Khảo sát tình hình kháng thuốc của một số vi khuẩn gây nhiễm trùng tại bệnh viện đa khoa trung ương thái nguyên

Vì vậy, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài“Khảo sát tình hình kháng thuốc của một số vi khuẩn gây nhiễm trùng tại Bệnh viện Đa khoa Trung Ương Thái Nguyên”... - Đánh giá đƣợc tình hình

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo : Chính quy

Chuyên ngành : Công nghệ sinh học

Khoa : CNSH - CNTP

Khóa học : 2013- 2017

Thái Nguyên, năm 2017

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ sinh học

Khoá học : 2013 - 2017 Giảng viên hướng dẫn : 1 TS Nguyễn Văn Duy

: 2 BS.Nguyễn Thị Huyền

Thái Nguyên, 2017

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình học tập và hoàn thành báo cáo thực tập này, em đã nhận được sự hướng dẫn, giúp đỡ tận tình của các thầy cô, các anh chị, các em và các bạn

Em xin cảm ơn TS Nguyễn Văn Duy, thầy đã định hướng và tận tình hướng dẫn cho em những kiến thức chuyên môn để em hoàn thành tốt báo cáo thực tập này

Em xin gửi lời cảm ơn đến Bs Nguyễn Thị Huyền, cô đã hết lòng giúp

đỡ, dạy bảo, động viên và tạo điều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trình thực tập và hoàn thành bài báo cáo này

Em xin cảm ơn các thầy cô, các anh chị trong Khoa Công Nghệ Sinh Học trường Đại học Nông Lâm - Đại học Thái Nguyên đã chỉ dạy, truyền đạt

và chia sẻ cho em những kiến thức vô cùng bổ ích, tạo mọi điều kiện tốt cho

em trong suốt quá trình học tâp tại trường

Em xin gửi lời cảm ơn cô và các anh chị trong Khoa Vi sinh - Bệnh viện Đa Khoa Trung Ương Thái Nguyên, đã trực tiếp hướng dẫn các kiến thức, kỹ thuật chuyên môn và tận tình giúp đỡ em trong thời gian thực tập và thu thập số liệu tại khoa để em có thể hoàn thành đề tài này

Lời cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình: con xin cảm

ơn ba mẹ và các em đã luôn bên cạnh con ủng hộ, động viên, nâng đỡ con những lúc con khó khăn và luôn tạo mọi điều kiện tốt nhất cho con trong cả quá trình học tập

Một lần nữa xin chân thành cảm ơn tất cả sựgiúp đỡ quý báu đó!

Thái Nguyên, tháng 5 năm 2017

Sinh viên

Nông Minh Ngọc

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Tên thuật ngữ viết tắt Nghĩa đầy đủ của thuật ngữ

ANSORD

Asian Network for Surveillance of ResistantPathogens

(Mạng lưới giám sát các căn nguyên kháng thuốc Châu Á)

CDC Center for Control and Prevention (Trung Tâm Kiểm Soát

và Phòng Bệnh Hoa Kỳ) CLSI Clinnical and Laboratory standards Institude (Viện Tiêu

Chuẩn và Xét Nghiệm) ESBL Extender Spectrum β-lactamase (enzyme β - lactamase

phổ rộng)

I Intermediate (Trung gian)

MRSA Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (tụ cầu kháng

Methicillin) NTBV Nhiễm trùng bệnh viện

PCR Polymerase Chain Reaction (Phương pháp khuếch đại

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng2.1:Đườngkínhkhoanhkhángsinhtheotiêuchuẩncủa CLSI2015-2016 22 Bảng 4.1: Tỷ lệ các loại vi khuẩn gây nhiễm trùng trên các bệnh nhân điều trị tại Bệnh viện Đa khoa Trung Ương Thái Nguyên 35 Bảng 4.2: Tỷ lệ bệnh nhân nhiễm trùng bệnh viện theo lứa tuổi 37 Bảng 4.3: Tỷ lệ vi khuẩn gây nhiễm trùng bệnh viện tại Bệnh viện Đa khoa Trung ương Thái Nguyên theo từng tháng từ tháng 12/2016 – 05/2017 39

Bảng 4.4: Tỷ lệ kháng thuốc kháng sinh của E coli tại Bệnh viện Đa khoa

Trung ương Thái Nguyên từ 12/2016 đến 5/2017 40

Bảng 4.5: Tỷ lệ kháng thuốc kháng sinh của S pneumoniae tại Bệnh viện Đa

khoa Trung ương Thái Nguyên từ 12/2016 đến 5/2017 43

Bảng 4.6: Tỷ lệ kháng thuốc kháng sinh của S aureus tại Bệnh viện Đa khoa

Trung ương Thái Nguyên từ 12/2016 đến 5/2017 46

Bảng 4.7: Tỷ lệ kháng thuốc kháng sinh của P aeruginosa tại Bệnh viện Đa

khoa Trung ương Thái Nguyên từ 12/2016 đến 5/2017 49

Bảng 4.8: Tỷ lệ kháng thuốc kháng sinh của K pneumoniae tại Bệnh viện Đa

khoa Trung ương Thái Nguyên từ 12/2016đến 5/2017 52

Bảng 4.9: Tỷ lệ kháng thuốc kháng sinh của A baumannii tại Bệnh viện Đa

khoa Trung ương Thái Nguyên từ 12/2016 đến 5/2017 54

Bảng 4.10: Tỷ lệ kháng thuốc kháng sinh của P mirabilis tại Bệnh viện Đa

khoa Trung ương Thái Nguyên từ 12/2016 đến 5/2017 56

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 3.1: Chaichứamôitrườngdinhdưỡngđểnuôicấyvisinhvậtnhiễm trùng trong máu của hãng BacT/ALERT,Đức 24 Hình3.2:Môi trường KIA 26

Hình 4.1: Kháng sinh đồ của vi khuẩnE coli chủng 16.21 phân lập được trên

bệnh nhân Trần Anh T ngày 22/12/2016 42

Hình 4.2: Kháng sinh đồ của vi khuẩn S pneumoniae chủng 5.26 phân lập

được trên bệnh nhân Nguyễn Văn Đ ngày 29/12/2016 45

Hình 4.3: Kháng sinh đồ của vi khuẩn S aureus chủng 10.21 phân lập được

trên bệnh nhân Nguyễn Thị H ngày 22/3/2017 48

Hình 4.4: Kháng sinh đồ của vi khuẩn P aeruginosa chủng 2.3 phân lập được

trên bệnh nhân Đinh Văn Đ ngày 4/3/2017 51

Hình 4.5: Kháng sinh đồ của vi khuẩn K pneumoniae chủng 1.24 phân lập

được trên bệnh nhân Nguyễn Thị T ngày 25/04/2017 53

Hình 4.6: Kháng sinh đồ của vi khuẩn A baumannii chủng 2.27 phân lập

được trên bệnh nhân Hà Văn H ngày 28/12/2016 55

Hình 4.7: Kháng sinh đồ của vi khuẩn Proteus chủng 3.3 phân lập được trên

bệnh nhân Bế Lăng T ngày 4/2/2017 57

MỤC LỤC

Phần 1 MỞ ĐẦU 1

1.1.Đặt vấn đề 1

1.3 Yêu cầu 2

1.4 Ý nghĩa của đề tài 3

1.4.1 Ý nghĩa khoa học 3

1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn 3

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

2.1.1 Khái niệm về nhiễm trùng bệnh viện 4

2.1.2 Hậu quả và đối tượng có nguy cơ bị nhiễm trùng bệnh viện 4

2.1.3 Vi khuẩn thường gặp trong nhiễm trùng bệnh viện 5

2.2 Tổng quan về đề kháng kháng sinh 7

2.2.1 Định nghĩa của kháng sinh 7

2.2.3 Sự đề kháng kháng sinh của vi khuẩn 10

2.2.4 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 14

2.3 Các phương pháp phát hiện vi khuẩn kháng thuốc 16

PHẦN 3 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

3.1 Đối tượng, vật liệu và phạm vi nghiên cứu 24

3.2 Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu 24

3.3 Dụng cụ, hóa chất và thiết bị sử dụng 24

3.4 Nội dung nghiên cứu 25

3.5 Phương pháp nghiên cứu 25

3.5.1 Phương pháp 1: Phân lập, xác định vi khuẩn và lưu giữ chủng 25

3.5.2 Phương pháp 2: Kháng sinh đồ 34

PHẦN 4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 35

4.1 Kết quả nghiên cứu tỷ lệ các loại vi khuẩn gây nhiễm trùng trên các bệnh

nhân điều trị tại Bệnh viện Đa khoa Trung Ương Thái Nguyên 35

4.2 Khảo sát tình hình kháng thuốc của một số loại vi khuẩn phân lập tại Bệnh việnĐakhoaTrungươngTháiNguyên 39

4.2.1 Tỷ lệ kháng kháng sinh của vi khuẩn Escherichiacoli 40

4.2.2 Tỷ lệ kháng kháng sinh của vi khuẩn Streptococcuspneumoniae 43

4.2.3 Tỷ lệ kháng kháng sinh của vi khuẩn Staphylococcusaureus 46

4.2.4.Tỷ lệ kháng kháng sinh của vi khuẩn Pseudomonasaeruginosa 49

4.2.5 Tỷ lệ kháng kháng sinh của vi khuẩn Klebsiellapneumonae 52

4.2.6 Tỷ lệ kháng kháng sinh của vi khuẩn Acinetobacter baumannii 54

4.2.7 Tỷ lệ kháng kháng sinh của vi khuẩn Proteus mirabilis………….… 58

PHẦN 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 58

5.1 Kếtluận 58

5.2 Kiếnnghị 59

TÀI LIỆU THAM KHẢO 611

Phần 1

MỞ ĐẦU 1.1.Đặt vấn đề

Nhiễm khuẩn bệnh viện (NKBV) là một trong những thách thức và mối quan tâm hàng đầu tại Việt Nam cũng như trên toàn thế giới Những nghiên cứu gần đây cho thấy NKBV làm tăng tỷ lệ tử vong, kéo dài thời gian nằm viện, tăng việc sử dụng kháng sinh, tăng đề kháng kháng sinh và tăng chi phí điều trị

Thống kê cho thấy tỷ lệ NKBV khoảng 5-10% ở các nước phát triển và

ở một số nước đang phát triển tỷ lệ này lên đến 25% [35] , NKBV cũng làm gia tăng tỷ lệ tử vong bệnh viện Tại Cộng đồng Châu Âu, tỷ lệ tử vong do nhiễm trùng bệnh viện là 37.000 ca/năm [39] , còn tại Mỹ tỷ lệ này lên tới 99.000 ca/năm [38] Các bệnh nguyên gây NKBV có mức độ đề kháng kháng sinh cao hơn với các bệnh nguyên gây nhiễm khuẩn cộng đồng đồng thời các NKBV có thời gian nằm viện trung bình dài hơn, từ 7-14 ngày Do đó, chi phí cho NKBV thường tăng gấp 2-4 lần so với các trường hợp không NKBV Chi phí phát sinh do NKBV tại Anh quốc là khoảng 1 tỷ đô-la[35] còn tại Mỹ là 28- 45 tỷ đô-la[38]

Sự ra đời của kháng sinh Penicillin đã đánh dấu cho kỷ nguyên phát triển của y học về điều trị nhiễm khuẩn và hàng loạt thuốc kháng sinh ra đời ngay sau đó đều phục vụ cho điều trị nhiễm trùng cho bệnh nhân Nên việc sử dụng thuốc kháng sinh trước, trong và sau khi phẫu thuật rất quan trọng có tác dụng đẩy lùi các vi khuẩn nhiễm trùng

Tuy nhiên, cùng với sự ra đời của thuốc kháng sinh thì việc sử dụng tự phát và lạm dụng thuốc quá mức dẫn đến một thực trạng là vi khuẩn kháng thuốc ngày càng gia tăng Nhất là ở những nơi sử dụng thuốc kháng sinh

nhiều và tập trung nhiều bệnh nhân nhƣ bệnh viện [15] Thực sự, các vi sinh vật kháng kháng sinh đang là mối đe dọa chung của toàn cầu

Một trong những biện pháp để kiểm soát và khống chế nhiễm trùng bệnh viện là chiến lƣợc sử dụng kháng sinh thích hợp và hiệu quả, bao gồm sử dụng kháng sinh dựa vào kinh nghiệm và liệu pháp xuống thang Việc lựa chọn đúng và dùng đúng thời điểm kháng sinh còn có tác dụng (kháng sinh còn nhạy) quyết định tới thành công của điều trị Tuy nhiên, mô hình vi khuẩn kháng kháng sinh thay đổi theo chính sách sử dụng kháng sinh của từng bệnh viện, từng khoa; thói quen sử dụng kháng sinh của các bác sỹ Do vậy các bệnh viện khác nhau sẽ có mô hình vi khuẩn kháng kháng sinh khác nhau, trong cùng bệnh viện các khoa khác nhau sẽ mô hình vi khuẩn kháng kháng sinh khác nhau Thậm chí trong cùng một khoa, mô hình vi khuẩn kháng kháng sinh cũng sẽ thay đổi theo thời gian

Bệnh viện Đa khoa Trung Ƣơng Thái Nguyên là một trong số bệnh viện lớn trong khu vực Phía Đông Bắc Việt Nam, tập trung nhiều bệnh nhân nặng

và là tuyến cuối của các bệnh viện cở sở trong khu vực nên là nơi nghi ngờ sẽ

có khả năng kháng thuốc cao NTBV không chỉ làm tăng thêm số ngày nằm viện, chi phí điều trị của bệnh nhân mà còn tăng nguy cơ đa kháng thuốc, nhất

là kháng sinh tăng tỷ lệ tử vong cho bệnh nhân Vì vậy, chúng tôi tiến hành

thực hiện đề tài“Khảo sát tình hình kháng thuốc của một số vi khuẩn gây nhiễm trùng tại Bệnh viện Đa khoa Trung Ương Thái Nguyên”

- Đánh giá đƣợc tình hình kháng kháng sinh của một số vi khuẩn gây nhiễm trùng bệnh viện phân lập đƣợc

1.4 Ý nghĩa của đề tài

1.4.1 Ý nghĩa khoa học

- Kết quả nghiên cứu của đề tài cung cấp nguồn tài liệu khoa học phục

vụ cho nghiên cứu và giảng dạy

- Đánh giá thực trạng vi khuẩn kháng thuốc ở Bệnh viện Đa khoa Trung ƣơng Thái Nguyên và cung cấp thông tin về tình hình nhiễm trùng ở bệnh viện và tình hình kháng thuốc kháng sinh của các vi khuẩn nhiễm trùng ở bệnh viện

- Kết quả khảo sát là nguồn tài liệu tham khảo cho các nghiên cứu thuộc cùng lĩnh vực liên quan

1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn

Xây dựng kháng sinh đồ cho từng bệnh nhân cụ thể giúp góp phần xây dựng chế độ hóa trị liệu liên quan cho bệnh nhân, hạn chế sự lây lan của các chủng vi khuẩn kháng thuốc ngoài cộng đồng

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan về nhiễm trùng bệnh viện

2.1.1 Khái niệm về nhiễm trùng bệnh viện

Nhiễm trùng là hiện tượng vi sinh vật gây bệnh xâm nhập vào mô (tế bào) của cơ thể vật chủ trong những hoàn cảnh nhất định [14]

Theo định nghĩa của Trung Tâm Kiểm Soát và Phòng Bệnh Hoa Kỳ

(Center for Control and Prevention - CDC) thì: “Nhiễm trùng bệnh viện là một loại nhiễm trùng tại chỗ hay toàn thân do phản ứng có mặt của tác nhân gậy bênh (hoặc độc tố của nó) mà nó chưa có mặt hoặc chưa được ủ bệnh lúc nhập viện”[45]

Những nhiễm trùng mắc phải ở bệnh viện nhưng biểu hiện lâm sàng sau khi người bệnh rời bệnh viện cùng là nhiễm trùng bệnh viện [19]

2.1.2 Hậu quả và đối tượng có nguy cơ bị nhiễm trùng bệnh viện

Nhiễm trùng bệnh viện gây ra nhiều hậu quả nghiêm trọng đối với cá nhân bệnh nhân cũng như cộng đồng vì nhiễm trùng bệnh viện không chỉ làm tăng số ngày nằm viện, chi phí điều trị mà còn tăng nguy cơ phát triển của các

vi khuẩn đa kháng thuốc làm tăng tỷ lệ tử vong cho bệnh nhân

Có nhiều đối tượng có nguy cơ bị nhiễm trùng bệnh viện nhưng riêng với bệnh nhân suy giảm miễn dịch vì các lý do sau: Bệnh nhân bị các bệnh của cơ quan miễn dịch, dùng các thuốc giảm miễn dịch như các thuốc điều trị ung thư, sau phẫu thuật, hoặc sau mắc một bệnh nặng, hoặc đang mắc một bệnh mạn tính, hoặc người có tuổi nằm điều trị ở bệnh viện lâu ngày, hoặc trẻ

em còi xương, suy dinh dưỡng, bị bệnh ỉa chảy kéo dài, những nhân viên bệnh viện thường xuyên tiếp xúc với vi sinh vật gây bệnh Trong khi cơ thể có sức đề kháng kém, tình trạng vệ sinh và bảo hộ lao động chưa được cải thiện [19]

Nhiễm trùng bệnh viện được chia ra thành nhiễm trùng nội sinh và nhiễm trùng ngoại sinh Nhiễm trùng nội sinh là loại nhiễm trùng do các vi sinh vật đã ký sinh sẵn ở người bệnh gây ra Chúng là những vi sinh vật gây bệnh cơ hội Nhiễm trùng ngoại sinh là loại nhiễm trùng do các vi sinh vật

xâm nhập vào bệnh nhân từ môi trường bên ngoài [19]

2.1.3 Vi khuẩn thường gặp trong nhiễm trùng bệnh viện

Mọi loài vi khuẩn đều có thể gây nhiễm trùng bệnh viện với tỷ lệ khác nhau nhưng đứng đầu là các vi khuẩn Gram Âm vì chúng có lớp màng ngoài được bọc bởi một nang, mà nang này che các kháng nguyên làm cơ thể phát hiện ra tác nhân xâm nhập khó khăn hơn Ngoài ra màng vi khuẩn có chứa lipopolysaccharide đóng vai trò là nội độc tố và làm tăng phản ứng viêm có thể gây sốc nhiễm khuẩn nên vi khuẩn Gram Âm gây bệnh nguy hiểm hơn Còn vi khuẩn Gram Dương chúng cũng gây nguy hiểm nhưng mức độ ít hơn

do cơ thể người không có peptidoglycan và có khả năng sản xuất enzyme lysozyme tấn công lớp Peptidoglycan của chúng

Các vi khuẩn Gram Âm có thể gây ra nhiễm trùng ở nhiều cơ quan như

hệ tiết niệu, hệ tuần hoàn hoặc ở các vết phẫu thuật Trong số các vi khuẩn

Gram Âm gây nhiễm trùng bệnh viện, phổ biến nhất là Escherichia coli,

Klebsiella, Enterobacter, Hemophilus…

Các vi khuẩn Gram Dương thường gặp nhất là: Staphylococcus aureus

và Streptococcus pneumoniae, Enterococcus… [19]

2.1.4 Tình hình nghiên cứu nhiễm trùng bệnh viên ở Việt Nam và trên Thế Giới

2.1.4.1 Tình hình nghiên cứu nhiễm trùng bệnh viện ở Việt Nam

Trong tình hình cả thế giới đều đang lo ngại và hướng đến các vi khuẩn gây nhiễm trùng bệnh viện kháng thuốc làm tăng nguy cơ tử vong, kéo theo nhiều hậu quả khác, đặc biệt ở các nước đang phát triển như Việt Nam, vấn đề

đó luôn được quan tâm hàng đầu Đã có rất nhiều bệnh viện tiến hành khảo

sát về tỷ lệ vi khuẩn gây nhiễm trùng bệnh viện trên cả nước gồm các bệnh viện lớn như: Bạch Mai, Bệnh viện Đa khoa Trung ương Huế, Thống Nhất…

và các bệnh viện cơ sở khác [12] Theo một báo cáo về tình hình kháng thuốc tại một số đơn vị điều trị tích cực trong cả nước, tỷ lệ vi khuẩn phân lập được

lần lượt là: Acinetobacter (24%), Klebsiella (20%) Theo nghiên cứu khác tại

37 bệnh viện các tỉnh phía Bắc trong năm 2006 - 2007, gồm 2 bệnh viện Trung ương, 17 bệnh viện tuyến tỉnh, 17 bệnh viện tuyến huyện cho thấy có 553/7571 (7,3%) bệnh nhân mắc bệnh nhiễm trùng bệnh viện có 3 loại chính

là viêm phổi 41,9%, nhiễm trùng vết mổ 27,5%, nhiễm trùng tiêu hóa 13,1%,

trong đó căn nguyên chính là Acinetobacter (23,3%), P aeruginosa (31,5%) [13]

Các loại vi khuẩn gây nhiễm trùng bệnh viện khác nhau là không giống nhau theo khảo sát năm 2009 tại Bệnh viện Nhân Dân Gia Định, tỷ lệ vi

khuẩn phân lập được lần lượt là E coli (29,7%), Klebsiella spp (26%), P aeruginosa (13,7%), S aureus (6,0%) và Acinetobacter spp là 5,0%, trong đó

có 14,5% E coli và 11,5% Klebsiella có sinh ESBL (Extender Spectrum

lactamase) là enzyme lactamase mà vi khuẩn tiết ra gây phá hủy vòng lactam làm mất tác dụng của các thuốc kháng sinh nhóm β-lactam [23] Cũng theo khảo sát khác tại Bệnh viện Nhi Quảng Nam vào năm 2015 của Nguyễn

β-Minh Thái [25], tỷ lệ các vi khuẩn phân lập được lần lượt là S aureus (25,5%), E coli (19,9%), K pneumonae (10,3%), S pneumoniae (6,5%), H influenzea (2,7%)…

Như vậy, tỷ lệ các vi khuẩn có thể khác nhau nhưng dẫn đầu gây nhiễm

trùng bệnh viện vẫn là vi khuẩn E coli, S aureus, Acinetobacter, P aeruginosa…

2.1.4.2 Tình hình nghiên cứu nhiễm trùng bệnh viện trên thế giới

Theo nghiên cứu của Mayon - white R T và cộng sự năm 1988[43]

về tỷ lệ nhiễm trùng bệnh viện trên 47 bệnh viện, 14 quốc gia, tỷ lệ trẻ em

dưới 1 tuổi có tỷ lệ nhiễm trùng bệnh viện là 13,5% và thường mắc bệnh về đường da, đường hô hấp… Tỷ lệ người lớn trên 64 tuổi nhiễm trùng là 12,0%

và dễ mắc các bệnh nhiễm trùng tiết niệu… Trong các vi khuẩn phân lập

được từ bệnh viện, E coli và S aureus là 2 trong 6 tác nhân chính gây nhiễm

trùng bệnh viện Theo báo cáo khác về tỷ lệ nhiễm trùng bệnh viện ở châu Âu

năm 1995, tỷ lệ các vi khuẩn phân lập được lần lượt là: Enterobacteriaceae (34,4%), S aureus (30,1% ), P aeruginosa (28,7%), Staphylococcus âm tính

enzyme coagulase (19,1%)… [42] Theo nghiên cứu của Anton Y P năm

2002, trong số 1,7 triệu người bị nhiễm trùng bệnh viện, gần như 99,000 người tử vong do nhiễm trùng bệnh viện hoặc liên quan đến nhiễm trùng bệnh viện đưa NTBV đứng hàng thứ 6 trong nguyên nhân gây tử vong ở Hoa Kỳ,

dữ liệu tương tự đã được báo cáo ở Châu Âu [41] Theo bài báo cáo của CDC năm 2011 trên 183 bệnh viện ở Hoa Kỳ, vi khuẩn thường gặp nhất trong

nhiễm trùng bệnh viện là S aureus bao gồm cả MRSA (11%), sau đó lần lượt là: Klebsiella (10%), E coli (9%), Enterococcus (9%), Pseudomonas (7%)

[29] Theo nghiên cứu ở Ả rập của Hanan H B và cộng sự thì trong số 89 tác

nhân phân lập gây bệnh thường gặp nhất là P aeruginosa (21,3%) và Enterococcus (10,9%) [40] Theo nghiên cứu của Khan H.A năm 2015 được

tiến hành ở nhiều nơi khác nhau trên thế giới chỉ ra rằng ở Bắc Mỹ và Châu

Âu có tỷ lệ bệnh nhân nhập viện là 5% - 10% trong khi ở Châu Á, Mỹ Latin

và Châu Phi cận Sahara có tới 40% bệnh nhân phải nhập viện do nhiễm trùng bệnh viện [39]

2.2 Tổng quan về đề kháng kháng sinh

2.2.1 Định nghĩa của kháng sinh

Định nghĩa kháng sinh đầu tiên ra đời: “Kháng sinh (antibiotic) là những chất kháng khuẩn được tạo ra từ các chủng vi sinh vật (vi khuẩn, nấm, antinomycetes), có tác dụng ức chế sự phát triển của các vi sinh vật khác”[6]

Định nghĩa khác về kháng sinh là: “Kháng sinh (antibiotic) là những hợp chất ngay ở nồng độ thấp đã có khả năng gây ức chế, hoặc tiêu diệt vi khuẩn một cách đặc hiệu, bằng cách gây rối loạn phản ứng sinh học ở tầm phân tử (nồng độ thấp:nồng độ điều trị nhỏ hơn nhiều lần so với liều với cơ thể; đặc hiệu: mỗi kháng sinh chircos tác dụng trên một loại vi khuẩn hay một nhóm vi khuẩn)” [15]

2.2.2 Cơ chế tác động của kháng sinh

Kháng sinh có tác động vào nhiều quá trình như ngăn cản quá trình vận chuyển thành phần tạo màng, ức chế các enzyme tổng hợp các yếu tố của màng vi khuẩn Chúng làm rối loạn quá trình nhân lên của vi khuẩn làm chúng nhân lên nhưng không có vách hoặc vách không hoàn chỉnh dễ bị tiêu diệt bởi điều kiện môi trường xung quanh Ví dụ: kháng sinh nhóm β-lactam, Vancomycin…

2.2.2.1 Ức chế tổng hợp thành tế bào

Petidoglycan là một bộ khung quan trọng của thành tế bào vi khuẩn,

nó quyết định hình dạng và sự toàn vẹn của tế bào vi khuẩn Trong quá trình tổng hợp Petidoglycan các kháng sinh β-lactam tác động lên enzyme transpeptidase ngăn cản sự hình thành Petidoglycan khiến cho thành tế bào vi khuẩn không được tổng hợp Các kháng sinh β-lactam còn hoạt hóa enzyme

tự ly giải thành tế bào Sự tác động của hai cơ chế này làm cho tế bào vi khuẩn vỡ do áp lực thẩm thấu bên trong tế bào cao hơn so với môi trường ngoại bào [14]

2.2.2.2 Gây rối loạn chức năng màng bào tương

Màng bào tương của tế bào là một màng thẩm thấu chọn lọc, có chức năng điều hòa quá trình trao đổi chất giữa trong và ngoài tế bào vi khuẩn Các kháng sinh Polymyxin gắn với các phân tử phospholipid trong cấu trúc màng tương vi khuẩn, làm tăng tính thấm chọn lọc của màng Sự vận chuyển của

các chất qua màng không kiểm soát được, những chất cần thiết cho tế bào thoát ra ngoài khiến cho tế bào vi khuẩn bị chết [14]

2.2.2.3 Ức chế tổng hợp axit nucleotic

- Ức chế tổng hợp DNA: Kháng sinh nhóm Quinolone ngăn cản quá trình tổng hợp DNA của vi khuẩn bằng cách ức chế enzyme DNA gyrase (Topoisomerase II) khiến cho 2 sợi DNA không được tháo xoắn trong quá trình sao chép nên quá trình sao chép DNA không diễn ra

- Ức chế tổng hợp RNA: Kháng sinh Rifampicin ức chế quá trình tổng hợp RNA của vi khuẩn bằng cách tác động lên tiểu phần β của enzyme RNA polymerase, ngăn cản quá trình tổng hợp RNA của vi khuẩn [14]

2.2.2.4 Ức chế tổng hợp protein

Ribosom vi khuẩn (70S) gồm 2 tiểu phần 30S và 50S Các kháng sinh

ức chế tổng hợp protein sẽ tác động lên các vị trí khác nhau tại 2 tiểu phần của ribosom vi khuẩn

a) Kháng sinh gắn với tiểu phần 30S của ribosom

Tiểu phần 30S của ribosom vi khuẩn chứa vị trí gắn của Mrna và vị trí cho

sự nhận biết đặc hiệu phức hợp aminoacyl- Trna Có nhiều cơ chế làm ức chế tổng hợp protein tại tiểu phần 30S của ribosom Ví dụ: Nhóm Aminoglycoside chúng tác động trực tiếp lên tiểu phần 30S ngăn cản quá trình bám gắn của mRNA vào ribosom, hoặc gây ra dịch mã sai di truyền, tạo các protein bất thường không có tác dụng thậm chí có tính độc với tế bào vi khuẩn [14]

b) Kháng sinh tác động vào tiểu phần 50S của ribosom

Kháng sinh Cloramphenicol ức chế enzyme petidyl transferase, ngăn cản sự hình thành liên kết peptide mới giữa chuỗi peptide được hình thành trước đó với phân tử axit amin trong phức hệ aminoacyl-tRNA làm cho chuỗi polyprtide không được phép kéo dài thêm [14]

2.2.2.5 Ức chế quá trình trao đổi chất

Axit folic có chức năng như một co-enzyme trong quá trình tổng hợp pyrimidine, purine, và một số axit amin ở vi khuẩn, ở vi khuẩn quá trình tổng hợp axit folic là một chuỗi phản ứng với sự xúc tác của một số chất quan trọng Để tổng hợp ra axit folic vi khuẩn phải sử dụng axit para-aminobenzoic (PAPA) nên cạnh tranh thay thế vào vị trí của PAPA và ngăn cản quá trình phát triển của vi khuẩn [14]

2.2.3 Sự đề kháng kháng sinh của vi khuẩn

2.2.3.1 Định nghĩa và phân loại đề kháng kháng sinh

Kháng sinh có tác dụng ức chế và tiêu diệt vi khuẩn nhưng trong môi trường có kháng sinh mà vi khuẩn vẫn phát triển thì được coi là sự đề kháng kháng sinh [8]

Kháng thuốc thật gồm kháng thuốc tự nhiên và kháng thuốc thu được

Kháng thuốc tự nhiên: Là sự kháng thuốc của những vi khuẩn không nằm trong phổ tác dụng của một kháng sinh nào đó kháng thuốc tự nhiên là

do đặc thù cấu trúc và sinh lý của tế bào vi khuẩn, nó tự nhiên và bền vững

Ví dụ: E.coli không chịu tác động của Erythromycin, tụ cầu kháng lại Colistin, trực khuẩn lao kháng lại Penicillin…

Kháng thuốc thu được: Là sự kháng thuốc của những vi khuẩn nằm trong phổ tác dụng của một kháng nhưng đã trở nên kháng lại kháng sinh đó

Ví dụ: Samonella kháng Cloramphenicol [19]

2.2.3.2 Cơ chế kháng thuốc của vi khuẩn

Cơ chế kháng thuốc của vi khuẩn là do đột biến gen hoặc nhận được gen kháng thuốc Đột biến gen xảy ra trước hoặc sau khi vi khuẩn tiếp xúc với kháng sinh có thể đó là đột biến một bước hoặc đột biến nhiều bước

Đột biến một bước mức độ đề kháng kháng sinh không phụ thuộc vào nồng độ thuốc kháng sinh được tiếp xúc chỉ sau một lần tiếp xúc mà tính đề kháng đã cao như Streptomycin, Lincomycin…

Đột biến nhiều bước (mức độ đề kháng phụ thuộc vào nồng độ kháng sinh chúng trải qua nhiều lần đột biến mới đề kháng mạnh như Penicillin, Cloramphenicol, Aminoglycoside… Tần suất xuất hiện đột biến rất nhỏ khoảng từ 10-6 đến 10-11) [19]

hệ khác mà còn có khả năng di truyền ngang giữa các vi khuẩn qua quá trình tiếp hợp Ngoài ra, vi khuẩn còn có các Transposon hay là các “gen nhảy” chứa 1 hoặc nhiều đoạn gen, chúng có khả năng nhảy từ plasmid vào nhiễm sắc thể hoặc từ plasmid này sang plasmid khác trong lúc vô tình là phương tiện chuyển các gen kháng thuốc [19] Trong vi sinh y học có những Transposon mang các gen đề kháng như Tn3 mang gen kháng Ampicillin, Tn5 mang gen kháng Kanamycin, Tn10 chứa gen kháng Tetraclin, Tn4 chứa gen kháng 3 kháng sinh Ampicillin, Streptomycin, Sunfamid… [8]

Cơ chế lan truyền đề kháng

Vi khuẩn mang gen đề kháng kháng sinh sẽ được di truyền dọc truyền

từ thế hệ này qua thế hệ khác hoặc có thế truyền ngang từ vi khuẩn này qua vi khuẩn khác

Cơ chế lan truyền trong tế bào truyền từ phân tử DNA này sang phân tử DNA khác trong tế bào, giữa các tế bào thông qua các hình thức như tiếp hợp

(là sự vận chuyển vật liệu di truyền từ vi khuẩn đực sang cái qua tiếp xúc nhau), biến nạp (là sự vận chuyển 1 đoạn DNA từ vi khuẩn cho nạp vào vi khuẩn nhận), tải nạp (là sự vận chuyển vật liệu di truyền từ vi khuẩn cho sang

vi khuẩn nhận qua phage) để chuyển gen đề kháng từ tế bào này sang tế bào khác trong cùng một loài hoặc khác loài

Trong quần thể vi sinh vật có thể chọn lọc dưới tác dụng của kháng sinh các vi khuẩn đề kháng phát triển và thay thế những vi khuẩn nhạy cảm, trong quần thể đại sinh vật những vi khuẩn đề kháng sẽ lây lan từ người này sang người khác qua con đường trực tiếp hoặc gián tiếp [14]

Các cơ chế kháng kháng sinh khác của vi khuẩn

a) Giảm sự tích lũy bên trong tế bào vi khuẩn

Vi khuẩn có thể làm giảm nồng độ thuốc kháng sinh bên trong tế bào bằng một trong những cơ chế sau:

+ Nhờ hệ thống bơm chủ động: Nồng độ kháng sinh trong tế bào sẽ giảm dần do kháng thuốc được vận chuyển tích cực ra khỏi tế bào vi khuẩn (sự đềkháng của vi khuẩn với Tetracycline, Macroline, Quinolone)

+ Làm giảm tính thấm của màng tế bào vi khuẩn như vi khuẩn làm thay đổi các kênh potein trên màng tế bào làm giảm tính thấm của màng tế bào với các kháng sinh nhóm β-lactam

+ Làm mất hệ thống vận chuyển qua màng do đó kháng sinh không lọt vào được trong tế bào vi khuẩn, sự đề kháng của vi khuẩn với nhóm Aminoglycoside [14]

b) Vi khuẩn tạo ra một số enzyme làm biến đổi hoặc phá hủy cấu trúc hóa học của phân tử kháng sinh:

Một số vi khuẩn có khả năng đề kháng với một số kháng sinh β-lactam nhờ enzyme β-lactamase, enzyme này gây hiện tượng acetyl hóa phân tử

Cloramphenicol khiến chúng không còn khả năng bám vào tiểu phần 50S ribosom của vi khuẩn [14]

c) Làm thay đổi đích tác động nên kháng sinh không gắn được vào đích:

- Sự đề kháng của vi khuẩn do đột biến xảy ra ở tiểu phần β của enzyme RNA-polymerase kháng Rifampicin

- Vi khuẩn phế cầu kháng Penicillin G và tụ cầu kháng Methicillin nhờ biến đổi các phân tử protein gắn Penicillin

- Vi khuẩn đề kháng nhóm Quinolone do sự đột biến gen mã hóa cho enzyme DNA gyrase trên nhiễm sắc thể vi khuẩn [14]

d) Vi khuẩn tăng tổng hợp enzyme chuyển hóa để bù năng lượng enzyme đã bị kháng sinh tác động:

Ví dụ: Vi khuẩn đề kháng với Trimethoprim nhờ tổng hợp enzyme dihydrofolate reductsse [14]

e) Vi khuẩn thay đổi đường chuyển hóa làm cho thuốc kháng sinh không tác động được vào quá trình chuyển hóa của vi khuẩn

f) Vi khuẩn đề kháng với Sulfonamide một số vi khuẩn không cần sử dụng PAPA tự tổng hợp nữa mà chúng sử dụng PAPA sẵn có trong môi

trường[14]

2.2.3.3 Các biện pháp hạn chế sự gia tăng kháng kháng sinh

Các biện pháp hạn chế sự gia tăng vi khuẩn kháng kháng sinh gồm:

- Chỉ dùng kháng sinh để điều trị những bệnh nhiễm khuẩn (những kháng sinh kháng khuẩn không có tác dụng với virus)

- Chọn kháng sinh theo kết quả kháng sinh đồ: Nên ưu tiên kháng sinh

có phổ hẹp, tác dụng đặc hiệu trên vi khuẩn gây bệnh và khuếch tán tốt nhất đến ổ vi khuẩn

- Dùng kháng sinh đủ liều lượng và thời gian (cho một đợt điều trị)

- Đề cao các biện pháp khử trùng và tiệt trùng, ngăn ngừa sự lan truyền

vi khuẩn đề kháng

- Liên tục giám sát sự kháng kháng sinh của vi khuẩn để có chiến lược

sử dụng kháng sinh hợp lý

2.2.4 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

2.2.4.1 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam

Ở Việt Nam đã có nhiều nghiên cứu về kháng thuốc Theo báo cáo vào năm 2000-2001 của Song J H và cộng sự năm 2004 [34], tỷ lệ kháng

Penicillin chiếm 71,4% và Erythromycine 92,1% của Streptococcus pneumoniae (nguyên nhân thường gặp và gây nhiễm khuẩn hô hấp tại Việt

Nam) được ghi nhận là cao nhất trong số 11 nước trong mạng lưới giám sát các căn nguyên kháng thuốc Châu Á (ANSORD) [12] Theo báo cáo khác phân tích về thực trạng sử dụng kháng sinh và kháng kháng sinh ở Việt Nam năm 2015 chỉ ra rằng tỷ lệ đề kháng kháng sinh được ghi nhận là tăng đột biến theo thời gian, vào năm 1990 tại Thành phố Hồ Chí Minh mới chỉ có 8%

các chủng S pneumoniae kháng với Penicillin, đến năm 1990 - 2000, tỷ lệ

này tăng 56% xu hướng tương tự tại các tỉnh phía Bắc Việt Nam [12] Một nghiên cứu khác vào năm 2000 - 2001, chỉ ra rằng có tới 25% số vi khuẩn phân lập được tại bệnh viện Thành phố Hồ Chí Minh đề kháng với kháng sinh Cephalosporin hàng 3 Theo tổng kết của Bộ Y tế năm 2004, phần lớn những kháng sinh sử dụng thường xuyên hiện nay đã bị kháng như Ceftriaxone 70%, Ceftazidime 64%, Cipfloxacine 55% [18] Cũng theo kết quả nghiên cứu thực trạng kháng kháng sinh tại 4 bệnh viện lớn ở Hà Nội (Việt Đức, Saint Paul, Bệnh viện 108, Bệnh viện Quân Y 103) của Bùi Khắc Hậu và cộng sự từ năm

2005-2008 [11]cho thấy P aeruginosa đề kháng có với kháng sinh Tetracyne

(92,1%), Ceftriaxone (58,5%) và Gentamycine (54%) Trong báo cáo sử dụng kháng sinh và kháng kháng sinh tại 15 bệnh viện Việt Nam năm 2008 - 2009

thì tình trạng kháng kháng sinh ở Việt Nam ở mức độ cao [12] Theo nghiên cứu sự kháng thuốc của vi khuẩn gây bệnh tại Bệnh viện Thống Nhất của Cao

Minh Nga năm 2008 [2] P.aeruginosa kháng cao với các kháng sinh thường

dùng nhóm Aminoglycid trong đó, Gentamicin (chiếm 62,9%), Amikacin (chiếm 49,0%), Imipenem (36,1%) Các nghiên cứu khác chỉ ra rằng có tới

75% các chủng Pneumococci kháng với 3 loại kháng sinh trở lên [27] Theo

kết quả nghiên cứu công bố năm 2009 của Le T M [28] cho thấy 42% chủng

Enterobacteriaceae kháng với Ceftazidime, 60% kháng với Gentamycine và

70% kháng với Nalidixic axit, tỷ lệ kháng cao này được ghi nhận ở người khỏe mạnh trong cộng đồng Cũng theo báo cáo năm 2011 của Lý Ngọc Kính

và cộng sự [13] về tình hình kháng thuốc tại một số đơn vị điều trị tích cực thì

tỷ lệ vi khuẩn kháng Gentamycine, Tobramycine và kháng cao trên 50% với nhóm Quinolon, nhạy cảm với Vancomycine, Colistin, Carbapenem Theo

một báo cáo của Trần Thị Lan Phương và cs năm 2008 S pneumoniae và Acinetobacter là 2 vi khuẩn thường gây nhiễm trùng bệnh viện và kháng với

hầu hết kháng sinh thông thường [20]

2.2.4.2 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Nhiễm trùng bệnh viện đang là mối lo ngại trên thế giới Hàng năm các thống kê về các vi khuẩn gây nhiễm trùng bệnh viện và khả năng kháng thuốc

ở trên thế giới được cập nhập và quan tâm Theo nghiên cứu của Pitt T L và

cộng sự năm 2003 ở Anh có tới 50% chủng P aeruginosa kháng

Gentamycine, 39% kháng Ceftazidime, 32% kháng Piperacine và 30% kháng Ciprofloxaxin (2003) [29] Theo nghiên cứu của Pereira L.P năm 2004 đề kháng Ciprofloracine thậm chí được ghi nhận ở trẻ em và người trưởng thành trước đó chưa từng sử dụng kháng sinh Quinolon Theo Báo cáo của Pereira

L.P năm 2004 tại Barbodas, Jamaica và Trinidad, họ Enterobacteriaceae

kháng Cephalosporin hàng 3 [30] Theo báo cáo của WHO năm 2008 sự đề

kháng của Acinetobacter với các kháng sinh khác lần lượt là Aminoglucoside

khoảng 20%, Ciprofloracine (30%), Ceftazidime (70%), Piperacine/ Tazobactam (50%), Cefotaxime (89%) ở châu Âu, tỷ lệ kháng cao nhất được báo cáo ở vùng Địa Trung Hải bao gồm Hi Lạp, Thổ Nhĩ Kỳ, Ý và Nhật Bản [35] Theo báo cáo của Adjei M A năm 2010 tại Úc (1992) và Philippin (2001) Ciprofloracine đã được báo cáo thất bại trong điều trị nhiễm khuẩn do lậu cầu khuẩn [41] Các kháng sinh nhóm Carbapenem là kháng sinh được lựa chọn cuối cùng trong điều trị nhiễm khuẩn nhưng theo báo cáo của WHO vào năm 2010 ở Anh đã có sự xuất hiện chủng kháng kháng sinh Carbapenem xảy

ra từ năm 2000 với vi khuẩn Acinetobacter Giữa năm 2004 và năm 2008 tỷ lệ

đề kháng với Meropenem đã tăng từ 13 đến 29% [35] Theo báo cáo của CDC

năm 2011 Klebsiella và E coli đang dần kháng với Carbapenems [39] Điều

này càng làm tăng mối lo ngại về tình hình kháng kháng sinh trên thế giới

2.3 Các phương pháp phát hiện vi khuẩn kháng thuốc

Để phát hiện vi khuẩn kháng thuốc có nhiều phương pháp khác nhau Trong đó phổ biến là phương pháp sinh học phân tử và kháng sinh đồ Phương pháp sinh học phân tử thường dùng là PCR, multiplex PCR

PCR (Polymerase Chain Reaction) hay còn gọi là phản ứng chuỗi trùng hợp được Kary Mullis phát minh năm 1980 là quá trình nhân một đoạn DNA lặp đi lặp lại nhiều lần Nếu ta có mồi phát hiện gene kháng thuốc phù hợp với đoạn DNA kháng thuốc trong vi khuẩn đó qua phản ứng PCR sẽ nhanh chóng phát hiện vi khuẩn kháng thuốc hay không Phương pháp này thực hiện nhanh chóng trong một ngày sẽ có kết quả Multiplex PCR là hình thức cải biên của PCR sử dụng nhiều mồi để phát hiện cùng lúc với nhiều mẫu Tuy nhiên, việc chạy phản ứng PCR rất tốn kém và không thể chọn ra được kháng sinh phù hợp nhất với từng bệnh nhân cụ thể mà trong khi phương pháp kháng sinh đồ

có thể làm được điều đó

Kháng sinh đồ là phương pháp phổ biến được dùng ở các bệnh viện,

để chọn được kháng sinh, nồng độ kháng sinh phù hợp với từng bệnh nhân đang điều trị Tuy nhiên phương pháp này tốn thời gian Để thực hiện kháng sinh đồ cần phân lập được vi khuẩn có trong bệnh phẩm Phân lập là quá trình tách riêng một loại vi khuẩn gây bệnh trong số nhiều vi khuẩn trong mẫu bệnh phẩm Để phân lập được vi khuẩn cần trải qua các bước sau:

2.3.1 Lấy bệnh phẩm

Bệnh phẩm là những chất có chứa vi khuẩn gây bệnh lấy từ người bệnh Bệnh phẩm có thể là phân (trong nhiễm khuẩn đường ruột), có thể là máu (trong nhiễm trùng máu), các chất dịch (dịch não tủy, dịch khớp gối, dịch màng bụng, dịch màng phổi), hoặc các chất dịch ở các hốc tự nhiên (dịch họng, dịch âm đạo) Để lấy bệnh phẩm đúng kỹ thuật, phải đảm bảo nguyên tắc sau:

- Đúng vị trí: lấy ở nơi đang có biểu hiện bệnh lý, trong các viêm nhiễm thì nên lấy ở ranh giới giữa nơi lành và nơi tổn thương

- Đúng thời gian: lấy đúng lúc bệnh phẩm có nhiều vi khuẩn hoặc chưa dùng kháng sinh

- Phải vô khuẩn: không để vi khuẩn nhiễm từ bên ngoài nhiễm vào bệnh phẩm làm cho sai kết quả và không gây nhiễm khuẩn thêm cho bệnh nhân Bệnh phẩm lấy xong phải ghi đầy đủ họ tên người bệnh, khoa, tuổi, phòng điều trị… và đóng gói đúng quy cách gửi về phòng xét nghiệm Bệnh phẩm cần được chuyển và làm xét nghiệm ngay, nếu chưa có điều kiện phải giữ chúng trong môi trường có dung dịch bảo quản và ở nhiệt độ thích hợp để đảm bảo giữ vi khuẩn còn sống

2.3.2 Nhuộm soi

Đây là phương pháp sơ bộ và đánh giá sự có mặt của vi khuẩn trong mẫu bệnh phẩm, biết được hình thái và tính chất bắt màu của vi khuẩn có thể định hướng cho nuôi cấy, phương pháp này vừa nhanh, vừa đơn giản, ít tốn kém

Phổ biến hơn cả là phương pháp nhuộm gram được phát minh do nhà khoa học người Đan Mạch Hans Christian Gram (1853 - 1938) nhằm phân biệt thành vi khuẩn Gram Âm và Gram Dương dựa trên cấu trúc thành tế bào

Nguyên lý: Vi khuẩn Gram Dương có thành tế bào dày do nó có nhiều lớp Peptidoglucan chất này có khả năng giữ phức hệ tím tinh thể-iot và bắt màu tím khi nhuộm trong khi đó vi khuẩn Gram Âm lại có lớp Peptidoglucan mỏng hơn sẽ giữ màu hồng của fuchsin

Sau khi nhuộm với tím Gentian, các tinh thể màu tím bám vào trong lớp Peptidoglucan và được cố định bởi logul phức hợp tím tinh thể - iot sẽ bám chặt vào thành Peptidoglycan sau khi dùng cồn tẩy nếu là vi khuẩn Gram Dương thì sẽ có màu tím vì hỗn hợp khử màu làm mất nước làm giảm khoảng trống giữa các phân tử nên các tím tinh thể vẫn bám vào lớp Peptidoglucan nên khi nhuộm với màu của fuchsin sẽ không có vị trí để fuchsin bám vào lớp Peptidoglucan Ngược lại, vi khuẩn Gram Âm khi tẩy cồn do chúng có lớp Peptidoglucan rất mỏng dù tím tinh thể bám vào thì dưới tác dụng của cồn sẽ

bị tẩy dưới tác dụng của cồn tạo nên các khoảng trống để fuchsin bám vào

2.3.3 Nuôi cấy

Vi khuẩn phát triển khác nhau trong một số môi trường khác nhau Nếu nuôi vi khuẩn trong môi trường lỏng thì vi khuẩn nào phát triển sẽ làm đục môi trường, còn nuôi chúng trong môi trường đặc thì sẽ mọc các khuẩn lạc Khuẩn lạc là tập hợp của 1 quần thể vi khuẩn duy nhất phát triển từ một vi khuẩn ban đầu Quan sát hình thái khuẩn lạc về màu sắc, kích thước… có thể nhận biết sơ bộ về vi khuẩn Có 3 loại khuẩn chính: khuẩn lạc R, S và M Để nuôi cấy bệnh phẩm, thường nuôi cấy trên môi trường phân lập môi trường

này ngoài các chất dinh dưỡng cần thiết còn có một số chất khác có tác dụng ức chế hoặc kích thích chọn lọc các vi khuẩn khác nhau phát triển

Ví dụ: Bệnh phẩm là phân thì nuôi cấy trên môi trường DCL (Dezoxicolat Xitrat Lactoza) đây là môi trường ức chế cầu khuẩn phát triển vì môi trường có thành phần Xitrat Sau khi cấy phân và cất tủ ấm 370

C, 24h thì

E coli có khuẩn lạc màu hồng, samolella, shigella có khuẩn lạc màu trắng

Khi nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường thạch máu thì quan sát có vòng tan huyết không vì có các vi khuẩn có khả năng gây tan huyết Tan huyết là khả năng có thể sản xuất enzyme phá hủy hồng cầu gây tan máu Có 3 dạng tan huyết là tan huyết α (Vòng tan huyết không hoàn toàn), β (Tan huyết hoàn toàn) và γ (Xung quanh khuẩn lạc không tìm thấy vòng tan máu, hồng cầu trong thạch vẫn giữ nguyên màu hồng nhạt) Phế cầu thường có tan huyết α hoặc β màu xanh, liên cầu nhóm D thường có tan huyết γ [8]

2.3.4 Xác định vi khuẩn

- Khảo sát những tính chất sinh vật hóa học

+ Xác định vi khuẩn bằng môi trường đường: Các loại đường như glucose, lactose, mantose… Chia vào ống nghiệm, khử trùng, cấy vi khuẩn lên và quan sát tùy từng loại vi khuẩn có khả năng mọc thành màu khác nhau

ở môi trường có đường và chỉ thị khác nhau Có các môi trường như KIA chứa đường lactose, glucose, môi trường manit chứa đường mantose… Cấy

vi khuẩn vào môi trường để tủ ấm 370 C qua đêm, quan sát màu sắc của thạch + Xác định vi khuẩn bằng phản ứng VP (Voges-Proskauer): cấy vi khuẩn vào môi trường lỏng như Clack-lubs để tủ ấm 370

C từ 2 - 4 ngày sau đó nhỏ dung dịch thử vào nếu màu đỏ hồng là dương tính [21]

+ Ngưng kết với kháng thể đặc hiệu

Là sự kết hợp giữa kháng nguyên hữu hình và kháng thể tạo thành phức kháng nguyên kháng thể dưới dạng những hạt có thể quan sát bằng mắt

thường hay kính lúp gồm có ngưng kết chủ động và ngưng kết thụ động Phản ứng ngưng kết chủ động phổ biến hơn kháng nguyên nằm ngay trên bề mặt tế bào vi khuẩn trộn vi khuẩn với kháng thể tương ứng trên phiến kính và quan sát Phương pháp này đơn giản và hay thực hiện nhiều ở các phòng thí

nghiệm vi sinh Ví dụ: phản ứng Weil- Felix chuẩn đoán Rickettsia giám định Salmonella bằng huyết thanh miễn dịch đặc hiệu kháng O và kháng H [19] 2.3.5 Kháng sinh đồ

Kháng sinh đồ là kỹ thuật xác định độ nhạy cảm của vi khuẩn với kháng sinh nhằm giúp thầy thuốc chọn được kháng sinh có hiệu lực dùng trong điều trị

Có 2 phương pháp thực hiện kháng sinh đồ là kỹ thuật khuếch tán trong thạch và kỹ thuật kháng sinh pha loãng trong thạch hoặc canh thang Phương pháp kháng sinh pha loãng trong thạch ít sử dụng hơn ở các bệnh viện vì hạn chế số lượng kháng sinh nhưng nếu để định lượng nồng độ kháng sinh thì lại

là phương pháp bắt buộc Còn phương pháp khoanh giấy kháng sinh khuếch tán trong thạch cùng một lúc có thể thử với nhiều kháng sinh cùng một lúc chỉ trong 1-2 đĩa thạch nên ít tốn kém hơn, cũng nhanh có kết quả nên được sử dụng phổ biến trong bệnh viện để định tính khả năng kháng thuốc của vi khuẩn WHO khuyến cáo thực hiện phương pháp kháng sinh đồ khuếch tán trên bề mặt thạch và so sánh đường kính theo tiêu chuẩn CLSI trên các bệnh viện trên thế giới để cùng nhau so sánh về tình hình kháng kháng sinh của các nước trên thế giới để đưa ra các khuyến cáo đồng thời [6]

Kỹ thuật phương pháp khoanh giấy kháng sinh khuếch tán trên thạch Mueller-Hinton thực hiện theo kỹ thuật của Kibry-Barer Mỗi khoanh giấy thấm một loại kháng sinh với một hàm lượng nhất định

Nguyên lý: Kháng sinh được thấm vào những khoanh giấy tròn với nồng

độ nhất định và được đặt tại một điểm trên mặt đĩa thạch Từ khoanh giấy, kháng sinh khuếch tán dần ra xung quanh, càng xa nơi đặt khoanh giấy nồng

độ kháng sinh càng thấp và ngược lại nơi càng gần khoanh kháng sinh nồng

Bảng2.1:Đườngkínhkhoanhkhángsinhtheotiêuchuẩncủa

CLSI2015-2016

ĐƯỜNG KÍNH GIỚI HẠN CỦA KHOANH KHÁNG SINH

SIR: Sensitivity - Interdiata – Resance Nhóm háng

Nguyên tắc chọn kháng sinh điều trị bệnh nhân trên kết quả kháng sinh đồ: chọn kháng sinh có phổ tác dụng hẹp cho kết quả S để điều trị, có tác dụng đặc hiệu lên vi khuẩn gây bệnh đã thử, dễ sử dụng, ít có phản ứng không mong muốn và rẻ tiền để điều trị cho bệnh nhân Không nên dùng kháng sinh đời mới, có hoạt phổ rộng cho nhiều loại vi khuẩn khác nhau một cách rộng rãi, để ngăn ngừa sự gia tăng vi khuẩn kháng thuốc [21]

2.3.6 Phương pháp giữ chủng vi sinh vật

Có nhiều phương pháp bảo quản chủng vi sinh vật như: bảo quản trong môi trường thạch bằng, định kỳ kiểm tra cấy truyền, giữ giống trong cát hoặc trong đất sét vô trùng, bảo quản bằng phương pháp lạnh đông, giữ giống bằng phương phápđông khô Trong đó, ở hầu hết các bệnh viện đều chọn bảo quản bằng phương pháp lạnh đông trong tủ âm sâu vì quy trình đơn giản, nhanh, bảo quản được lâu

Nguyên lý: Ở nhiệt độ lạnh sâu -1960 C đến -800 C nước cần cho hoạt động sống của vi sinh vật bị bất hoạt, tế bào vi sinh vật bị ức chế không tăng sinh Tuy nhiên tế bào có thể bị vỡ trong quá trình làm lạnh và làm tan mẫu

do tích lũy chất điện giải trong quá trình bảo quản hình thành nước trong tế bào bổ sung chất dung dịch bảo vệ như glycerol 15%,…

PHẦN 3 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Đối tượng, vật liệu và phạm vi nghiên cứu

- Đối tượng nghiên cứu: Một số vi khuẩn gây nhiễm trùng bệnh viện

phân lập trên mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân đang được điều trị tại Bệnh viện

Đa khoa Trung ương Thái Nguyên

- Phạm vi nghiên cứu: Trên các bệnh nhân điều trị tại Bệnh viện Đa

khoa Trung ương Thái Nguyên

3.2 Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu

- Địa điểm: Phòng vi sinh tại Bệnh viện Đa khoa Trung ương Thái Nguyên

- Thời gian nghiên cứu: Từ ngày 15/12/2016 đến ngày 15/05/2017 3.3 Dụng cụ, hóa chất và thiết bị sử dụng

- Dụng cụ: Đĩa peptri, kính hiển vi, lam kính, phiến kính, đèn cồn, ống

nghiệm, que cấy, tăm bông…

+Chỉ thị màu như phenol đỏ, xanh metylen…

+ Các hóa chất làm môi trường như: agar, đường đa lượng, vi lượng, khoanh giấy kháng sinh…

- Thiết bị: Tủ ấm, tủ sấy, cân phân tích, máy hấp vô trùng, máy cấy máu,

tủ lạnh…

3.4 Nội dung nghiên cứu

- Nội dung 1: Nghiên cứu tỷ lệ các loại vi khuẩn gây nhiễm trùng trên các bệnh nhân điều trị tại Bệnh viện Đa khoa Trung ương Thái Nguyên từ 15/12/2016 đến 15/5/2017

- Nội dung 2: Khảo sát tình hình kháng thuốc của một số loại vi khuẩn phân lập tại Bệnh viện Đa khoa Trung ương Thái Nguyên từ 15/12/2016 đến 15/5/2017

3.5 Phương pháp nghiên cứu

3.5.1 Phương pháp 1: Phân lập, xác định vi khuẩn và lưu giữ chủng

3.5.1.1 Kỹ thuật lấy bệnh phẩm(theo sổ tay hướng dẫn lấy mẫu của khoa gửi tới các khoa lâm sàng)

Bệnh phẩm có thể do các khoa phòng nội trú mang đến và đạt yêu cầu

vô trùng về dụng cụ lấy mẫu hoặc lấy bệnh phẩm tại khoa vi sinh (đối với bệnh nhân nội trú) Bệnh phẩm phải đảm bảo lấy đúng vị trí, đúng thời gian

Hình3.1:Chaichứamôitrườngdinhdưỡngđểnuôicấyvisinhvậtnhiễm trùng

trong máu của hãng BacT/ALERT,Đức

3.5.1.2 Quan sát trực tiếp bằng kính hiển vi Theo Antony van Leeuwenhoek, 1676

Quan sát bằng kính hiển vi cho phép nhìn hình dạng, khả năng bắt màu của vi khuẩn Có thể là làm tiêu bản soi tươi để phát hiện khả năng di động của vi khuẩn, sự có mặt của nấm, trùng roi gây bệnh hoặc chúng ta nhuộm tiêu bản để xem hình thái của vi khuẩn

- Soi tươi: Để phát hiện khả năng di động của vi khuẩn

+ Tiêu bản giọt ép: Dùng que cấy hoặc ống hút lấy bệnh phẩm lỏng hoặc canh khuẩn, rồi nhỏ một giọt lên lam kính còn các bệnh phẩm đặc thì nhỏ 1 giọt NaCl 0,9% vô khuẩn lên lam kính và hòa đều vào giọt NaCl 0,9%

+ Đặt lá kính lên giọt canh khuẩn thật nhẹ nhàng tránh tạo bọt khí

+ Soi kính hiển vi với vật kính X10, vật kính X40

- Nhuộm:

+ Làm tiêu bản bằng cách dùng que cấy bệnh phẩm (hoặc canh khuẩn) dàn mỏng lên phiến kính theo đường xoắn ốc đường kính 1cm để khô tự nhiên hoặc cho vào tủ ấm 37o C sau đó cố định tiêu bản bằng nhiệt, hóa chất, hoặc phối hợp

+ Kỹ thuật nhuộm Gram Theo Hans Christian Joachim Gram,1884 là phương pháp phổ biến dùng ở các trường học, bệnh viện,… để phân loại vi khuẩn thành vi khuẩn Gram Âm và vi khuẩn Gram Dương

3.5.1.3 Nuôi cấy theo Robert Koch, 1881 [32]

Phương pháp phổ biến và quan trọng để phân lập vi khuẩn bằng phương pháp vi sinh

- Các loại vi khuẩn khác nhau sống trên các môi trường khác nhau Có thể là môi trường lỏng hoặc đặc hoặc bán rắn hay môi trường bình thường là môi trường nước thịt, thạch thường hoặc môi trường đặc biệt (môi trường gelatin, môi trường thạch máu, môi trường óc yếm khí, môi trường khoai tây…)

- Nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường lỏng: Môi trường thông dụng nhất

là canh thang dùng que cấy hoặc pipet Pasteur cho bệnh phẩm vào canh thang Đem ủ ở nhiệt dộ thích hợp 370

C trong 18 - 24 giờ Vi khuẩn có thể phát triển làm đục môi trường hoặc tạo váng trên bề mặt nước

- Nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường đặc: Thông dụng nhất là môi trường thạch dinh dưỡng ở trên bề mặt môi trường mọc khuẩn lạc có thể quan sát bằng mắt thường Dựa vào màu sắc, hình thái, kích thước khuẩn lạc có thể

giúp định danh sơ bộ về vi khuẩn đó Pha môi trường có bổ sung 8 – 12 % agar đổ ra ống thạch nghiêng hoặc đĩa peptri hút dịch vi khuẩn lên bề mặt thạch cấy trải đều Để vào tủ ấm 370C quan sát sự mọc của khuẩn lạc [21]

3.5.1.4 Xác định vi khuẩn

Phương pháp thường sử dụng để xác định vi khuẩn là dựa vào xác định tính chất hóa học của vi khuẩn đó Hiện nay, người ta đã sản xuất ra các bộ xác định đồng thời các tính chất sinh vật hóa học của vi khuẩn như bộ chạy đường API 20E hoặc 20NE của hãng Biomerieux, Pháp xác định 20 tính chất của vi khuẩn sau đó có máy đọc tự động để xác định tên vi khuẩn Nhưng việc

sử dụng chúng rất tốn kém nên ít sử dụng hơn và chỉ sử dụng đối với các trực khuẩn đường ruột xác định thử oxyda âm hoặc dương Người ta thường dựa vào các tính chất sau để xác định vi khuẩn:

- Chuyển hóa glucid

+ Chuyển hóa đường

Môi trường KIA (Kligler Iron Agar) là môi trường tổng hợp gồm có hai loại đường là lactose và glucose, trong đó tỷ lệ giữa lactose và glucose là 10/1

và chất chỉ thị pH phenol đỏ Nuôi cấy vi khuẩn và môi trường để ở nhiệt độ

370 C trong 24h nếu vi khuẩn có màu đỏ sang màu vàng ở phần chân ống thạch (môi trường KIA đổ thạch nghiêng) thì môi trường có khả năng lên men đường glucose mà không lên men đường lactose Nếu vi khuẩn có khả năng lên men đường lactose thì toàn bộ môi trường chuyển sang màu vàng [15]

Hình 3.2: Môi trường KIA

Ghi chú: 1 Đối chứng âm; 2: môi trường KIA dương tính

Môi trường Manit là môi trường có chứa đường manit Nuôi cấy vi khuẩn và môi trường để ở nhiệt độ 370C trong 24h nếu vi khuẩn có khả năng

sử dụng manit thì môi trường sẽ chuyển từ màu đỏ đậm sang màu vàng Môi trường có màu đỏ đậm thạch bằng nên khi cấy dùng que thẳng chọc vào giữa ống [15]

+ Các tính chất khác trong quá trình len men đường

Phản ứng Red Methyl (RM): Một số loài vi khuẩn có khả năng sản sinh

ra các axit (Lactic, acetic, formic…) từ glucose qua con đường lên men nhất

là các vi khuẩn đường ruột Chúng sản sinh đủ một lượng axit để môi trường nuôi cấy luôn giữ ở pH ≤ 4,4 Sử dụng các môi trường lỏng như Clark–lubs để nuôi cấy vi khuẩn để 24 - 48h và nhỏ 2 - 3 giọt RM là ta có thể phát hiện ra chúng [15]

Phản ứng Voges-Proskauer (VP): một số vi khuẩn trong quá trình lên men đường có khả năng tạo ra chất trung gian là acethyl-methyl-carbinol (Acetone) Có thể phát hiện chất này dựa trên sự biến đổi của Acetoin thành diacetyl qua tác dụng của KOH và O2 trong không khí Sau đó diacetyl bị biến đổi thành một phức chất màu đỏ dưới sự xúc tác của α-naphthol và creatin Để