Xác định sự sai khác di truyền của dê nản đinh hóa với một số giống dê khác bằng phương pháp mã vạch DNA

Hiện nay, vùng gene COI nằm trong ti thể được coi là vùng gene chuẩn trong xây dựng mã vạch DNA để nhận dạng loài động vật và được công nhận bởi tổ chức mã vạch quốc tế [25] Xuất phát t

NGUYỄN PHƯƠNG NAM

Tên đề tài:

XÁC ĐỊNH SỰ SAI KHÁC DI TRUYỀN GIỮA DÊ NẢN ĐỊNH HÓA VỚI MỘT SỐ GIỐNG DÊ KHÁC BẰNG PHƯƠNG PHÁP MÃ VẠCH DNA

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học

Khóa học : 2013 - 2017

Thái Nguyên, năm 2017

NGUYỄN PHƯƠNG NAM

Tên đề tài:

XÁC ĐỊNH SỰ SAI KHÁC DI TRUYỀN GIỮA DÊ NẢN ĐỊNH HÓA VỚI MỘT SỐ GIỐNG DÊ KHÁC BẰNG PHƯƠNG PHÁP MÃ VẠCH DNA

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học

Khóa học : 2013 - 2017 Người hướng dẫn : 1 TS Dương Văn Cường

2 ThS Ma Thị Trang

Thái Nguyên, năm 2017

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình học tập và nghiên cứu để hoàn thành được tốt khóa luận tốt nghiệp này ngoài sự nỗ lực cá nhân, tôi đã nhận được sự hướng dẫn, giúp đỡ, chỉ bảo động viên của thầy cô, bạn bè và gia đình Nhân dịp hoàn thành luận văn

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới thầy giáo: TS Dương Văn Cường,

Khoa Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm, Trường Đại học Nông Lâm

Thái Nguyên, ThS Ma Thị Trang và cán bộ tại Bộ môn Sinh học Phân tử và Công

nghệ Gene – Viện Khoa học Sự Sống – Đại học Thái Nguyên đã luôn tận tình chỉ bảo, trực tiếp hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suất thời gian thực hiện đề tài cũng như trong quá trình hoàn chỉnh luận văn tốt nghiệp

Tôi xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo Viện Khoa học Sự Sống – Đại học Thái Nguyên, các thầy cô trong Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, các cán bộ, anh chị làm việc tại Bộ môn Sinh học Phân Tử và công nghệ Gene - Viện Khoa học Sự Sống – Đại học Thái Nguyên đã giúp đỡ tạo điều kiện để tôi học tập và nghiên cứu

Cuối cùng tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đã luôn ủng hộ, động viên, chia sẻ giúp đỡ để tôi vượt qua mọi khó khan trong quá trình học tập và hoàn thành luộn văn

Xin chân thành cảm ơn!

Thái Nguyên, ngày tháng 6 năm 2017

Nguyễn Phương Nam

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1 Các mẫu dê Nản nghiên cứu 18

Bảng 3.2 Trình tự mồi cho phản ứng PCR 19

Bảng 3.3 Danh mục các thiết bị đƣợc sử dụng 19

Bảng 3.4 Danh mục các loại hóa chất đƣợc sử dụng 20

Bảng 3.5 Thành phần phản ứng PCR 22

Bảng 4.1: Kết quả đo độ tinh sạch DNA 25

Bảng 4.2 Vị trí sai khác trong trình tự nucleotide của chỉ thị COI của 10 mẫu dê Nản và 2 mẫu trên NCBI 31

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Dê Nản ở xã Kim Phượng huyện Định Hóa 5

Hình 4.1 Kết quả tách chiết DNA tổng số dê Nản 24

Hình 4.2 Kết quả PCR chỉ thị COI của các mẫu dê Nản 25

Hình 4.3: Kết quả giải trình tự chỉ thị COI các mẫu Dê Nản theo giá trị QV 27

Hình 4.4 Kết quả kiểm tra sự sai khác giữa các lần lặp lại của thí nghiệm 28

Hình 4.5: Kết quả BLAST chỉ thị COI của mẫu D42 với chỉ thị COI của Capra aegagrus hircus đã công bố trên NCBI 29

Hình 4.6: So sánh vị trí sai khác trong trình tự nucleotide chỉ thị COI của 10 mẫu nghiên cứu với 3 chỉ thị COI trên NCBI 30

Bảng 4.3 Hệ số tương đồng khi phân tích trình tự gene COI của các mẫu dê Nản với trình tự trên ngân hàng mã vạch DNA (BOLD) 32

Hình 4.7: Cây phân loại dựa trên trình tự chỉ thị COI của dê Nản và 3 mẫu dê trên thế giới 33

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

Từ, thuật ngữ viết tắt Nghĩa đầy đủ của từ, thuật ngữ

BLAST Basic Local Alignment Search Tool

Bp Base pair – cặp bazơ nitơ

COI Cytochrome C oxidase Subutnit I DNA Deoxyribonucleic Acid

EDTA Etilendiamin tetraaxetic acit

Kb Kilo base – Kilo bazo nito

NCBI Nation Cetrer for Biotechnology Information (trung

tâm Quốc gia về Thông tin Công nghệ sinh học)

PCR Polymerase Chain Recation

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

DANH MỤC BẢNG ii

DANH MỤC HÌNH iii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT iv

PHẦN : 1MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu của đề tài 2

1.2.1 Mục tiêu tổng quát 2

1.2.2 Mục tiêu cụ thể 2

1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 2

1.3.1 Ý nghĩa khoa học của đề tài 2

1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài 3

PHẦN 2: TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU 4

2.1 Tổng quan về đối tượng nghiên cứu 4

2.1.1 Nguồn gốc của Dê 4

2.1.2 Vị trí phân loại của Dê 4

2.2 Cơ sở khoa học của đề tài 6

2.2.1 Giới thiệu về công nghệ mã vạch DNA 6

2.2.2 Mã vạch DNA sử dụng trong xác định loài ở động vật và thực vật 7

2.2.2.1 Mã vạch DNA ở thực vật 7

2.2.2.2 Mã vạch DNA ở động vật 9

2.3 Phương pháp tách chiết DNA tổng số 10

2.4 Phương pháp điện di DNA trong gel agarose 11

2.5 Kỹ thuật PCR 12

2.6 Phương pháp xác định trình tự các nucleotide 12

2.7 Tình hình nghiên cứu DNA mã vạch gene trong và ngoài nước 13

2.7.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 13

2.7.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 16

PHẦN 3:ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

3.1 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 18

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 18

3.1.2 Vật liệu nghiên cứu 18

3.2 Dụng cụ, thiết bị nghiên cứu 19

3.2.1 Thiết bị 19

3.2.2 Hóa chất 20

3.3 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 20

3.4 Nội dung nghiên cứu 20

3.5 Phương pháp nghiên cứu 21

3.5.1 Lấy mẫu mô tai 21

3.5.2 Phương pháp tách chiết DNA tổng số 21

3.5.3 Phương pháp PCR 22

3.5.4 Phương pháp xác định trình tự các nucleotide 23

3.5.5 Phân tích dữ liệu 23

PHẦN 4:KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24

4.1 Kết quả tách DNA tổng số 24

4.2 Kết quả PCR khuếch đại chỉ thị COI của các mẫu 25

4.3 Kết quả phân tích các chỉ thị DNA bacoding 26

4.3.1 Kết quả phân tích chất lượng giải trình tự 26

4.3.2 Kết quả phân tích chỉ thị COI 28

PHẦN 5:KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 34

5.1 Kết luận 34

5.2 Đề nghị 34

I.Tài liệu tham khảo tiếng việt 35

II Tài liệu tham khảo tiếng anh 35

III Tài liệu từ internet 37

PHẦN 1

MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Ở Việt Nam hiện nay chăn nuôi đang là một trong những ngành rất quan trọng, chiếm tỷ trọng khá cao trong nền kinh tế Trong những năm qua, bên cạnh việc phát triển chăn nuôi trâu, bò Nhà nước cũng rất quan tâm đến phát triển chăn nuôi dê Vì thế ngành chăn nuôi dê của nước ta ngày càng phát triển, do cần ít vốn, quay vòng nhanh, tận dụng được lao động và thích hợp với vùng miền núi nơi điều kiện kinh tế người dân còn khó khăn Chăn nuôi dê cung cấp nhiều loại sản phẩm phục vụ đời sống con người như: thịt, sữa, lông, da, sừng, móng và cung cấp một nguồn phân bón khá lớn phục vụ cho sản xuất nông nghiệp Sữa dê cung cấp một nguồn protein rất quan trọng cho con người, đặc biệt sữa dê rất hiếm khi nhiễm khuẩn lao như sữa bò [6]

Theo Tổng cục Thống kê, số đầu dê năm 2015 của toàn vùng trung du và

miền núi phía Bắc đạt trên 898.295 con, chiếm 51,6% tổng đàn dê của cả nước

Trong đó chiếm phần lớn là các loại dê có nguồn gốc từ Ấn Độ (Barbari, Jamunapari, Beetal), từ Pháp, Mỹ, Úc (Saanen, Alpine, Boer) [24] Các loại dê này

có khối lượng sữa và trọng lượng cơ thể lớn hơn một số giống dê bản địa nên được nuôi dưỡng và cho lai với các giống dê bản địa ở nước ta Điều này dẫn đến số lượng dê bản địa đang dần bị giảm đi, bị lai tạp với các giống dê khác làm mất đi một số nguồn gene quý, trong đó dê Nản Định Hóa là một ví dụ

Định Hóa là huyện miền núi phía Tây Bắc của tỉnh Thái Nguyên với địa hình chiếm phần lớn là đồi núi các dãy núi đá vôi hiểm trở, rất phù hợp với việc chăn thả

dê, đặc biệt là với dê cỏ Chính vì thế ở huyện Định Hóa hay nói chính xác hơn là khu vực quanh dãy núi Nản ở đây người dân đã có truyền thống lâu đời về chăn nuôi dê, nên ở đây đã hình thành giống dê Nản mang thương hiệu riêng của khu vực Dê Nản chất lượng thịt tốt thơm ngon, tỷ lệ nạc cao, chịu đựng mức dinh dưỡng thấp hơn các loại dê khác có khả năng sinh trưởng và phát triển nhanh, đặc biệt dê Nản có khả năng sinh trưởng khá tốt trong điều kiện thời tiết bất lợi, vì nó đã thích nghi với điều kiện tự nhiên sẵn có của huyện Định Hóa Giá thành của thịt dê

Nản khá cao, nhưng hiện nay số lượng dê Nản thuần còn lại rất ít do đó không đủ đáp ứng nhu cầu của thị trường Theo số lượng thống kê của sở Nông nghiệp & PTNT tỉnh Thái Nguyên, thời điểm tháng 10 năm 2015 đàn dê nuôi ở huyện Định Hóa có 18.404 con, trong đó chủ yếu là dê lai, đàn dê Nản hiện còn rất ít (Ước chỉ còn khoảng 2.000 con) Vì số lượng Dê nản còn ít nên rất dễ bị lai tạp với các loại

dê khác, gây mất đi nguồn gene quý nên cần có các biện pháp phân biệt để bảo tồn

Các phương pháp phân loại học tuyền thống về hình thái, sinh lý, hóa sinh có

ưu điểm là nhanh chóng và đơn giản song lại phụ thuộc rất nhiều vào kinh nghiệm của các điều tra viên nên thiếu tính chính xác dẫn đến có nhiều sự nhầm lẫn Với sự tiến bộ của kĩ thuật di truyền, phương pháp mã vạch DNA đã trở thành một cụ hỗ trợ cho các phương pháp truyền thống để đưa ra các kết quả cuối cùng một cách

chính xác nhất Hiện nay, vùng gene COI nằm trong ti thể được coi là vùng gene

chuẩn trong xây dựng mã vạch DNA để nhận dạng loài động vật và được công nhận bởi tổ chức mã vạch quốc tế [25]

Xuất phát từ những lý do trên tôi lựa chọn đề tài “Xác định sự sai khác di

truyền của dê Nản Đinh Hóa với một số giống dê khác bằng phương pháp mã vạch DNA”

1.2 Mục tiêu của đề tài

1.2.1 Mục tiêu tổng quát

Xác định sự sai khác di truyền của dê Nản Đinh Hóa với một số giống dê khác bằng mã vạch DNA

1.2.2 Mục tiêu cụ thể

- Khuếch đại và giải trình tự chỉ thị COI (Cytochrome C oxidase Subutnit I)

- Xác định sự sai khác di truyền giữa dê Nản Định Hóa và một số giống

dê khác

1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

1.3.1 Ý nghĩa khoa học của đề tài

- Kết quả của đề tài bổ sung dữ liệu cho nguồn gene dê và mở ra triển vọng ứng dụng công nghệ sinh học trong phân loại và định danh loài

1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài

- Là cơ sở khoa học để góp phần bảo tồn nguồn gene dê Nản Định Hóa không bị lai tạp gây mất đi nguồn gene quý

- Nghiên cứu bảo tồn và phát triển dê Nản giúp xây dựng thương hiệu đặc sản địa phương góp phần xóa đói giảm nghèo cho các hộ chăn nuôi miền núi và thúc đẩy phát triển kinh tế của địa phương cũng như trong khu vực

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU 2.1 Tổng quan về đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Nguồn gốc của Dê

Nhiều nhà khoa học ở các nước khác nhau đã nghiên cứu về nguồn gốc của

dê nhà, tuy còn nhiều ý kiến khác nhau nhưng đại đa số các nhà khoa học cho rằng

dê là một trong những loại vật nuôi được thuần hóa sớm nhất

Người ta cho rằng dê nhà ngày nay (Capra hircus) có nhiều nguồn gốc khác

nhau Tổ tiên trực tiếp của dê nhà gồm 2 nhóm dê rừng chính:

+ Dê rừng Bezoar (Capra aegagrus) được tìm thấy ở Iran và các nước vùng

tiểu Á, là tổ liên của phần lớn dê nhà đang được nuôi ở châu Á và châu Âu Nó được coi là nhóm tổ tiên thứ nhất của dê nhà Dê thuộc nhóm này có sừng thẳng nhưng xoắn vặn

+ Dê rừng Markhor (Capra Falconeri), nhóm này có sừng cong vặn về phía

sau và được coi là nhóm tổ tiên thứ 2 của dê nhà, còn thấy ở vùng núi Hymalaya và đang được nuôi nhiều ở hai bên sườn phía Đông là Tây của dãy núi này Nhóm Markhor phân bố ở Afghanistan và vùng Kashimir – Karakorum

Hiện nay, người ta thấy rằng khu vực nuôi dê lâu đời nhất là các nước Trung Đông, sau đó đến Ấn Độ và Ai Cập, tiếp đến là các nước châu Âu, châu Á và châu Phi Khu vực nuôi dê mới nhất là Đông Nam Á [6]

2.1.2 Vị trí phân loại của Dê

Về phân loại động vật học, dê thuộc giới động vật (Animalia), ngành động vật có dây sống (Chordata), phân ngành động vật có xương sống (Vertebrata), lớp động vật có vú (Mammalia), bộ guốc chẵn (Artiodactyla), họ trâu bò (bovidae), họ phụ dê cừu (capra rovanae), thuộc loài dê (Capra) [6]

2.1.3 Giới thiệu về dê Nản

 Đặc điểm ngoại hình:

Theo khảo sát ban đầu dê Nản có thân hình thấp nhỏ so với các giống dê ngoại nhập Khối lượng cơ thể sơ sinh khoảng 1,7-1,9 kg Dê Nản trưởng thành chỉ đạt từ

25 -30 kg/con Tính trung bình thì dê đực nặng khoảng 25 kg, và dê cái nặng khoảng 20 kg Dê Nản có đầu to, đôi tai nhỏ, ngắn và dựng đứng lên, cặp sừng cũng ngắn, sắc lông màu trắng hoặc đen, có con khoang trắng đen hoặc màu cánh gián,

cổ ngắn có bờm và có râu cằm Hình 2.1 là hình ảnh của dê Nản được chụp tại xã Kim Phượng huyện Định Hóa

Hình 2.1 Dê Nản ở xã Kim Phượng huyện Định Hóa

 Chế độ ăn uống:

Qua quan sát ban đầu Dê Nản ăn nhiều loại cỏ, lá và cành non của nhiều loại cây đặc biệt là cây họ đậu, các loại củ quả và hạt ngũ cốc, các phụ phẩm nông nghiệp Người ta nuôi dê Nản theo phương thức chăn thả trên núi vào ban ngày, nhốt vào chuồng từ chiều tối Mỗi ngày cho mỗi con dê ăn thêm khi đã về chuồng 1 – 2 kg cỏ non và lá cây họ đậu, 200 - 300g thức ăn tổng hợp (cám gạo, bột ngô, bột săn, bột đậu tượng trộn với một chút muối) Đối với dê cái đang chửa thì tăng 1,5 lần, dê cái đang nuôi con thì tăng gấp 2 - 3 lần lượng thức ăn thêm đó Mỗi con dê

đực giống mỗi ngày cho ăn khoảng 3,5 - 4,0 kg lá cỏ tươi, 1 - 1,5 kg lá ngô hoặc lá đậu hoặc lá những cây họ đậu khác giàu chất đạm và 0,3 - 0,4 kg thức ăn tinh

2.2 Cơ sở khoa học của đề tài

2.2.1 Giới thiệu về công nghệ mã vạch DNA

Phân loại sinh vật thường dựa trên các khóa phân loại về chỉ tiêu về hình thái, sinh lý, hóa sinh Tuy nhiên trong nhiều trường hợp, mẫu vật chưa phát triển đầy đủ các đặc tính hình thái, hoặc chúng bị hư hỏng các bộ phận ngoài, hoặc mẫu vật chết đã khiến quá trình nhận diện mẫu vật trở nên khó khăn thậm chí là không thể Vì vậy cần có những phương pháp bổ sung để nhận diện nhanh chóng, chính xác hơn

Từ giữa những năm 1990, với sự phát triển mạnh mẽ của sinh học phân tử, một phương pháp nghiên cứu mới trong lĩnh vực phân loại học đã hình thành và được gọi là phương pháp phân loại học phân tử Phương pháp này dựa trên các

dữ liệu thông tin về hệ gene (DNA) trong và ngoài nhân hoặc các sản phẩm của chúng (protein) Tùy mục đích hoặc đối tượng nghiên cứu, người ta có thể lựa chọn các gene (đoạn DNA) khác nhau hoặc các sản phẩm khác nhau của hệ gene

Năm 2003, Paul Hebert - nhà nghiên cứu đại học Guelph, Canada là người sáng lập ra phương pháp mã vạch DNA – đây là một phương pháp dùng để nhận diện các loài Mã vạch sử dụng trình tự nucleotide ngắn lấy từ một phần thích hợp trong hệ gene của sinh vật như một chuỗi ký tự duy nhất giúp nhận diện hai loài sinh vật với nhau [17] Ông đề xuất sử dụng một trình tự ngắn của một gene được gọi

là Cytochrome c oxidase 1 (COI) có chiều dài khoảng 650 bp, đây là một trình tự

DNA có chứa trong tất cả các loài động vật, tuy nhiên các trình tự này có thể sử dụng

để phân biệt các loài động vật Đoạn gene COI được tìm thấy trong ty thể Hệ gene ty

thể của động vật là một mục tiêu tốt để phân tích hơn bộ gene nhân vì thiếu các đoạn

intron và việc phát sinh loài thường tập trung vào các gene trong ty thể, 13 gene mã hóa cho protein trong ty thể động vật là những vùng gene có nhiều tiềm năng để dùng làm mã vạch DNA bởi vì sự thêm và mất các trình tự dẫn đến một sự thay đổi trong

khung đọc rất hiếm xảy ra, trong đó COI có đủ các yếu tố quan trọng để có thể sử dụng làm mã vạch DNA [16] Lợi thế của việc sử dụng đoạn COI trong xác định loài

là đoạn gene này đủ ngắn để được giải trình tự một cách nhanh chóng và rẻ tiền nhưng cũng đủ dài để xác định được các biến thể giữa các loài Một mã vạch DNA điển hình cần đáp ứng được các yêu cầu sau:

(1) Có tính phổ biến cao để có thể thực hiện trên nhiều loài

(2) Trình tự có tính đặc hiệu cao và có hiệu suất nhân bản cao

(3) Có khả năng phân biệt đồng thời được nhiều loài

Có năm bước chính liên quan đến xác định loài bằng trình tự đoạn mã vạch DNA Đầu tiên, một mẫu vật phải được thu gom và xác định bởi các nhà phân loại Một mẫu mô được lấy từ mẫu và tiến hành tách chiết thu DNA tổng số, sau đó trình

tự DNA đích được khuếch đại bằng phản ứng PCR và được giải trình tự để tạo ra một

mã vạch Cuối cùng, các mã vạch được nhập vào hệ thống ngân hàng dữ liệu Barcode (BOLD) Nó là một hệ thống trực tuyến để giúp các nhà nghiên cứu thu thập, quản lý

và phân tích mã vạch DNA Mỗi mục được tổ chức trong BOLD có thông tin như tên phân loại, hình ảnh của loài, GPS tọa độ nơi mà loài đó đã được tìm thấy và trình tự

mã vạch Thông tin này có thể truy cập thông qua BOLD cho bất cứ ai trên thế giới

và có nhiều ứng dụng bao gồm cả giám sát môi trường, an toàn thực phẩm và y học

Ví dụ, mã vạch DNA sẽ được sử dụng để xác định các ấu trùng của loài xâm hại, phát hiện ra các loài mới xác định các loài gây ra một vết cắn, chích hoặc ngộ độc, xác minh thực vật hay thành phần động vật trong thực phẩm [11]

2.2.2 Mã vạch DNA sử dụng trong xác định loài ở động vật và thực vật

2.2.2.1 Mã vạch DNA ở thực vật

Hệ thực vật vô cùng phong phú và đa dạng vì vậy vấn đề về phân loại và định danh sẽ không dễ dàng và tốn nhiều thời gian Việc định danh loài dựa vào các đặc điểm bên ngoài không cho kết quả cao, trong khi số lượng loài luôn luôn biến

động và có những loài đã tuyệt chủng mà chưa hề biết đến Vì vậy, cần có một biện pháp thích hợp để giả quyết vấn đề này [8] Sự ra đời của một công nghệ gọi là “mã vạch DNA” là một công cụ hữu ích trong việc phân loại và định danh loài Đoạn gene sử dụng làm mã vạch có thể tìm thấy ở tất cả các sinh vật (hoặc ít nhất là trong tất cả các thành viên của một nhóm loài), các trình tự nucleotide sẽ giống nhau hoặc rất giống nhau ở các cá thể trong cùng một loài, nhưng khác nhau giữa các loài Chính vì vậy, khu vực này có thể được sử dụng cho nhận dạng các loài bằng cách so sánh trình tự của nó trong sinh vật thử nghiệm với trình tự từ tài liệu tham khảo đặc biệt từ các cơ sở dữ liệu [11]

Mã vạch DNA đã được sử dụng một cách hiệu quả ở động vật, tảo và nấm, nhưng vẫn còn những cuộc tranh luận về việc sử dụng các vùng DNA chuẩn để áp dụng cho thực vật Năm 2005, nhóm PWG (Plant Working Group) đã đưa ra 5 vùng gen nằm trong lạp thể có tiềm năng để sử dụng làm mã vạch cho thực vật bao gồm

vùng matK (mã hóa cho maturase và có vị trí trong gen trnK), vùng rpoB (tiểu đơn

vị RNA polymerase), rpoC1(tiểu đơn vị RNA polymerase), accD (tiểu đơn vị của acetyl CoA carboxylase) và UBBAXH (trước đây được biết đến như ycf5; gen mã

hóa protein tham gia vào quá trình sinh tổng hợp cytochrome c) Năm 2007, trong một nghiên cứu tiếp theo đã đề xuất thêm hai vùng gen nằm trong DNA plastid đó

là hai locus rbcL và matK dùng để xác định các cây hạt trần, hạt kín, dương xỉ, bút

tháp và rêu Hiệu suất xác định loài của sự kết hợp hai locus này đạt 72% Ngoài ra

các vùng khác như psbA-trnH thuộc plastid và ITS1-5.8S rRNA-ITS2 thuộc DNA

ribosome hạt nhân cũng được thử nghiệm như mã vạch bổ sung [9]

Kỹ thuật này rất hữu ích trong các nghiên cứu phân loại học, sinh thái và tiến hóa Ngoài ra, nó có thể được sử dụng trong các lĩnh vực như: Bảo tồn, khoa học pháp y và các ngành công nghiệp thực phẩm Việc nghiên cứu mã vạch DNA thực vật đã vượt xa mục đích so sánh vùng DNA khác nhau để tiến tới những ứng dụng thực tế hơn như: Cung cấp cái nhìn sâu hơn vào phân loại học ở cấp độ loài, nhận diện và phân chia ranh giới giữa các loài; hỗ trợ nhận diện các mẫu vật chưa được nhận biết hoặc chưa xác định được thuộc loài nào

Có một số tiêu chí để lựa chọn một trình tự có thể được sử dụng như một mã vạch DNA Các trình tự được sử dụng làm mã vạch phải có trong tất cả các loài của một đơn vị phân loại lớn, trình tự đó phải đảm bảo đủ ngắn khoảng 400 - 800bp để

có thể phân lập được từ các mẫu vật đã bị hư hỏng, suy giảm về chất lượng và để khuếch đại một cách dễ dàng, không tốn kém Trình tự của mã vạch DNA cũng giữa các loài cần có sự giống nhau đến 70% song cũng phải chứa khoảng 30% trình

tự khác nhau để có thể xác định và phân biệt được các loài với nhau [11]

2.2.2.2 Mã vạch DNA ở động vật

Với hàng triệu loài cùng với những biến đổi không ngừng trong từng giai đoạn sống thế giới động động vật đặt ra một thách thách lớn trong việc phân loại và định danh các loài Một hệ thống phân cho thế giới động vật sẽ có thể bao gồm ít nhất hàng triệu loài khác nhau [13] Phân loại hiện đại xuất hiện từ giữa thế kỷ 18,

đã mô tả được khoảng 1,7 triệu loài Các nhóm động vật lớn hơn thường được mô tả đầu tiên, trong khi nhiều sinh vật nhỏ hơn vẫn chưa được biết đến Tuy nhiên, ngay

cả các loài động vật lớn hơn vẫn có những nghi ngờ về nhận dạng giữa các loài Hệ sinh vật của trái đất có thể chứa từ 10 đến 100 triệu loài sinh vật nhân chuẩn Vì vậy, để định danh loài thông qua các đặc điểm hình thái thì con số trên là quá lớn, bên cạnh đó cũng có một số lĩnh vực khác liên quan đến việc xác định loài như: Đấu tranh chống buôn bán các loài nguy cấp đang trong nguy cơ tuyệt chủng, giám sát thủy sản, xác định và kiểm soát sự lây lan của các loài vật gây hại hoặc bệnh, xác định dòng tuyệt chủng Với sự đa dạng sinh học cao như vậy thì việc tìm ra một công nghệ cho việc phân loại là vô cùng quan trọng

Năm 2003, Paul Hebert đề xuất "mã vạch DNA" (DNA Barcode) như là một cách để xác định loài, mã vạch DNA là một chuỗi nucleotide ngắn lấy từ một phần thích hợp của hệ gen được sử dụng để xác định ở mức độ loài Ông đề xuất xây dựng một hệ thống phân loại cho động vật dựa trên sự đa dạng trong chuỗi

cytochrome c oxidase tiểu đơn vị 1 (COI) [13] Gen cytochrome c oxidase tiểu đơn

vị 1 trong ty thể cung cấp một số lợi thế so với DNA nhân: có thể nhân lên nhanh chóng, thiếu các đoạn intron và có số lượng bản sao cao Những đặc điểm đó rất

quan trọng đối với sự khuếch đại bằng phản ứng chuỗi polymerase (PCR) và sử

dụng như là một marker phân tử [15] Lưu ý rằng trình tự gen COI chỉ dùng để xác

định các động vật có xương sống và côn trùng, nó không thể dùng cho tất cả các

nhóm động vật, chẳng hạn đối với bọt biển và san hô thì vùng gen này rất bảo thủ,

nhưng lại có sự biến đổi quá cao ở các loài lưỡng cư và giáp xác, trong khi ở các loài

như giun tròn, sán lá và tardigrades (loài gấu nước) thì vùng gen này có sự sắp xếp lại

lớn nên sẽ làm ngăn cản việc sử dụng các cặp mồi phổ biến trong phản ứng PCR

Ngoài locut gen CO1, các đoạn gen khác trong ty thể Cytb (cytochrome b), gen

ribosome 12S, 16S cũng được dùng như ADN mã vạch trong nhận dạng ở động vật

2.3 Phương pháp tách chiết DNA tổng số

Tách chiết DNA là cần thiết bởi các thực nghiệm của công nghệ gene đều tiến hành với DNA DNA là phân tử có kích thươc lớn, do đó trong quá trình thao tác cần tránh mọi tác nhân cơ học hoặc hóa học mạnh để bảo đảm độ nguyên vẹn về cấu trúc để thực hiện các khâu nghiên cứu tiếp theo

Tùy vào từng loại mẫu vật mà có phương pháp tách chiết DNA tổng số khác nhau, nhưng nguyên lý chung gồm những bước sau:

Bước 1: Phá vỡ màng tế bào và màng nhân (tế bào Eukaryote) Thông

thường tế bào, mô được nghiền trong nitơ lỏng -1960C hoặc dùng hỗn hợp chất tẩy (SDS, Sarcosyl) và proteinase K Khi đó màng tế bào, màng nhân sẽ bị phá vỡ và giải phóng DNA ra môi trường và phân hủy các protein liên kết với DNA

Bước 2: Loại bỏ các thành phần không mong muốn trong mẫu, chủ yếu là các protein, mẫu được lắc mạnh trong một dung dịch phenol và chloroform, dung dịch này có tác dụng làm biến tính protein đồng thời không hòa tan DNA, sau khi li tâm sẽ tủa thành lớp nằm giữa pha nước và pha phenol/chloroform Pha nước có chứa DNA được thu nhận lại

Bước 3: Tủa DNA, mục đích của việc kết tủa là nhằm thu nhận DNA dưới dạng cô đặc, một phần nhằm bảo vệ chúng ra khỏi sự phân hủy các enzym, mặt khác có thể hòa tan chúng lại trong dung dịch theo nồng độ mong muốn Có thể tủa DNA trong ethanol (2,5 dung tích ethano l/1 dung tích mẫu), môi trường có nồng độ

muối cao, nhiệt độ thấp, tuy nhiên cũng có thể tủa trong isopropanol (1 thể tích isopropano l/1 thể tích mẫu), không cần muối Sau khi thu nhận DNA, cặn tủa cần phải rửa trong ethanol 70% để loại bỏ muối hoặc isopropanol dính vào

Bước 4: Hòa tan DNA Kết tủa DNA sau khi rửa bằng cồn và để khô tự nhiên được hòa tan trong TE hoặc nước cất để bảo quản DNA phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo

2.4 Phương pháp điện di DNA trong gel agarose

Phương pháp điện di DNA dựa vào đặc tính của các nucleic acid là các đại phân tử tích điện âm nên khi chịu tác dụng của lực điện trường với điện thế và cường độ thích hợp chúng sẽ di chuyển về phía cực dương của điện trường Phương pháp điện di được thực hiện phụ thuộc vào kích thước, cấu hình của DNA, loại gel, nồng độ gel và cường độ dòng điện Các phân tử có kích thước nhỏ sẽ di chuyển về phía cực dương nhanh hơn các phân

tử có kích thước lớn Đây cũng chính là cơ sở để có thể sàng lọc các dòng tái tổ hợp bằng phương pháp so sánh kích thước

Các bước của phương pháp điện di được tiến hành như sau:

Chuẩn bị gel

+ Cân 1 gam agarose cho vào 99 ml dung dịch TAE 1X, đun sôi trong lò vi sóng sao

cho agarose tan hoàn toàn (nồng độ 1%)

+ Để gel nguội đến 600C, đổ gel vào khuôn đã cài sẵn lược và đợi cho gel đông lại + Nhấc lược khỏi bản gel và đặt bản gel vào bể điện di

+ Đổ dung dịch đệm TAE vào bể điện di sao cho ngập bản gel

Tra mẫu điện di

+ Tỷ lệ tra: Trộn theo tỉ lệ 1 µl loading dye với 5 µl mẫu

+ Cài đặt chương trình điện di ở hiệu điện thế 100-110 V, 100-200 mA, trong 30 phút (khi vị trí vạch mầu chạy được khoảng 2/3 bản gel)

2.5 Kỹ thuật PCR

Phương pháp PCR do Kary Mullis và cộng sự phát minh vào năm 1985 Phương pháp PCR cho phép khuếch đại, tạo ra số lượng bản sao rất lớn của gen trong một thời gian ngắn Phản ứng PCR dựa trên cơ sở tính chất biến tính, hồi tính của DNA

và nguyên lý tổng hợp DNA Trên cơ sở trình tự của đoạn DNA khuôn, đoạn mồi, các nucleotide tự do và enzyme DNA polymerase có thể tổng hợp được đoạn DNA đích mong muốn [3]

Phản ứng PCR khếch đại gene đích mong muốn được lập lại nhiều lần các chu

kỳ nhân gene, trong một thời gian ngắn số lượng bản sao DNA tạo thành sẽ tăng theo cấp số nhân

 Phản ứng PCR gồm các bước chủ yếu sau:

Bước biến tính: Hai mạch đơn của phân tử DNA tách đôi dưới tác dụng của nhiệt độ Bước này thường được tiến hành ở 94 – 950C sẽ làm đứt các lien kết hydro của phân tử DNA, hai mạch DNA tách rời nhau thành 2 mạch đơn, làm khuân cho quá trình tổng hợp, giai đoạn này kéo dài từ 30 giây đến 1 phút

Bước gắn mồi: Nhiệt độ của phản ứng được hạ thấp Trong hỗn hợp phản ứng lúc này có mặt hai mạch đơn DNA vừa tách khỏi nhau và hai mồi Mỗi đoạn mồi sẽ nhận biết và bám vào một sợi DNA mạch đơn theo nguyên tắc bổ sung Nhiệt độ gắn mồi phụ thuộc vào độ dài và trình tự mồi, thông thường nằm trong khoảng 45-600

C và kéo dài từ 30 giây đến 1 phút Bước kéo dài: Nhiệt độ 720C là nhiệt độ thích hợp nhất cho hoạt động của enzyme DNA polymerase Enzyme DNA polymerase xúc tác hoạt động tổng hợp các nucleotide tự do vào cuối đoạn mồi theo nguyên tắc bổ sung và cuối cùng một đoạn DNA mới được tổng hợp

Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ liên tục, thông thường thực hiện khoảng 20-40 chu kỳ [2]

2.6 Phương pháp xác định trình tự các nucleotide

Giải trình tự là phương pháp xác định thứ tự sắp xếp của 4 nucleotide (adenine, guanine, cytosine và thymine) trên một phân tử DNA Với việc phát triển

phương pháp giải trình tự tự động việc xác định trình tự DNA của sinh vật đã trở nên dễ dàng hơn Các thông tin về trình tự DNA của hệ gen sinh vật đã trở nên không thể thiếu cho các quá trình nghiên cứu sinh học cơ bản, cũng như trong các lĩnh vực chẩn đoán hoặc pháp y

Phương pháp này dựa trên nguyên tắc của phương pháp dideoxynucleotide cải tiến của Sanger, đó là sử dụng các phân tử triphosphate dideoxynucleotide (ddNTPs) như là các điểm kết thúc trong quá trình tổng hợp chuỗi DNA Các thành phần sử dụng trong phương pháp này đó là: Mẫu DNA sợi đơn, DNA mồi, Enzyme taq-DNA polymerase, bốn loại dNTPs, dung dịch đệm và có thêm một lượng nhỏ ddNTP (trong đó có một loại đánh dấu bằng cách gắn với một phân tử huỳnh quang) Mẫu DNA được chia thành bốn phản ứng riêng biệt có chứa tất cả bốn deoxynucleotides chuẩn (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) và polymerase DNA Mỗi phản ứng chỉ được thêm vào một trong bốn dideoxynucleotide (ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTP), các dideoxynucleotide này bị mất 2 nguyên tử oxy ở vị trí carbon thứ 3 và carbon thứ 4

Do đó khi mạch DNA đang tổng hợp bị gắn một ddNTP thì không có nhóm 3’-OH ở nucleotide cuối cùng nên mạch đang tổng hợp không được tiếp tục kéo dài vì vậy phản ứng tổng hợp sẽ dừng lại [8] Mỗi ddNTP sử dụng được gắn với một phân tử huỳnh quang và mỗi nucleotide cho một màu khác nhau Các đoạn DNA thu được được phân tách theo kích thước bằng điện di trên cùng một ống mao quản Các đoạn DNA khác nhau sẽ phân tách trên gel mao quản và xuất hiện dưới dạng các đỉnh và màu đi kèm Các đỉnh được phát hiện bằng cách sử dụng nguồn laser Đọc trình tự DNA bằng cách xác định màu của đỉnh khi chúng đi qua thiết bị phát hiện và thông tin này sẽ được chuyển trực tiếp đến một máy tính và sẽ xác định được trình tự của đoạn DNA [26]

2.7 Tình hình nghiên cứu DNA mã vạch gene trong và ngoài nước

2.7.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Năm 2010, Locke SA và cộng sự đã sử dụng vùng mã vạch COI để phân biệt

Diplostomum spp (ấu trùng ký sinh trong mắt cá) Tiến hành thu thập được 497 mẫu

ấu trùng từ mắt cắc loài cá của sông St Lawrence ở Canada Sử dụng chỉ thị mã

vạch ITS và COI để phân loại các loài gây bệnh nghiêm trọng Tuy nhiên kết quả cho thấy chỉ thị COI cho kết quả phân biệt tốt hơn [22]

Năm 2012, Emre Keskin và cộng sự đã sử dụng tiểu đơn vị COI ty thể để

làm sáng tỏ tính đa dạng di truyền của các loài cá nước ngọt không phải là bản địa

Thông qua toàn bộ dữ liệu tìm thấy có 145 chuỗi COI Sự khác biệt về mã vạch COI

giữa các quần thể cùng loài là thấp, đặc biệt đối với quần thể C gibelio, G

thấy rõ ràng tính hiệu quả của phương pháp mã vạch DNA cho cả nhận dạng ở cấp

độ loài và cho thấy sự khác biệt giữa các quần thể, có thể được sử dụng để quản lý hiệu quả các loài xâm lấn và các chiến lược bảo tồn đối với các loài bản địa và đặc

Năm 2015, Joana Costa và cộng sự nghiên cứu trên loài Hypericum nằm trong số các cây thuốc đang ngày càng được sử dụng vì lợi ích sức khoẻ Hypericum

perforatum nổi tiếng với các đặc tính chống viêm, chống trầm cảm và chống virut,

cũng như một chất chữa bệnh Trong y học cổ truyền Bồ Đào Nha, Hypericum

androsaemum được sử dụng chủ yếu cho tính chất bảo vệ gan và lợi tiểu Nghiên

cứu này nhằm tìm kiếm khả năng sử dụng hai ứng viên mã vạch DNA mini (ITS1

và matK) để chứng thực H perforatum và H androsaemum trong truyền thống Các kết quả phân tích từ ITS1 và matK là cơ sở để phát triển các thử nghiệm PCR đặc

hiệu cho từng loài và PCR trong thời gian thực kết hợp với Phân tích Độ Phân giải Cao (HRM), như những cách tiếp cận đơn giản để phân biệt đáng tin cậy của cả hai loài Các vùng mã vạch đã thành công trong việc nhận dạng PCR đặc trưng cho

từng nhóm đối tượng Khu vực ITS1 cho thấy một số sự biến đổi nội bộ từ các kết quả sắp xếp, làm ảnh hưởng đến phân tích HRM, trong khi matK cho thấy là một

mã vạch mini thích hợp cho sự khác biệt của cả hai loài bằng PCR thời gian thực cùng với phân tích HRM Các xét nghiệm đã được áp dụng có hiệu quả cho thảo mộc [14]

Năm 2015, Locke SA và cộng sự đã sử dụng mã vạch DNA nghiên cứu tính

đa dạng của ấu ấu trùng Diplostomidae (Platyhelminthes: Digenea) trong mắt cá

nước ngọt Ấu trùng ở một số loài Diplostomidae (Platyhelminthes: Digenea) sống

trong mắt cá và khó xác định được các loài dựa trên hình thái học Ở đây, phân tích dựa trên khoảng cách mã vạch cytochrome c oxidase 1, và trong một số mẫu, các chuỗi được chuyển mã bên trong (ITS-1, 5.8S, ITS-2) được thực hiện cho hơn 2000

Diplostomidae từ Châu Phi, Trung Đông, Châu Âu, Châu Á Và châu Mỹ Hai mươi

hai loài Diplostomum, Tylodelphys và Austrodiplostomum được phân biệt 52 loài

gồm 12 loài được xác định, sáu loài ở hai quần thể loài và 34 loài giả định, và 33/52

đã được mô tả trong các nghiên cứu trước đó Hầu hết (23/40) các loài không xác định, giả định phân biệt bởi cytochrome c oxidase 1 khoảng cách được hỗ trợ bởi ít nhất một dòng bổ sung Khi cường độ lấy mẫu của 52 loài tăng lên, sự thay đổi cytochrome c oxidase 1 giảm giữa và tăng lên trong các loài, trong khi quy mô không gian ở các loài đó được lấy mẫu không có hiệu lực Tuy nhiên, sự thay đổi giữa các loài luôn luôn vượt quá sự thay đổi trong các loài Các mối liên kết vòng đời mới, hồ sơ địa lý và lưu trữ, và dữ liệu di truyền đã được ghi nhận ở một số loài, bao gồm Tylodelphys jenynsiae, Tylodelphys immer và Diplostomum ardeae [19]

Năm 2016, Mariana L Lyra đã tiến hành nghiên cứu mã vạch DNA trong đánh giá tính đa dạng di truyền và ước tính độ phong phú của các loài lưỡng cư

Vùng 5 'của tiểu đơn vị oxidase (COI) là rất quan trọng để thu thập mã vạch DNA

của các loài lưỡng cư Các tác giả đã nghiên cứu điều kiện PCR mới và thử nghiệm mồi mới AnF1 + AnR1) làm tăng hiệu quả của việc phục hồi mã vạch ở lưỡng cư Kết quả thấy rằng nhiệt độ gia tăng thấp cho chu kỳ PCR cải thiện đáng kể hiệu quả

khuếch đại Có thể khôi phục chuỗi COI đối với 100% loài được phân tích (N =

161), bao gồm ~ 15% các loài được biết đến từ Brazil (77 chi và 23 họ) Đó là một cải tiến quan trọng đối với các nghiên cứu trước đây Đánh giá sơ bộ về sự đa dạng loài cho thấy số loài có thể bị đánh giá thấp khoảng 25% Kết luận chỉ ra rằng mã vạch DNA là một phương pháp hiệu quả, đơn giản và được chuẩn hóa để xác định

sự đa dạng bí ẩn ở động vật lưỡng cư và sử dụng nó trong kiểm kê đa dạng sinh học

và trên khắp quần thể rộng khắp các loài đã biết [20]

2.7.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Năm 2014, Dương Văn Tăng, Vũ Đình Duy, Trần Thị Việt Thanh thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tiến hành đề tài “Đánh giá khả

năng sử dụng mã vạch COI trong việc định loại động vật tại bảo tang thiên nhiên

Việt Nam” tiến hành với Ba mẫu có tại Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam ký hiệu GN.bttnvn, GC.bttnvn, BHM.bttnvn được giám định hình thái ban đầu và được định tên là Gấu ngựa (Ursus thibetanus), Gấu chó (Helarctos malayanus) hoặc tên đồng nghĩa (Ursus malayanus) và Báo hoa mai (Panthera pardus) được sử dụng cho phân tích này DNA tổng số được tách từ mẫu mô cơ, sau đó tiến hành phản ứng PCR Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng kít Extraction Gel của Qiagen và xác định trình

tự bằng cặp mồi Barcode LCO1490/ HCO2198 của chương trình DNA Barcoding

Kết quả đã khuyếch đại được vùng gen COI, ở Gấu chó, Gấu ngựa có cùng kích

thước 623 bp còn ở Báo hoa mai là 653 bp Phân tích bằng phần mềm máy tính Mega 5.2.2 và chương trình BLAST trên ngân hàng gen quốc tế cho thấy các mẫu vật Gấu ngựa, Gấu chó, Báo hoa mai có tên chính xác như đã định loại bằng hình thái Kết quả mẫu nghiên cứu GN.bttnvn, GC.bttnvn, BHM.bttnvn đã đăng ký thành công vơi Genbank với các mã số công bố KF986481, KF986482 và KF986483 Mức độ tương đồng của các trình tự từ các mẫu nghiên cưu Gấu ngựa, Gấu chó và Báo hoa mai so với dữ liệu công bố trên GenBank lần lượt là 99%, 99,5% và

99,85% Với kết quả thu được, vùng gen COI có thể được sử dụng để giám định các

mẫu động vật quý hiếm không nguyên vẹn [1]

Năm 2014, Dương Thúy Yên thuộc Đại học Cần Thơ tiến hành nghiên cứu

“So sánh trình tự một số gen mã vạch của cá rô đầu vuông và cá rô đồng tự nhiên” thu ở xã Vĩnh Thuận Tây, huyện Vị Thủy, tỉnh Hậu Giang, nơi phát hiện cá rô đầu vuông với mẫu cá rô tự nhiên được thu ở 3 nơi, gồm Rừng U Minh Hạ - Cà Mau, vườn quốc gia Tràm Chim, Tam Nông – Đồng Tháp và Châu Thành A – Hậu Giang Số mẫu thu của mỗi dòng cá là 40 mẫu Nghiên cứu này nhằm kiểm tra giả

thuyết trên dựa vào sự so sánh trình tự 3 gen mã vạch trong ty thể (gen Cytochrom

C oxidase subunit 1- COI và Cytochorome b-Cyt b) và trong nhân (Gen Rhodopsin – Rho) giữa cá rô đầu vuông và cá rô tự nhiên thu ở 3 tỉnh Kết quả tìm thấy 3 dạng

trình tự của gen COI (trong 15 mẫu), 3 dạng của gen Cyt b (21 mẫu) và 1 dạng gen

Rho (7 mẫu) trong các mẫu nghiên cứu So sánh trình tự gen COI và Cyt b của cá rô

trong nghiên cứu này tương đồng trên 99% với cá rô Anabas testudineus có sẵn ở

cơ sở dữ liệu của GenBank và hệ thống BOLD [5]

Năm 2015, Nguyễn Phương Thảo và Dương Thúy Yên tiến hành nghiên cứu

đề tài “So sánh đặc điểm hình thái và DNA mã vạch của hai loài cá bống trân Butis

butis và Butis humeralis” Đề tài so sánh đặc điểm hình thái và trình tự gene

cytochrome C oxidase subutnit I (COI) của hai “loài” cá bống trân Butis butis và

Butis humeralis đã được công bố trong các nghiên cứu trước để kiểm chứng việc

định danh hai loài Kết quả về hình thái, chúng giống nhau ở hình dạng thân, mõm, màu sắc và cấu tạo cơ gốc vi ngực và một số chỉ tiêu đo Tuy nhiên, chúng khác nhau ở vạch và màu sắc của mắt, vị trí bắt đầu của vi lưng và vi hậu môn, tỉ lệ dài

đầu/khoảng cách hai mắt và cao thân/cao cuống đuôi Về trình tự gene COI, các

mẫu của hai loài giống nhau ở mức 99-100% Khoảng cách di truyền giữa 2 loài (0,003±0,001) tương đương với khoảng cách di truyền trong cùng một loài Như

vậy, 2 nhóm cá bống trân là cùng một loài Loài này khác với loài B butis ở Genbank (giống trình tự gene COI ở mức 86%), chứng tỏ việc phân loại loài của cá

B butis trên thế giới chưa rõ ràng và cần tiếp tục được nghiên cứu [4]

Năm 2015, Trần Thị Việt Thanh và cộng sự đã tiến hành đề tài “Sử dụng mã vạch DNA (DNAbarcodes) trong việc xác định mẫu chim tại bảo tàng thiên nhiên Việt Nam” Trên cơ sở sử dụng mã vạch DNA (Cytochrome c oxidase 1-CO1), đã giám định tên loài cho 4 mẫu chim thuộc họ Khướu (Timaliidae): 005_BTTNVN (Khướu mào cổ trắng), 028_BTTNVN (Lách tách đầu đốm), 045_BTTNVN (Lách tách mày trắng) và 055_BTTNVN (Khướu mặt đen) DNA tổng số được tách từ mẫu máu, sau

đó tiến hành phản ứng PCR, tinh sạch sản phẩm PCR và xác định được trình tự nucleotide vùng gen Barcode (CO1) với kích thước khoảng 650 bp cho mỗi mẫu Kết quả về vùng gen CO1 đã chỉ ra mức độ tương đồng di truyền cao, 99,7% (028_BTTNVN/Alcippe castaneceps), 99,8% (045_BTTNVN/ Alcippe vinipectus), 99,28% (99,2-99,5%; 055_BTTNVN/Garrulax affinis) và mẫu 005_BTTNVN thuộc giống Ynhina, được xác định bởi tên loài Y diademata trên GenBank Các dẫn liệu di truyền thu thập được cho mỗi mẫu đều tương đồng với phân loại bằng hình thái Bốn trình tự nucleotide vùng gen CO1 của mẫu chim nghiên cứu đã được đăng ký trên GenBank với các mã số: KP768404, KP768405, KP708406, KP768407 [7]

PHẦN 3 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Mẫu mô tai dê Nản được lấy tại địa bàn huyện Định Hóa – Thái Nguyên

Bảng 3.1 Các mẫu dê Nản nghiên cứu

1 Xóm Chũ 1 – Xã Bộc Nhiêu – Huyện Định Hóa D2

2 Xóm Chũ 1 – Xã Bộc Nhiêu – Huyện Định Hóa D3

3 Xóm Chũ 1 – Xã Bộc Nhiêu – Huyện Định Hóa D9

7 Xóm Hợp Thành – Xã Phượng Tiến – Huyện Định Hóa D63

8 Xóm Tải – Xã Phượng Tiến – Huyện Định Hóa D68

9 Xóm Tải – Xã Phượng Tiến – Huyện Định Hóa D78

10 Xóm Tải – Xã Phượng Tiến – Huyện Định Hóa D81

3.1.2 Vật liệu nghiên cứu

Mồi thực hiện phản ứng khuếch đại đoạn gene COI được thiết kế dựa trên

nghiên cứu của tác giả Tavares và cộng sự năm 2008

Thông tin của các cặp mồi được liệt kê trong bảng sau:

Bảng 3.2 Trình tự mồi cho phản ứng PCR

Stt Tên

mồi Trình tự mồi (5’-3’)

Ta (oC)

Kích thước dự kiến (bp)

1 VF1d TTC TCA ACC AAC CAC AAR GAY ATY GG

50 750

2 VR1d TAG ACT TCT GGG TGG CCR AAR AAY CA

Ghi chú: Y là nucleotide T hoặc C, R là nucleotide G hoặc A

3.2 Dụng cụ, thiết bị nghiên cứu

3.2.1 Thiết bị

Bảng 3.3 Danh mục các thiết bị được sử dụng

1 Bộ điện di Scie – plas Ltd – UK

2 Bể ổn nhiệt Techne – OSI

3 Cân điện tử TE 214S – Startorius Germany

4 Máy cất nước Canada Bio Water system –Pall Co.UK

5 Máy chụp gel Gel Logic 1500 – Kodak - USD

6 Máy đo pH F – 51 BW – Horiba – Japan

7 Máy lắc S3000 – Jeotech- Korea

8 Máy ly tâm Eppendorf – CHLB Đức

9 Máy PCR Amplied Biosystems USA/Singapore

10 Máy spindown E- centrifuge – Wealtex – Taiwan/USA

11 Máy Vortex Vortex Genius 3 – IKA Genmany/ China

12 Nồi hấp khử trùng HV – 110 – Hirayama – Japan

13 Tủ an toàn sinh học cấp 2 Nu – 425 – 400E – Nuaire - USA

14 Tủ lạnh -200C, -800C Super freezer Eco 130 – Ficchetti - Italy

15 Máy đo quang phổ kế