hạt lép.[11]

2.8.3 Hạn ảnh hưởng đến năng suất ngô ở các giai đoạn sinh trưởng khác nhau

Hạn ảnh hưởng đến năng suất hạt ở bất cứ giai đoạn nào của ngô nhất

là thời kỳ ngô ra hoa Năm 1960 Denmead và Shaw tiến hành thí nghiệm bớt nước đến trạng thái héo trước khi cây trỗ, trong khi trỗ và sau khi thụ phấn thì năng suất giảm tương ứng 20,50 và 21% Ở thí nghiệm khác khi quan sát trạng thái héo trước phun râu, khi phun râu và ba tuần sau thụ phấn thì thấy năng suất giảm tương ứng 15,53 và 30% Thời kỳ ngô mẫn cảm nhất với hạn

là từ 2 đến 22 ngày sau phun râu, đỉnh cao là 7 ngày sau phun râu năng suất giảm 45% Có tác giả còn theo dõi thiệt hại năng suất 90% khi ngô bị hạn ở thời kỳ chuẩn bị trỗ đến bắt đầu đẫy hạt Cây ngô mẫn cảm với hạn nhất ở giai đoạn trỗ cờ-kết hạt vì hoa đực, hoa cái cách nhau tới 1m, khi khô hạn có trường hợp xảy ra hiện tượng tung phấn rồi nhưng râu chưa phun hay nói cách khác là chênh lệch thời gian thụ phấn và phun râu kéo lớn làm cho số hạt trên bắp bị giảm

Năng suất ngô phụ thuộc rất nhiều từ điều kiện môi trường hạn hay không hạn, ít hoặc nhiều Trong khi phần lớn diện tích ngô trên thế giới đều phụ thuộc vào nước trời, cho nên nhà chọn tạo giống phải chọn giống sinh trưởng, phát triển tốt trong điều kiện hạn chế nước tưới và độ ẩm của đất Ảnh hưởng của hạn đối với năng suất hạt phụ thuộc vào thời gian sinh trưởng và

độ dài thời kỳ hạn Hầu hết các báo cáo khoa học đều cho rằng thời gian tung phấn phun râu, trước và sau trỗ có tác động mạnh nhất tới năng suất như khoảng cách tung phấn-phun râu, số lượng bắp/cây, do vậy có thể căn cứ vào những đặc trưng trên để chọn lọc các giống ngô chịu hạn Tất cả các đặc tính nông học của cây ngô đều bị biến đổi trong điều kiện hạn, những tính trạng này được điều khiển bởi một số lượng lớn gen tương tác với môi trường.[11]

Phần 3 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Đối tượng nghiên cứu và phạm vi nghiên cứu

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Cây ngô chuyển gen chịu hạn modiCspB thế hệ T5 do Viện nghiên cứu

Ngô cung cấp

-Các cây ngô dòng V152 chuyển gen modiCspB và dòng nền

-Các cây ngô dòng C436 chuyển gen modiCspB và dòng nền

3.1.2 Phạm vi nghiên cứu

Đánh giá tính ổn định của các cây ngô chuyển gen chịu hạn modiCspB

thế hệ T5 trong điểu kiện phòng thí nghiệm và điều kiện đồng ruộng

3.1.3 Hóa chất và thiết bị nghiên cứu

3.1.4.1 Hóa chất

Đề tài sử dụng các hóa chất nghiên cứu sau: dNTP (Sigma), Taq polymerasa (sigma), agrarose (thermo)…

Cặp mồi CspB-F1-Bam và CspB-R1-Not sử dụng trong phản ứng PCR phát

hiện sự có mặt của gen modiCspB trong các dòng ngô chuyển gen được các

nhà khoa học của Viện nghiên cứu hệ Gen kết hợp với các nhà khoa học của Viện nghiên cứu Ngô thiết kế đặc hiệu với trình tự đoạn gen modiCspB và đặt sản xuất tại hãng IDT của Mỹ Trình tự các mồi được trình bày trong bảng 3.1 dưới đây