Nghiên cứu ảnh hưởng của các thành phần dinh dưỡng đến sự phát triển của nấm đông trùng hạ thảo cordyceps militaris trên môi trường giá thê ̉nhân tạo

LƯƠNG THỊ DUNG Tên đề tài: NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC THÀNH PHẦN DINH DƯỠNG ĐẾN SỰ PHÁT TRIỂN CỦA NẤM ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO CORDYCEPS MILITARIS TRÊN GIÁ THỂ NHÂN TẠO KHÓA LUẬN TỐT NGHI

LƯƠNG THỊ DUNG Tên đề tài:

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC THÀNH PHẦN DINH DƯỠNG

ĐẾN SỰ PHÁT TRIỂN CỦA NẤM ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO (CORDYCEPS

MILITARIS) TRÊN GIÁ THỂ NHÂN TẠO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo : Chính quy

LƯƠNG THỊ DUNG Tên đề tài:

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC THÀNH PHẦN DINH DƯỠNG

ĐẾN SỰ PHÁT TRIỂN CỦA NẤM ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO (CORDYCEPS

MILITARIS) TRÊN GIÁ THỂ NHÂN TẠO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo : Chính quy

Kết thúc thời gian thực tập tại Phòng Sinh học Phân tử - Viện Khoa học

Sự sống – Đại học Thái nguyên, đến nay em đã hoàn thành đề tài tốt nghiệp

Để đạt được kết quả như ngày hôm nay, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban Giám hiệu Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, Ban Chủ nhiệm Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm cùng các thầy cô giáo trong Khoa đã tạo điều kiện tốt nhất cho em trong suốt thời gian thực tập

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy giáo TS Dương Văn Cường

và KS Vũ Hoài Nam đã tận tình chỉ bảo, giúp đỡ và hướng dẫn em trong thời gian thực hiện đề tài

Cuối cùng, em xin cám ơn gia đình đã tạo điều kiện vật chất tốt nhất có thể và luôn là chỗ dựa tinh thần cho em trong quá trình thực tập; cảm ơn bạn

bè đã giúp đỡ em trong thời gian vừa qua

Mặc dù bản thân đã cố gắng hết sức nhưng do thời gian thực hiện đề tài có hạn nên bản khóa luận không thể tránh khỏi những thiếu sót, em rất mong nhận được ý kiến đóng góp chân thành từ các thầy cô và các bạn để đề tài được hoàn thiện hơn

Em xin chân thành cảm ơn!

Thái Nguyên tháng năm 2017

Sinh viên

Lương thị Dung

DANH MỤC TỪ VÀ THUẬT NGỮ VIẾT TẮT

Từ, thuật ngữ viết tắt Nghĩa đầy đủ của từ, thuật ngữ (cả tiếng

Anh và tiếng Việt)

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.2: Thành phần hóa học chủ yếu của hai loài nấm Đông trùng hạ thảo

quan trọng 10

Bảng 3.1: Thiết bị, dụng cụ và hóa chất 16

Bảng 3.2: Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn cacbon 20

đến khả năng sinh trưởng của sợi nấm 20

Bảng 3.3: Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn nito 20

đến khả năng sinh trưởng và phát triển của nấm 20

Bảng 3.4: Nghiên cứu ảnh hưởng của muối khoáng 21

đến khả năng sinh trưởng của sợi nấm 21

Bảng 3.6: Xác định nguồn dinh dưỡng và mức biến đổi các yếu tố dinh dưỡng 22

Bảng 4.1: Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng các nguồn cacbon tới 26

năng suất nuôi trồng nấm Đông trùng hạ thảo 26

Bảng 4.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng các nguồn nito khác nhau tới 29

năng suất nuôi trồng nấm Đông trùng hạ thảo 29

Bảng 4.3: Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng muối khoáng khác nhau tới 33

năng suất nuôi trồng nấm Đông trùng hạ thảo 33

Bảng 4.4: Xác định nguồn dinh dưỡng và mức biến đổi các yếu tố dinh dưỡng 34

Bảng 4.5: Ma trận kết quả mối tương quan giữa các yếu tố dinh dưỡng tới năng suất nuôi trồng nấm Đông trùng hạ thảo 35

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1: Đông trùng hạ thảo trong tự nhiên 4

Hình 2.2: Phân loại nấm Cordyceps 5

Hình 2.3: Vòng đời sinh trưởng của nấm Đông trùng hạ thảo 6

Hình 2.4: Nấm Cordyceps militaris và mặt cắt dọc quả thể chứa các

bào tử (Christian et al, 1837) 7

Hình 3.1: Sơ đồ quy trình nuôi cấy nấm Đông trùng hạ thảo 18

Hình 4.1: Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn cacbon đến khả năng sinh trưởng của sợi nấm 24

Hình 4.2: Ảnh hưởng của nguồn cacbon tới sinh trưởng và phát triển của quả thể nấm Đông trùng hạ thảo 25

Hình 4.3:Ảnh hưởng của các nguồn cacbon khác nhau tới năng suất nuôi trồng nấm 26

Hình 4.4: Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các nguồn nito đến khả năng sinh trưởng của sợi nấm 27

Hình 4.5: Ảnh hưởng của nguồn nito tới sinh trưởng và phát triển của quả thể nấm Đông trùng hạ thảo 28

Hình 4.6: Ảnh hưởng của các nguồn nito khác nhau tới năng suất nuôi trồng nấm 29

Hình 4.7: Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của muối khoáng đến khả năng sinh trưởng của sợi nấm 31

Hình 4.8: Ảnh hưởng của muối khoáng tới sinh trưởng và phát triển của quả thể nấm Đông trùng hạ thảo 32

Hình 4.9: Ảnh hưởng của các muối khoáng khác nhau tới năng suất nuôi trồng nấm 33

Hình 4.10: Hình ảnh so sánh hai tổ hợp các yếu tố dinh dưỡng ảnh hưởng đến mật độ quả thể 36

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

DANH MỤC TỪ VÀ THUẬT NGỮ VIẾT TẮT ii

DANH MỤC BẢNG iii

DANH MỤC HÌNH iv

MỤC LỤC v

Phần 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu của đề tài 2

1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 2

Phần 2 TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU 4

2.1 Tổng quan về Đông trùng Hạ Thảo 4

2.1.1 Tên gọi Đông Trùng Hạ Thảo 4

2.1.2 Nguồn gốc và phân loại 4

2.1.3 Cơ chế xâm nhiễm 5

2.1.4 Cordyceps militaris 6

2.2 Tiềm năng ứng dụng nuôi trồng ĐTHT trên giá thể nhân tạo 12

2.3 Tình hình nghiên cứu nấm Đông trùng hạ thảo trong nước và trên thế giới 13

2.3.1 Tình hình nghiên cứu nấm Đông trùng hạ thảo trên thế giới 13

2.2.3 Tình hình nghiên cứu nấm Đông trùng hạ thảo trong nước 14

Phần 3 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

3.1 Đối tượng nghiên cứu và phạm vi nghiên cứu 16

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 16

3.1.2 Phạm vi nghiên cứu 16

3.1.3 Vật liệu nghiên cứu 16

3.2 Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu 17

3.2.1 Địa điểm tiến hành nghiên cứu 17

3.2.2 Thời gian tiến hành nghiên cứu 17

3.3 Nội dung nghiên cứu 17

3.4 Phương pháp nghiên cứu 18

3.4.1 Phương pháp nghiên cứu 18

3.4.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm 19

3.4.3 Chỉ tiêu theo dõi 22

3.4.4 Phương pháp xử lý số liệu 22

PHẦN 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23

4.1 Ảnh hưởng của các nguồn cacbon đến khả năng sinh trưởng của sợi nấm, sự hình thành và phát triển của quả thể, năng suất sinh học 23

4.2 Ảnh hưởng của các nguồn nito đến khả năng sinh trưởng của sợi nấm, sự hình thành và phát triển của quả thể, năng suất sinh học 27

4.3 Ảnh hưởng của muối đến khả năng sinh trưởng của sợi nấm, sự hình thành và phát triển của quả thể, năng suất sinh học 30

4.4 Kết quả nghiên cứu mối tương quan giữa các nguồn dinh dưỡng đến sự hình thành và phát triển quả thể nấm Cordyceps militaris trên môi trường nhân tạo 34

PHẦN 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 37

5.1 Kết luận 37

5.2 Đề nghị 37

TÀI LIỆU THAM KHẢO 39

Phần 1

MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Trong những năm gần đây, các loại thảo dược ngày càng được quan tâm đến như một loại thực phẩm chức năng chăm sóc sức khỏe con người Bên cạnh đó, chúng còn được các nhà nghiên cứu y dược hết sức chú ý vì sự đa dạng về các hoạt chất sinh học Tiêu biểu t rong số đó phải kể đến như nấm Đông trùng ha ̣ thảo, nấm Linh Chi hay sâm Ngọc Linh…

Đông trùng hạ thảo là một trong những loại thảo dược giúp bồi bổ cơ thể phù hợp với mọi lứa tuổi: từ trẻ con, phụ nữ mang thai, thanh thiếu niên cho đến người già Theo các tài liệu ghi chép về đông dược cổ, Đông trùng hạ thảo là một vị thuốc bổ hết sức quý giá, có tác dụng tốt đối với trẻ em còi xương, chậm lớn Các nghiên cứu hiện đại cũng chứng minh Đông trùng hạ thảo có tác dụng tích cực đối với các bệnh về thận, tăng cường miễn dịch và

hỗ trợ điều trị ung thư Trong thành phần nấm Đông trùng hạ thảo có nhiều hoạt chất quý như: Cordycepin (3’-deoxyadenosine) có khả năng kháng khuẩn, kháng nấm, kháng u, hoạt động kháng virus; Adenosine được cho là

có tác dụng điều hòa miễn dịch, bảo vệ tim mạch; Mannitol cũng có chức năng hoạt tính sinh học, giúp lợi tiểu , chống các chứng ho ra máu và nhiều loại vitamin khác[3],[30]

Theo thống kê củ a công ty nghiên cứu và đầu tư phát triển thi ̣ trường trung Quốc - Huidian cho thấy nhu cầu thi ̣ trường cho Đông trùng ha ̣ thảo năm 2013 đa ̣t 8000 tấn, sản lượng ước tính mỗi năm tăng 20%, dự kiến đa ̣t mức 19000 tấn vào năm 2017[10] Trong khi, sản lượng trong tự nhiên ch ỉ đáp ứng được khoảng 1% Trước tình hình đó, các nhà khoa học trên thế giới

tâ ̣p trung nghiên cứu nuôi Đông trùng ha ̣ thảo trên môi trường nhân tạo có các thành phần dinh dưỡng và các hoạt chất sinh học tương tự như Đông trùng hạ

thảo tự nhiên nhưng lại có giá thành rẻ hơn đáng kể Tại Việt Nam, việc nghiên cứu nuôi cấy Đông trùng hạ thảo trên môi trường nhân tạo cũng đạt được mô ̣t số thành tựu đáng kể Tuy vậy, các công bố về loài nấm dược liệu quý này mới chỉ dừng lại ở việc phát hiện một số chủng có trong tự nhiên và nhân giống trên môi trường cấp I , chưa có công bố nào về nghiên cứu Đông trùng hạ thảo trên môi trường giá thể nhân ta ̣o

Thực trạng hiện nay trong việc nuôi trồng nấm Đông trùng hạ đều gặp phải đó là mật độ quả thể nấm thưa, quả thể nấm bị sùi, đầu quả thể bị phân nhánh, tính hướng sáng kém Với mong muốn góp phần cải thiê ̣n hiê ̣u suất nuôi trồng nấm Đông trùng ha ̣ thảo trên giá thể nhân ta ̣o , tôi tiến hành thực

hiê ̣n đề tài “Nghiên cứu ảnh hưởng của các thành phần dinh dưỡng đến sự phát triển của nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris trên giá thể nhân tạo”

1.2 Mục tiêu nghiên cứu của đề tài

1.2.1 Mục tiêu tổng quát

Đánh giá được ảnh hưởng của điều kiện dinh dưỡng tới khả năng phát

triển của nấm, sự hình thành và phát triển của quả thể nấm ĐTHT cordyceps

militaris trên môi trường nhân tạo

1.2.2 Mục tiêu cụ thể

Xác định ảnh hưởng của nguồn cacbon đến khả năng sinh trưởng và phát triển

của quả thể nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris, năng suất sinh học

Xác định ảnh hưởng của nguồn nito đến khả năng sinh trưởng và phát triển

của quả thể nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris, năng suất sinh học

Xác định ảnh hưởng của muối khoáng đến sự hình thành và phát triển

của quả thể nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris, năng suất sinh học

Xác định được môi trường dinh dưỡng thích hợp cho sự sinh trưởng và

phát triển của nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris, năng suất sinh học

1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

Kết quả nghiên cứu sự ảnh hưởng của một số yếu tố dinh dưỡng cơ bản

tới sự sinh trưởng và phát triển, hình thành thể quả nấm Cordyceps militaris

trên môi trường nhân tạo sẽ là căn cứ khoa học cho việc hoàn thiện và đưa ra

quy trình sản xuất nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris vào thực tiễn

phục vụ đời sống con người

Ngoài ra kết quả của đề tài cũng cung cấp thông tin khoa học cho các

nhà khoa học nghiên cứu chuyên sâu loài nấm quý hiếm Cordyceps militaris

Tạo ra sản phẩm nấm Đông trùng hạ thảo có chất lượng đảm bảo với chi phí hợp lí

1.3.1 Ý nghĩa khoa học của đề tài

Quá trình nghiên cứu sẽ đưa ra được sự ảnh hưởng của thành phần dinh dưỡng đến sự sinh trưởng và phát triển của nấm Đông trùng hạ thảo

Cordyceps militaris trên môi trường nhân tạo

1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài

Kết quả nghiên cứu sự ảnh hưởng của một số yếu tố dinh dưỡng cơ bản

tới sự sinh trưởng và phát triển, hình thành thể quả nấm Cordyceps militaris

trên môi trường nhân tạo sẽ là căn cứ khoa học cho việc hoàn thiện và đưa ra

quy trình sản xuất nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris vào thực tiễn

phục vụ đời sống con người

Ngoài ra kết quả của đề tài cũng cung cấp thông tin khoa học cho các

nhà khoa học nghiên cứu chuyên sâu loài nấm quý hiếm Cordyceps militaris

Tạo ra sản phẩm nấm Đông trùng hạ thảo có chất lượng đảm bảo với chi phí hợp lí

Phần 2 TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU 2.1 Tổng quan về Đông trùng Hạ Thảo

2.1.1 Tên gọi Đông Trùng Hạ Thảo

Đông trùng Hạ thảo (ĐTHT) tên khoa học là Cordyceps, chỉ hiện tượng những loài nấm thuộc lớp Ascomycetes kí sinh trên ấu trùng các loài bọ cánh phấn thuộc chi Thitarodes [6] Tên gọi chú ng xuất phát từ quan sát thực tế: vào mùa Đông bào tử nấm xâm nhiễm, ký sinh trong cơ thể ấu trùng (Đông trùng), đến mùa hè quả thể n ấm mọc chồi từ đầu con sâu nhô lên khỏi mặt đất trông giống mô ̣t loa ̣i thực vâ ̣t (Hạ thảo) vì vậy nó có tên là Đông trùng hạ thảo

Hình 2.1: Đông trùng hạ thảo trong tự nhiên 2.1.2 Nguồn gốc và phân loại

ĐTHT trong tự nhiên được phát hiện chủ yếu ở một số cao nguyên của Nepal, Ấn Độ, Trung Quốc và Bhutan…, trung bình các cao nguyên này có

độ cao từ 3500m đến 5000m so với mặt nước biển Dựa trên đặc điểm hình thái cũng như đặc điểm cấu trúc phân tử, Đông trùng hạ thảo được xếp vào

phân giới nấm (Fungi), ngành nấm túi (Ascomycota), lớp Sordariomycetes, bộ

Hypocreales, họ Cordycipitaceae, chi Cordyceps (Kobayasi et al, 1982), bao

gồm 400 loài đã được phát hiện, tuy nhiên cho đến nay người ta mới chỉ tập

trung nghiên cứu 2 loài nấm Cordyceps sinensis và Cordyceps militaris có giá

trị dược liệu tốt với con người

Hình 2.2: Phân loại nấm Cordyceps 2.1.3 Cơ chế xâm nhiễm

Trong tự nhiên, nấm Đông trùng hạ thảo được coi là nấm gây bệnh cho côn trùng do chúng ký sinh trên cơ thể ấu trùng hoặc côn trùng đã trưởng

thành Các loài thuộc chi Cordyceps khác nhau lây nhiễm ở giai đoạn nhộng

và các ký chủ khác nhau, rồi nhân lên trong cơ thể ký chủ Vào cuối thu hoặc đầu mùa đông , bào tử nấm nh ờ gió phát tán ra bên ngoài và tìm ki ếm cơ thể

ký chủ phù hợp Khi tiếp xúc với ký chủ, bào tử nấm bắt đầu hình thành các ống nảy mầm có các thể bám Các ống n ày tiết ra các enzyme như lipase , chitinase, protease… làm tan vỏ ngoài của ký chủ và xâm nh ập vào bên trong

cơ thể Một vài loài Cordyceps còn có khả năng tác động tới hành vi vật chủ,

khiến chúng phải leo lên cây và gắn mình vào đó trước khi chết để đảm bảo

sự phát tán bào tử một cách tối đa. Sau đó các bào t ử bắt đầu hình thành hệ sợi, hê ̣sợi nấm hú t dinh dưỡng và sinh trưởng m ạnh mẽ gây chết ký chủ Khi

thời tiết ấm áp hơn, hệ sợi nấm bắt đầu phát triển một cách mạnh mẽ hình thành quả thể và chồi lên khỏi mặt đất và tiếp tục vòng sinh sản mới nhờ phát tán bào tử

Hình 2.3: Vòng đời sinh trưởng của nấm Đông trùng hạ thảo

2.1.4 Cordyceps militaris

Nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris là một loài trong chi

Codyceps, chúng thường ký sinh trên ấu trùng bọ cánh phấn côn trùng Quả

thể có hình thon dài, có màu vàng cam, chiều dài quả thể từ 2-8cm, chiều ngang khoảng 0,5 cm[4] Quả thể nấm nhô lên từ xác ấu trùng hoặc nhộng, mặt cắt ngang quả thể có màu nhạt, rỗng ở giữa (Hình 2.4) Các nang bào tử dài từ 300-510 µm, bề rộng 4 µm Bên trong các nang bào tử là tập hợp các bào tử nang không màu và phân đoạn, kích thước 3.5-6 × 1- 1.5 µm Các bào

tử nang này trong điều kiện nghèo dinh dưỡng sẽ đứt ra và nảy chồi tạo các

bào tử thứ cấp Nấm Cordyceps militaris có dải phân bố rộng, ở Bắc Mỹ,

châu Âu và châu Á[18]

Hình 2.4: Nấm Cordyceps militaris và mặt cắt dọc quả thể chứa các

bào tử (Christian et al, 1837)

So với Cordyceps sinensis, Cordyceps militaris nuôi dễ hơn trong cả hai

loại môi trường nền rắn và chất lỏng với nguồn dinh dưỡng nhiều carbon và

nguồn nitơ Cordyceps militaris cũng đã được sử dụng trong y học cổ truyền của Trung Quốc rất lâu về trước Gần đây, Cordyceps militaris ngày càng được xem như là một nguồn thay thế cho Cordyceps sinensis vì các chất có

hoạt tính sinh học và tính chất dược liệu tương tự nhau [7],[9],[27] Hơn nữa,

nghiên cứu gần đây cũng đã chứng minh rằng Cordyceps militaris chứa nhiều

loại thành phần có hoạt tính sinh học như cordycepin, ergosterol, mannitol và polysaccharides [5],[8],[13]

2.1.5 Gía trị của Đông trùng Hạ thảo

2.1.3.1 Gía trị dược liệu

 Giá trị dược liệu theo y học cổ truyền

Nấm Đông trùng hạ thảo được coi là một dược liệu truyền thống của Trung Quốc và chữa trị được nhiều bệnh nan y Theo y học cổ truyền của Trung Quốc, nấm Đông trùng hạ thảo được dùng để điều trị thành công các chứng rối loạn lipit máu, viêm phế quản mạn, hen phế quản, viêm thận mạn

tính, suy thận, rối loạn nhịp tim, cao huyết áp, viêm mũi dị ứng, viêm gan B mạn tính, ung thư phổi và thiểu năng sinh dục

Những năm gần đây, các nghiên cứu hiện đại đã chứng minh được những công dụng chữa bệnh và bồi bổ cơ thể mà các nhà Y học cổ truyền đã sử dụng

do các hoạt chất sinh học quý trong quả thể nấm: Cordycepin deoxyadenosine) có khả năng kháng khuẩn , kháng nấm, kháng u, hoạt động kháng virus [3],[30]; Adenosine được cho là có tác dụng điều hòa miễn dịch, bảo vệ tim mạch; Mannitol cũng có chức năng hoạt tính sinh học , giúp lợi tiểu, chống các chứng ho ra máu [16] và nhiều loại vitamin khác

(3’- Giá trị dược liệu theo y học hiện đại

Những năm gần đây, rất nhiều tính chất dược lý của loài nấm này được nghiên cứu một cách khoa học và đã được công bố trên các tạp chí chuyên ngành trong đó ĐTHT có các tác dụng chính sau:

Ức chế và ngăn ngừa di căn ung thư:

Ung thư là các bệnh do sự phân chia không kiểm soát của các tế bào tại một hoặc nhiều cơ quan trong cơ thể, dẫn tới hình thành các khối U Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng dịch chiết từ thể quả Cordyceps militaris có tác dụng

chống ung thư, ngừa di căn, đặc biệt hữu hiệu với hai loại tế bào trong tĩnh mạch rốn là HT1080 và B16-F10 Trong dịch chiết nấm có khả năng làm giảm sự hình thành các mạch máu mới bằng cách giảm sự biểu hiện của bFGF, từ đó ngăn ngừa được sự di căn của tế bào ung [22]

Tác dụng hỗ trợ điều trị bênh tiểu đường:

Một nghiên cứu được thực hiện tại bệnh viện Nankai Thiên Tân – Trung Quốc từ tháng 10 năm 2012 đến tháng 01 năm 2014 Nhóm nghiên cứu trên 120 bệnh nhân bị bệnh tiểu đường loại 2 – tức là khi đói lượng glucose trong huyết tương lớn hơn 7.0 mmol/l Số bệnh nhân này được chia ngẫu nhiên thành 3 nhóm: nhóm 1 điều trị cơ bản, nhóm 2 được điều trị bằng

việc sử dụng viên nang Đông trùng hạ thảo loại corbrin 2g sử dụng 3 lần/ngày

và 3 ngày trước khi đi chụp động mạch, nhóm 3 sử dụng viên nang Đông trùng hạ thảo corbrin loại 3g sử dụng 3 lần/ngày và 3 ngày trước khi chụp động mạch Kết quả cho thấy bệnh nhân khi sử dụng viên nang có sự giảm và

ổn định đường huyết hơn khi điều trị thông thường Tuy nhiên trong nghiên cứu này nhóm nghiên cứu chỉ xác định lượng đường huyết ở mức ngắn hạn trước và sau 3 ngày điều trị, cần có thêm các nghiên cứu với số lượng mẫu lớn hơn và thời gian dài hơn để có thể kết luận rõ hơn tác dụng của Đông trùng hạ thảo chữa bênh tiểu đường loại 2 [25]

Hỗ trợ điều trị các bệnh liên quan đến tim:

Các bệnh tim mạch là một nhóm các rối loạn về tim và mạch máu và chúng bao gồm: Bệnh tim mạch – bệnh của các mạch máu cung cấp cho cơ tim; Bệnh liên quan mạch máu não – bệnh của các mạch máu cung cấp cho não; Bệnh động mạch ngoại biên – bệnh của mạch máu cung cấp cho cánh tay

và chân; Huyết khối tĩnh mạch sâu và thuyên tắc phổi – cục máu đông trong

các tĩnh mạch chân, có thể bật ra và di chuyển đến tim và phổi Các phân tích

hoá học cho thấy trong đông trùng hạ thảo có adenosine, deoxy-adenosine, nucleotide adenosine và các loại nucleotide tự do khác, giúp giữ ổn định và điều chỉnh rối loạn nhịp tim Ngoài ra, các digoxin, hydrochlorothiaside, dopamine và dobutamine trong đông trùng hạ thảo giúp cải thiện chất lượng cuộc sống của các bệnh nhân suy tim mãn tính

Chống oxi hóa và kháng viêm

Chống lão hoá, chống các chứng viêm tấy được thể hiện trong công trình nghiên cứu của Ahn Y J cs (2000) ông cho rằng nấm Đông trùng hạ thảo có tác dụng chống viêm nhiễm kìm hãm sự phát triển của một số

virut, vi khuẩn và nấm[3] Ngoài ra nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps

militaris còn có tác dụng kìm hãm sự oxy hoá của lipit, lipoprotein và

lipoprotein tỷ trọng thấp [12]

2.3.1.3 Giá trị dinh dưỡng

Các phân tích hoá học cho thấy trong sinh khối của C.militaris có 17

acid amin khác nhau, D-mannitol, lipit và nhiều nguyên tố khoáng (Se, Zn, Cu ) Thành phần hóa học và các hoạt chất sinh học của 2 loài nấm đƣợc thể hiện ở bảng sau :

Bảng 2.2: Thành phần hóa học chủ yếu của hai loài nấm Đông trùng hạ

nhà khoa học trên thế giới như Mỹ, Thái Lan, Trung Quốc… đã tiến hành nghiên cứu nuôi Đông trùng hạ thảo trên môi trường nhân tạo có hầu hết các hoạt tính sinh học của Đông trùng hạ thảo tự nhiên nhưng lại có giá thành rẻ

hơn đáng kể Trong đó loài Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris đang trở

thành sự thay thể lý tưởng cho Đông trùng hạ thảo tự nhiên

Theo thống kê của công ty nghiên cứu thị trường Huidian Rearch, năm

2013 quy mô nuôi trồng Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris ở khu vực Tân Hoa xã và Liêu Ninh - Trung Quốc đạt sản lượng 8000 tấn/ năm chiếm 70% nhu cầu thị trường, ước tính giá trị đạt 1,5 tỷ Nhân dân tệ Trong những năm gần đây, nhu cầu tiêu thụ các nguyên liệu dược liệu tự nhiên đều có xu hướng tăng, trong đó Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris có mức độ tăng trưởng bình quân 10 %/năm, ước tính đến năm 2017 đạt 2,5 tỷ Nhân dân tệ[10]

2.2 Tiềm năng ứng dụng nuôi trồng ĐTHT trên giá thể nhân tạo

Do có chứa nhiều hoạt chất sinh học quý: cordycepin, adenosin,

polysaccharides, ergosterol và mannitol nên từ lâu ĐTHT được coi là một

loại thảo dược quý, có nhiều giá trị dược liệu trong việc hạ đường huyết, chống viêm, ức chế sự phát triển của tế bào ung thư, điều hòa hệ miễn dịch, chống oxi hóa, tăng hoạt lực của tinh trùng Tuy nhiên, ĐTHT trong tự nhiên sản lượng rất ít nên để tìm kiếm và sử dụng ĐTHT tự nhiên làm dược phẩm

hoặc thực phẩm chức năng là vấn đề không khả thi (Hong et al ,2010)[11]

Những nghiên cứu ban đầu trên thế giới về môi trường nuôi trồng ĐTHT được thực hiện trên côn trùng, mặc dù sản lượng đã được cải thiện song vẫn chưa đáp ứng được ở quy mô công nghiệp và chi phí sản xuất vẫn còn cao Bên cạnh đó, việc tập trung sản xuất các chất hoạt chất quý trong nấm ĐTHT mà không thu quả thể bằng phương pháp lên men lỏng cũng đang được hướng tới Tuy nhiên nhược điểm của phương pháp này là khâu xử lý

nguồn nước thải sau khi thu hồi hoạt chất, đồng thời việc tách chiết thu hồi hoạt chất còn phức tạp và giá thành cao

Do đó, việc tìm ra nguồn cơ chất thích hợp để nuôi trồng ĐTHT trên giá thể nhân tạo là giải pháp tối ưu Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng không có sự chênh lệch quá nhiều giữa giá trị dinh dưỡng trong ĐTHT tự nhiên và nuôi trên giá thể nhân tạo Việc thu hoạch quả thể nấm trên giá thể nhân tạo không những có thể thu hoạch được hoạt chất sinh học vốn quý trong nấm mà còn có thêm các acid amin và các vitamin thiết yếu khác Bên cạnh đó, nguồn cơ chất nhân tạo còn lại có thể tận dụng phục vụ cho công tác chăn nuôi không có sản phẩm phụ thải ra môi trường

Theo Li và cộng sự (2004), ngũ cốc và một số chất hữu cơ khác: bột đậu, hạt ngô, lõi ngô, vỏ hạt bông, kê, lúa miến, lúa mì, ngũ gốc, hoa hướng dương được chứng minh là cơ chất tốt để thay thế côn trùng[16],[12],[27] Năm 2014, Ting-chi Wen cho thấy sự hình thành quả thể của nấm ĐTHT trên

cơ chất gạo cho năng suất cao hơn đáng kê so với các loại giá thể khác (Ting, 2014)[21] Kể từ đó, gạo được sử dụng như một thành phần chủ yếu cho sự sinh trưởng quả thể của ĐTHT

2.3 Tình hình nghiên cứu nấm Đông trùng hạ thảo trong nước và trên thế giới

2.3.1 Tình hình nghiên cứu nấm Đông trùng hạ thảo trên thế giới

Ngày nay, khi lượng Cordyceps militaris ngoài thiên nhiên là rất khan hiếm thì việc nuôi trồng nhân tạo nấm Cordyceps militaris để thu sinh khối được quan tâm như là một giải pháp thay thế Trên thế giới, việc nghiên cứu nuôi trồng nấm Cordyceps militaris được các nhà nghiên cứu khá quan tâm và đạt được rất nhiều thành tựu Ngoài việc nghiên cứu về các thành phần hoạt chất có trong nấm thì việc nghiên cứu môi trường nuôi cấy thích hợp giúp cải thiện năng xuất và ổn định chất lượng cũng được chú trọng

Năm 2002, Li và cộng sự khảo sát sự hình thành quả thể nấm ĐTHT trên các nguồn cơ chất hữu cơ khác nhau như: Hạt ngô, hạt bông, kê, ngũ cốc và gạo… kết quả cho thấy, trên cơ chất gạo nấm ĐTHT cho năng suất cao hơn hẳn so với các loại ngũ cốc khác Ở Việt Nam là một trong những nước có sản lượng gạo cao nhất thế giới, do đó đây là một lợi thế trong nuôi trồng ĐTHT Năm 2012, tại Malaysia, các nhà khoa học gồm LekTeng Lim, ChiaYen Lee, & EngThuan Chang đã tiến hành nghiên cứu: Tối ưu hóa các điều kiện nuôi cấy nấm trên môi trường rắn để sản xuất Adenosine, Cordycepin, và D-

mannitol trong quả thể của nấm dược liệu Cordyceps militaris (L.:Fr.) Link

(Ascomycetes) [14],[29]

Năm 2013 Tang Jiapeng, Liu Yiting, and Zhu Li [20],[28], ba nhà khoa học Trung Quốc đã thực hiện đề tài tối ưu hóa quá trình lên men và tinh chế

codycepin từ Cordyceps militaris Kết quả thu được là chọn được môi trường

nuôi cấy tối ưu với thành phần là: glucose, 60 g/L; KH2PO4, 0,7 g/L; MgSO4

7H2O, 0,7 g/L; cao nấm men, 9.00 g/L; và tryptone, 17.10 g/L Điều kiện nuôi cấy tối ưu là: nhiệt độ trung bình, 27.1oC; tuổi giống, 3 ngày; và kích thước giống , 10%, làm tăng 2,5 lần (7,35 g/L) so với việc sử dụng các môi trường

và điều kiện sản xuất cordycepin ban đầu Ngoài ra, kết quả còn cho thấy cordycepin tinh khiết có thể gây ra sự chết tế bào của các tế bào ung thư tuyến tiền liệt RM-1 ở chuột

2.2.3 Tình hình nghiên cứu nấm Đông trùng hạ thảo trong nước

Hiện nay, Ở nước ta, mặc dù đã có nhiều cơ sở nuôi trồng ĐTHT

Cordyceps militaris, tuy nhiên đều mang tính tự phát, ít cơ sở có sự đầu tư

nghiên cứu bài bản Tình trạng thoái hóa giống và phập phù trong sản xuất đang là những khó khăn mà người trồng nấm này gặp phải

So với thế giới, các nghiên cứu về nấm ĐTHT Cordyceps militaris ở

Việt Nam chưa được công bố nhiều Phần lớn những gì mà các nhà nghiên

cứu Việt Nam có được về nguồn dược liệu quý hiếm này đều chỉ dừng lại ở việc phát hiện các chủng của ĐTHT sẵn có trong tự nhiên hoặc một số ít các nghiên cứu được tiến hành nhưng cũng chỉ dừng lại ở mức độ nghiên cứu về

sự sinh trưởng của hệ sợi hoặc nghiên cứu tạo quả thể ở mức độ thử nghiệm

PGS.TS Phạm Thị Thuỳ, Viện Bảo vệ thực vật đã chủ trì đề tài phát triển nấm Đông trùng hạ thảo làm nguyên liệu thực phẩm chức năng cho người trong chương trình nghiên cứu nghị định thư giữa Việt Nam và Trung

Quốc cấp nhà nước về nghiên cứu nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps

militarris Kết quả đã nghiên cứu xác định được một số giá trị dược liệu trong

nấm gồm chất Cordycepin, HEAA, một số vitamin và một số nguyên tố vi lượng [1]

Trần Văn Mão (2002) đã nêu sơ bộ về môi trường nhân giống, kỹ thuật nuôi trồng thể quả và nuôi cấy sinh khối hệ sợi nấm Cordyceps sinensis Tuy nhiên, những thông tin này đều tập hợp từ các nguồn tài liệu tham khảo của Trung Quốc

Phạm Quang Thu (2009) đã thử nghiệm nuôi trồng thể quả trên giá thể nhân tạo chủng nấm CM1 loài Cordyceps militaris, chủng giống đang nuôi trồng với quy mô công nghiệp tại Quảng Châu, Trung Quốc Kết quả đã thu được thể quả nấm phát triển bình thường trên giá thể[2]

Phần 3 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Đối tượng nghiên cứu và phạm vi nghiên cứu

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Chủng giống ĐTHT nhập tại ngân hàng vi sinh vật Đức (DSMZ)

3.1.2 Phạm vi nghiên cứu

Nghiên cứu ảnh hưởng nguồn carbon ảnh hưởng đến quá trình hình thành và phát

triển của nấm đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris trên giá thể nhân tạo

Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn nito đến quá trình hình thành và phát triển của

nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris trên giá thể nhân tạo

Nghiên cứu sự ảnh hưởng của muối khoáng đến sự hình thành và phát

triển quả thể nấm Cordyceps militaris trêngiá thể nhân tạo

Nghiên cứu mối tương quan giữa các nguồn dinh dưỡng bổ sung đến sự hình

thành và phát triển quả thể nấm Cordyceps militaris trên giá thể nhân tạo

3.1.3 Vật liệu nghiên cứu

Bảng 3.1: Thiết bị, dụng cụ và hóa chất

Nồi hấp vô trùng Cốc đong, ống đong Glucose

Tủ an toàn sinh học cấp II Đĩa petri MgSO4

Máy điều hòa Túi nilon,Chun nịt Peptone

3.2 Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu

3.2.1 Địa điểm tiến hành nghiên cứu

Bộ môn Sinh học phân tử và Công nghệ gene - Viện Khoa học sự sống – Đại học Thái Nguyên

3.2.2 Thời gian tiến hành nghiên cứu

Từ tháng 12 năm 2016 đến tháng 6 năm 2017

3.3 Nội dung nghiên cứu

Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng nguồn carbon ảnh hưởng đến quá

trình hình thành và phát triển của nấm đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris

trên môi trường nhân tạo

Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn nito đến quá trình hình

thành và phát triển của nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris trên môi

trường nhân tạo

Nội dung 3: Nghiên cứu sự ảnh hưởng của muối khoáng đến quá trình hình

thành và phát triển quả thể nấm Cordyceps militaris trên môi trường nhân tạo

Nội dung 4: Nghiên cứu mối tương quan giữa các nguồn dinh dưỡng

đến sự hình thành và phát triển quả thể nấm Cordyceps militaris trên môi

trường nhân tạo

3.4 Phương pháp nghiên cứu

3.4.1 Phương pháp nghiên cứu

Hình 3.1: Sơ đồ quy trình nuôi cấy nấm Đông trùng hạ thảo

Trong nội dung của đề tài sử dung chủng giống ĐTHT chất lượng tốt

được đạt từ ngân hàng vi sinh vật Đức (DSMZ) Giống sinh trưởng bình thường, không bị nhiễm nấm, không bị nhiễm khuẩn để làm vật liệu tiến hành

Bước 2: Chuẩn bị môi trường

Sử dụng 20g gạo Lứt và 32ml môi trường nền cho vào bình nuôi thủy tinh được hấp khử trùng ở nhiệt độ 121o

C trong 30 phút Thành phần dinh dưỡng các môi trường nền sẽ được thay đổi tùy thuộc vào thí nghiệm

Bước 3: Cấy giống

Dùng pipet 5ml hút lấy 2ml giống nấm trong môi trường dịch thể, cấy vào bình nuôi chứa giá thể và môi trường nền đã được hấp khử trùng Thực hiện cấy giống trong tủ an toàn sinh học cấp 2 đã được bật tia UV trong 30 phút

Bước 4: Nuôi trong phòng tối, nhiệt độ 20oC để thúc đẩy tăng trưởng hệ sợi làm hệ sợi nấm ăn kín giá thể

Bước 5: Khi sợi nấm ăn kín giá thể, chiếu sáng với cường độ 500lux với thời gian 12h/ngày

Bước 6: Theo dõi, đánh giá theo các nội dung nghiên cứu

3.4.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm

Thí nghiệm được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn,4 công thức tùy theo mỗi thí nghiệm , mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần nhắc lại cấy 10 mẫu

3.4.2.1 Nội dung 1: Nghiên cứu nguồn cacbon ảnh hưởng đến quá trình hình thành và phát triển của nấm ĐTHT Cordyceps militaris trên môi trường nhân tạo

Để nghiên cứu sự ảnh hưởng nguồn cacbon khác nhau đến khả năng sinh trưởng của nấm Đông trùng hạ thảo, tôi tiến hành thực hiện cấy giống nấm

Cordyceps militaris trên 3 nguồn Cacbon khác nhau: Glucose, Saccarose,

Mantose và môi trường đối chứng không được bổ sung nguồn cacbon Hàm lượng nguồn cacbon được khảo sát ở mức 40 g/L

Bảng 3.2: Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn cacbon

đến khả năng sinh trưởng của sợi nấm

Công Thức Ký hiệu Nguồn cacbon bổ sung

Tôi sử dụng gạo lứt làm giá thể kết hợp với các công thức môi trường

đã được quy định, pH môi trường được điều chỉnh về mức 6,5

Nấm sau khi được cấy trên các loại môi trường được chuyển vào nuôi trong điều kiện nuôi không chiếu sáng để kích hoạt Sau khi sợi nấm ăn kín cơ chất nấm được chuyển sang điều kiện nuôi chiếu sáng 12h/ngày, cường độ chiếu sáng là 500lux và độ ẩm là 80% đến 90%

3.4.2.2 Nội dung 2 : Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn nito đến quá trình hình thành và phát triển của nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris trên môi trường nhân tạo

Để nghiên cứu sự ảnh hưởng nguồn nito khác nhau đến khả năng sinh trưởng của nấm Đông trùng hạ thảo, tôi tiến hành thực hiện cấy giống nấm

Cordyceps militaris trên 3 nguồn nito khác nhau: Peptone, Cao nấm men, Cao

malt và môi trường đối chứng không được bổ sung nguồn nito Hàm lượng nguồn nito được khảo sát ở mức 5 g/L

Bảng 3.3: Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn nito đến khả năng sinh trưởng và phát triển của nấm

Công Thức Ký hiệu Nguồn nitogen bổ sung