Ứng dụng của dược liệu chứa Tannin trong sản xuất dược phẩm

Phản ứng tạo màu- Phản ứng với TT Folin hoặc Folin - Ciocaulteau: Cho màu xanh => định tính & định lƣợng... ĐỊNH LƯỢNG• Phương pháp bột da* • Phương pháp tạo tủa với đồng acetat.. • Ph

ThS.DS Huỳnh Anh Duy

1

A ĐẠI CƯƠNG VỀ TANIN

I ĐỊNH NGHĨA

II CẤU TRÚC HOÁ HỌC

III TÍNH CHẤT

IV ĐỊNH TÍNH – ĐỊNH LƯỢNG

B CÁC DƯỢC LIỆU CHỨA TANIN

NỘI DUNG

ĐỊNH NGHĨA

• Những hợp chất polyphenol có trong thực vật, có vị chát được phát hiện dương tính với thí nghiệm thuộc da.

• Pseudotanin : acid gallic, các chất catechin, acid chlorogenic.

• Cơ chế thuộc da : liên kết hydro tanin và protein.

3

Cơ chế thuộc da

5

Đun chảy tanin/kiềm

PHÂN LOẠI

Tanin

Tanin pyrogallic Thủy phân đƣợc

Tanin pyrocatechic Không thủy phân đƣợc

Tanin hỗn hợp

7

1 Tanin thủy phân đƣợc

LK esther

Các acid hay gặp

Liên kết depsid

Acid gallic

Acid m-trigallic Acid m-digallic

9

Acid ellargic Acid hexahydroxydiphenic

Ribose Hamamelose

(Hydroxy-methyl-D-ribose)

11

Các đặc trưng của tanin pyrogallic

• Pseudoglycosid

yếu.

(gallotanin) hoặc acid ellargic (ellargitanin)

pyrogallol acid gallic

Các phản ứng khác

15

Một số ví dụ

Nhóm galloyl

• Là và vỏ cây Hamamelis virginiana L.

17

• Ổi: Psidium guajava L.

Casuarinin Casuarictin

2 Tanin ngƣng tụ

• Tanin không thủy phân/tanin pyrocatechic/phlobatanin.

Tanin

pyrocatechic Đỏ tanin/phlobaphen

Acid / Enzym

19

Đặc điểm tanin pyrocatechic

• Khi cất khô thu được pyrocatechin là chính.

• Cho tủa màu xanh lá đậm với muối sắt (III).

• Cho tủa bông với nước brom

• Khó tan trong nước hơn tanin pyrogallic.

21

OH

OH

pyrocatechin

Tanin pyrogallic vs tanin pyrocatechic

G-G=2, 2’, 3, 3’, 4, 4’-hexahydroxydiphenoyl

Stenophynin A

O HO

OH OH OH

OH

O HO

OH OH OH

O HO

OH

OH OH OH

OH

O HO

OH

OH OH OH

Epigallocatechin gallate (EGCG)

Epigallocatechin gallate (EGCG)

CHIẾT XUẤT

• Tanin: không tan / DM kém phân cực.

• Tan / DM phân cực : aceton, cồn, cồn loãng

và nước.

• Tan tốt nhất là nước nóng.

• Sóng siêu âm: hỗ trợ tăng hiệu suất chiết

29

TÍNH CHẤT VÀ ĐỊNH TÍNH

Định tính

2.1 Định tính hóa học

Thí nghiệm thuộc da:

- “ Da sống” ngâm vào HCl 2%, rửa nước.

- Ngâm vào dung dịch thử 5’ phút.

- Rửa sạch bằng nước, nhúng Fe (III) sulfat 1%

- Da màu nâu => tanin (+)

31

- Tủa với gelatin muối

- Tủa với phenazon

- Tủa với alkaloid

- Tạo tủa với alkaloid, một số dẫn chất nitơ

- Tủa với muối kim loại nặng

- Tạo tủa với muối của Pb, Hg, Zn, Fe, Cu.

- Tủa với K2Cr2O7 đậm đặc

35

Phản ứng tạo màu

- Phản ứng với TT Folin hoặc Folin - Ciocaulteau:

Cho màu xanh => định tính & định lƣợng

- Phản ứng với kali fericyanid

Kali fericyanid +

37

Phản ứng tạo màu

TT Stiasny: Formol + HCl, 

+

Phát hiện catechin tự do

HCl đậm đặc, 

- Nhuộm lignin

- HCl đậm đặc Hồng, đỏ

Phloroglucinol

Catechin

39

Phát hiện catechin tự do

TT Stiasny, 

Tủa đỏ gạch

Catechin

Phát hiện acid chlorogenic

( Acid 3-trans-Caffeoylquinic )

Dịch chiết

(có acid chlorogenic)

NH 4 OH Không khí

Xanh lục

41

Định tính tannin bằng sắc ký lớp mỏng

43

Định tính tannin bằng HPLC

ĐỊNH LƯỢNG

• Phương pháp bột da*

• Phương pháp tạo tủa với đồng acetat.

• Phương pháp oxy hóa (PP Lowenthal)*

• Phương pháp đo màu với thuốc thử Folin*

• Phương pháp đo màu với TT Folin - Ciocalteau*

• Phương pháp HPLC*

45

Phương pháp bột da

• Cách tiến hành:

- Chiết kiệt tanin: TT Fe (III).

- Chính xác dịch chiết, bốc hơi, sấy 105 oC, cân => T1.

- Chính xác dịch chiết, thêm bột da, khuấy đều, để yên 15’.

- Lọc Lấy chính xác dịch lọc, bốc hơi, sấy 105 oC, cân => T2.

Lượng tanin = (T1 - T2)

- Chính xác nước cất, thêm bột da, khuấy đều, để yên 15’.

- Lọc, lấy chính xác dịch lọc, bốc hơi, sấy 105 oC, cân =>

Phương pháp oxy hóa (Lowenthal)

tanin chuẩn.

KMnO4

Phương pháp oxy hóa (Lowenthal)

• Cách tiến hành

- Chiết kiệt tanin

- Chuẩn độ với KMnO4, chỉ thị màu là sulfo indigo

- Định lượng dung dịch chuyển sang vàng.

1 ml KMnO4 tương ứng với 4,157 mg tanin.

49

Phương pháp tạo tủa với Cu acetat

• Cách tiến hành

- Chiết tanin bằng cồn 60%.

- Lọc tủa, sấy, cân.

- Nung tủa được Cu oxyd

- Lấy hiệu số giữa đồng tanat và đồng oxyd rồi qui về

phần trăm.

Phương pháp tạo tủa với Cu acetat

Phương pháp tạo tủa với Cu acetat

o Chuẩn độ iod bằng Natri thiosulfat, công thức sau:

E = D - C trong đó C = (A–B) x 1,2517

o E là lượng tanin trong dung dịch đem định lượng.

o D là lượng đồng tanat xác định bằng phương pháp cân.

o C là lượng đồng oxyd kết hợp với tanin.

o A là lượng đồng cho vào dung dịch lúc ban đầu.

o B là lượng đồng thừa trong dung dịch sau khi lọc loại đồng tanat xác định bằng phương pháp đo Iod.

o (1ml natrithiosulfat 0,1N ứng với 0,00635g đồng)

Phương pháp đo màu với TT Folin - Ciocalteu

• TT Phosphomolybdostungtic / TT Folin - Denis

• Cách tiến hành

- Dịch chiết nước + TT Phosphomolybdostungtic/kiềm  Màu xanh

- Đo A ở 755 - 760 nm

- Tiến hành 2 mẫu:

+ Mẫu 1: dịch chiết đã loại tanin  Polyphenol không phải tanin

+ Mẫu 2: Không loại tanin  Polyphenol toàn phần

- Sự chênh lệch hai độ hấp thu là lượng tanin trong mẫu

53

Phương pháp đo màu với TT Folin - Ciocalteu

• TT dùng để loại tanin: bột da, casein, polyvinyl polypyrrolidon (PVPP).

• Tanin chuẩn: acid tannic Xây dựng đường chuẩn

• Tính toán kết quả: %tanin/dược liệu

Acid tannic

• Bột dược liệu (0.75 g) được chiết xuất với nước nóng ở 70 °Ctrong 15 phút.

• Để nguội và lọc, dịch chiết được cho vào bình định mức 100

mL, bổ sung đến vạch bằng methanol 30%

• Dung dịch 1: Trộn 2 mL dịch chiết trên với 8 mL nước cất và

10 mL đệm natri acetat (pH = 5)

• Dung dịch 2: thu được bằng cách lắc 10 mL dung dịch 1 với

50 mg casein trong 1 giờ, lọc

• Mẫu 1: Cho 1 mL dung dịch 1, thêm 0,5 mL thuốc thử Ciocalteu, thêm tiếp Na2CO3 33% vừa đủ 10 mL.

Folin-• Mẫu 2: Cho 1 mL dung dịch 2, thêm 0,5 mL thuốc thử Ciocalteu, thêm tiếp Na2CO3 33% vừa đủ 10 mL

Folin-• Mẫu trắng: nước cất

• Độ hấp thu được đo ở 720 nm

57

• Độ hấp thu A1 từ mẫu 1.

• Độ hấp thu A2 từ mẫu 2

• Độ hấp thu A được đo 3 lần, lấy kết quả trung bình

• Độ chênh lệch độ hấp thu:

A = (A1 - A2) tương ứng với hàm lượng tannin trong mẫu

• Chất chuẩn: acid tannic (khoảng nồng độ 10–60 μg/mL)

Phương trình hồi quy:

y = 19,346x + 0,0185

Trong đó:

- x: nồng độ (C)

- y: Độ hấp thu (A)

Lấy A thế vào phương trình hồi quy:

=> C của mẫu thử quy về acid tannic

Phương pháp đo màu với TT Folin

• TT acid phospho wolframic

• Cách tiến hành

- Dịch chiết nước + TT Folin/Na bicarbonat  Màu xanh

- Đo A, 715 nm, 2 phút

- Tiến hành 2 mẫu:

+ Mẫu 1: dịch chiết đã loại tanin bằng bột da + TT Folin

+ Mẫu 2: Không loại tanin

- Lấy hiệu mật độ quang của 2 mẫu trên

Chuẩn bị dịch chiết:

• Lấy 0,75 g dược liệu (m), thêm 150 mL nước cất.

• Đun nóng trong 15 phút Để nguội, lọc Cho dịch lọc vào bình định mức 250 mL, bổ sung nước tới vạch.

• Lọc tiếp, loại bỏ 50 mL dịch lọc đầu tiên.

• 200 mL còn lại được sử dụng cho thử nghiệm (G).

61

Mẫu trắng: nước cất.

Mẫu chuẩn: pyrogallol

Mẫu 1: Polyphenol toàn phần

• Lấy 5 mL dịch lọc (G) trên, bổ sung nước vừa đủ thành 25 mL

• Lấy 5 mL vừa pha, thêm 2 mL acid phosphowolframic (TTFolin), bổ sung vừa đủ 50 mL bằng dung dịch Na2CO3 15%

• Sau 3 phút, đo độ hấp thu A ở 715 nm

Mẫu 2:

• Lấy 20 mL dịch lọc (G) thêm 0.2 g bột da Lắc kỹ 60 phút, lọc

• Lấy 5 mL dịch lọc bổ sung vừa đủ thành 25 mL bằng nước cất

• Lấy 5 mL vừa pha, thêm 2 mL acid phosphowolframic (TTFolin), bổ sung vừa đủ 50 mL bằng dung dịch Na2CO3 15%

• Sau 3 phút, đo độ hấp thu A ở 715 nm

• Được giá trị A2

63

Tính toán:

• 50 mg pyrogallol pha trong nước cất thành 100 mL dung dịch

• Tiếp tục, lấy 5 mL pha thành 25 mL bằng nước cất

• Lấy 5 mL vừa pha, thêm 2 mL acid phosphowolframic (TTFolin), bổ sung vừa đủ 50 mL bằng dung dịch Na2CO3 15%

• Sau 3 phút, đo độ hấp thu A ở 715 nm, được A3

• Hàm lượng tannin được tính theo công thức:

) A



Phương pháp HPLC

• Pha tĩnh: RP-18, đôi khi rây phân tử (Sephadex).

• Pha động: Hỗn hợp nước, MeOH, ACN.

• Chất điều chỉnh pH: acid phosphoric, NH4H2PO4, acid

trifluoroacetic (TFA).

• Detector: UV.

• Riêng lẻ hay đồng thời.

65

- Cột sắc ký: RP-18 (SunFire,Waters, USA) (150 mm x 4,6mm, 5  m)

- Đầu dò: PAD

- Hệ dung môi: acetonitril - TFA 0,05% trong nước (pH 2.25)

- Kiểu rửa giải: gradient

- Tốc độ dòng: 1.0 mL/phút,

- Thể tích tiêm mẫu: 20  L

- Nhiệt độ cột: 25 o C.

- Bước sóng: 272 nm

A – acid tannic

B – procyanidin B2

C – acid gallic

TÁC DỤNG - CÔNG DỤNG

• Đối với thực vật:

- Chất bảo vệ: khỏi nấm mốc, côn trùng

- Tham gia trao đổi chất, oxy hóa khử.

Đối với con người

• Thuốc săn da.

• Kháng khuẩn

• Viêm ruột, tiêu chảy.

• Chữa ngộ độc (kim loại nặng và alkaloid)

• Tác dụng đông máu

71

• Các ellagitanin có tính kháng ung thư: gemin A, agrimoniin, rugosin D kháng Sarcoma 180 / chuột.

• Chống oxy hóa

• Trong công nghiệp: thuộc da.

DƯỢC LIỆU CHỨA TANIN

Ngũ bội tử

• Tổ đã phơi hay sấy khô của ấu trùng sâu Ngũ bội tử ( Melaphis chinensis (Bell.) Baker = Schlechtendalia chinensis Bell ) ký sinh trên cây Muối/cây Diêm phu mộc ( Rhus chinensis Muell.), họ Đào lộn hột (Anacardiaceae )

• Tên khoa học: Galla sinensis

• Tác dụng, công dụng

- Kháng HIV

- Ức chế peroxid hóa / chuột.

- Viêm ruột, nhiễm trùng da

77

• Tên khoa học: Psidium guajava L., Myrtaceae

• Thành phần hóa học :

- 10% tanin: Búp và lá

- Cả 3 loại tanin:

 Thủy phân được.

 Không thủy phân.

 Hỗn hợp.

• Thủy phân được: gallotanin, ellargitanin

gallotanin

81

• Không thủy phân: procyanidin-B1, prodelphinidin-B1

• Tanin hỗn hợp: acutissimin A, B; guajavin A & B.

acutissimin A Acutissimin B

83

- Catechin, gallocatechin, leucocyanidin.

- Flavonoid: quercetin, avicularin, guajaverin

Công dụng

• Kháng khuẩn mạnh.

• Kháng các dòng tế bào ung thư.

• Chữa lỵ, tiêu chảy.

Măng cụt

87

• Thành phần hóa học

- Vỏ chứa tanin 8%: Procyanidin A-2, B-2.

- Xanthon: dẫn chất isoprenyl hóa , vd:  -mangostin.

Procyanidin A-2 Procyanidin B-2

89

Công dụng

• Kháng viêm, kháng khuẩn, kháng nấm.

• Chữa lỵ, tiêu chảy.

Terminalia nigrovenulosa Kiene Terminalia catappa L.