Tuyển chọn và nghiên cứu đặc điểm sinh học của một số chủng vi khuẩn lên men thức ăn thô xanh phục vụ chăn nuôi

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM ______o0o______ PHẠM HUY THÀNH KHÔI Tên đề tài: TUYỂN CHỌN VÀ NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN LÊN MEN THỨC ĂN THÔ

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

o0o

PHẠM HUY THÀNH KHÔI

Tên đề tài:

TUYỂN CHỌN VÀ NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC

CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN LÊN MEN THỨC ĂN THÔ XANH

PHỤC VỤ CHĂN NUÔI

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học

Khóa học : 2013-2017

Thái Nguyên, năm 2017

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

o0o

PHẠM HUY THÀNH KHÔI

Tên đề tài:

TUYỂN CHỌN VÀ NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC

CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN LÊN MEN THỨC ĂN THÔ XANH

PHỤC VỤ CHĂN NUÔI

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học

Giảng viên hướng dẫn:

1.TS.Phí Quyết Tiến Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàm Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

2.ThS Bùi Đình Lãm Khoa CNSH-CNTP, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên

Thái Nguyên, năm 2017

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình thực hiện đề tài nghiên cứu trong luận văn này,

tôi đã nhận được sự giúp đỡ tận tình của các thầy cô và cán bộ Phòng Công

nghệ Lên men, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công

nghệ Việt Nam

Trước hết tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Phí Quyết Tiến –

Phó viện trưởng Viện Công nghệ Sinh học, Trưởng phòng Công nghệ Lên

men, Viện Công nghệ Sinh học, người đã tận tình hướng dẫn tôi trong suốt

quá trình thực hiện đề tài

Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới NCS ThS Vũ Thị Hạnh

Nguyên – cán bộ phòng Công nghệ Lên men, người đã trực tiếp hướng dẫn

tôi thực hiện đề tài nghiên cứu

Đồng thời tôi cũng xin cảm ơn KS Nguyễn Văn Thế cùng các cán bộ

Phòng Công nghệ Lên men đã chỉ bảo tôi nhiệt tình, giúp đỡ, tạo điều kiện

thuận lợi cho tôi hoàn thành nghiên cứu này

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn ThS Bùi Đình Lãm cùng các thầy cô giáo

trong Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, cùng các thầy cô,

cán bộ trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đã đồng hành cùng tôi trong

suốt thời gian học tập và nghiên cứu

Cuối cùng, tôi cũng xin chân thành cám ơn bạn bè, gia đình, những

người đã giúp đỡ, động viên và là chỗ dựa tinh thần vững chắc cho tôi suốt

thời gian qua

Thái Nguyên, ngày 6 tháng 5 năm 2017

Sinh viên Phạm Huy Thành Khôi

DANH MỤC BẢNG

Trang

Bảng 3.1: Danh mục và xuất xứ của các hóa chất chính sử dụng trong nghiên cứu 16 Bảng 3.2: Danh mục các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu 17 Bảng 4.1: Tổng hợp các đặc điểm hình thái khuẩn lạc và một số đặc điểm sinh

học của các chủng nghiên cứu 24 Bảng 4.2: Hoạt tính enzyme ngoại bào của các chủng VK 28 Bảng 4.3: Hoạt tính đối kháng của các chủng VK được tuyển chọn 31 Bảng 4.4: Khả năng đồng hóa của một số nguồn cacbon của chủng TX4 và TX9 34 Bảng 4.5: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng phát triển của hai chủng

TX4 và TX9 sau 48 giờ nuôi cấy 36 Bảng 4.6:Ảnh hưởng của pH ban đầu đến sự sinh trưởng của 2 chủng

TX4 và TX9 38 Bảng 4.7: Phân tích trình tự gen mã hóa 16S rDNA của chủng TX9 41

DANH MỤC HÌNH

Trang

Hình 4.1: Khả năng sinh enzym ngoại bào của chủng TX4 và TX9 29 Hình 4 2: Hoạt tính đối kháng với VK kiểm định của chủng TX4, TX9 32 Hình 4 3: Ảnh đặc điểm hình thái khuẩn lạc và đặc điểm hình thái tế bào của

chủng TX4, TX9 33 Hình 4 4: Khả năng sử dụng các nguồn cacbon của chủng TX4 35 Hình 4 5: Khả năng sử dụng các nguồn cacbon của chủng TX9 35 Hình 4.6: Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến sự sinh trưởng và phát triển

của hai chủng TX4 và TX9 37 Hình 4.7: Ảnh hưởng của nồng độ muối NaCl đến đến sự sinh trưởng của 2

chủng TX4 và TX9 39 Hình 4.8: Điện di đồ DNA tổng số của chủng TX9 40 Hình 4 9: Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại gene mã hóa 16S rRNA 40

DANH MỤC NHỮNG TỪ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN

EM Effective Microorganisms FLF Fermented Liquid Feed

MỤC LỤC

Trang

LỜI CẢM ƠN i

DANH MỤC BẢNG ii

DANH MỤC HÌNH iii

DANH MỤC NHỮNG TỪ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN iv

MỤC LỤC v

PHẦN 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu và yêu cầu của đề tài 3

1.3 Ý nghĩa của đề tài 3

1.3.1 Ý nghĩa khoa học 3

1.3.2 Ý nghĩa trong thực tiễn 3

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

2.1 Sử dụng vi sinh vật trong sản xuất thức ăn thô xanh dạng lỏng 4

2.2 Đặc điểm sinh học của Bacillus 6

2.2.1 Đặc điểm hình thái 6

2.2.2 Dinh dưỡng và tăng trưởng 7

2.2.3 Một số loài Bacillus phổ biến trong tự nhiên 7

2.3 Cơ sở khoa học lựa chọn chủng Bacillus trong sản xuất probiotic làm thức ăn chăn nuôi 9

2.3.1 Khả năng sinh bào tử 9

2.3.2 Khả năng sinh enzyme phân hủy chất hữu cơ 10

2.3.3 Khả năng đối kháng 12

2.3.4 Khả năng chịu được nồng độ muối cao, chịu axit, chịu kiềm 13

2.4 Tình hình nghiên cứu và sử dụng probiotic từ các chủng Bacillus trong chăn nuôi gia súc và gia cầm trong và ngoài nước 13

2.4.1 Nghiên cứu trong nước 14

2.4.2 Nghiên cứu ngoài nước 14

PHẦN 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 16

3.1 Vật liệu nghiên cứu 16

3.1.1 Chủng vi sinh vật 16

3.1.2 Hóa chất sử dụng 16

3.1.3 Thiết bị sử dụng 17

3.1.4 Môi trường nuôi cấy 17

3.2 Địa điểm và thời gian tiến hành 18

3.3 Nội dung nghiên cứu 18

3.4 Phương pháp nghiên cứu 18

3.4.1 Phương pháp giữ giống vi khuẩn 18

3.4.2 Nhân giống vi khuẩn 18

3.4.3 Phương pháp xác định hoạt tính catalase 19

3.4.4 Khả năng sinh tổng hợp các enzyme ngoại bào của các chủng vsv 19

3.4.5 Khảo sát hoạt tính đối kháng với VSV kiểm định bằng phương pháp đục lỗ thạch 19

3.5 Nghiên cứu đặc điểm sinh học của các chủng VSV 20

3.5.1 Quan sát đặc điểm hình thái khuẩn lạc 20

3.5.2 Quan sát hình thái tế bào 20

3.5.3 Xác định khả năng sử dụng nguồn carbon 21

3.5.4 Xác định khả năng chịu muối và dải nhiệt độ, pH thích hợp cho sinh trưởng của vi khuẩn 21

3.6 Phương pháp phân loại chủng vi sinh vật được tuyển chọn dựa trên phân tích trình tự gen mã hóa 16S rRNA 22

3.6.1 Tách chiết DNA tổng số 22

3.6.2 Khuếch đại gen mã hoá16S rRNA của chủng vi khuẩn 23

PHẦN 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24

4.1 Sàng lọc và tuyển chọn các chủng vi khuẩn có đặc tính phù hợp cho lên men thức ăn thô xanh 24

4.2 Khả năng sinh enzyme ngoại bào (amylase, protease, cellulase, xylanase, β-glucosidase) 27

4.3 Hoạt tính kháng VSV kiểm định 30

4.4 Đặc tính sinh học và phân loại chủng đã tuyển chọn 33

4.4.1 Nghiên cứu đặc điểm tế bào của chủng TX4 và TX9 33

4.4.2 Đặc điểm sinh lý sinh hóa của chủng TX4 và TX9 34

4.4.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy 36

4.4.4 Ảnh hưởng của pH môi trường đến khả năng phát triển của VK TX4 và TX9 37

4.4.5 Ảnh hưởng của nồng độ NaCl đến khả năng phát triển của chủng TX4 và TX9 38

4.5 Phân lo ại dựa trên xác đ ịnh trình t ự gen mã hóa 16S rDNA của chủng TX9 39

4.5.1 Tách DNA tổng số và khuếch đại 16S của chủng TX9 39

4.5.2 Giải trình tự đoạn gen 16S rDNA 41

PHẦN 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 43

5.1 Kết luận 43

5.2 Kiến nghị 43

TÀI LIỆU THAM KHẢO 44

PHẦN 1

MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Thức ăn thô xanh luôn có tầm quan trọng đặc biệt và không thể thay thế trong chăn nuôi Tùy thuộc chủng loại nguyên liệu, loại thức ăn này có thể chứa hầu hết các chất dinh dưỡng mà vật nuôi cần như protein, các vitamin, khoáng đa lượng và vi lượng thiết yếu và các chất có hoạt tính sinh học cao Nguồn thức ăn thô xanh ở nước ta hiện nay rất phong phú, tuy nhiên lại phụ thuộc rất nhiều vào thời vụ nhất là vào mùa đông, thời tiết khô hanh cây cỏ kém phát triển khiến nguồn thức ăn thô xanh trở lên khan hiếm Trước đây, công nghệ xử lý thức ăn thô xanh ở trong nước chủ yếu để chế biến và bảo quản thức ăn chăn nuôi cho gia súc nhai lại, đặc biệt là trâu, bò nhờ công nghệ lên men ủ chua Một số nghiên cứu và sử dụng chế phẩm sinh học (chế phẩm

EM, chế phẩm đa enzyme Viprotics, bổ sung chế phẩm sinh học hỗn hợp EVP ) hiện nay dùng cho xử lý nguồn nguyên liệu hoặc phế phụ phẩm công nghiệp giàu tinh bột như ngô, cám, gạo, đậu tương, bã bia, rượu sau chưng cất, phế phẩm công nghiệp sản xuất cồn từ sắn hoặc sản phẩm phụ công nghiệp sản xuất miến dong, bánh đa Nhóm vi sinh vật chủ yếu sử dụng

trong các công nghệ trên gồm nấm men Saccharomyces cerevisiae, Bacillus spp., Lactobacillus spp giúp thủy phân tinh bột, tạo sinh khối nấm men nhờ

kết hợp với một số nguồn nitơ vô cơ, hữu cơ khác nhau Theo nghiên cứu thăm dò từ nhóm nghiên cứu tại Viện Công nghệ sinh học, có thể sử dụng chế phẩm sinh học phù hợp để lên men thức ăn thô xanh tạo nguồn thức ăn lỏng cho chăn nuôi lợn

Trong chăn nuôi lợn, thức ăn chiếm tới 70% chi phí và là yếu tố chính quyết định chất lượng, giá thành sản phẩm Tại Việt Nam, thức ăn chăn nuôi nước ta chủ yếu là nhập từ nước ngoài (chiếm 71,21%, số liệu của Tổng cục

thống kê năm 2014) Theo Cục chăn nuôi, năm 2014 Việt Nam nhập khoảng 11,7 triệu tấn nguyên liệu thức ăn chăn nuôi, trị giá khoảng 4,9 tỷ USD (tương đương 108.000 tỷ đồng) Như vậy ngành chăn nuôi trong nước thực tế đang mang lợi nhuận chủ yếu cho các công ty sản xuất thức ăn và nông dân nước ngoài Đó cũng là lý do giá thành sản phẩm thịt sản xuất trong nước có giá thành cao và dự kiến hạn chế lợi thế cạnh tranh với sản phẩm nhập khẩu khi Hiệp định Đối tác xuyên Thái Bình Dương (TPP) được thực hiện Đứng trước thực trạng đó, cần thiết phải thay đổi phương thức chăn nuôi hữu cơ để vừa đảm bảo hiệu quả về kinh tế (năng suất, hiệu quả), xã hội (chất lượng tốt, VSATTP) và môi trường (tận dụng hiệu quả nguồn tài nguyên sẵn có) và cạnh tranh tốt với sản phẩm ngoại nhập Một trong những giải pháp công nghệ phù hợp là sử dụng chế phẩm sinh học (có hoạt tính thủy phân cellulose, bảo quản thức ăn) có thể lên men thức ăn thô xanh kết hợp với phụ phẩm nông nghiệp có nguồn protein (khô đậu tương, vỏ, thân cây họ đậu ) đã qua

xử lý cơ học để tạo thức ăn lỏng cân đối cho chăn nuôi

Xuất phát từ luận điểm trên chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề

tài:“Tuyển chọn và nghiên cứu đặc điểm sinh học của một số chủng vi khuẩn lên men thức ăn thô xanh phục vụ chăn nuôi” Nghiên cứu góp phần

tìm các chủng vi khuẩn phù hợp có thể định hướng tạo chế phẩm sinh học thủy phân thức ăn thô xanh, tận thu phụ phế phẩm nông nghiệp nâng cao hiệu quả trong chăn nuôi và giảm ô nhiễm môi trường Phạm vi nghiên cứu này tập

trung sàng lọc các chủng vi khuẩn có hoạt tính probiotics, thuộc chi Bacillus

có hoạt tính thủy phân cellulose để kết hợp với các nhóm vi sinh vật khác tạo chế phẩm vi sinh vật lên men thức ăn thô xanh Mục đích nhằm tuyển chọn

những chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus phù hợp cho lên men thức ăn thô

xanh phục vụ trong chăn nuôi và nghiên cứu đặc điểm sinh học của vi sinh vật tuyển chọn

1.2 Mục tiêu và yêu cầu của đề tài

Sàng lọc được những chủng khuẩn thuộc chi Bacillus có khả năng sản

sinh enzyme ngoại bào thủy phân cellulose và các đặc tính khác Từ đó, nghiên cứu đặc điểm sinh lí sinh hóa và phân loại của các chủng vi khuẩn được lựa chọn

1.3 Ý nghĩa của đề tài

1.3.1 Ý nghĩa khoa học

Tuyển chọn vi khuẩn thủy phân cellulose phù hợp cho lên men thủy phân thức ăn thô xanh và nghiên cứu đặc điểm sinh lí sinh hóa, phân loại của các chủng đã chọn

1.3.2 Ý nghĩa trong thực tiễn

- Sản phẩm nghiên cứu góp phần mở ra hướng nghiên cứu tạo chế phẩm vi sinh vật giúp người chăn nuôi lợn hạn chế sự phụ thuộc vào nguồn thức ăn công nghiệp, tận dụng phụ phế phẩm nông nghiệp nâng cao hiệu quả trong chăn nuôi và giảm ô nhiễm môi trường

- Giúp sinh viên củng cố và hệ thống hóa lại kiến thức đã học và nghiên cứu khoa học, tác phong và kỹ năng làm việc sau này

- Giúp sinh viên biết cách đặt vấn đề, đưa ra phương pháp nghiên cứu,

xử lý, phân tích số liệu và trình bày một đề tài khoa học

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Sử dụng vi sinh vật trong sản xuất thức ăn thô xanh dạng lỏng

Thức ăn thô xanh dạng lỏng (Fermented Liquid Feed, FLF) có thể được sản xuất bằng cách lên men một hoặc một số loại nguyên liệu như hạt ngũ cốc, nguyên liệu giàu protein, nguyên liệu tổng hợp khác (bột đậu tương, bột

cá, bột xương), sinh khối thực vật và phối trộn thức ăn đã lên men này với các thành phần thức ăn không lên men khác để cung cấp thức ăn hoàn chỉnh cho lợn Tuy nhiên, phương pháp lên men thức ăn dạng lỏng có thể gặp một

số vấn đề: gây ra mất các chất dinh dưỡng thiết yếu như vitamin và axit amin, đặc biệt là sinh tổng hợp các axit amin thiết yếu đã được bổ sung vào thức ăn [24;25] Dù vậy, về tổng thể các nghiên cứu cũng đưa ra kết luận cho lợn ăn nguồn ngũ cốc hoặc thức ăn đã lên men thay vì các loại thức ăn tổng hợp thông thường hoặc là thức ăn khô sẽ mang lại hiệu quả về kinh tế, chất lượng thịt và bảo vệ môi trường [24; 25]

Trong chăn nuôi lợn, thức ăn chiếm tới 70% chi phí và là yếu tố chính quyết định chất lượng, giá thành sản phẩm Tại Việt Nam, thức ăn chăn nuôi nước ta chủ yếu là nhập từ nước ngoài (chiếm 71,21%, số liệu của Tổng cục thống kê năm 2014) Theo Cục chăn nuôi, năm 2014 Việt Nam nhập khoảng 11,7 triệu tấn nguyên liệu thức ăn chăn nuôi, trị giá khoảng 4,9 tỷ USD (tương đương 108.000 tỷ đồng) Như vậy ngành chăn nuôi trong nước thực tế đang mang lợi nhuận chủ yếu cho các công ty sản xuất thức ăn và nông dân nước ngoài Đây cũng là lý do giá thành sản phẩm thịt sản xuất trong nước cao và

dự kiến hạn chế lợi thế cạnh tranh với sản phẩm nhập khẩu khi Hiệp định Đối tác xuyên Thái Bình Dương (TPP) được thực hiện Đứng trước thực trạng đó, cần thiết phải thay đổi phương thức chăn nuôi hữu cơ để vừa đảm bảo hiệu quả về kinh tế (năng suất, hiệu quả), xã hội (chất lượng tốt, VSATTP) và môi

trường (tận dụng hiệu quả nguồn tài nguyên sẵn có) và cạnh tranh tốt với sản phẩm ngoại nhập

Công nghệ xử lý thức ăn thô xanh ở trong nước chủ yếu để chế biến và bảo quản thức ăn chăn nuôi cho gia súc nhai lại, đặc biệt là trâu, bò nhờ công nghệ lên men ủ chua Một số nghiên cứu sử dụng chế phẩm sinh học (chế phẩm EM, chế phẩm đa enzyme Viprotics, bổ sung chế phẩm sinh học hỗn hợp EVP ) hiện nay dùng cho xử lý nguồn nguyên liệu hoặc phụ phế phẩm công nghiệp giàu tinh bột như ngô, cám, gạo, đậu tương, bã bia, rượu sau chưng cất, phế phẩm công nghiệp sản xuất cồn từ sắn hoặc sản phẩm phụ công nghiệp sản xuất miến dong, bánh đa Nhóm vi sinh vật chủ yếu sử dụng

trong các công nghệ trên gồm nấm men S cerevisiae, Bacillus spp.,

Lactobacillus spp giúp thủy phân tinh bột, tạo sinh khối nấm men nhờ kết

hợp với một số nguồn nitơ vô cơ, hữu cơ khác nhau

Năm 2006-2009, Phạm Quốc Việt và cộng sự đã thực hiện đề tài

"Nghiên cứu sản xuất probiotic và enzyme tiêu hoá dùng trong chăn nuôi", trong đó đã phân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật hữu ích, bước đầu các xác định điều kiện sinh trưởng và phát triển của các chủng vi sinh vậttuyển chọn và tạo tổ hợp các chủng vi khuẩn hữu ích có các đặc tính probiotic Chế phẩm probiotic đa chủng dạng bột có thành phần chính gồm 6 chủng vi khuẩn có ích (04 chủng vi khuẩn lactic, 01 chủng vi khuẩn

Bacillus và 01 chủng nấm men) Sử dụng chế phẩm vi sinh vật bổ sung trực

tiếp vào thức ăn chăn nuôi đã cải thiệntốc độ sinh trưởng ở lợn và gà từ 16%, giảm tỷ lệ tiêu chảy ở lợn 32% Ngoài ra, đề tài đã sản xuất chế phẩm đa enzyme dạng bột có thành phần chính gồm amylase (2210 IU/g), protease (110IU/g), cellulase (1116 IU/g), beta-glucanase (200 IU/g) và xylanase (1000 IU/g) giúp cải thiệntốc độ sinh trưởng ở lợn và gà từ 6-11%, tăng hiệu quả sử dụng thức ăn ở lợn và gà từ 5-9% [16]

5-2.2 Đặc điểm sinh học của Bacillus

Đặc điểm phân loại: Theo khóa phân loại của Bergey, chi Bacillus là

một chi lớn và đa dạng, được phân loại như sau:

VK Bacillus được Ehrenberg mô tả lần đầu tiên năm 1835 là “Virbrio

subtilis” Năm 1872, Cohn đặt tên lại là B subtilis (Gordon, 1981) Họ Bacillaceae được chia làm 5 chi gồm: Bacillus, Sporolactobacillus, Clostridium, Sporosarcina,Desulfortomaculum, đặc trưng của họ này là hình

thành nội bào tử [5; 23]

2.2.1.Đặc điểm hình thái

TB hình que, thẳng hoặc gần thẳng, kích thước 0,3 - 2,2x 1,2 -7 µm Các TB thường xếp thành cặp hay chuỗi, đầu tròn hoặc hơi vuông LàVK Gram dương, hầu hết có hoạt tính catalase Chúng thường di động nhờ roi.Một TB chỉ có thể hình thành duy nhất một nội bào tử, nội bào tử có hình oval hoặchình trụ Bào tử có khả năng chịu nhiệt, axit, sự hình thành nội bào

tử không bịngăn cản bởi sự tiếp xúc không khí Các loài thuộc chi Bacillus

đặc trưng cho trựckhuẩn sinh bào tử mà vẫn giữ nguyên hình que khi mang bào tử, trong một sốtrường hợp chỉ hơi phình to lên một chút [8] Tùy theo loài, bào tử của chúng có thể nằm ởgiữa, gần cuối, hoặc ở cuối [8;23]

Đặc điểm phân bố: Nhờ khả năng sinh bào tử nên Bacillus có thể tồn

tạitrong thời gian rất dài dưới các điều kiện khác nhau Chúng rất phổ biến trong tự nhiên nên có thể phân lập từ nhiều nguồn khác nhau như đất, nước, không khí, phân, trầm tích biển, thức ăn, sữa, lớp mùn, [6;23]

2.2.2.Dinh dưỡng và tăng trưởng

+ Hầu hết các loài thuộc chi Bacillus là những sinh vật hóa dị dưỡng,

thunăng lượng nhờ sự oxi hóa các hợp chất hữu cơ như đường, amino axit,

axit hữu cơ, Một số VK tự dưỡng không bắt buộc (B schlegelli) có khả

năng phát triển trong môi trườngchỉ có CO2 Một số loài Bacillus (B subtilis)

có khả năng sử dụng các chất vô cơ, trong khi một số loài khác như B

sphaericus, B cereus cần các hợp chất hữu cơ (vitamin, axit amin) cho sự

sinh trưởng Đặc biệt Bacillus gây bệnh cho côn trùng như B.thuringiensis, B

popllae, B lentimorbus, B cereus, B anthracis (trong đó B.cereus, B anthracis gây bệnh trên người) có nhu cầu dinh dưỡng phức tạp, chúng không

phát triển được trong môi trường VK thông thường như NA, NB [2; 20; 23]

+ Phần lớn các loài thuộc chi Bacillus là VK hiếu khí hoặc kị khí tùy

nghi,nhiệt độ sinh trưởng tối ưu từ 30 – 45C, một số VK chịu nhiệt với nhiệt

độ sinh trưởng tối ưu lên tới650

C, hoặc ưa lạnh (5C – 25C) Các loài VK

thuộc chi Bacillus sinh trưởng trong khoảngpH rộng từ 2 – 11 Trong phòng thí nghiệm, dưới điều kiện sinh trưởng tối ưu, Bacillus có thời gian thế hệ là

25 phút Nhờ có phổ chịu đựng pH, nhiệt độ và muối rộng nên Bacillus có thể

tồn tại ở điều kiện bất lợi trong thời gian dài [2;18]

2.2.3 Một số loài Bacillusphổ biến trong tự nhiên

+ B subtilis (trực khuẩn cỏ khô) được phát hiện đầu tiên trong phân

ngựa(1941) bởi tổ chức y học Nazi của Đức [1] Lúc đầu, loài này được sử dụng đểphòng bệnh lỵ cho các chiến sĩ Đức chiến đấu ở Bắc Phi Chúng có khuẩn lạc khô, khôngmàu hoặc có màu xám nhạt, trắng, hơi nhăn hay tạo ra các lớp màng mịn, lan trên bề mặt thạch Khuẩn lạc có mép nhăn bám vào môi trường thạch Trực khuẩn hình que, ngắn, nhỏ,TB đứng riêng rẽ hoặc chuỗi Nhiệt độ tối ưu cho sinh trưởng là 36-50oC, tối đa là 60oC Bào tử chịu được nhiệt độ khá cao, có hình bầu dục, phân bố lệch tâm Nhờ khả năng sinh

một số enzyme ngoại bào (amylase, cellulase, protease,…) và sinh tổng hợp

được nhiều loại kháng sinh như subtilin, subtilosin A, sublancin,…mà B

subtilis được ứng dụng rất rộng rãi trong chăn nuôi, y học, thực phẩm,…[8]

+ B amyloliquefaciens có hình thái khuẩn lạc và TB tương tự B

subtilis Nhưngkhác nhau về đặc tính sinh hóa, có khả năng lên men đường

lactose nhanh và lênmen glucose chậm, thành phần G + C của B subtilis khoảng 41,5% - 43,5% còntrong chủng B amyloliquefaciens là 43,5 – 44,9%

Chúng phân bố phổ biến trong đất, nước Do có khả năng sinh tổng hợp mạnh các enzyme như amylase, protease [6], xenlulase và xylanase [33] nên được ứng dụng nhiều trong công nghiệp sản xuất enzyme, công nghiệp thuộc da [5;

34] Ngoài ra, B amyloliquefaciens còn được ứng dụng trong các lĩnh vực

khác như nông nghiệp, y học bởi khả năng sinh các chất chuyển hóa như vitamin, nucleoside purine (inosine, guanosine) [33;34], chất kháng khuẩn (bacteriocin), chất kháng nấm (bacimin), hoocmon tăng trưởng thực vật IAA [21;33;34;42] Đặc biệt, nhiều nghiên cứu cho thấy các chế phẩm probiotic từ

B amyloliquefaciens đã góp phần cải thiện chất lượng môi trường nước, tăng

cườngcác phản ứng miễn dịch, kiểm soát sự phát triển quá mức của VSV gây bệnh cho tôm,cá,…[44]

+ B licheniformis là VK hoại sinh, bào tử hình ovan, phát tán chủ yếu

trong đất, kể cả đất nghèo dinh dưỡng như đất hoang hay sa mạc Khuẩn lạc nhỏ, màutrắng đục, bề mặt nhăn nheo TB chuyển động nhờ tiêm mao và loài này kỵ khí không bắt buộc

+ B pumilus phát tán rộng khắp nơi, thường có mặt trong đất nhiều hơn

B subtilis Khuẩn lạc nhỏ, xung quanh viền mờ không ranh giới TB của nó

gần giống tế bào B subtilis

+ B megaterium có khuẩn lạc hình tròn đều, không có thùy, méptròn

hoặc hơi lượn sóng, màu trắng kem, trông giống như giọt nến trắng,thường có

vòng hoặc các vòng đồng tâm trên mặt TB dài, đứng riêng rẽ hoặc xếp thành

chuỗi Bào tử hình elip, nằm lệch tâm B megaterium được sử dụng trong sản

xuất penicillin nhờ khả năng tổng hợp penicillin amidase Bên cạnh đó, chúng còn có thể sản sinh các enzyme phân hủy sinh học, sản sinh vitamin B12, oxetanocin, cytochromes P450 và một số axit amin khác

+ B polymyxa có khuẩn lạc không màu, phẳng, lồi, trơn, lan dần ra

xung quanh,mép đôi khi có thùy TB đứng riêng rẽ hoặc xếp thành đôi, chuỗi ngắn Bào tử hình bầu dục kéo dài Loại VK này làm giảm pectin và polysaccarit trong cây Ngoài ra, chúng còn có khả năng cố định đạm Đây là một VK rất phổ biến trong đất

+ B cereus có khuẩn lạc phẳng, khá khuếch tán, hơi lõm, trắng đục TB

đứngriêng rẽ hay xếp thành chuỗi Bào tử có hình bầu dục, nằm lệch tâm, TB chất có chứa các hạt và không bào nhỏ Chúng thường phát tán khắp nơi, sinh sôi, nảy nở trên thực phẩm và có thể sinh độc tố gây ngộ độc thực phẩm

2.3 Cơ sở khoa học lựa chọn chủng Bacillus trong sản xuất probiotic làm

thức ăn chăn nuôi

Các VK được sử dụng làm probiotic phổ biến nhất là các VK lactic như

Bifidobacterium spp, Lactobacillus acidophilus Đây là các VK hiện diện bình

thường trong ruột người, động vật và có khá nhiều tài liệu nghiên cứu về tính chất probiotic của chúng Tuy nhiên, chúng là các VK vi hiếu khí, đòi hỏi điều kiện dinh dưỡng đặc biệt nên việc nuôi cấy gặp nhiều khó khăn và giá thành sản phẩm cao Bên cạnh đó, các VK này còn khó bảo quản và khả năng chịu đựng thấp trong điều kiện đông khô, sấy phun, [10;19] Ngoài đặc điểm

dễ nuôi cấy, tốc độ PT nhanh, phân bố rộng rãi trong tự nhiên, Bacillus còn có

nhiều đặc tính phù hợp để tạo chế phẩm sinh học như:

2.3.1 Khả năng sinh bào tử

Đặc điểm quan trọng của Bacillus là khả năng sinh bào tử Bào tử được môtả đầu tiên bởi Cohn (1872) khi nghiên cứu về B subtilis và sau đó được

Koch(1875) mô tả khi nghiên cứu về B anthracis Một số loài Bacillus

thường có khảnăng hình thành bào tử trong chu trình PT tự nhiên hoặc khi gặp điều kiện bất lợinhư: nhiệt độ cao, MT nghèo dinh dưỡng, pH không thích hợp, MT tích lũy nhiềusản phẩm trao đổi chất bất lợi,…Khi gặp điều kiện thuận lợi, bào tử sẽ nảy mầm vàPT thành một TB mới có sức sống mạnh

mẽ hơn Vì vậy, nội bào tử được sinh rakhông phải để sinh sôi nảy nở mà là

cơ chế đảm bảo cho sự sống còn của VK khitrải qua các điều kiện khắc nghiệt [19].Ở phần lớn VK, trong 1 tế bào chỉ có 1 bào tử và sau khi trưởng thành bàotử được phóng thích ra khỏi TB Ở bào tử trưởng thành không diễn ra quá

trình traođổi chất (được xem như trạng thái tiềm sinh) Bào tử Bacillus phát

triển theo chu kì, trong trạng thái tiềm ẩn, chúng có thể tồn tại trong thời gian

rất dài, đến hàng tỷ năm Ví dụ như bào tử của B subtilis có thể duy trì khả năng sống đến 200-300 năm (Sonenshein et al., 1993) Bên cạnh đó, bào tử

Bacillus còn có tính ổn định cao với nhiệt độ và sự khô hạn Ví dụ như ở nhiệt

độ 1000C, bào tử B cereus có khả năng chịu được 2 phút, B subtilis chịu được 180 phút, B mesentericus chịu được 380 phút (Rosovitz et al., 1998) Còn khả năng đề kháng với tia phóng xạ của bào tử B mesentericus gấp 36 lần so với TB dinh dưỡng của E coli, bào tử và tinh thể của B.thuringensis có

độc tố ức chế nhiều loại côn trùng và bệnh than [43] Các nhà VSV nhanh chóng nhận ra tầm quan trọng của bào tử như là đặc điểm phân loại nổi bật, là

cách xác định đơn giản họ Bacillaceae Có thể nói, đây là đặc điểm rất quan

trọng và có liên quan đến việc sản xuất các chế phẩm sinh học probiotic [18]

2.3.2 Khả năng sinh enzyme phân hủy chất hữu cơ

Trong quá trình sống, Bacillus thường sản sinh những chất có hoạt tính

sinh học cần thiết để thích ứng với nhiều hoàn cảnh và điều kiện MT sống Trong đó, khả năng sinh các loại enzyme ngoại bào như protease, amylase, cellulase, alkaline phosohatase, cyclodextran, glucanotransferase,

galactosidase, chitinase, glucose, isomerase, glucanase, lipase, urease, là một

đặc tính nổi bật của các loài Bacillus

Protease hay peptide hydrolase là những enzyme thuỷ phân liên kết

peptide (- O – NH -) trong phân tử protein và các polypeptide Sản phẩm của quá trình thuỷ phân này có thể là các acid amin, các peptide, các polypeptide

chuỗi ngắn [15] Có thể nói Bacillus là một trong số các VSV có khả năng

sinh protease nhiều nhất, đặc biệt là protease kiềm tính [4] Nhờ khả năng bền

nhiệt và bền pH nên protease kiềm từ Bacillus có tầm quan trọng lớn trong

ngành công nghiệp chất tẩy rửa, sản xuất bột giặt; trong công nghiệp thuộc

da; trong thủy phân protein của cá, thịt,…Điển hình là B licheniformis, B

subtilis, B amyloliquefaciens, và B.majovensis [4;8;29]

Amylase là một trong những enzyme được quan tâm nghiên cứu sớm

và nhiều nhất Đặc biệt, so với amylase lấy từ động vật và vi nấm thì amylase

từ Bacillus bền hơn trong môi trường acid của dạ dày Vì thế nên amylase từ

Bacillus được sử dụng phối hợp với coenzyme A, cytocrom C, ATP,

carboxylase để sản xuất thuốc điều trị bệnh tim mạch, bệnh thần kinh Ngoài

ra, chúng còn được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp dệt, công nghiệp thực phẩm (sản xuất bia, rượu, giấm, bột ngọt, bánh kẹo, nước trái cây),… Ví

dụ như amylase từ B licheniformis [32; 35]

Cellulase là enzyme xúc tác sự phân hủy cellulose thành sản phẩm

trung gian là cellubiose và sản phẩm cuối cùng là đường glucose Trong tự nhiên có nhiều nhóm VSV có khả năng phân hủy cellulose, trong đó vi nấm là nhóm có khả năng phân giải mạnh Nhiều loài VK cũng có khả năng này nhưng số lượng và thành phần các loại enzyme không đầy đủ, chủ yếu chỉ

sinh endoglucanase Riêng Bacillus là loài sinh cellulase khá cao, chúng chủ

yếu được phân lập từ đất vườnnơi có nguồn xác bã hữu cơ (rơm, rạ, mụn

dừa, ) dồi dào Ví dụ như, cellulase từ B subtilis [27; 28; 38]

Tóm lại, nhờ hệ enzyme ngoại bào đa dạng, nhóm VK này có thể chuyển hóa các chất khó tiêu (cellulose, tinh bột, protein) thành chất dễ tiêu (axit amin

và glucose) góp phần cải thiện dinh dưỡng, kích thích tiêu hóa thức ăn và giúp vật nuôi tăng trọng nhanh, đặc biệt là heo con ở giai đoạn sau cai sữa

Do vậy, có thể nói khả năng sinh enzyme thủy phân các hợp chất hữu cơ là

một đặc tính rất cần thiết trong việc nghiên cứu sử dụng Bacillus để tạo chế

phẩm probiotic trong chăn nuôi

2.3.3 Khả năng đối kháng

Như đã trình bày ở phần trên, VSV probiotic có khả năng đối kháng với VSV gây bệnh thông qua khả năng cạnh tranh vị trí bám dính và khả năng sinh

chất có hoạt tính kháng khuẩn cao Cụ thể, một số chủng Bacillus thường cạnh

tranh với VSV gây bệnh về nguồn thức ăn, năng lượng, muối khoáng, MT sống, để làm giảm mật độ VSV gây bệnh và dần dần đẩy lùi được dịch bệnh

Ví dụ, chủng B subtilis QST 713 là VK di động, ưa khí được Công ty Agra

Quest phát hiện và được Cục bảo vệ MT Mỹ (EPA) đánh giá là có hiệu quả

đáng kể trong việc phòng chống được nhiều bệnh do VK và nấm gây ra B

subtilis QST 713 hoạt động bằng cách chiếm bề mặt lá cây và cạnh tranh với

các mầm bệnh để giành không gian sống, nhờ đó đã ngăn cản được nhiều bệnh

trên cây trà Nhiều dòng B subtilis được xác định là có khả năng chế ngự mầm

bào tử của nấm bệnh bằng cách cạnh tranh dinh dưỡng và muối khoáng,…[2]

Còn khả năng sinh KS của Bacillus đã được các nhà khoa học nghiên cứu từ rất

lâu Năm 1907, Nicolle là người đầu tiên phát hiện ra hoạt tính kháng khuẩn

của B subtilis Đến năm 1974, Dahab và Goorani đã báo cáo có ít nhất 5 loại

KS được chiết tách từ B subtilis như: subtilin, bacitracin, bacillin, subtenolin

và bacilomycin Ngoài ra, còn rất nhiều loài Bacillus khác có khả năng tổng hợp KS như: B.amyloliquefaciens sinh subtilisin, B brevis sinh gramicidin, tyrothricin, B pumilus sinh pumilin, B polymixa sinh colistin,

polimycin,…[43] Đặc biệt, các chất này thường không được dùng trong y tế nên không xảy ra hiện tượng nhờn thuốc đối với VSV gây bệnh, riêng bacitraxin là chất KS được bổ sung vào thức ăn chăn nuôi để ức chế VK gây bệnh đường ruột và kích thích tiêu hóa cũng như tang trọng của vật nuôi [8]

2.3.4 Khả năng chịu được nồng độ muối cao, chịu axit, chịu kiềm

Nhiều loài Bacillus có khả năng PT tốt trong MT có nồng độ muối khá cao như B subtilis, B licheniformis Chúng thường tồn tại ở MT nước lợ,

nước mặn, trong đường ruột của tôm và được coi là VK có lợi cho tôm [31]

B racemilacticus và B coagulans có thể chịu đựng được nồng độ muối mật

trên 0,3% [36]; một vài chủng khác như B pasteurii, B.seohaeanensis, B

pantothenticus,…có thể ST ở nồng độ NaCl 10% [43] Đặc biệt, nhờ khả năng

sinh bào tử mà rất nhiều loài Bacillus có khả năng ST và sống sót trong MT acid cũng như trong MT kiềm Ví dụ như chủng B.laevolacticus DSM 6475

có thể PT đến tận mức pH 2-3 mà bình thường các chủng VK khác không thể

phát triển được [36] Còn B alcalophilus và B pasteurii có thể ST tốt ở pH

8-11 [43] Chính nhờ những đặc tính ưu việt nêu trên cùng với khả năng dễ bảo

quản ở điều kiện thường, Bacillus được đánh giá là một trong những đối

tượng giàu tiềm năng khai thác trong lĩnh vực sản xuất chế phẩm sinh học

2.4 Tình hình nghiên cứu và sử dụng probiotic từ các chủng Bacillus trong chăn nuôi gia súc và gia cầm trong và ngoài nước

Với đặc điểm sinh lý, sinh hóa ưu việt, Bacillus là một nguồn gen

phong phú, được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như: trong công nghiệp thực phẩm, trong lĩnh vực CNSH, trong lĩnh vực y học,… Đặc

biệt là trong chăn nuôi, con người đã sử dụng Bacillus một cách hiệu quả

trong việc tạo ra nhiều chế phẩm probiotic giúp phòng và điều trị một số bệnh đường tiêu hóa ở gia súc-gia cầm,…Có thể kể đến những nghiên cứu sau đây:

2.4.1 Nghiên cứu trong nước

Năm 1962, B subtilis được Đào Trọng Đạt và Vũ Đình Hưng dùng để

phòng và trị bệnh phân trắng ở heo con, bước đầu cho kết quả khả quan [3]

Năm 1998, Lã Văn Kính đã thử nghiệm probiotic trên gà đẻ cho kết quả sản lượng tăng 5% so với đối chứng không sử dụng probiotic [7]

Năm 2002, Nguyễn Thị Minh Chiến bổ sung probiotic cho heo con theo

mẹ với liều 0,8; 1,0 và 1,2 tỷ CFU/kg thức ăn cho kết quả khả quan trong việc làm giảm tỷ lệ tiêu chảy, tỷ lệ chết và nâng cao tăng trọng heo con lúc cai sữa

Cũng trong năm 2002 này, Tạ Thị Vịnh và cộng sự đã nghiên cứu sử

dụng chế phẩm VITOM 1.1 và VITOM 3 (do Nga sản xuất, chứa B subtilis

chủng VKPMV-7092-) để phòng, trị bệnh đường tiêu hóa trên heo và gà Qua

đó nhận thấy khi dùng VITOM 3 tăng trọng trên heo tăng 6%, tỉ lệ tiêu chảy phân trắng giảm 11%, tỉ lệ khỏi bệnh đạt 100% và không có tái phát, còn khi dùng VITOM 1.1 tăng trọng trên gà tăng 11,8%, tỉ lệ khỏi bệnh đạt 99%

Năm 2003, Nguyễn Như Pho và Trần Thị Thu Thủy đã nghiên cứu sử

dụng probiotic (Oganic Green) trong việc phòng ngừa tiêu chảy do E coli trên heo con sau cai sữa đã cho kết quả làm giảm số lượng E coli thải qua

phân, giảm tỉ lệ tiêu chảy, cải thiện tăng trọng và giảm tiêu tốn thức ăn [17]

Năm 2009, Trần Quốc Việt và cộng sự thuộc Viện Chăn nuôi Việt Nam

đã nghiên cứu sản xuất probiotic và enzyme tiêu hóa dùng trong chăn nuôi Kết quả đã tìm ra 2 quy trình sản xuất và 2 chế phẩm probiotic làm tăng ST vật nuôi 10%, tăng hiệu quả sử dụng thức ăn 10%, hạn chế 15% tỉ lệ bệnh đường tiêu hóa ở vật nuôi [14]

2.4.2 Nghiên cứu ngoài nước

Năm 1940, Noriokimura Yokohamo đã nghiên cứu sản xuất chế phẩm

Kumura từ B subtilis để ngăn chặn sự PT và sinh độc tố của chủng nấm mốc

Asp.flavus, Asp paraciticus Nghiên cứu này được ứng dụng rộng rãi trong

công nghệ sản xuất thức ăn chăn nuôi

Năm 1949, tại Pháp đã lưu hành thuốc dạng lỏng chứa B subtilis chủng

IP 5832, đến năm 1955 có thêm dạng bột và viên nang mềm Năm 1962, Guy

Albot còn phát hiện B subtilis có tác dụng tốt trong điều trị tiêu chảy do lạm dụng KS và viêm đại tràng mãn tính Còn khi trộn thêm với VK lactic, B

subtilis chữa chứng loạn khuẩn rất hiệu quả ở người và vật nuôi

Tại Nhật Bản, với chế phẩm probiotic có tên gọi là EM (Effective

Microorganisms) trong đó có Bacillus, do GS.TS TeRuo Higa, Trường Đại

học Ryukyus, Okinawa, Nhật Bản nghiên cứu năm 1980 Chế phẩm này được

sử dụng nhiều trong chăn nuôi, trồng trọt cũng như bảo vệ MT và đã mang lại hiệu quả khả quan Cho đến nay, đây là chế phẩm được hơn 80 nước và vùng lãnh thổ sử dụng, đặc biệt là khu vực Châu Á, Thái bình Dương trong đó có Trung Quốc, Hàn Quốc, Thái Lan và Việt Nam

Năm 1999, Kyriakis và cộng sự đã nghiên cứu ảnh hưởng của probiotic LSP 122 đến việc phòng ngừa bệnh tiêu chảy trên heo con giai đoạn 28 ngày tuổi Thí nghiệm này được tiến hành trên 4 lô: Lô 1 không dùng probiotic, lô

2 sử dụng B toyoi với liều 106CFU/kg thức ăn, lô 3 và 4 sử dụng B

licheniformis với liều 106 và 107 CFU/kg thức ăn Kết quả cho thấy các lô thí nghiệm (2, 3 và 4) đều có tỉ lệ tiêu chảy và tình trạng tiêu chảy ít nghiêm trọng hơn so với lô đối chứng Ngoài ra, sự tăng trọng và tiêu tốn thức ăn cũng cải thiện hơn so với lô đối chứng Trong đó, lô sử dụng 107

CFU B

licheniformis/kg thức ăn cho kết quả tốt nhất

Năm 2001, Lema và cộng sự đã dùng probiotic trộn với thức ăn cho cừu

ăn liên tục trong 7 ngày với liều 6 x 106

CFU/kg thức ăn để khảo sát sự bài thải

của E coli O157:H7 Kết quả nghiên cứu cho thấy, sự bài thải E coli trong

phân thấp hơn so với đối chứng không sử dụng probiotic trộn với thức ăn

Tóm lại, các công trình nghiên cứu được tóm lược ở trên đã sử dụng các chế phẩm probiotic trên gia súc, gia cầm Mỗi công trình nghiên cứu về những khía cạnh khác nhau nhưng điều kết luận là probiotic có ảnh hưởng tốt cho vật nuôi như ức chế VSV gây bệnh, phòng ngừa và điều trị tiêu chảy, cải thiện tăng trọng và hệ số tiêu tốn thức ăn,…

PHẦN 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 3.1 Vật liệu nghiên cứu

3.1.1 Chủng vi sinh vật

Các chủng vi khuẩn có hoạt tính phân giải cellulose thuộc chi Bacillus

có đặc tính probiotic phù hợp cho lên men thức ăn thô xanh nhận từ Bộ sưu tập giống của Phòng Công nghệ Lên men, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Các chủng vi sinh vật kiểm định: Salmonella entericaATCC 14028,Escherichia coli ATCC 11105,Bacillus cereus ATCC 11778,nhận từ

Bộ sưu tập giống VSV của Phòng Công nghệ Lên men, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

3.1.2 Hóa chất sử dụng

Bảng 3.1: Danh mục và xuất xứ của các hóa chất chính

sử dụng trong nghiên cứu

Cao nấm men Nhật Bản Casein thủy phân Nhật Bản Cao Thịt Nhật Bản Tinh Bột Tan Việt Nam

- Một số hóa chất khác được sử dụng như: Các nguồn đường, các chất vi lượng, các nguyên tố khoáng

3.1.3 Thiết bị sử dụng

Bảng 3.2: Danh mục các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu

Thiết bị Model, hãng sản xuất, nơi sản xuất

Máy lắc ổn nhiệt CPT inc, Hàn Quốc

Máy chạy điện di Mupid, Nhật Bản

Cân điện tử AB 201, Mettler Toledo, Thụy Sỹ

Máy đo OD S-300 nano, Optima, Nhật Bản

Pipetman các loại Gilson, Pháp

Tủ cấy vô trùng Nuare, Pháp

Nồi hấp khử trùng ALP MC-40DP, Nhật Bản

3.1.4 Môi trường nuôi cấy

Các môi trường được sử dụng trong đánh giá khả năng sản sinh hoạt tính enzyme ngoại bào và khả năng đối kháng với vi sinh vật kiểm định, môi trường xác định đặc điểm sinh học của các chủng vi sinh vật (Phụ lục 1)

3.2 Địa điểm và thời gian tiến hành

- Địa điểm nghiên cứu: Phòng Công nghệ Lên men, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

- Thời gian nghiên cứu: Từ 12/2016 đến 6/2017

3.3 Nội dung nghiên cứu

- Nội dung 1: Sàng lọc và tuyển chọn các chủng vi khuẩn có đặc tính phù hợp cho lên men thức ăn thô xanh

- Nội dung 2: Nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng vi khuẩn đã tuyển chọn

- Nội dung 3: Khuếch đại và phân tích trình tự gen 16S rDNA của chủng đã được tuyển chọn

3.4 Phương pháp nghiên cứu

3.4.1 Phương pháp giữ giống vi khuẩn

Chủng vi khuẩn sử dụng trong nghiên cứu được nuôi trên môi trường thạch nghiêng MPA trong ống nghiệm ở 30oC trong 48 giờ Giống được bảo quản trong tủ lạnh ở 2- 4oC, được cấy truyền hàng tháng và được hoạt hóa lại trước khi nhân giống cho lên men [11] Để bảo quản lâu dài, vi khuẩn được giữ ở trong điều kiện lạnh sâu -80oC

Giống được bảo quản trong glycerol 70%, glycerol khi được trữ lạnh không hình thành tinh thể đá giúp cho tế bào không bị phá vỡ Tiến hành cấy

1 khuẩn lạc vào môi trường LB lỏng nuôi qua đêm, thu dịch nuôi vào ống eppendorf 1,5 ml đem ly tâm 4000 vòng/10 phút Sau đó bổ sung 700 µl glycerol 70%, voltex hòa tan sinh khối và bảo quản trong tủ lạnh -80oC

3.4.2 Nhân giống vi khuẩn

Chủng vi khuẩn từ ống nghiệm thạch nghiêng được hoạt hóa bằng cách cấy sang ống nghiệm mới rồi được cấy vào môi trường nhân giống, nuôi ở

30oC trong thời gian 24 giờ trên máy lắc tốc độ 220 vòng/phút Mật độ giống

vi khuẩn đạt 108 CFU/ml

3.4.3 Phương pháp xác định hoạt tính catalase

Catalase là một đặc điểm của đa số các vi sinh vật hiếu khí Được phát hiện bằng cách nhỏ H2O2 lên bề mặt khuẩn lạc, những chủng vi sinh vật hiếu khí xuất hiện bọt khí O2chứng tỏ có hoạt tính catalase

3.4.4 Khả năng sinh tổng hợp các enzyme ngoại bào của các chủng vi khuẩn

Để xác định khả năng sinh enzyme ngoại bào của vi khuẩn, các chủng được cấy chấm điểm trên đĩa Petri chứa môi trường MPA có bổ sung các cơ chất khác nhau trong thời gian 1 - 3 ngày ở 30oC như sau:

+ Bổ sung 1 % (w/v) tinh bột tan để xác định hoạt tính amylase Hiện màu bằng dung dịch Lugol, quan sát vòng phân giải trên đĩa Petri

+ Bổ sung 1 % (w/v) casein để xác định hoạt tính protease Hiện màu bằng dung dịch acid tricloacetic 10% (w/v), quan sát vòng phân giải trên đĩa Petri

+ Bổ sung CMC (cacboxyl metyl cellulase) để xác định hoạt tính cellulase Hiện màu bằng dung dịch Lugol, quan sát vòng phân giải trên đĩa Petri

+ Bổ sung Esculin (3g/l) và Ferric ammonium citrate (0,2 g/L), ủ ở

30oC trong 48 giờ để xác định hoạt tính β-glucosidase, quan sát vòng phân giải trên đĩa [12]

+ Bổ sung 1 % (w/v) xylan để xác định hoạt tính xylanase Để kết tủa xylan, đổ ethanol lên bề mặt đĩa trong 2 - 3 giờ ở nhiệt độ phòng Chọn khuẩn lạc có các vòng sáng trong xung quanh trên nền môi trường mờ đục [25]

3.4.5 Khảo sát hoạt tính đối kháng với VSV kiểm định bằng phương pháp đục lỗ thạch

- Ly tâm 5000 vòng/phút (10 phút) để loại bỏ sinh khối, thu nhận dịch nổi bên trên

- Cấy trang VSV kiểm định lên MT tương ứng

- Dùng khoan nút chai vô trùng (đường kính d=0,9cm) khoan lỗ ở giữa đĩa chứa VSV kiểm định

- Bổ sung 0,1ml dịch lên men của chủng Bacillus nghiên cứu vào lỗ khoan

- Đặt mẫu trong tủ lạnh từ 4 – 8 giờ, ủ ở nhiệt độ phòng 24 giờ, sau đó xác định hoạt tính đối kháng bằng cách đo đường kính vòng vô khuẩn D cm

 Kiểm tra kết quả

Hoạt tính ức chế được đánh giá bằng đường kính vòng phân giải

- Dựa vào vòng ức chế VK kiểm định, chọn lọc các chủng Bacillus có

khả năng kháng khuẩn mạnh [17]

3.5 Nghiên cứu đặc điểm sinh học của các chủng vi khuẩn

3.5.1 Quan sát đặc điểm hình thái khuẩn lạc

Các chủng VSV được nuôi cấy trên môi trường thạch MPA ở 30o C Hình thái khuẩn lạc và khả năng phát triển của chủng được quan sát sau 24 giờ và 48 giờ nuôi cấy

3.5.2 Quan sát hình thái tế bào

Chủng VSV được nuôi trong môi trường lỏng MPA ở nhiệt độ 30oC trên máy lắc tốc độ 200 vòng/phút trong thời gian 18 - 20 giờ Tế bào vi khuẩn trong dịch nuôi cấy được nhuộm Gram và quan sát hình thái dưới kính hiển vi quang học

* Phương pháp nhuộm Gram [11]:

+ Loại bỏ thuốc nhuộm, sau đó nhỏ dung dịch lugol lên tiêu bản và giữ trong 1 phút

+ Loại bỏ dung dịch lugol, rửa tiêu bản bằng cồn 95oC trong 30 - 40 giây + Rửa lại bằng nước

+ Làm khô vết bôi

+ Nhuộm bổ sung bằng fucsin loãng trong 1  2 phút

+ Rửa lại bằng nước, để khô, sau đó đem quan sát

Nếu là chủng Gram (+) sẽ có màu tím, chủng Gram (-) có màu hồng

3.5.3 Xác định khả năng sử dụng nguồn carbon

Khả năng sử dụng nguồn carbon của chủng vi khuẩn nghiên cứu được xác định trên môi trường thạch MK trong các ống nghiệm có bổ sung 1% (w/v) các nguồn đường khác nhau như nguồn carbon duy nhất Khử trùng các ống nghiệm chứa môi trường thạch theo phương pháp Pasteur Tiếp đó, cấy vi khuẩn vào các ống thạch nghiêng và nuôi 1 - 3 ngày ở nhiệt độ 30oC Môi trường khoáng sử dụng nguồn carbon bổ sung là glucose được lựa chọn làm đối chứng dương và môi trường khoáng không bổ sung đường được lựa chọn làm đối chứng âm Quan sát khả năng phát triển trên các môi trường để xác định khả năng sử dụng các nguồn carbon khác nhau của vi khuẩn

3.5.4 Xác định khả năng chịu muối và dải nhiệt độ, pH thích hợp cho sinh trưởng của vi khuẩn

Để xác định khả năng phát triển của vi khuẩn ở các nồng độ muối khác nhau, vi khuẩn được nuôi cấy trên môi trường MPA có bổ sung NaCl nồng độ tăng dần từ 1 - 10 % ở 30o

C Quan sát sự phát triển của vi khuẩn trên môi trường sau 1 - 3 ngày nuôi cấy

Để xác định dải nhiệt độ và pH thích hợp cho sinh trưởng của vi khuẩn, chủng vsv được nuôi cấy trên môi trường MPA thạch ở các nhiệt độ khác nhau (20, 30, 37, 40, 45 và 50oC) và dải pH khác nhau (từ pH 3,0 – pH 10,0) Quan sát sự phát triển của vi khuẩn trên môi trường sau 1 - 3 ngày nuôi cấy