Saponin và ứng dụng của dược liệu chứa Saponin trong sản xuất dược phẩm

KHÁI NIỆM CHUNG VỀ SAPONIN• Saponin/ saponosid là một nhóm các glycosid có phầngenin có cấu trúc triterpen hay steroid 27C.. - Có thể tạo phức với cholesterol hoặc với các chất hydroxyst

SAPONIN DƯỢC LIỆU CHỨA SAPONIN

ThS.DS Huỳnh Anh Duy

MỤC TIÊU HỌC TẬP

1 Định nghĩa về saponin

2 Cấu trúc hoá học của saponin

3 Các phương pháp kiểm nghiệm dược liệu chứa saponin

4 Phương pháp chung để chiết xuất saponin

5 Tác dụng và công dụng của saponin

6 Các dược liệu chứa saponin đã đưa vào giáo trình, chú trọng Cam thảo, Viễn chí, Ngưu tất, Rau má, Ngũ gia bì chân chim, Nhân sâm, Tam thất, Mạch môn

2

KHÁI NIỆM CHUNG VỀ SAPONIN

• Saponin/ saponosid là một nhóm các glycosid có phầngenin có cấu trúc triterpen hay steroid (27C)

• Gặp rộng rãi trong thực vật, một số ĐV thân mềm: Hảisâm, Sao biển

• Sapo = xà phòng

Tính chất chung đặc trưng

- Làm giảm sức căng bề mặt, tạo bọt nhiều khi lắc với nước

- Làm vỡ hồng cầu ngay ở những nồng độ rất loãng

- Độc với cá, diệt các loài thân mềm như giun, sán, ốc sên

- Kích ứng niêm mạc gây hắt hơi, đỏ mắt

- Có thể tạo phức với cholesterol hoặc với các chất hydroxysteroid khác

3β-4

Một vài ngoại lệ: saponin không thể hiện đầy đủ tính chất

• Các sarsaparillosid trong chi Smilax không phá huyết,không cộng cholesterol

• Saponin đắng, ngoại trừ

+ Glycyrrhizin/ cam thảo

+ Abrusosid / cam thảo dây

+ Osladin, polypodosid A và B / một số loài Dương xỉ

Polypodium

• Một số hợp chất khác như glycosid tim, protein thực vật,terpen glycosid … cũng tạo bọt

DANH PHÁP

- Saponin: Thường dùng cách đặt tên chung của các heterosid (Từ tên chi hoặc loài) + OSID.

Ví dụ: các aral osid từ Aralia manshurica.

Các ginsen osid từ Panax ginseng

- Aglycon (sapogenin): tiếp vị ngữ -GENIN, -IDIN.

Ví dụ: các Dios genin từ các loài Dioscorea, các tomat idin từ cà chua (tomatoes).

- Ngoại lệ: glycyrrhiz in (từ Cam thảo), vina -ginsenosid (từ Sâm Việt nam).

6

CẤU TRÚC HÓA HỌC - PHÂN LOẠI

• Như mọi glycosid, cấu tạo của saponin gồm:

- Phần không đường (aglycon): sapogenin, có thể 30C hay 27C.

- Phần đường (glycon)

PHẦN SAPOGENIN

• Có cấu trúc triterpen (30C) hoặc steroid (27C).

• Nhóm thế: thường là -OH, đôi khi oxo, sulfat.

• Nhóm -OH: tự do, liên kết với đường, acyl hóa

• C3 : -OH định hướng  , gắn đường hầu hết của Saponin.

8

PHẦN ĐƯỜNG CỦA SAPONIN

PHẦN ĐƯỜNG CỦA SAPONIN (TT)

- Thường là: liên kết glycosid

- Đôi khi: liên kết ester, do chức acid ở C-28 / saponintriterpenoid

- Monodesmosid: gắn vào C-3 (trừ asiaticosid,madecassosid ở C-28)

- Bidesmosid: 1 mạch gắn C-3, còn lại gắn C-26 (steroid)hoặc C-28 (triterpenoid)

10

CẤU TRÚC HÓA HỌC - PHÂN LOẠI

SAPONIN STEROID

(27C)

SPIROSTAN FUROSTAN ALKALOID

GLYCO-Aminofurostan Spirosolan Solanidan

12

CẤU TRÚC HÓA HỌC - PHÂN LOẠI

1 Saponin triterpen (Saponin triterpenoid)

1.1 Saponin triterpen 5 vòng (pentacyclic)

CÁCH ĐÁNH SỐ

14

Lupan

CẤU TRÚC HÓA HỌC - PHÂN LOẠI

1 Saponin triterpen (Saponin triterpenoid)

1.1 Saponin triterpen 5 vòng (pentacyclic)

NHÓM OLEANAN: khung cơ bản là oleanan

16

CẤU TRÚC HÓA HỌC - PHÂN LOẠI

saponin triterpen trong tự nhiên thuộc nhóm này Thường gặp dẫn chất  -amyrin (3  -hydroxy olean-12-en).

• NHÓM OLEANAN:

Hederagenin

Gypsogenin Acid oleanolic

18

CẤU TRÚC HÓA HỌC - PHÂN LOẠI

1.1 Saponin triterpen 5 vòng (pentacyclic)

NHÓM URSAN: cấu trúc giống như oleanan nhưng khác

nhóm methyl C-29 gắn vào C-19 (chứ không C-20)

CẤU TRÚC HÓA HỌC - PHÂN LOẠI

• NHÓM URSAN: khá phổ biến, thường gặp -amyrin (3hydroxy ursan-12-en)

-20

• NHÓM URSAN: VÍ DỤ

1.1 Saponin triterpen 5 vòng (pentacyclic)

NHÓM LUPAN: Vòng E 5 cạnh, C-20 ở ngoài vòng hướng 

Thường là dẫn chất 3-hydroxy lupan-20(29)-en

E

(3-hydroxy lupan-20(29)-en)

22

• NHÓM LUPAN: ít gặp trong thiên nhiên

Betulinic acid

• 1.1 Saponin triterpen 5 vòng (pentacyclic)

• NHÓM HOPAN: Vòng 5, C-22 ở ngoài vòng, hướng 

21

22

24

1.2 Saponin triterpen 4 vòng (tetracyclic)

Cũng có 30C nhưng chỉ có 4 vòng A, B, C, D

- Dammaran

- Lanostan

- Cucurbitan

1.2 Saponin triterpen 4 vòng (tetracyclic)

• Tiêu biểu là sapogenin thật protopanaxadiol và protopanaxatriol của Nhân sâm ( Panax ginseng CA Meyer) thu được khi thủy phân bằng enzym.

panaxatriol

protopanaxadiol protopanaxatriol

Protopanaxadiol Protopanaxatriol

[H + ]

• NHÓM DAMMARAN: thường gặp trong cây thuộc chi Panax.

• Ngoài ra, còn gặp trong hạt Táo, Rau đắng biển, Cổ yếm(Giảo cổ lam)

1.2 Saponin triterpen 4 vòng (tetracyclic)

• NHÓM LANOSTAN : gặp ở một số động vật như Hải sâm ( Holothuria spp.) Các saponin này có tính phá huyết mạnh hơn các saponin có nguồn gốc thực vật.

• Cấu trúc: gần giống dammaran, chỉ khác nhóm methyl góc gắn vào

• NHÓM LANOSTAN: VÍ DỤ

1.2 Saponin triterpen 4 vòng (tetracyclic)

NHÓM CUCURBITAN: gặp trong họ Cucurbitaceae

• NHÓM CUCURBITAN: VÍ DỤ

Momordicosid A

CẤU TRÚC HÓA HỌC - PHÂN LOẠI

2 Saponin steroid: aglycon có cấu trúc steroid với khung

cơ bản là khung cholestan, gồm 27C

34

CẤU TRÚC HÓA HỌC - PHÂN LOẠI

• NHÓM SPIROSTAN : Cấu tạo giống cholestan nhưng mạch

• NHÓM SPIROSTAN: VÍ DỤ

Sarsasapogenin

Smilagenin

Tigogenin

• NHÓM SPIROSTAN:

Các saponin nhóm này dùng làm nguyên liệu tổng hợp thuốc steroid Quan trọng nhất là:

+ Diosgenin (từ loài Dioscorea, Mía dò )

+ Hecogenin (từ các loài Agave)

38

• NHÓM F UROSTAN :

- Cấu trúc tương tự spirostan chỉ khác vòng F bị biến đổi

- Có 2 trường hợp sau:

Parillin

Enzym

B A

C D E Vòng F mở

E

F

• Trường hợp thứ 2:

- Vòng F chỉ có 5 cạnh, do sự đóng vòng 22-25 epoxy nhưavenacosid trong Yến mạch

- Avenacosid có 2 mạch đường, khi thủy phân cắt đường

glucose ở C-26 thì cũng đóng vòng thành spirostan

42

E F

F là vòng 5 cạnh

[H + ] Avenacosid A

Isonuatigenin

E

F

• NHÓM SAPONIN STEROID ALKALOID (Glycoalkaloid)

- Saponin có chứa N trong phân tử

- Gọi là pseudoalkaloid

- Thường gặp trong họ Solanaceae

44

• NHÓM SOLANIDAN:

Có 2 vòng E và F cùng chung 1 carbon và 1 nitơ

Solanin (trong mầm Khoai tây)

Các nhóm khác

khác nhưng vẫn có đủ 8C trên nhánh Vd: Osladin, polypodosaponin.

• Riêng  -spinasterol có mạch nhánh 10 C

48

TÍNH CHẤT CỦA SAPONIN

- Saponin thường có vị đắng, mùi nồng , gây hắt hơi.

- Đa số saponin ở dạng vô định hình, tan trong nước, khó kết tinh.

- Tan nhiều trong cồn loãng, dung môi phân cực , ít tan trong hexan, benzen, eter

- Sapogenin và dẫn chất acetyl dễ kết tinh, có tính tan ngược lại.

đa số saponin có khả năng quay cực.

- Điểm chảy thường cao (200-300 o C), đôi khi kèm theo sự phân hủy.

TÍNH CHẤT (tt)

• Bị hấp phụ bởi: kaolin, magnesium oxid, tinh bột,polyamid, than động vật => Tinh chế

• Bị thủy phân bằng acid tạo các sapogenin tương ứng

• Có thể tạo artefact (genin giả) do acid mạnh, dùng điềukiện nhẹ như enzym hay quang xúc tác

50

TÍNH CHẤT (tt)

• Có tính hoạt động bề mặt => Tính tạo bọt

• Có khả năng làm vỡ hồng cầu => Tính phá huyết

• Kích ứng niêm mạc, hắt hơi, đỏ mắt, nôn mửa

• Độc với cá: làm tăng tính thấm của biểu mô hô hấp, làm

cá mất điện giải

• Tạo phức với cholesterol hoặc 3-hydroxysteroid khác

NHẮC LẠI

TÍNH TẠO BỌT

• Tạo bọt bền khi lắc với nước

• Tạo bọt mạnh hay yếu tùy cấu trúc saponin

TÍNH PHÁ HUYẾT

• Làm vỡ hồng cầu (GT: gắn với cholesterol màng): cẩn thận khi sử dụng

• Hồng cầu của đông vật khác nhau có độ nhạy cảm khác nhau.

• Không có sự khác biệt giữa triterpen và steroid

• Đường phân nhánh phá huyết mạnh hơn

• Monodesmosid phá huyết mạnh hơn bisdesmosid tương ứng

52

KIỂM NGHIỆM

1 Dựa trên tính chất tạo bọt:

- Đây là tính chất đặc trưng nhất của saponin

- Giảm sức căng bề mặt của nước và tạo bọt

- Dùng để định tính saponin

- Saponin là một chất hoạt động bề mặt tự nhiên,

steroid) liên kết với phần đường ưa nước (hydrophilic) qua dây nối glycosid

1.1 Thử nghiệm tạo bọt

- Chiết DL với cồn 70%, thu dịch chiết, bốc hơi tới cắn

- Hòa cắn với một ít nước, cho vào ống nghiệm

- Lắc 1 phút (=30 lần lắc)

- Quan sát lớp bọt sau 15 phút

* Sơ bộ phân biệt saponin triterpen và saponin steroid:

- Phản ứng tạo bọt Fontan-Kaudel

Cho cắn dịch chiết cồn vào 2 ống nghiệm chứa 5 ml dungdịch HCl (pH=1) và 5 ml dung dịch NaOH (pH=13) Bịt vàlắc mạnh ống nghiệm theo quy định

+ Bọt trong 2 ống tương đương nhau: saponin triterpen.

+ Bọt trong ống pH = 13 > ống pH = 1 nhiều: saponin steroid.

56

1.2 Chỉ số bọt:

Là số ml nước để hòa tan saponin trong 1 g dược liệu

cho cột bọt cao 1 cm sau khi lắc và đọc Tiến hành trong điều kiện quy định.

2 Dựa trên tính chất phá huyết

- Khả năng làm vỡ hồng cầu cũng đặc trưng cho

saponin

- Giả thuyết: do sự tạo phức với cholesterol và ester của

nó trên màng hồng cầu

- Tuy nhiên: CSPH và khả năng tạo phức đôi khi không

liên hệ với nhau

- Hồng cầu của mỗi động vật nhạy cảm khác nhau: cừu,

thỏ, bò

58

* Chỉ số phá huyết:

Là số ml dung dịch đệm cần thiết để hòa tan saponin cótrong 1 g nguyên liệu gây ra sự phá huyết đầu tiên vàhoàn toàn đối với một thứ máu đã chọn

Tiến hành trong điều kiện quy định

3 Dựa trên độ độc đối với cá:

Chỉ số cá: Là độ pha loãng của 1 g nguyên liệu để có nồng

độ làm cho đa số cá trong 1 thử nghiệm mất thăngbằng Trong điều kiện quy định

* Phân biệt với Rotenon (Isoflavonoid)

60

Rotenon

4 Khả năng tạo phức với cholesterol

- Định tính dựa vào khả năng tạo phức không tan

- Saponin triterpenoid < steroid

5 Các phản ứng màu (không đặc hiệu)

- Phản ứng Salkowski: + H2SO4 hoặc H3PO4 cho màu

vàng, hồng, đỏ tím Thêm 1 ít acid selenic cho màu đỏmận

- Phản ứng Rosenthaler: saponin triterpenoid + vanilin

1%/HCl, hơ nóng => màu hoa cà

- Phản ứng với SbCl3/ CHCl3, soi UV 365 nm

+ Sap Triterpenoid: huỳnh quang xanh

+ Sap Steroid: huỳnh quang vàng

62

- Phản ứng Liebermann - Burchard (cắn dl/anhydric

acetic + H2SO4 đậm đặc)

+ Vòng ngăn cách hồng đến đỏ tím: triterpenoid

+ Vòng ngăn cách xanh lá cây: steroid

6 Sắc ký lớp mỏng

• Pha tĩnh: Si-gel/saponin, Si-gel+AgNO3/Sapogenin

• Mẫu: Saponin/cồn, Sapogenin/dm hữu cơ (thủy phân)

• Pha động:

- Saponin: CHCl3-MeOH-H2O (65:35:10, lớp dưới)

- Sapogenin: CHCl3-MeOH (19:1), CHCl3-Aceton (9:1),

C6H6-Etyl acetat (1:1), C6H6-Aceton (9:1) C6H6-MeOH(9:1), n-hexan-aceton (7:3), …

• Phát hiện: VS, H2SO4/cồn, hơi iod

64

8 Định lượng

Phương pháp cân:

- Chiết dược liệu bằng dung môi thích hợp

- Loại tạp, tinh khiết hóa

- Lọc, thu saponin

- Sấy đến khối lượng không đổi Cân

PP này kém chính xác, áp dụng đối với dược

liệu có hàm lượng saponin cao.

8 Định lượng

Phương pháp đo quang

• Triterpenoid : TT vanillin - sulfuric Ví dụ, định lượng acid glycyrrhetic trong Cam thảo, phản ứng cho màu tím.

• Spirostan : Akahori dùng aldehyd có nhân thơm và acid phosphoric

để định lượng Các dẫn chất A5-sapogenin, ví dụ diosgenin, thì dùng thuốc thử FeCl3- H3PO4.

+ Trộn 50 μg diosgenin và 50 ml thuốc thử, làm lạnh 5 phút trong nước đá, thêm 0,5 ml H2SO4, làm lạnh 10 phút rồi giữ ở 70 °C trong 9 phút.

+ Sau đó làm lạnh 10 phút và để yên 60 phút, đo độ hấp thu

ở 485 nm.

68

8 Định lượng

Sắc ký lỏng cao áp:

• Phương pháp hiện nay được sử dụng nhiều trong định tính,định lượng các chất nói chung và saponin nói riêng

• Cột sắc ký: Pha đảo RP-18, rây phân tử

• Hệ dung môi: hỗn hợp nước - methanol, nước - acetonitril

với các tỉ lệ khác nhau, có hay không có dung dịch đệm

• Chương trình dung môi có thể là isocratic hay gradient

• Detector: chỉ số khúc xạ (RI), hay tán xạ bay hơi (ELSD),

detector có nhiều ưu điểm nhất hiện nay là detector khốiphô MS Do các saponin ít có các nối đôi, nhất là các nốiđôi liên hợp nên thường chỉ có hấp thu tử ngoại ở vùngsóng ngắn 210 - 195 nm nên việc sử dụng detector UVtương đối hạn chế trong phân tích saponin

CHIẾT XUẤT

CHIẾT XUẤT SAPONIN

CHIẾT XUẤT

CHIẾT XUẤT SAPOGENIN

72

TINH CHẾ

- Thay đổi dung môi: nhỏ từ từ dịch chiết cồn vào DMHC

- Kết tinh trong dung môi thích hợp

- Sắc ký cột: Pha thường, đảo, rây phân tử

- Tạo bọt: Sục khí trơ  bọt  thu Saponin sạch

- Tạo phức với Cholesterol: Phá phức bằng pyridin

- Thẩm tích

- Dùng bột Mg oxyd hoặc polyamid để tách saponin khỏi

tanin: ethanol 80%

PHÂN BỐ TRONG THIÊN NHIÊN

- Trong đó ¾ là saponin triterpenoid , chủ yếu là oleanan.

gặp:Fabaceae, Araliaceae, Cucurbitaceae, Rosaceae

Liliaceae(

- Smilax), Dioscoreaceae, Amaryllidaceae, Agavaceae,

Smilacaseae.

74

- Một số ít gặp 2 lá mầm: Scrophulariaceae,

Solanaceae

- Saponin alkaloid steroid đặc biệt gặp trong các cây

thuộc chi Solanum (Solanaceae)

- Còn gặp saponin lanostan trong 1 số động vật: Hải

sâm, Sao biển

- Thực tế, không gặp Sap trong ngành Hạt trần

- Saponin thường chứa trong không bào.

- Tìm thấy trong tất cả bộ phận của cây: rễ, thân, lá,

quả, hạt

- Hàm lượng có thể đến rất cao như: Sâm chứa 5-10%

saponin, Bồ kết 10%, Cam thảo 8-10%

76

TÁC DỤNG

TÁC DỤNG

78

CÔNG DỤNG

DƯỢC LIỆU CHỨA SAPONIN

80

CAM THẢO

• Tên khoa học: Glycyrrhiza uralensis Fisch.,

Hoặc Glycyrrhiza glabra L., Fabaceae

• Bộ phận dùng: Thân rễ phơi, sấy khô

CAM THẢO

• Thành phần hóa học:

Saponin: glycyrrhizin dưới dạng muối Mg và Ca của acid

glycyrrhizic (còn gọi là acid glycyrrhizinic)

Acid glycyrrhizinic

82

acid glycyrrhetinic

CAM THẢO

• Công dụng:

- Chữa loét dạ dày

- Chữa ho, long đàm

- Kháng viêm tại chỗ

- Bảo vệ gan

-

RAU MÁ

• Tên khoa học: Hydrocotyle asistica L., Apiaceae

• Toàn cây tươi hoặc khô

86

RAU MÁ

• Thành phần hóa học:

Saponin: Asiaticosid Thủy phân cho aglycon là acid asiatic

NHÂN SÂM

- Sâm Triều Tiên, Sâm Cao Ly

- Tên KH: Panax ginseng CA Meyer, Araliaceae

- Bộ phận dùng: Rễ củ

90

NHÂN SÂM

• Thành phần hóa học:

- Saponin (ginsenosid): chủ yếu là nhóm dammaran, một ít là oleanan

- Chứa propopanaxadiol và protopanaxatriol.

- Phần lớn gọi là ginsenosid Rx theo các nhà khoa học Nhật

Bản, x thay đổi theo các saponin khác nhau.

92

NHÂN SÂM

• Công dụng:

- Bổ, tăng lực, tăng sức bền vận động

- Cải thiện năng lực tinh thần, tăng trí nhớ, chống stress

- Tăng khả năng miễn dịch, chống oxy hóa

- Bảo vệ gan, giải độc rượu

94

SÂM VIỆT NAM

- Sâm Ngọc Linh, Sâm K5, cây thuốc giấu

- Tên KH: Panax vietnamensis Ha et Grushv., Araliaceae

- Bộ phận dùng: Thân rễ và Rễ củ

SÂM VIỆT NAM

Thành phần hóa học:

- Các Ocotillol saponin : là nhóm saponin chủ yếu của

Sâm Việt nam như pseudo-G-RT4, 24(S)-pseudo-G-F11,

Ginsenosid Rh5

SÂM VIỆT NAM

Công dụng:

-Tăng lực, chống mệt mỏi, kích thích TKTW

-Tác dụng adaptogen, kháng khuẩn, long đờm

- Chống stress do tâm lý

- Dứa Mỹ (cây Thùa): Agave spp., ở Việt Nam có loài

Agave americana, Agavaceae

100