Xác định mối tương quan giữa đa hình di truyền các gen prolactin receptor và estrogen receptor với tính trạng sinh sản của lợn nậm khiếu

Theo nghiên cứu của Drogemuller và cộng sự 2001 cho thấy gen thụ thể prolactin PRLR và gen thụ thể estrogen ESR có mối liên quan đến năng suất sinh sản của lợn nái [16].. Từ những cơ sở

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

NGUYỄN THỊ THÚY NGA

Tên đề tài:

XÁC ĐỊNH MỐI TƯƠNG QUAN GIỮA ĐA HÌNH DI TRUYỀN CÁC GEN

PROLACTIN RECEPTOR VÀ ESTROGEN RECEPTOR VỚI TÍNH TRẠNG

SINH SẢN CỦA LỢN NẬM KHIẾU

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Khoa : CNSH - CNTP Khóa học : 2013 - 2017

Thái Nguyên – năm 2017

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

NGUYỄN THỊ THÚY NGA

Tên đề tài:

XÁC ĐỊNH MỐI TƯƠNG QUAN GIỮA ĐA HÌNH DI TRUYỀN CÁC GEN

PROLACTIN RECEPTOR VÀ ESTROGEN RECEPTOR VỚI TÍNH TRẠNG

SINH SẢN CỦA LỢN NẬM KHIẾU

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Lớp : K45 – CNSH

Khoa : CNSH - CNTP Khóa học : 2013 - 2017 Người hướng dẫn: 1 TS Dương Văn Cường

2 ThS Ma Thị Trang

Thái Nguyên – năm 2017

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình học tập và nghiên cứu để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp ngoài sự nỗ lực, cố gắng của bản thân, em đã nhận được sự giúp đỡ, hướng dẫn, chỉ bảo và động viên của thầy cô, bạn bè và gia đình

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo TS Dương Văn Cường và ThS Ma Thị Trang, người đã trực tiếp hướng dẫn và giúp đỡ em trong suốt thời

gian thực hiện đề tài cũng như trong quá trình hoàn chỉnh luận văn tốt nghiệp

Em xin chân thành cảm ơn tới các thầy cô trong Khoa Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm đã dạy dỗ và giúp đỡ em trong suốt thời gian qua

Em xin chân thành cảm ơn tới các cán bộ, anh chị làm việc tại Viện khoa học

sự sống – ĐH Thái Nguyên đã tạo điều kiện để em học tập và hoàn thành đề tài nghiên cứu

Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân, bạn bè đã luôn động viên, chia sẻ giúp đỡ em những lúc khó khăn trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành khóa luận

Em xin chân thành cảm ơn!

Thái Nguyên, ngày…tháng….năm 2017

Sinh Viên

Nguyễn Thị Thúy Nga

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1: Danh mục các thiết bị sử dụng trong đề tài 26

Bảng 3.2: Các hóa chất sử dụng trong đề tài 26

Bảng 3.3: Trình tự mồi cho phản ứng PCR 29

Bảng 3.4: Thành phần phản ứng PCR khuếch đại gen PRLR và ESR 29

Bảng 3.5: Thành phần phản ứng cắt gen PRLR bằng enzyme AluI 30

Bảng 3.6: Thành phần phản ứng cắt gen ESR bằng enzyme PvuII 30

Bảng 3.7: Vị trí cắt enzyme giới hạn AluI và PvuII 31

Bảng 4.1: Kết quả đo độ tinh sạch và nồng độ DNA 33

Bảng 4.2: Tỷ lệ kiểu gen PRLR của lợn Nậm Khiếu 36

Bảng 4.3: Tỷ lệ kiểu gen ESR của lợn Nậm Khiếu 39

Bảng 4.4: Một số chỉ tiêu về năng suất sinh sản của lợn Nậm Khiếu 40

Bảng 4.5: Năng suất sinh sản ứng với các kiểu gen PRLR ở lợn nái Nậm Khiếu 41 Bảng 4.6: Năng suất sinh sản ứng với các kiểu gen ESR ở lợn nái Nậm Khiếu 43

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 2.1: Hình ảnh lợn Nậm Khiếu được nuôi tại Chi nhánh nghiên cứu và phát

triển động thực vật bản địa – Thái Nguyên 4

Hình 2.2: Trình tự đoạn gen PRLR (GenBank accession: U96306) 6

Hình 2.3: Kích thước các alen có trong kiểu gen PRLR của lợn 7

Hình 2.4: Kích thước các đoạn DNA dự kiến thu được khi phân tích đa hình đoạn gen PRLR bằng enzyme AluI 8

Hình 2.5: Hình ảnh mô phỏng vị trí cắt đa hình của enzyme AluI trên đoạn gen PRLR 8

Hình 2.6: Đoạn gen PRLR nghiên cứu, vị trí cắt của enzyme AluI 9

Hình 2.7: Trình tự đoạn gen ESR (GenBank accession: HF947274) 10

Hình 2.8: Kích thước các alen có trong kiểu gen ESR của lợn 11

Hình 2.9: Kích thước các đoạn DNA dự kiến thu được khi phân tích đa hình đoạn gen ESR bằng enzyme PvuII 12

Hình 2.10: Hình ảnh mô phỏng vị trí cắt đa hình của enzyme PvuII trên đoạn gen ESR 12

Hình 2.11: Đoạn gen ESR nghiên cứu và vị trí cắt của enzyme PvuII 13

Hình 3.1: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen PRLR …… 29

Hình 3.2: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen ESR 30

Hình 4.1: Kết quả tách chiết DNA tổng số 8 mẫu mô tai lợn Nậm Khiếu 33

Hình 4.2: Sản phẩm PCR nhân lên từ cặp mồi PRLR 34

Hình 4.3: Sản phẩm PCR nhân lên từ cặp mồi ESR 35

Hình 4.4: Kết quả phân tích đa hình đoạn gen PRLR bằng enzyme AluI 36

Hình 4.5: Tỷ lệ kiểu gen và tần số alen gen PRLR trong quần thể lợn nghiên cứu 37

Hình 4.6: Kết quả phân tích đa hình đoạn gen ESR bằng enzyme PvuII 38 Hình 4.7: Tỷ lệ kiểu gen và tần số alen gen ESR trong quần thể lợn nghiên cứu 39

RFLP : Restriction Fragment Length Polymorphism DNA

SD : Standard Deviation (Độ lệch chuẩn)

SE : Standard Error (Sai số chuẩn)

TE : Tris – EDTA

V/p : Vòng/phút

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN 1

DANH MỤC CÁC BẢNG 2

DANH MỤC CÁC HÌNH 3

DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT 4

MỤC LỤC 5

Phần 1 1

MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu của đề tài 2

1.2.1 Mục tiêu tổng quát 2

1.2.2 Mục tiêu cụ thể 2

1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 3

1.3.1 Ý nghĩa khoa học của đề tài 3

1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài 3

Phần 2 4

TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU 4

2.1 Tổng quan về đối tƣợng nghiên cứu 4

2.1.1 Tổng quan về lợn Nậm Khiếu 4

2.1.2 Gen Prolactin receptor – PRLR 5

2.1.2.1 Nguồn gốc và cấu tạo 5

2.1.2.2 Chức năng của Prolactin 5

2.1.2.3 Gen thụ thể Prolactin 5

2.1.3 Gen Estrogen receptor – ESR 9

2.1.3.1 Nguồn gốc 9

2.1.3.2 Chức năng của Estrogen 10

2.1.3.3 Gen thụ thể Estrogen receptor – ESR 10

2.2 Cơ sở lý luận của đề tài 13

2.2.1 Năng suất sinh sản và các chỉ tiêu liên quan đến năng suất sinh sản 13

2.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến năng suất sinh sản 14

2.2.2.1 Ảnh hưởng của yếu tố di truyền 14

2.2.2.2 Ảnh hưởng của ngoại cảnh 15

2.2.3 Một số phương pháp sử dụng trong nghiên cứu gen lợn và ứng dụng 15

2.3 Cơ sở khoa học của đề tài 17

2.3.1 Khái niệm đa hình gen 17

2.3.2 Phương pháp tách chiết DNA 17

2.3.3 Kỹ thuật PCR 18

2.3.4 Kỹ thuật PCR – RFLP 19

2.4 Tổng quan tình hình trong nước và trên thế giới 20

2.4.1 Tổng quan tình hình nghiên cứu trên thế giới 20

2.4.2 Tổng quan tình hình nghiên cứu trong nước 21

Phần 3 25

ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

3.1 Đối tượng nghiên cứu 25

3.2 Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu 25

3.2.1 Địa điểm tiến hành nghiên cứu 25

3.2.2 Thời gian nghiên cứu 25

3.3 Nội dung nghiên cứu 25

3.4 Phương pháp nghiên cứu 25

3.4.1 Dụng cụ và thiết bị nghiên cứu 25

3.4.1.1 Dụng cụ nghiên cứu 25

3.4.1.2 Thiết bị nghiên cứu 26

3.4.2 Hóa chất nghiên cứu 26

3.4.3 Phương pháp lấy mẫu 27

3.4.4 Phương pháp tách chiết DNA 27

3.4.5 Phương pháp PCR 28

3.4.6 Phương pháp cắt bằng enzyme giới hạn 30

3.4.7 Phương pháp theo dõi các chỉ tiêu về khả năng sinh sản 31

3.5 Các phương pháp xử lý số liệu 32

Phần 4 33

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33

4.1 Kết quả phân tích được đa hình gen PRLR (Prolactin Receptor) và ESR (Estrogen Receptor) của lợn nái Nậm Khiếu 33

4.1.1 Kết quả tách chiết DNA tổng số từ mẫu tai lợn Nậm Khiếu 33

4.1.2 Kết quả PCR khuếch đại gen PRLR và ESR bằng cặp mồi đặc hiệu 34

4.1.2.1 Kết quả khuếch đại gen PRLR bằng cặp mồi đặc hiệu 34

4.1.2.2 Kết quả khuếch đại gen ESR bằng cặp mồi đặc hiệu 35

4.1.3 Kết quả phân tích đa hình đoạn gen PRLR và ESR 35

4.1.3.1 Kết quả phân tích đa hình đoạn gen PRLR bằng enzyme AluI 35

4.1.3.2 Kết quả phân tích đa hình đoạn gen ESR bằng enzyme PvuII 38

4.2 Kết quả xác định mối tương quan giữa đa hình di truyền các gen PRLR và ESR

với tính trạng sinh sản của lợn Nậm Khiếu 40

4.2.1 Năng suất sinh sản của lợn nái ứng với các kiểu gen của gen PRLR 41

4.2.2 Năng suất sinh sản của lợn nái ứng với các kiểu gen của gen ESR 43

Phần 5 48

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 48

5.1 Kết luận 48

5.2 Kiến nghị 48

TÀI LIỆU THAM KHẢO 49

Phần 1

MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Theo số liệu thống kê của Viện chăn nuôi Việt Nam, trong năm 2015 đàn lợn của nước ta có khoảng 29 triệu con và cung cấp sản lượng thịt chiếm khoảng 72% tổng số thịt từ vật nuôi [3] Hiện nay, thị hiếu người tiêu dùng đang có nhiều thay đổi với xu hướng quay trở lại sử dụng các sản phẩm thực phẩm bản địa có nguồn gốc rõ ràng Trước những nhu cầu đó việc lưu giữ, bảo tồn và phát triển các sản phẩm đặc trưng của từng địa phương được các nhà khoa học và chính quyền các cấp quan tâm nhằm phát triển các sản phẩm chất lượng cao gắn liền với thương hiệu địa phương mang lại giá trị kinh tế cao

Nguồn gen lợn bản địa của nước ta tương đối phong phú với khoảng 26 giống đã được phát hiện Tuy nhiên, quy mô đàn củ a nhi ều giống lợn bản địa ngày càng giảm trong đó một số giống có nguy cơ biến mất [1] Thay thế vào đó là những giống lợn lai với nhiều ưu điểm như thời gian sinh trưởng nhanh, cho trọng lượng thịt lớn và dễ dàng chăm sóc trên quy mô trang trại Tuy nhiên chất lượng thịt, khả năng chịu đựng bệnh và chịu đựng kham khổ của những giống lợn lai này lại không cao bằng các giống bản địa Lợn Nậm Khiếu là một giống lợn địa phương, đặc sản của vùng núi phía Bắc, với chất lượng thịt thơm, thịt nhiều nạc, ít mỡ và khả năng chịu được điều kiện bất lợi cao.Với nhiều ưu điểm trên nên việc duy trì nòi giống, bảo tồn giống lợn này là hết sức cần thiết

Một trong những tiêu chí quan trọng trong đánh giá chất lượng chăn nuôi lợn

là năng suất sinh sản của lợn nái Để nâng cao năng suất sinh sản của lợn bằng cách chọn lọc giống là khó do khả năng di truyền về các tính trạng này thấp [7] Với sự phát triển của các kỹ thuật hiện đại, các nhà nghiên cứu đã chọn lọc giống vật nuôi dựa vào các chỉ thị phân tử nhằm tăng khả năng chính xác, rút ngắn thời gian và tăng hiệu quả chọn lọc Trong đó, nghiên cứu về mối tương quan đa hình di truyền

gen với tính trạng sinh sản là rất cần thiết trong việc nâng cao năng suất sinh sản

Theo nghiên cứu của Drogemuller và cộng sự (2001) cho thấy gen thụ thể prolactin (PRLR) và gen thụ thể estrogen (ESR) có mối liên quan đến năng suất sinh sản của

lợn nái [16] Gen thụ thể PRLR (Prolactin receptor) nằm trên nhiễm sắc thể số 16,

là gen đánh dấu có liên quan đến tính trạng sinh sản của lợn [19] Từ những kết quả nghiên cứu trong những năm gần đây trên thế giới cho thấy gen này thực sự có liên

quan đến số con đẻ ra và số con còn sống trên lợn Prolactin có tác động sinh học

lên sự phát triển của tuyến vú, sự tiết sữa của người và thú cái trong thời gian mang

thai và nuôi con [8] Và chỉ những cá thể nào có thụ thể tiếp nhận prolactin (prolactin receptor) mới chịu ảnh hưởng của hormone này [14] Còn gen ESR (Estrogen receptor) của lợn thì liên quan mật thiết với quá trình mang thai và chức

năng hoạt động của nó thông qua thụ thể, nó có alen đặc trưng liên quan đến số con

được sinh ra [21]

Từ những cơ sở khoa học trên, nhằm mục đích ứng dụng những tiến bộ của

kỹ thuật di truyền vào chăn nuôi để nâng cao khả năng sinh sản, chọn lọc được

giống tốt, giống có chất lượng cao, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Xác định

mối tương quan giữa đa hình di truyền các gen Prolactin receptor và Estrogen receptor với tính trạng sinh sản của lợn Nậm Khiếu”

1.2 Mục tiêu của đề tài

1.2.1 Mục tiêu tổng quát

Xác định mối tương quan giữa đa hình di truyền các gen PRLR và ESR với

tính trạng sinh sản của lợn Nậm Khiếu

1.2.2 Mục tiêu cụ thể

- Nghiên cứu đa hình đoạn gen PRLR trên lợn Nậm Khiếu

- Nghiên cứu đa hình đoạn gen ESR trên lợn Nậm Khiếu

- Xác định mối tương quan giữa đa hình di truyền các gen PRLR và ESR

với tính trạng sinh sản của lợn Nậm Khiếu

1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

1.3.1 Ý nghĩa khoa học của đề tài

Xác định được đa hình đoạn gen PRLR và ESR làm cơ sở khoa học cho việc

nghiên cứu mối tương quan giữa kiểu gen với khả năng sinh sản của lợn

1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài

- Có ý nghĩa quan trọng trong việc bảo tồn, chọn giống có khả năng sinh sản cao bằng các chỉ thị phân tử

- Kết quả nghiên cứu về tính trạng sinh sản tạo tiền đề cho những nghiên cứu tiếp theo nhằm ứng dụng công nghệ hiện đại vào công tác chọn tạo giống nhằm đem lại hiệu quả kinh tế, duy trì nòi giống, phục vụ nhu cầu thị trường và phát triển kinh tế của địa phương

Phần 2 TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU 2.1 Tổng quan về đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Tổng quan về lợn Nậm Khiếu

- Đặc điểm ngoại hình

Lợn Nậm Khiếu toàn thân được bao phủ bởi những lông ngắn, cứng giống tóc rễ tre, thường có màu hung và màu đen Đầu và chiều dài cơ thể lợn trưởng thành khoảng 90 – 180 cm, chiều dài đuôi khoảng 30 cm, chiều cao của vai khoảng

55 – 110 cm

Hình 2.1: Hình ảnh lợn Nậm Khiếu được nuôi tại Chi nhánh nghiên cứu và phát

triển động thực vật bản địa – Thái Nguyên

- Thói quen ăn uống

Lợn Nậm Khiếu là loài ăn tạp và đôi khi ăn bừa bãi Ngoài thức ăn tinh như ngô, gạo chúng còn có khả năng ăn lượng lớn thức ăn xanh như các loại rau, củ, rễ cây

- Tập tính sinh sản

Lợn Nậm Khiếu cái đẻ nhiều lứa trong năm Số lượng con mỗi lần sinh từ 5

-8 con/lứa Thời gian mang thai là 113 ngày Thời gian để lợn con trưởng thành trung bình 7 tháng

Tuổi được coi là trưởng thành về mặt sinh dục có thể giao phối ở con cái là 8 – 10 tháng, trung bình là 9 tháng Ở con đực tuổi trưởng thành về mặt sinh dục có thể giao phối là 8 – 10 tháng, trung bình là 9 tháng

- Đặc điểm sinh trưởng, phát dục của lợn Nậm Khiếu

Lợn Nậm Khiếu sinh trưởng chậm, khối lượng sơ sinh 0,4 - 0,6 kg, khối lượng lúc 2 tháng tuổi khoảng 10 – 12 kg và đạt kích thước tối đa khoảng 50 – 60

kg lúc 12 tháng tuổi

2.1.2 Gen Prolactin receptor – PRLR

2.1.2.1 Nguồn gốc và cấu tạo

Prolactin còn gọi là LTH (Luteotropic hormone) Ở người và các loài động vật hữu nhũ prolactin được tổng hợp và phân tiết ở tế bào qua acid của tuyến não

thùy Nó là một polypeptide gồm mười chín cấu tử amino acid và trọng lượng phân

tử khoảng 23000 Da [14]

2.1.2.2 Chức năng của Prolactin

Prolactin có tác động sinh học lên sự phát triển của tuyến vú, sự tiết sữa của người và thú cái trong thời gian mang thai và nuôi con Prolactin được phân tiết từ

các tế bào qua acid của tuyến não thùy theo máu di chuyển đến cơ quan đích, ở đây

xảy ra sự tiếp nhận prolactin Sự tiếp nhận này được quyết định bởi các thụ thể có tại các cơ quan đích Sự xuất hiện của thụ thể prolactin chịu kiểm soát chủ yếu bởi

yếu tố di truyền

2.1.2.3 Gen thụ thể Prolactin

Theo các nghiên cứu của Drogemuler (2001) nếu trên các cá thể lợn có

sự xuất hiện của gen thụ thể prolactin thì số con trên ổ đẻ nhiều, tỷ lệ sống sót

của các lợn con cao Đặc biệt, trọng lượng lợn con sinh ra vẫn duy trì ở mức

bình thường không có chênh lệch đáng kể so với các ổ đẻ có số con ít [16] Ngoài ra, các nhà nghiên cứu cũng thấy các cá thể lợn con có sự hiện diện của

gen thụ thể prolactin có trọng lượng tăng trên ngày cao hơn các cá thể không

có sự hiện diện của gen này

Gen thụ thể PRLR định vị trên nhiễm sắc thể số 16 và có 2 alen là A và B tạo

ra các kiểu gen AA, AB và BB Trong 3 kiểu gen này thì trên các giống lợn Large White, Meishan, Landrace kiểu gen AA có năng suất sinh sản cao hơn, kích thước lợn con sinh ra đồng đều và số con trên ổ đẻ nhiều hơn kiểu gen AB, BB

2.1.2.3.1 Trình tự gen PRLR

Trình tự gen PRLR được công bố trên ngân hàng gen (GenBank accession: U96306) Trình tự gen PRLR được thể hiện dưới hình sau:

Hình 2.2: Trình tự đoạn gen PRLR (GenBank accession: U96306)

2.1.2.3.2 Các kiểu gen trong phân tích đa hình đoạn PRLR bằng enzyme AluI

Phân tích đa hình đoạn gen PRLR bằng enzyme AluI thu được các dạng alen

tương ứng như sau:

Alen A: 85 bp – 59 bp – 19 bp

Alen B: 104 bp – 59 bp

Từ đó ta có các kiểu gen tương ứng như sau:

- Kiểu gen AA: Những cá thể mang kiểu gen AA là những cá thể đồng hợp

tử cắt về gen PRLR Khi điện di trên gel agarose sẽ thu được 3 băng

tương ứng với các kích thước 85 bp – 59 bp – 19 bp

- Kiểu gen AB: Những cá thể mang kiểu gen AB là những cá thể dị hợp tử Khi điện di trên gel agarose sẽ thu được 4 băng tương ứng với các kích thước 104 bp – 85 bp – 59 bp – 19 bp

- Kiểu gen BB: Những các thể mang kiểu gen BB là những cá thể đồng

hợp tử cắt về gen PRLR Khi điện di trên gel agarose sẽ thu được 3 băng

tương ứng với các kích thước 104 bp – 59 bp

Sơ đồ mô phỏng 2 alen A và B được thể hiện ở hình 2.3

a) Alen A

b) Alen B

Hình 2.3: Kích thước các alen có trong kiểu gen PRLR của lợn

Sơ đồ mô phỏng 3 kiểu gen AA, AB, BB tương ứng được thể hiện ở hình 2.4 dưới đây:

c) Kiểu gen AA (85 bp, 19 bp và 59 bp)

d) Kiểu gen AB (104 bp, 85 bp, 59 bp và 19 bp)

e) Kiểu gen BB (104 bp và 59 bp)

Hình 2.4: Kích thước các đoạn DNA dự kiến thu được khi phân tích đa hình

đoạn gen PRLR bằng enzyme AluI

2.1.2.3.3 Vị trí cắt đa hình của enzyme AluI trên gen PRLR

Sử dụng phần mềm vector NTI mô phỏng đoạn gen PRLR đƣợc cắt bởi enzyme AluI

Hình 2.5: Hình ảnh mô phỏng vị trí cắt đa hình của enzyme AluI

trên đoạn gen PRLR

Hình 2.6: Đoạn gen PRLR nghiên cứu, vị trí cắt của enzyme AluI

Chú ý:

- (1) Trình tự màu tím là vị trí cắt của enzyme AluI

- (2) Hai trình tự màu đỏ là hai vị trí bám của mồi xuôi và mồi ngược trong

phản ứng PCR nhân đoạn gen PRLR (163 bp)

Hình 2.5 và hình 2.6 cho thấy phân đoạn gen PRLR (449 bp) có chứa 5 vị trí cắt của enzyme AluI Trong đó đoạn gen kích thước 163 bp nghiên cứu có chứa 2 vị

trí cắt tại nucleotide số 184 và 203 tạo ra 3 băng có kích thước 59 bp, 19 bp và 85

bp tương ứng với kiểu alen A Và tại vị trí 203, ở đó bazơ G có thể sẽ bị thay thế

bằng nucleotide khác làm thay đổi trình tự nhận biết của enzyme AluI nên đoạn gen PRLR chỉ bị cắt tại vị trí 183, và sản phẩm cắt đoạn gen PRLR sẽ gồm các đoạn DNA

có kích thước phân tử là 104 bp và 59b bp tương đương với kiểu alen B

2.1.3 Gen Estrogen receptor – ESR

2.1.3.2 Chức năng của Estrogen

- Kích thích sự phát triển của tuyến vú, làm phát triển hệ thống dẫn sữa và tích mỡ ở tuyến vú

- Làm phát triển nội mạc của ống dẫn trứng, tăng tế bào tiêm mao của ống dẫn trứng cũng như hoạt động của chúng để đẩy phôi vào tử cung

- Kích thích sự tăng trưởng của các tuyến nội mạc tử cung để nuôi phôi

2.1.3.3 Gen thụ thể Estrogen receptor – ESR

Gen thụ thể ESR có ảnh hưởng quan trọng đến sự thụ tinh ở thú cái được

Rothschild và cs (năm 1991) phát hiện như một dấu hiệu di truyền quan trọng việc

tăng năng suất của lợn nái [21] Gen ESR có 2 alen D và E nằm trên nhiễm sắc thể

số 1, và tạo 3 kiểu gen DD, DE và EE Một vài nghiên cứu cho thấy alen E làm tăng chiều dài tử cung, số bào thai trên mỗi sừng và trọng lượng trung bình của mỗi thai

Do đó ảnh hưởng của alen E làm gia tăng hiệu quả và năng suất sinh sản

2.1.3.3.1 Trình tự gen ESR

Trình tự gen ESR được công bố trên ngân hàng gen (GenBank accession: HF947274) Trình tự gen ESR được thể hiện dưới hình sau:

Hình 2.7: Trình tự đoạn gen ESR (GenBank accession: HF947274)

2.1.3.3.2 Các kiểu gen trong phân tích đa hình đoạn ESR bằng enzyme PvuII

Phân tích đa hình đoạn gen ESR bằng enzyme PvuII thu được các dạng alen

tương ứng như sau:

Alen D: 120 bp

Alen E: 65 bp – 55 bp

Từ đó ta có các kiểu gen tương ứng như sau:

- Kiểu gen DD: Những cá thể mang kiểu gen DD là những cá thể đồng hợp

tử cắt về gen ESR Khi điện di trên gel agarose sẽ thu được 1 băng tương

ứng với kích thước 120 bp

- Kiểu gen DE: Những cá thể mang kiểu gen DE là những cá thể dị hợp tử Khi điện di trên gel agarose sẽ thu được 3 băng tương ứng với các kích thước 120 bp – 65 bp – 55 bp

- Kiểu gen EE: Những các thể mang kiểu gen EE là những cá thể đồng hợp

tử cắt về gen ESR Khi điện di trên gel agarose sẽ thu được 2 băng tương

ứng với các kích thước 65 bp – 55 bp

Sơ đồ mô phỏng 2 alen D và E được thể hiện ở hình 2.8

Alen D

Alen E

Hình 2.8: Kích thước các alen có trong kiểu gen ESR của lợn

Sơ đồ mô phỏng 3 kiểu gen DD, DE, EE tương ứng được thể hiện ở hình 2.9:

i Kiểu gen DD (120 bp)

ii Kiểu gen DE (120 bp, 65 bp và 55 bp)

iii Kiểu gen EE (65 bp và 55 bp)

Hình 2.9: Kích thước các đoạn DNA dự kiến thu được khi phân tích đa hình

đoạn gen ESR bằng enzyme PvuII

2.1.3.3.3 Vị trí cắt đa hình của enzyme PvuII trên gen ESR

Sử dụng phần mềm vector NTI mô phỏng đoạn gen ESR đƣợc cắt bởi enzyme PvuII:

Hình 2.10: Hình ảnh mô phỏng vị trí cắt đa hình của enzyme PvuII trên đoạn

gen ESR

Hình 2.11: Đoạn gen ESR nghiên cứu và vị trí cắt của enzyme PvuII

Hình 2.10 và hình 2.11 cho thấy phân đoạn gen ESR (121 bp) có chứa 1 vị trí cắt của enzyme PvuII tại vị trí nucleotide 66 Vị trí cắt tạo ra 2 băng 65 bp và 55 bp

tương ứng với kiểu alen E Và tại vị trí 66, ở đó bazơ G có thể sẽ bị thay thế bằng

nucleotide khác làm thay đổi trình tự nhận biết của enzyme PvuII nên đoạn gen ESR

không bị cắt tại vị trí nào giữ nguyên băng với kích thước 120 bp tương ứng với kiểu alen D

2.2 Cơ sở lý luận của đề tài

2.2.1 Năng suất sinh sản và các chỉ tiêu liên quan đến năng suất sinh sản

Năng suất sinh sản được coi như là một trong những chỉ tiêu quan trọng nhất trong đánh giá giá trị kinh tế của vật nuôi Để đánh giá năng suất sinh sản của lợn nái, từ xưa những nhà chọn giống đã đưa ra các chỉ tiêu theo dõi nhằm tìm ra được lợn nái có năng suất sinh sản tốt nhất và được phân làm 3 nhóm: số lượng con, khối lượng lợn con và thời gian Tuy nhiên, các nhóm chỉ tiêu này có mối tương quan nhất định với nhau Vì vậy, trong chọn giống lợn các nhà di truyền chọn giống chỉ quan tâm tới một số tính trạng năng suất nhất định mà theo họ là các chỉ tiêu có tầm quan trọng kinh tế trong chăn nuôi lợn nái sinh sản

Từ năm 1980, Legault cho rằng trong các chỉ tiêu đánh giá đến năng suất sinh sản của lợn nái thì chỉ tiêu số lợn con cai sữa do một nái sản xuất là chỉ tiêu tổng hợp và đúng đắn nhất [17] Số lợn con cai sữa do một lợn nái s ản xuất trong một năm phụ thuô ̣c vào s ố trứng rụng, tỉ lệ lợn con sống lúc sơ sinh và tỉ lệ lợn con sống tới lúc cai sữa [15] Mabry và cs (1996) cho rằng, các tính trạng năng suất sinh sản chủ yếu của lợn nái bao gồm: số con sơ sinh sống, số con cai sữa, khối lượng 21 ngày/ổ và số lứa đẻ/nái/năm Từ đó có thể thấy việc nâng cao năng suất số con sơ

sinh sống và số con cai sữa của một nái góp phần to lớn trong việc tăng trưởng kinh

tế của người chăn nuôi

- Một số chỉ tiêu về số lượng như: Số con sơ sinh còn sống đến 24h/lứa đẻ, bình quân số lợn con đẻ ra còn sống/lứa, tỷ lệ sống, số con cai sữa/ lứa, khoảng cách lứa đẻ

- Một số chỉ tiêu về chất lượng như: Khối lượng con sơ sinh, độ đồng đều về khối lượng, khối lượng cai sữa toàn ổ

2.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến năng suất sinh sản

2.2.2.1 Ảnh hưởng của yếu tố di truyền

- Cuối cùng là nhóm giống “nguyên sản” hay các giống “bản địa” có năng suất sinh sản cũng như năng suất thịt thấp nhưng nó có khả năng thích nghi tốt với môi trường riêng của chúng Các giống bản địa thường có khả năng sinh sản kém hơn các giống, dòng chuyên hóa do chúng chưa được chọn lọc và quản lý tốt và thường bị cận huyết cao, nhưng các giống lợn này lại có khả năng thích nghi tốt với điều kiện môi trường sống không thuận lợi

Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra các cá thể lợn mang các chỉ thị gen liên quan đến

tính trạng sinh sản của lợn như: Prolactin receptor (liên quan đến khả năng sống sót của lợn con), Estrogen receptor (liên quan đến kích cỡ lứa đẻ), Adiponectin (Gen

này phát hiện thấy sự chuyển hóa lipid và glucose và điều chỉnh chức năng nhau

thai), Leptin (điều tiết sinh sản ở lợn), Paternal expression gen 1 (có ảnh hưởng đến

sự phát triển của phôi), Osteopontin (Tỷ lệ rụng trứng và chiều dài dạ con) …

2.2.2.2 Ảnh hưởng của ngoại cảnh

- Dinh dưỡng là một yếu tố có ảnh hưởng rất lớn đến năng suất sinh sản của lợn nái, nó tạo động lực để lợn nái có thành tích sinh sản tốt hơn Năng suất sinh sản của lợn nái sẽ giảm khi chúng ăn những loại thức ăn thiếu protein, vitamin, khoáng chất, hoặc thức ăn bị thối mốc

- Chuồng trại: Cũng là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến năng suất sinh sản của lợn nái Chuồng trại luôn sạch sẽ, thoáng mát, khí hậu phù hợp sẽ giúp lợn hạn chế bị mắc bệnh, phát triển khỏe mạnh, mau lớn hơn

- Bệnh tật: như các bệnh truyền nhiễm, viêm đường sinh dục đều có thể dẫn đến sảy thai, chết thai dẫn đến năng suất sinh sản giảm

2.2.3 Một số phương pháp sử dụng trong nghiên cứu gen lợn và ứng dụng

Một số phương pháp nghiên cứu gen hiện nay:

Các chỉ thị di truyền được sử dụng trong chọn giống lợn thường có liên quan đến các tính trạng năng suất, chất lượng thịt, sinh sản, khả năng kháng bệnh… Vì vậy nghiên cứu đa hình gen của vật nuôi và xác định các chỉ thị có liên quan đến

tính trạng sinh sản nhằm hỗ trợ cho công tác chọn giống rất có ý cả trong khoa học lẫn thực tiễn

Sử dụng các phương pháp phân tích đa hình có thể xác định các chỉ thị di truyền ở mức độ sinh hoá như: Sự đa hình nhóm máu, đa hình protein/enzyme, hệ thống kháng nguyên, phân tích đa hình bằng enzyme giới hạn (RFLP) với DNA nhân hoặc DNA ty thể, khuếch đại ngẫu nhiên đa hình DNA (RAPD), khuếch đại

đa hình chiều dài các đoạn gen nhân có chọn lọc (AFLP), đa hình các trình tự lặp lại đơn giản: minisatellites, microsatellie (MS), SNP - đa hình nucleotide đơn…)

- Phương pháp phân tích đa hình các đoạn cắt bằng enzyme giới hạn (Polymerase Chain Reaction – Restriction Fragment Lenghth Polymorphism= PCR-RFLP) Nguyên lý của phương pháp này là nhờ PCR (Polymerase Chain Reaction)

để khuếch đại đoạn gen cần nghiên cứu bằng các đoạn mồi đặc hiệu, sau đó dùng enzyme giới hạn để cắt đoạn từ đó xác định sự có mặt hay không của điểm đột biến tương ứng với sự có mặt hay không của các alen Trong các nghiên cứu đa hình di truyền gen lợn, phương pháp RFLP được sử dụng phổ biến nhất và có nhiều thành tựu đáng kể

- Phương pháp phân tích đa hình chiều dài các đoạn DNA được khuếch đại (Amplified Fragment Lenghth Polymorphisms = AFLP) Phương pháp này là kỹ thuật kết hợp giữa RFLP và PCR AFLP sử dụng đồng thời hai enzyme cắt giới hạn cắt DNA bộ gen tạo ra đầu so le, sau đó gắn với các adapter oligonucleotide có trình

tự được thiết kế dựa trên trình tự nhận biết của enzyme cắt giới hạn các đoạn cắt được dùng làm khuôn cho phản ứng PCR

Việc phát triển các chỉ thị di truyền phân tử nói chung đều đòi hỏi trình độ kỹ thuật cao song có nhiều những ưu điểm: Nó cho phép sử dụng nguồn gen mà không làm ảnh hưởng đến sự điều hoà và biểu hiện tự nhiên của gen; chỉ cần một lượng rất nhỏ chứa ít vật liệu di truyền vẫn có thể cho kết quả nhanh và chính xác

2.3 Cơ sở khoa học của đề tài

2.3.1 Khái niệm đa hình gen

Tính đa hình của gen do alen quyết định, gen có nhiều alen thì tính đa hình càng cao [2] Gregor Mendel (1856) định nghĩa alen như sau: “Alen là các dạng khác nhau của một gen cùng qui định một tính trạng” Từ năm 1925 trở đi, sau khi Morgan thành công trong việc lập bản đồ di truyền của ruồi giấm, thì alen được định nghĩa lại như sau: “Alen là các dạng khác nhau của cùng một gen định vị trên một locus của cùng một nhiễm sắc thể cùng qui định một tính trạng nào đó ở cơ thể sinh vật”

Sự đa hình DNA là những biến đổi trong trình tự DNA của một cá thể, sự biến đổi đó có thể, hay không thể ảnh hưởng lên kiểu hình Sự biến đổi này thường được phát hiện qua nhiều phương pháp sinh học phân tử khác nhau Những biến đổi được phát hiện có ảnh hưởng lên kiểu hình được xem như một marker đặc hiệu cho biến đổi đó Điều đó có nghĩa là nếu một cá thể có cùng sự đa hình đó, có thể sẽ biểu hiện một vài đặc điểm tương tự khác

2.3.2 Phương pháp tách chiết DNA

Ở động vật, DNA được tách chiết từ da, cơ vân, mô mỡ và từ máu Quy trình gồm 4 bước cơ bản sau:

Bước 1: Phá vỡ màng tế bào và màng nhân (tế bào Eukaryote) Thông

thường tế bào, mô được nghiền trong một hỗn hợp chất tẩy (SDS, Sarcosyl) và proteaza K Khi đó màng tế bào, màng nhân sẽ bị phá vỡ và giải phóng DNA ra môi trường và phân hủy các protein liên kết với DNA

Bước 2: Loại bỏ các thành phần không mong muốn trong mẫu, chủ yếu là các protein, mẫu được lắc mạnh trong một dung dịch phenol và chloroform, dung dịch này có tác dụng làm biến tính protein đồng thời không hòa tan DNA, sau khi li tâm sẽ tủa thành lớp nằm giữa pha nước và pha phenol/chloroform Pha nước có chứa DNA được thu nhận lại

Bước 3: Tủa DNA, mục đích của việc kết tủa là nhằm thu nhận DNA dưới dạng cô đặc, một phần nhằm bảo vệ chúng ra khỏi sự phân hủy các enzyme, mặt khác có thể hòa tan chúng lại trong dung dịch theo nồng độ mong muốn Có thể tủa DNA trong ethanol (2,5 dung tích ethanol/1 dung tích mẫu), môi trường có nồng độ muối cao, nhiệt độ thấp, tuy nhiên cũng có thể tủa trong isopropanol (1 thể tích isopropanol/1 thể tích mẫu), không cần muối Sau khi thu nhận DNA, cặn tủa cần phải rửa trong ethanol 70% để loại bỏ muối hoặc isopropanol dính vào

Bước 4: Hòa tan DNA, kết tủa DNA sau khi rửa bằng cồn và để khô tự nhiên được hòa tan trong TE hoặc nước cất để bảo quản DNA phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo

2.3.3 Kỹ thuật PCR

Phương pháp PCR do Kary Mullis và cộng sự phát minh vào năm 1985 Phương pháp PCR cho phép khuếch đại, tạo ra số lượng bản sao rất lớn của gen trong một thời gian ngắn Phản ứng PCR dựa trên cơ sở tính chất biến tính, hồi tính của ADN

và nguyên lý tổng hợp ADN Trên cơ sở trình tự của đoạn ADN khuôn, đoạn mồi, các nucleotide tự do và enzyme ADN polymerase có thể tổng hợp được đoạn ADN đích mong muốn [10]

Mỗi chu kỳ gồm 3 bước trên được lập lại nhiều lần [4]

2.3.4 Kỹ thuật PCR – RFLP

2.3.4.1 Nguyên tắc

Phương pháp PCR – RFLP: là phương pháp nghiên cứu đa hình chiều dài các đoạn DNA cắt bởi các enzyme giới hạn Kỹ thuật này dựa trên đặc điểm của các loại enzyme khác nhau, tạo ra các đoạn cắt DNA khác nhau phân biệt bằng điện di

đồ Như vậy quá trình thực hiện kỹ thuật PCR – RFLP gồm các giai đoạn sau:

 Tiến hành phản ứng PCR với cặp primer thích hợp để phân lập đoạn DNA cần phân tích sự đa hình

 Tiến hành phân cắt đoạn DNA này với một enzyme cắt thích hợp

 Chạy điện di xác định sự khác nhau của các băng DNA và đưa ra kết luận

Kỹ thuật PCR-RFLP có thể phát hiện một số thay đổi trong trình tự nucleotide liên quan đến vị trí nhận biết của enzyme giới hạn, phương pháp này hiện nay được ưa thích và sử dụng phổ biến trong nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới do tính đơn giản và chi phí thấp, có khả năng tiến hành phân tích đồng thời với số lượng mẫu lớn, thời gian cho kết quả nhanh [25]

2.3.4.2 Ứng dụng

Trong chọn giống thực vật có thể sử dụng kỹ thuật RFLP để chọn lọc trực tiếp các gen lặn mong muốn, không cần phân tích qua nhiều thế hệ [31] Mặt khác đối với các đặc điểm do nhiều gen kiểm soát, hoặc có sự liên kết giữa các gen, sử dụng kỹ thuật RFLP để xác định quan hệ giữa các gen đó Đây là một kỹ thụât có thể xác định sự phân li di truyền của một số tính trạng theo qui luật Mendel

Trong chọn giống động vật, đây là một kỹ thuật hữu hiệu để xác định những con giống có đặc điểm di truyền tốt như những gen liên quan đến sinh sản, liên quan đến ngoại hình, liên quan đến phẩm chất thịt, sữa,…

2.4 Tổng quan tình hình trong nước và trên thế giới

2.4.1 Tổng quan tình hình nghiên cứu trên thế giới

Short và cs (1997) nghiên cứu ảnh hưởng của các locut gen ESR đến tính

trạng sinh sản và sản xuất của các dòng lợn thương phẩm cho biết có mối liên quan

của tổng số con sơ sinh sống với các alen có lợi của gen ESR [27]

Baskin L.C và D.Pomp (1997) đã tiến hành phân tích đa hình gen GHRH ở lợn sử dụng enzyme hạn chế AluI Kết quả thu được sản phẩm PCR dài 455 bp với

2 alen được xác định: A (250 bp, 100 bp) và B (230 bp, 100 bp) tương ứng với 3 kiểu gen AA, AB và BB [20]

C Drogemuller và cs (2001) đã tiến hành nghiên cứu gen thụ thể Prolactin

trên đối tượng lợn Landrace bằng phương pháp PCR – RFLP với enzyme cắt hạn

chế được sử dụng là ALuI khi nhân đoạn gen với cặp mồi đặc hiệu và tìm được đoạn gen PRLR có kích thước 163bp Tác giả đã xác định được mối tương quan giữa gen PRLR với đặc điểm sinh sản của lợn đặc biệt là tác động phụ rất quan trọng của alen

B đến số con sinh ra còn sống sót Alen B có tác dụng làm tăng số con/lứa đẻ [16]

Trong nghiên cứu của Xu N Y và cs (2003) đã ứng dụng phương pháp PCR

- RFLP để phân tích sự phân bố của gen PRLR trong ba dòng của lợn Jinhua Tác

động của PRLR với tính trạng sinh sản trên các giống lợn này được tính toán bằng

phần mềm SPSS Tần số kiểu gen AA, AB, BB của gen PRLR ở các dòng Jinhua I,

II và III lần lượt là: 0,2560; 0,3929; 0,3512; 0,2000; 0,2667; 0,5333 và 0,1273; 0,4909; 0,3818 và tần số tương đối của alen A và B ở các dòng Jinhua I, II và III lần lượt là: 0,45; 0,55; 0,33; 0,67 và 0,37; 0,63 Tuy nhiên họ đã không thấy có sự kết

hợp đáng kể nào giữa locus PRLR với tính trạng sinh sản của lợn Jinhua đồng thời cũng không thấy có sự tương tác giữa ESR và PRLR đến số lợn con sinh ra còn sống

sót và toàn bộ số lượng của lợn con được sinh ra (p < 0,05) và trọng lượng con lúc

sơ sinh (p< 0,01) [22]

B T.Van Rens (2003) cũng đã nghiên cứu sự tác động giữa kiểu gen PRLR

của các con lợn nái khác nhau với kích cỡ lứa đẻ Thí nghiệm được tiến hành trên

77 con lợn nái thuộc các giống khác nhau đã xác định được tần số tương đối của các alen A = 0,57 và alen B = 0,43 tương ứng với tần số tương đối của các kiểu gen

AA: AB: BB là 0,47: 0,19: 0,34 Kiểu gen PRLR có tác động đến tiềm năng của lứa

đẻ của các con lợn cái con thông qua ảnh hưởng đến số lượng núm vú; đồng thời nó cũng ảnh hưởng đến số con sống sót/ lứa đẻ thông qua ảnh hưởng đến trọng lượng lợn con lúc sơ sinh, tốc độ tăng trưởng của lợn con trước lúc cai sữa [30]

Nghiên cứu của Terman A (2005) tập trung chủ yếu vào việc phát hiện các

đột biến DNA để từ đó xác định mối tương quan giữa kiểu gen PRLR và kích cỡ lứa

đẻ của các con lợn nái Ba Lan (Large White x Landrace) Nhằm xác định các tính trạng sinh sản: tổng số lợn con được sinh ra (TNB), số lợn con sinh ra còn sống

(NBA) và số lợn con cai sữa Sự đa hình của gen PRLR cũng được phân tích bằng

phương pháp PCR - RFLP với các đoạn mồi đặc hiệu và enzyme cắt hạn chế là

AluI Tần số xuất hiện hai alen của gen PRLR là alen A=0,62 và allele B=0,38 [26]

Theo nghiên cứu của Marek Kmiec và Arkadiusz Terman (2006) nghiên cứu tập trung theo dõi 229 con lợn đực thuộc các nguồn gốc khác nhau thuộc nhiều vùng địa lý khác nhau bằng cách thu nhận tinh dịch từ các con lợn đực đem thụ tinh cho các con lợn nái với cùng một điều kiện chăm sóc DNA hệ gen được thu nhận

một cách tinh khiết từ máu Kiểu gen PRLR đã được xác định nhờ phương pháp PCR - RFLP Đa hình gen PRLR được nghiên cứu và phát hiện nhờ enzyme cắt hạn chế AluI Tần số tương đối của alen A ở các con lợn đực trong các nghiên cứu trên

là lớn hơn nhiều so với alen B trong đó đặc biệt ở giống Hampshire x Pietrain tần số tương đối của alen A lên tới 83% trong khi alen B chỉ có 17% Tần số tương đối của các alen A ở các con lợn đực là lớn hơn so với các con lợn nái [19]

2.4.2 Tổng quan tình hình nghiên cứu trong nước

Nguyễn Văn Hậu và cs (2000) đã tiến hành giải trình tự đoạn gen hormone sinh

trưởng GH (từ nucleotide 381 đến nucleotide 802) trên 3 giống lợn nội Việt Nam (Lợn Ỉ, Móng Cái và lợn H’.Mông) Kết quả phân tích cho thấy đoạn gen GH có độ lớn 422 bp

trong vùng exon 2 và phân tích trình tự đã phát hiện được các điểm đột biến tại vị trí 507,