THỬ NGHIỆM AUTO – VACCINE PHÒNG BỆNH DO E. COLI TRÊN HEO Ngành học: BÁC SĨ THÚ Y Niên khoá: 20032008 Sinh viên thực hiện: NGUYỄN VĂN ĐỨC Thành Phố Hồ Chí Minh 03

Kháng nguyên H không quyết định yếu tố độc lực vì không có vai trò bám dính, đồng thời không có ý nghĩa trong việc tạo ra miễn dịch phòng bệnh nên ít được quan tâm.. Độc tố đường ruột en

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM

KHOA CHĂN NUÔI – THÚ Y

[\

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

THỬ NGHIỆM AUTO – VACCINE PHÒNG BỆNH

DO E COLI TRÊN HEO

Ngành học: BÁC SĨ THÚ Y Niên khoá: 2003-2008 Sinh viên thực hiện: NGUYỄN VĂN ĐỨC

Thành Phố Hồ Chí Minh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM

KHOA CHĂN NUÔI – THÚ Y

[\

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

THỬ NGHIỆM AUTO – VACCINE PHÒNG BỆNH DO

E COLI TRÊN HEO

Giáo viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện: PGS.TS NGUYỄN NGỌC HẢI NGUYỄN VĂN ĐỨC Th.S NGUYỄN THỊ THU NĂM

Thành Phố Hồ Chí Minh

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu trường Trung Học Kỹ Thuật

Nông Nghiệp cùng phòng Quản Trị - Đời Sống đã tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi vừa

học vừa làm trong suốt 5 năm qua

Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu trường Đại Học Nông Lâm

TPHCM, Khoa Chăn Nuôi – Thú Y cùng tất cả quý Thầy Cô đã truyền đạt cho em

trong suốt quá trình học tập tại trường

Em rất cảm ơn PGS.TS.Nguyễn Ngọc Hải và ThS.Nguyễn Thị Thu Năm đã

nhiệt tình hướng dẫn để em hoàn thành đề tài này

Anh cũng xin cảm ơn các em Dư, Thoa, Vy, Uyên, Nhân, Châu đã chia sẻ, giúp đỡ anh khi gặp khó khăn

Cuối cùng, anh rất cảm ơn em và các con luôn bên cạnh lo lắng, chăm sóc, chia

sẻ niềm vui và nỗi buồn với anh Em và các con là niềm tình thần vô cùng quý báu của anh

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Văn Đức

TÓM TẮT

Đề tài “thử nghiệm auto – vaccine phòng bệnh do E coli trên heo”

Thời gian thực hiện từ 01/11/2008 đến 01/03/2009 tại phòng thí nghiệm vi sinh, Bộ Môn Vi Sinh Truyền Nhiễm, trường Đại Học Nông Lâm TP.HCM và trại thực tập thực nghiệm trường Trung Học Kỹ Thuật Nông Nghiệp Q.9 TP.HCM

Chúng tôi thu được kết quả:

• Auto-vaccine thực nghiệm tạo đáp ứng miễn dịch tốt

• Hiệu quả phòng ngừa tiêu chảy do E coli của auto-vaccine thực nghiệm tương đương với vaccine phòng bệnh E coli của Mỹ

• Tiêm auto-vaccine làm giảm rõ rệt lượng vi khuẩn E coli/gr phân heo so

với tiêm vaccine Mỹ (P=0,005)

• Auto-vaccine thực nghiệm không ảnh hưởng đến sức ăn, sự vận động và

hô hấp của heo con

• Auto-vaccine không gây những phản ứng phụ như ói mửa, ủ rủ, run rẩy

và hoàn hoàn không gây phản ứng cục bộ tại nơi tiêm

MỤC LỤC

TRANG

Trang tựa i

LỜI CẢM ƠN ii

TÓM TẮT iii

MỤC LỤC iv

MỤC LỤC iv

DANH SÁCH CÁC BẢNG ix

DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ x

DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ xi

Chương 1 PHẦN MỞ ĐẦU 1U 1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích đề tài 2

1.3 Yêu cầu đề tài 2

Chương 2 TỔNG QUAN 3

2.1 Giới thiệu sơ lược về E coli 3

2.1.1 Hệ thống phân loại 3

2.1.2 Đặc điểm sinh vật học 3

2.1.2.1 Đặc điểm hình thái 3

2.1.2.2 Đặc điểm nuôi cấy 3

2.1.2.3 Đặc tính sinh hóa 4

2.1.2.4 Sức đề kháng 4

2.1.2.5 Cấu trúc kháng nguyên 4

2.1.2.6 Độc tố 5

2.1.2.7 Sự kết dính 6

2.1.2.8 Tính chất gây bệnh của vi khuẩn E coli 7

2.1.2.9.Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 7

2.2 Miễn dịch ở heo con 8

2.2.1 Miễn dịch thụ động 8

2.2.2 Miễn dịch chủ động 9

2.3 Cơ chế sinh bệnh tiêu chảy của E coli 9

2.4 Triệu chứng – bệnh tích 10

2.4.1 Triệu chứng 10

2.4.2 Bệnh tích 10

2.4.3 Chẩn đốn bệnh 10

2.5 Phịng và trị bệnh 11

2.5.1 Phịng bệnh 11

2.5.2 Vệ sinh 12

2.5.3 Miễn dịch 13

2.5.4 Điều trị 14

2.6 Vaccine E coli của Mỹ 14

2.7 Auto-vaccine 15

2.7.1 Định nghĩa auto-vaccine 15

2.7.2 Quy trình sản xuất auto-vaccine 15

2.7.3 Ưu điểm và nhược điểm của việc sản xuất auto-vaccine 15

2.7.3.1 Ưu điểm 15

2.7.3.2 Nhược điểm 16

2.8 Chất bổ trợ 16

2.8.1 Định nghĩa chất bổ trợ 16

2.8.2 Tác dụng của chất bổ trợ 17

2.8.3 Chất bổ trợ MONTANIDE (chất bổ trợ sử dụng trong đề tài này) 17

Chương 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

3.1.2 Địa điểm 18

3.2 Vật liệu thí nghiệm 18

3.2.1 Đối tượng khảo sát 18

3.2.2 Thiết bị và dụng cụ 18

3.2.3 Hĩa chất 18

3.2.4 Mơi trường nuơi cấy 18

3.3 Nội dung nghiên cứu 19

3.4 Đối tượng nghiên cứu 19

3.5.1 Qui trình phân lập và giám định vi khuẩn E coli 19

3.5.1.1 Cách lấy mẫu 19

3.5.1.2 Phân lập vi khuẩn E coli 20

3.5.1.3 Tiêu chí đánh giá heo con bị tiêu chảy nghi do E coli 21

3.5.2 Điều chế auto-vaccine 21

3.5.3 Phương pháp kiểm tra hiệu giá kháng thể bằng phản ứng ngưng kết chậm trong ống nghiệm 24

3.5.3.1 Cách lấy mẫu máu và bảo quản 24

3.5.3.2 Chuẩn bị dịch kháng nguyên 26

3.5.3.3 Tiến hành phản ứng .27

3.5.3.4 Đọc kết quả 27

3.6 Đếm tổng số vi khuẩn E coli/gam phân heo con 28

3.6.1 Cách lấy mẫu 28

3.6.2 Cách pha loãng mẫu 29

3.6.3 Cách thực hiện 29

3.6.4 Công thức tính số lượng E coli/gam phân 29

3.7 Bố trí thí nghiệm để đánh giá hiệu quả của vaccine 30

3.7.1 Đối với heo nái: 30

3.7.2 Đối với heo con theo mẹ đã chủng auto-vaccine 30

3.7.3 Đối với heo con: Đếm số lượng E coli 30

3.7.4 Đối với heo con tiêu chảy lấy mẫu phân cấy phân lập 31

3.8 Các chỉ tiêu theo dõi 31

3.9 Xử lý số liệu 31

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32

4.1 Kết quả lựa chọn chủng E coli làm auto – vaccine 32

4.2 Theo dõi phản ứng của heo sau khi tiêm vaccine 32

4.3.Tỷ lệ tiêu chảy 32

4.4 Tỷ lệ heo tiêu chảy nghi do E coli 33

4.5 Tỷ lệ ngày con tiêu chảy 34

4.6 Hiệu giá kháng thể trên heo nái sau khi chủng ngừa 2 loại vaccine 35

4.7 Hiệu giá kháng thể trên heo con sau khi chủng auto – vaccine lần 1 và lần 2 36

4.8 Số lượng E coli /gram phân 37

4.8.1 Đếm số lượng khuẩn lạc vi khuẩn E coli trên heo con lần 1 và lần 2 sau khi tiêm vaccine của Mỹ trên heo nái 37

4.8.2 Đếm số lượng khuẩn lạc vi khuẩn E coli sau khi tiêm auto – vaccine lần 1 và lần 2 38

4.8.3 So sánh số lượng khuẩn lạc vi khuẩn E coli/ gram phân sau khi sử dụng hai loại vaccine 39

4.8.4 So sánh số lượng khuẩn lạc vi khuẩn E coli/ gram phân lần 1 và lần 1 sau khi sử dụng hai loại vaccine 40

4.8.5 So sánh số lượng khuẩn lạc vi khuẩn E coli/ gram phân lần 2 và lần 2 sau khi sử dụng hai loại vaccine 41

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 42

5.1 Kết luận 42

5.2 Đề nghị 42

TÀI LIỆU THAM KHẢO 43

KẾT QUẢ THỐNG KÊ 44

PHỤ LỤC 48

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 3.1 Khuẩn lạc E coli trên môi trường EMB 21

Hình 3.2: E coli trên môi trường KIA 22

Hình 3.3 Trắc nghiệm IMViC của E coli 22

Hình 3.4 Hình thái E coli khi nhuộm Gram 23

Hình 3.5 Khuẩn lạc E coli trên môi trường TSA 23

Hình 3.6 Cách lấy máu heo con 25

Hinh 3.7 Phản ứng ngưng kết 28

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Chẩn đoán phân biệt các bệnh rối loạn tiêu hóa ở heo con 11

Bảng 3.1 Phân lô, tiêm vaccine và lấy mẫu máu 30

Bảng 3.2 Ngày tiêm và liều tiêm vaccine cho heo con theo mẹ đã chủng auto-vaccine 30

Bảng 3.3 Lịch lấy mẫu máu để kiểm tra hàm lượng kháng thể heo con 30

Bảng 3.4 Phân lô đếm số lượng E coli 30

Bảng 4.1:Tỷ lệ tiêu chảy trên heo con sau khi sử dụng 2 loại vaccine 32

Bảng 4.2 Tỷ lệ tiêu chảy nghi do E coli trên heo con sau khi sử dụng 2 loại vaccine 33

Bảng 4.3 Tỷ lệ ngày con tiêu chảy sau khi sử dụng 2 loại vaccine 34

Bảng 4.4 Hiệu giá kháng thể trên heo nái sau khi chủng ngừa 2 loại vaccine (log2) 35

Bảng 4.5 Hiệu giá kháng thể trên heo con lần lấy máu 1 và 2 sau khi sử dụng auto – vaccine (log2) 36

Bảng 4.6 Kết quả đếm số lượng vi khuẩn E coli/gram phân lần 1 và lần 2 khi tiêm vaccine Mỹ (log10) 37

Bảng 4.7 Kết quả đếm số lượng vi khuẩn E coli/gram phân lần 1 và lần 2 khi tiêm auto-vaccine (log10) 38

Bảng 4.8 So sánh số lượng khuẩn lạc vi khuẩn E coli/gram phân sau khi sử dụng hai loại vaccine 39

Bảng 4.9 So sánh số lượng khuẩn lạc vi khuẩn E coli/gr phân lần 1 và lần 1 sau khi sử dụng hai loại vaccine 40

Bảng 4.10 So sánh số lượng khuẩn lạc vi khuẩn E coli/gr phân lần 2 và lần 2 sau khi sử dụng hai loại vaccine 41

DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ Sơ đồ 2.1 Hệ thống biện pháp phòng bệnh cho E coli 12

Sơ đồ 3.1 Qui trình phân lập và định danh vi khuẩn E coli (Nguyễn Ngọc Hải, 1999) 20

Sơ đồ 3.2 Qui trình tạo auto-vaccine E coli 24

Sơ đồ 3.3 Qui trình tạo dịch huyền phù kháng nguyên E coli 26

Sơ đồ 3.4 Cách tiến hành phản ứng ngưng kết xác định hiệu giá kháng huyết thanh 27

DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 4.1 Tỷ lệ tiêu chảy trên heo con sau khi sử dụng 2 loại vaccine 33

Biểu đồ 4.2.Tỷ lệ tiêu chảy nghi do E coli trên heo con sau khi sử dụng 2 loại vaccine 34

Biểu đồ 4.3 Tỷ lệ ngày con tiêu chảy trên heo con sau khi sử dụng 2 loại vaccine 35

Biểu đồ 4.4 Hiệu giá kháng thể trên heo nái sau khi sử dụng 2 loại vaccine 36

Biểu đồ 4.5 Hiệu giá kháng thể trên heo con lần lấy máu 1 và 2 sau khi sử dụng auto – vaccine 37

Biểu đồ 4.6 Kết quả đếm số lượng vi khuẩn E coli/gram phân lần 1 và lần 2 khi tiêm vaccine Mỹ 38

Biểu đồ 4.7 Kết quả đếm số lượng vi khuẩn E coli/gr phân lần 1 và lần 2 khi tiêm auto-vaccine 38

Biểu đồ 4.8 Số lượng khuẩn lạc vi khuẩn E coli/gr phân sau khi sử dụng hai loại vaccine 39

Biểu đồ 4.9 Số lượng khuẩn lạc vi khuẩn E coli/gr phân lần 1 và lần 1 sau khi sử dụng hai loại vaccine 40

Biểu đồ 4.10 Số lượng khuẩn lạc vi khuẩn E coli/gr phân lần 2 và lần 2 sau khi sử dụng hai loại vaccine 41

Thường gặp nhất trên heo con theo mẹ là bệnh tiêu chảy do vi khuẩn Escherichia coli

Bệnh xảy ra lẻ tẻ quanh năm nhưng bùng phát mạnh vào lúc giao mùa, thời tiết không ổn định, tùy thuộc vào điều kiện chăm sóc nuôi dưỡng Bệnh không gây chết cao nhưng làm thú còi cọc, chậm tăng trưởng nên gây thiệt hại lớn cho nhà chăn nuôi

Đã có nhiều công trình nghiên cứu nhằm tìm ra các biện pháp khống chế bệnh tiêu chảy trên heo con Việc phòng bệnh tiêu chảy trên heo con theo mẹ có thể được thực hiện với việc cải tiến điều kiện chăm sóc nuôi dưỡng hay tiêm phòng vaccine

Xuất phát từ tình hình thực tế trên và được sự phân công của Khoa Chăn Nuôi Thú Y Trường Đại Học Nông Lâm TPHCM, cùng với sự hướng dẫn tận tình của

PGS.TS Nguyễn Ngọc Hải và ThS Nguyễn Thị Thu Năm chúng tôi tiến hành đề tài

“thử nghiệm auto – vaccine phòng bệnh do E coli trên heo”

1.2 Mục đích đề tài

Khảo sát hiệu quả của auto-vaccine để ứng dụng trong thực tiễn

1.3 Yêu cầu đề tài

• Phân lập chủng E coli để điều chế auto-vaccine

• Thử nghiệm auto-vaccine trên 10 heo nái và đàn heo con của chúng

• Đánh giá hiệu quả auto-vaccine

• So sánh hiệu quả của auto-vaccine với vaccine Porcine Pili Shield do Mỹ sản xuất

Chương 2

TỔNG QUAN

2.1 Giới thiệu sơ lược về E coli

Escherichia coli, gọi tắt là E coli còn có tên khác là Bacterium coli được

Escherich phát hiện 1885 trong trường hợp tiêu chảy ở trẻ em và được coi như là vi khuẩn sống vô hại trong ruột già của người và động vật Đến năm 1955, Schofield và

Davis mới chứng minh được vai trò gây bệnh đường ruột của E coli ở heo con Vi khuẩn E coli theo phân của gia súc, gia cầm và người ra môi trường bên ngoài Loài động vật ăn thịt và loài ăn tạp bài tiết phân ra ngoài chứa nhiều vi khuẩn E coli hơn

2.1.2.2 Đặc điểm nuôi cấy

Trực khuẩn hiếu khí tùy nghi, mọc tốt trên các môi trường dinh dưỡng thông

thường Vi khuẩn E coli có thể sinh trưởng ở nhiệt độ 15 – 400C và nhiệt độ thích hợp nhất là 370C, pH thích hợp 7,2 – 7,4

Trên môi trường thạch, E coli hình thành khuẩn lạc tròn, mặt lồi, bờ đều bóng

nhẵn, đường kính khuẩn lạc từ 2 – 3mm

Trong môi trường canh, sau 4 – 5 giờ vi khuẩn phát triển làm đục đều tạo cặn ở phần đáy ống, có mùi thối Để càng lâu càng đục nhiều và sau 3 ngày có thể có váng mỏng trên bề mặt môi trường

Trên môi trường chẩn đoán chuyên biệt:

• Môi trường EMB có khuẩn lạc màu tím ánh kim

• Môi trường MCK hình thành khuẩn lạc màu hồng đỏ

• Môi trường KIA – TSI tạo môi trường màu vàng/vàng và sinh hơi, không sinh H2S

2.1.2.3 Đặc tính sinh hóa

Lên men sinh hơi glucose, lactose, fructose, galactose, maltose

Không lên men dextrin, glycogen

Phản ứng IMViC: indol (+), methyl red (MR +), Voges Proskauer (VP -), citrate (-)

2.1.2.4 Sức đề kháng

Bị diệt ở nhiệt độ 600C trong 15 – 30 phút, 95% bị diệt khi bị đông lạnh trong 2 giờ Chúng có thể sống ở điều kiện ngoại cảnh từ vài tuần đến 1 tháng Các chất sát trùng như : acid fenic, HgCl2, formol diệt khuẩn trong 5 phủt

2.1.2.5 Cấu trúc kháng nguyên

a) Kháng nguyên O: là kháng nguyên thân chịu nhiệt (Stable-heat), có trên 160 loại, không bị hủy ở 100 – 1200C trong 2 giờ Kháng nguyên O bền với các chất cồn, với acid HCl 1N chịu được 20 giờ nhưng bị hủy bởi formol Kháng nguyên này có bản chất là lipopolysaccharide, được chia làm 4 nhóm từ OI – OIV

b) Kháng nguyên K: có hơn 100 loại, có bản chất là polysaccharide, chịu nhiệt kém, bị hủy bởi 1000C trong 1 giờ, một số bị hủy ở 1210C trong 2 giờ Kháng nguyên

K có 4 loại : A, B, L và M

Type A: rất chịu nhiệt, khi đun 1200C trong 1 giờ không bị phá hủy, tính kháng nguyên, khả năng liên kết và kết tủa đều giữ nguyên

Type B: tương đối chịu nhiệt khi đun 100 trong 1 giờ, vẫn giữ được khả năng

ngưng kết và kết tủa Kháng nguyên này thường gặp trong nhóm E coli gây bệnh

đường ruột

0

Type L: không chịu nhiệt, bị phá hủy khi đun 100 C trong 1 giờ, mất khả năng ngưng kết, kết tủa và tính kháng nguyên

Type M: chưa được biết rõ

Phần lớn các tác giả cho rằng kháng nguyên O trong cấu trúc kháng nguyên tạo

ra hàng rào bảo vệ giúp vi khuẩn chống lại tác động ngoại cảnh và hiện tượng thực bào

c) Kháng nguyên lông H: có 60 loại từ H1 – H60, bản chất là protein chịu nhiệt thấp, ở nhiệt độ 1000C trong 2 giờ thì mất kháng nguyên Phần lớn E coli có chung

type kháng nguyên này

Kháng nguyên H là tổng hợp nhiều thành phần kháng nguyên Kháng nguyên H không quyết định yếu tố độc lực vì không có vai trò bám dính, đồng thời không có ý nghĩa trong việc tạo ra miễn dịch phòng bệnh nên ít được quan tâm Nhưng nó lại có ý nghĩa lớn trong việc xác định giống, loài của vi khuẩn

d) Kháng nguyên F (Fimbriae): là kháng nguyên khuẩn mao Chúng có dạng hình sợi dài tương đương 4µm, thẳng hoặc xoắn, giúp kết dính vi khuẩn vào nhung mao bờ bàn chải ở ruột

Các kháng nguyên khuẩn mao liên quan đến bệnh tiêu chảy:

• F4 (K88) với các dạng ab, ac, ad

a) Nội độc tố (endotoxine): là những độc tố do vi khuẩn sản sinh ra nhưng chỉ được bài xuất ra ngoài khi nào vi khuẩn bị dung giải thành phần hóa học của nó là một hợp chất gồm: glucid, lipid, protid chịu được nhiệt độ cao

b) Ngoại độc tố (exotoxine) là những chất độc do vi khuẩn tiết ra ngoài

Ngoại độc tố có bản chất protein, không chịu nhiệt (60 – 800C đã bị phá hủy),

dễ bị các phân hóa tố làm mất tác dụng Ngoại độc tố dễ tan và dễ lan rộng, tác động vào tổ chức thần kinh hay vào máu làm tăng huyết cầu

Vi khuẩn E coli có thể tiết ngoại: độc tố làm tan huyết và độc tố đường ruột

enterotoxin

Độc tố đường ruột (enterotoxin) gồm 2 loại chịu nhiệt và không chịu nhiệt

• Enterotoxin LT (heat labile enterotoxin): là ngoại độc tố không chịu nhiệt (bị

vô hoạt ở 600C trong 15 phút), gây tiêu chảy mất nước, gây độc đối với tế bào thần kinh Độc tố này có bản chất là protein chia làm 2 loại: LTa và LTb LT bị mất hoạt tính ở 56 – 580C và ở pH = 11

• Enterotoxin ST (heat sable enterotoxin) bền với nhiệt độ, gây tiêu chảy heo con

ST có trọng lượng phân tử thấp (<20000 D) và có khả năng miễn dịch kém Còn LT, ngược lại có trọng lượng phân tử cao (>100000 D) và có khả năng gây miễn dịch tốt

Ngoài ra E coli còn tiết ra một số độc tố khác như cytotoxins necrotising factor

(CNF) và hemolysine (Hly)

2.1.2.7 Sự kết dính

Tất cả E coli gây bệnh đường ruột có khả năng kết dính vào vách tế bào thành

ruột Sự kết dính này là do các pili Có 5 loại kháng nguyên F được thừa nhận là yếu tố kết dính có cấu trúc pili: F4ac, F4ab, F4ad, F5 và 987P

Ba kháng nguyên đầu giúp cho vi khuẩn khả năng kết dính vào tế bào thượng bì toàn bộ ruột non, còn kháng nguyên F5 và 987P chỉ kết dính vào tế bào thượng bì phần

giữa và phần sau của ruột non Các kháng nguyên F4 và 987P chỉ có ở vi khuẩn E coli gây bệnh trên heo Kháng nguyên F5 tìm thấy chủ yếu ở E coli gây bệnh trên bê, nhưng cũng thấy nhiều ở E coli gây bệnh trên heo con

Sự hình thành các kháng nguyên pili cũng như độc tố đường ruột đều được

kiểm soát di truyền bởi các plasmid và có thể truyền lan giữa các vi khuẩn E coli qua

pili giới tính Các plasmid pili F4 thường kết hợp với các plasmid tạo hemolysin gây dung huyết Tuy nhiên, khả năng tạo hemolysin không gây ảnh hưởng đến độc lực và

khả năng gây bệnh của vi khuẩn E coli và nhiều chủng E coli dung huyết không gây

bệnh

2.1.2.8 Tính chất gây bệnh của vi khuẩn E coli

Đặc trưng của vi khuẩn E coli gây bệnh được xác định trong mối quan hệ với

phương thức gây bệnh, nơi cư trú và hình thái gây bệnh sau khi đã cảm nhiễm, có thể trình bày tóm tắt ở bảng sau:

Theo đặc điểm sinh bệnh, vi khuẩn E coli được phân thành một số nhóm đại

diện như sau:

• ETEC (Enterotoxigenic Escherichia coli): E coli sinh độc tố đường ruột gây

tiêu chảy heo con

• EPEC (Enteropathogenic Escherichia coli) : E coli gây bệnh đường ruột gây

tiêu chảy trên heo cai sữa

• AEEC (Attaching and Effacing Escherichia coli): E coli kết dính và phá hủy

tế bào thượng bì

• EHEC (Entero haeamorrhagic Escherichia coli): E coli gây xuất huyết

đường ruột (Trần Thanh Phong,1996)

Trong những nhóm E coli gây bệnh thì ETEC được nói đến nhiều nhất và được

xem như một nguyên nhân thông thường nhất ở bệnh tiêu chảy ở thú non, từ thể nhẹ đến thể nặng, nhất là trên những thú nuôi trong những điều kiện không tốt

2.1.2.9.Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

a) Trong nước

Nguyễn Văn Lượng (1963), phân lập 500 mẫu phân con heo tiêu chảy đã xác

định được các serotype E coli: O26, O55, O86,O111, O19.

Theo Đào Trọng Đạt và cộng tác viên (1982), tỷ lệ phân lập được ở heo bệnh

cao hơn heo khỏe Tác giả cho rằng E coli giữ vai trò kế phát trong nguyên nhân gây

bệnh

Vũ Văn Ngữ và Lê Kim Thảo (1982) cho rằng có nhiều yếu tố gây loạn khuẩn

do E coli đặc biệt là khí hậu, thời tiết, chế độ ăn uống từ heo mẹ…

Nguyễn Thị Nội và cộng tác viên (1978), điều tra 8 tỉnh thấy E coli tập trung

nhiều nhất là các serotype O149, O147, O141, O138, O139, O137.

Theo Trần Sĩ Trung (2000), tỷ lệ nhiễm E coli trên heo con theo mẹ bị tiêu

chảy ở 2 trại Đồng Hiệp và Nam Hòa là 88%

Huỳnh Công Tuấn (2000), thử kháng sinh đồ các chủng E coli được phân lập

từ 100 mẫu phân heo con cai sữa của các trại Dưỡng Sanh, Đồng Hiệp, Giống Cấp I

cho thấy 72,6% các chủng E coli phân lập được nhạy cảm với kanamycine, 71,9%

nhảy cảm với ciprofloxacine, 64,5% nhạy cảm với colistine, 58,1% nhạy cảm với gentamycine

Theo Nguyễn Thụy Hải (2001), vi khuẩn E coli phân lập được từ phân heo con

tiêu chảy thuộc các type O139:K82, O141:K85ab, O138:K81, K88

Vũ Lại Xuân Hiệp (2003), kháng sinh có tác dụng tốt đối với E coli phân lập

từ phân heo con theo mẹ bị tiêu chảy lần lượt là colistine (97.1%), gentamycine (62,32%), norfloxacine (45,65%)

b) Nước ngoài

Nossle (1912) cho rằng ở đường ruột người và gia súc có một loại vi khuẩn E

coli có tính đối kháng cao với các loại vi sinh vật khác

Dxbiozek và M.Trusbinxkii (1972) khi xét nghiệm 325 chủng vi khuẩn đường

ruột từ heo bệnh tại Ba Lan đã xác định 225 chủng E coli thuộc nhóm O149.

Tại Ấn Độ theo tài liệu Xboel và Malik (1973) trong bệnh do trực khuẩn E coli

ở heo, type kháng nguyên thường xuyên phân lập được nhất là type O8

(V.V.Niconxki)

Gornoh và cộng sự (1974) cho rằng ở heo con bị nhiễm khuẩn E coli tự nhiên

trong đại bộ phận các trường hợp có thể phân lập được các type O8, O116, O147, O149 và

ít khi thấy O9, O15, O , O117 108.(trích dẫn bởi Nguyễn Thụy Hải, 2001)

2.2 Miễn dịch ở heo con

2.2.1 Miễn dịch thụ động

a) Kháng thể heo mẹ truyền qua sữa đầu

Miễn dịch ở heo con có được chủ yếu là do nhận được các nhân tố miễn nhiễm

từ sữa đầu heo mẹ

Trong những giờ đầu tiên sau khi sinh (24 – 48 giờ), heo con có thể hấp thu qua ruột các γ-globulin miễn dich có trong sữa đầu của heo mẹ để tạo miễn dịch thụ động, chủ yếu là IgG (chiếm 85%), IgM và IgA Phẩm chất và tính đặc hiệu của các γ-globulin miễn dịch này có liên quan chặt chẽ đến chất kích thích kháng nguyên ở heo

mẹ

IgG có tác dụng phòng bệnh toàn thân

IgA, IgM và đặc biệt là IgA có tác dụng phòng bệnh đường ruột

b) Nhân tố kháng tiết ASF (Anti Secretory Factor):

Có tác dụng giúp tế bào ruột non của heo con tránh được những rối loạn tiết

dịch quá mức do tác động của độc tố LT của vi khuẩn E coli

2.2.2 Miễn dịch chủ động

Từ ngày 80 trong bào thai, heo con đã có khả năng đáp ứng miễn dịch đối với một số mầm bệnh mà nó tiếp xúc (Arlette Laval, 1999, trích dẫn bởi Vũ Lại Xuân Hiệp, 2003)

Sau khi heo con được sinh ra, các tế bào lympho trong sữa đầu của heo mẹ có khả năng vượt qua hàng rào ruột kích thích sự tạo miễn dịch chủ động cho heo con xảy

ra sớm hơn

2.3 Cơ chế sinh bệnh tiêu chảy của E coli

Ở heo con, vi khuẩn E coli xâm nhập vào đường tiêu hóa qua miệng, đi qua dạ

dày dễ dàng vì pH dạ dày vẫn còn trung tính ở heo con mới sinh và đến ruột non Vi

khuẩn E coli gây bệnh chống lại được tác động của nhu động ruột nhờ khả năng bám

dính vào tế bào thượng bì nhung mao bởi các lông bám, nhân lên và sản sinh độc tố đường ruột Lông bám và độc tố đường ruột là 2 tác nhân sinh bệnh chính của vi khuẩn

E coli gây bệnh tiêu chảy ở heo con theo mẹ

Các cơ quan tiếp nhận đặc hiệu (Specific receptor) trên các tế bào thượng bì niêm mạc ruột tiếp nhận các phân tử độc tố đường ruột Các độc tố sẽ kích thích các enzyme adenyl cyclase dẫn đến tăng hàm lượng cAMP (cyclic 3’, 5’ – adenosine monophosphate) và cGMP (cyclic 3’, 5’ – guanosine monophosphate) ở trong tế bào Kết quả sự hoạt hóa này làm tăng sự vận chuyển bicarbonate và sodium và cùng với

chúng là nước từ tế bào vào ống ruột Khi sự thải tiết, sự hấp thụ nước và các chất điện giải mất cân bằng, sẽ làm cho thú tiêu chảy, mất nước và chết

2.4 Triệu chứng – bệnh tích

2.4.1 Triệu chứng

Heo bệnh đi tiêu phân lỏng như nước, có bọt trắng hoặc vàng nhạt, mùi hôi khó chịu

Một số heo bệnh có thể ói mửa, bụng thót lại, mắt lõm sâu, da tím tái

Heo bệnh bị mất nước nhanh, lông xù, suy yếu, bỏ bú và có thể chết sau 24 –

48 giờ tiêu chảy

2.4.2 Bệnh tích

Không có bệnh tích đặc trưng

Dạ dày chứa sữa đông vón hoặc thức ăn không tiêu hóa được

Ruột non xung huyết

(Nguyễn Như Pho, 1995)

2.4.3 Chẩn đoán bệnh

Chứng viêm ruột ỉa chảy ở heo con do nhiều nguyên nhân gây ra Theo

Bergeland (1980) chỉ có khoảng 50% trường hợp tiêu chảy ở heo con theo mẹ do E

coli gây ra Tiếp theo E coli là Isospora suis chiếm 23%, Rotavirus 20,9% và TGE (Transmissible gastroenteritis) chiếm 11,2%

Để chẩn đoán phân biệt, bên cạnh các dấu hiệu lâm sàng về giải phẫu bệnh lý, cần được khẳng định bằng chẩn đoán phòng thí nghiệm

Bước đầu tiên trong chẩn đoán phân biệt sơ bộ là phải xác định được pH của phân là acid hay kiềm Dịch tiêu chảy do phân tiết có pH kiềm, trong khi đó dịch tiêu

chảy do kém hấp thụ (mal absorption) là acid Do vậy, viêm ruột do E coli gây ra

phân có pH kiềm, còn do virus phân có pH là acid

Bước tiếp theo là phải phân lập vi khuẩn E coli và kiểm tra sự hiện diện của

kháng nguyên F4, F5 và enterotoxin Đồng thời, kiểm tra tổ chức học niêm mạc ruột non xem các nhung mao có bị teo hay không Bảng dưới đây nêu sự chẩn đoán phân biệt các bệnh gắn liền với triệu chứng rối loạn tiêu hóa của heo con

Bảng 2.1 Chẩn đoán phân biệt các bệnh rối loạn tiêu hóa ở heo con

Nguyên nhân Tuổi

mắc bệnh

Tình trạng phân

Bệnh tích đại thể Bệnh tích vi thể Phương pháp chẩn đoán

phòng thí nghiệm

1 Escherichia

coli Nhỏ-sau cai sữa Lỏng có màu

trắng hoặc vàng

Dưỡng chấp lỏng màu trắng

Không có Phân lập vi

khuẩn

2 TGE Sơ sinh

– trưởng thành

Lỏng Thành ruột

non mỏng, dưỡng chấp trong

Teo nhung mao rõ rệt Phân lập virus

3 Rotavirus Sơ sinh

– sau cai sữa

Lỏng hoặc nhão

Dưỡng chấp lỏng Teo nhung mao vừa

hoặc vàng

Chất chứa lỏng, màng giả ở ruột non

Hoại tử fibrin mức độ khác nhau

Nhuộm tiêu bản niêm dịch, giám định cầu trùng

5.Clostridium

perfringens

type C

1 – 14 ngày

Phân lỏng lẫn máu

Xuất huyết hoại tử nhiều bọt khí

Hoại tử niêm mạc xuất huyết

Nhuộm tiêu bản, phân lập

vi khuẩn gram dương

6.Treponema

hyodysenteriae

7 ngày – trưởng thành

Nhầy lẫn máu

Màng giả ở ruột già

Sưng và bào mòn niêm mạc

Phân lập vi khuẩn nhuộm tiêu bản niêm mạc

Để phòng bệnh do E coli có hiệu quả cần thực hiện các biện pháp tổng hợp

một cách có hệ thống với phương châm tăng cường tốt khả năng miễn dịch của heo con và giảm đến mức thấp nhất khả năng tiếp xúc với vi khuẩn này Hệ thống biện pháp phòng bệnh tổng hợp có thể minh họa bằng sơ đồ dưới đây:

- Di truyền

- Dinh dưỡng Heo Miễn dịch

-Chủng vaccine -Phòng bệnh khác Giảm

quần

thể

E coli

-Nền chuồng sạch và khô

-Không khí khô ấm Môi trường Vệ sinh

-Kiểm dịch

- Hóa liệu pháp

Sơ đồ 2.1 Hệ thống biện pháp phòng bệnh cho E coli

2.5.2 Vệ sinh

Kết cấu chuồng trại có ảnh hưởng rất lớn đến số lượng vi khuẩn E coli trong

môi trường, do vậy phải cố gắng thiết kế nền chuồng sao cho thoát phân và nước tiểu heo nái ra khỏi nền chuồng nhanh nhất Ở Tây Âu và Bắc Mỹ người ta thường thiết kế nền chuồng heo nái có lỗ hoặc khe có kích thước vừa đủ để phân và nước tiểu lọt xuống rãnh và thoát ngay sau khi được thải ra, giúp cho nền chuồng heo bao giờ cũng khô ráo và sạch sẽ

Môi trường ấm và khô không những sẽ làm giảm số lượng vi khuẩn E coli tồn

tại ở trong chuồng mà còn giảm sự thoát nhiệt của heo con Sự mất nhiệt cơ thể là stress chủ yếu đối với heo con sơ sinh, làm giảm sức đề kháng của chúng

Cần phải kiểm soát sự xuất nhập heo ở trại chặt chẽ để tránh du nhập các

serotype E coli khác hoặc các tác nhân gây ra bệnh khác vào trại

Bên cạnh đó, có thể cho heo mẹ ăn thức ăn có trộn kháng sinh để giảm tạm thời

số lượng vi khuẩn E coli trong đường ruột Tuy nhiên, chỉ nên sử dụng thức ăn có

kháng sinh trong thời gian trước và sau khi đẻ Việc sử dụng kháng sinh kéo dài có thể làm tăng nhanh chóng hiện tượng kháng- kháng sinh, dẫn đến giảm hiệu lực điều trị

và sữa Sự bảo vệ của kháng thể khỏi nhiễm trùng đường ruột của heo con sơ sinh chỉ

có hiệu lực khi chúng ở trong đường ruột

Trong tuần lễ đầu sau khi sinh, mỗi ngày heo con hấp thụ từ sữa mẹ khoảng 3g γ-globulin miễn dịch Không có các kháng thể được hấp thụ này, heo con sẽ hoàn toàn

mẫn cảm với nhiễm khuẩn E coli, cho dù đã nhận đủ lượng sữa đầu (Trần Đình Từ,

2003)

Heo con có thể bắt đầu sản sinh kháng thể cho mình vào khoảng 10 ngày tuổi, cho đến khi đó, miễn dịch bảo vệ hoàn toàn phụ thuộc vào kháng thể trong sữa mẹ Đầu tiên các IgM được sản xuất, sau đó là IgA Vài ngày sau kháng thể IgA trở nên trội trong các dịch tiết đường ruột IgA đóng vai trò rất quan trọng trong cơ chế miễn dịch tại chỗ của bề mặt niêm mạc

Các yếu tố có ảnh hưởng đến cơ chế miễn dịch ở heo nái như các yếu tố di truyền, dinh dưỡng, qui trình tiêm chủng và sự hiện diện của một số bệnh khác rõ ràng

là có ảnh hưởng đến cơ chế bảo vệ ở heo con

Bất kỳ bệnh nào làm giảm sự tiết sữa đều giảm hiệu lực của cơ chế bảo vệ Sự thiếu hụt dinh dưỡng do mức ăn vào không đủ hoặc sự thiếu cân bằng trong thành phần dinh dưỡng của mẹ đều ảnh hưởng đến hàm lượng kháng thể trong sữa Sự thiếu hụt vitamin làm giảm khả năng sản xuất kháng thể và người ta phát hiện thấy sự tương quan giữa mức vitamin E thấp và chỉ số tiêu chảy tăng cao (Trần Đình Từ, 2003)

Sự ức chế bằng kiểm soát di truyền đối với sự kết dính E coli mang kháng

nguyên F4 vào tế bào niêm mạc ruột được ghi nhận Đã có một vài nghiên cứu nhằm

chọn lọc những dòng heo nái có sức đề kháng cao với vi khuẩn E coli gây bệnh

Tiêm chủng vaccine cho heo nái và heo con là một biện pháp hữu hiệu giảm

thiệt hại do E coli gây ra Vaccine E coli có hiệu lực thông dụng phải chứa đủ 5 thành

phần kháng nguyên F4ac, F4ab, F5, 987P và LT

Tóm lại, để giảm tổn thất do E coli gây ra cần thực hiện một hệ thống biện

pháp tổng hợp, trong đó chú ý quản lý – chăm sóc tốt cho heo nái trong thời kỳ mang thai và heo con sơ sinh (Trần Đình Từ, 2003)

2.5.4 Điều trị

Trong công tác điều trị cần chú ý tổng hợp triệu chứng điển hình của bệnh tiêu chảy là mất nước và chất điện giải vì đây là nguyên nhân chính làm giảm khả năng sinh trưởng và tăng tỷ lệ chết của heo con Để điều trị bệnh đạt được kết quả tốt chúng

ta phải phối hợp các nhóm thuốc một cách hợp lý để tạo ra tác động đồng bộ, triệt để

và nhanh chóng

Chúng ta cần làm kháng sinh đồ để xem độ nhạy cảm của vi khuẩn đối với kháng sinh Các loại kháng sinh thường sử dụng như gentamycine, colistine, norfloxacine, streptomycine, bactrium…

Các vitamin dùng để tăng cường sức đề kháng và khả năng chịu đựng của cơ thể như vitamin A, vitamin C và vitamin B

Bổ sung nước và các chất điện giải, cung cấp năng lượng cho cơ thể như truyền glucose Cung cấp vi sinh vật có lợi vào cơ thể để chúng cạnh tranh lấn áp các vi

khuẩn độc hại, tái lập sự cân bằng hệ vi sinh đường tiêu hóa như Saccharomyces,

Lactobacillus…

2.6 Vaccine E coli của Mỹ

Vaccine có tên thương mại là Porcine Pili Shield – vaccine vi khuẩn vô hoạt ngừa bệnh tiêu chảy và bệnh sưng phù đầu trên heo con

Hãng sản xuất là Novartis Animal Health (USA) Nhà phân phối độc quyền tại Việt Nam là công ty TNHH TM & SX Thuốc Thú Y Thịnh Á (ASIFAC)

Thành phần: vaccine vô hoạt chứa các yếu tố F4, F5, 987P và F41

Đặc tính thuận lợi của sản phẩm:

• Nái tơ và nái rạ được chủng ngừa trước khi đẻ thì heo con đẻ ra bú sữa mẹ được bảo hộ ngay từ ban đầu do trong sữa mẹ có chứa kháng thể

• Can thiệp trực tiếp được trên heo con

• Trên 90% bệnh trạng tiêu chảy heo con do vi khuẩn E coli gây ra có một hay

tất cả các yếu tố yếu tố, F4, F5, 987P và F41

• Kháng thể do heo mẹ tạo ra trong sữa đầu sẽ ức chế sự kết bám của vi khuẩn làm chúng khơng cịn bám vào thành ruột để phát triển gây độc tố làm tiêu chảy heo con

• Nái rạ và nái tơ 2 – 5 tuần trước khi đẻ chích liều 2ml/con Tái chủng trước 2 tuần ở các lứa đẻ kế tiếp

• Heo con từ 7 – 10 ngày tuổi chích liều 0,5ml/con Tiêm nhắc lại lúc

3 – 4 tuần tuổi với liều 1ml/con

• Cần bổ sung thêm liều trị kháng sinh và cung cấp chế độ ăn cĩ dinh dưỡng đầy đủ và cân đối

2.7 Auto-vaccine

2.7.1 Định nghĩa auto-vaccine

Auto-vacine là vaccine mang mầm bệnh (vi khuẩn hoặc virus) của vật chủ hay vùng dịch nào đó và được sử dụng để chủng ngừa cho chính vật chủ hay vùng dịch đó

2.7.2 Quy trình sản xuất auto-vaccine

Việc đầu tiên trong quy trình sản xuất auto-vaccine là cần phân lập mầm bệnh (vi khuẩn hoặc virus) từ mô bệnh hoặc dịch chiết của vật chủ mang bệnh

Tiếp theo, mầm bệnh sẽ được làm chết hoặc làm yếu bởi các tác nhân hoá học, nhiệt, điện hay phóng xạ

Sau cùng kháng nguyên được tinh sạch và bổ sung một số chất cần thiết để thành phẩm auto-vaccine

2.7.3 Ưu điểm và nhược điểm của việc sản xuất auto-vaccine

Có tính đặc hiệu cao vì tạo miễn dịch chuyên biệt

Phương pháp hiệu quả chống lại vi khuẩn có tính kháng rộng

Phương pháp phòng ngừa hữu hiệu đối với virus biến chủng nhanh hay vi khuẩn kháng kháng sinh nhanh

Có thể được sử dụng để phòng ngừa những tác nhân gây bệnh ở dạng phân tử ( như prion…)

Chi phí sản xuất cao, giá thành phẩm cao

Khó để thương mại hóa auto-vaccine thành phần

2.8 Chất bổ trợ

Ngày nay các hãng sản xuất vaccine luôn bổ sung chất bổ trợ và sản phẩm của mình Sử dụng chất bổ trợ để đem lại hiệu quả cho vaccine là bí quyết riêng của mỗi công ty

2.8.1 Định nghĩa chất bổ trợ

Chất bổ trợ là một tác nhân được bổ sung vào vaccine có tác dụng tăng cường kích thích hệ miễn dịch, tạo nên sự đáp ứng với vaccine mạnh và dài hơn, qua đó nâng cao hiệu quả của vaccine

Muối nhơm là một trong những chất bổ trợ được sử dụng nhiều và sớm trong vaccine, đặc biệt là vaccine cho người Tuy nhiên, những nghiên cứu gần nay cho thấy chất bổ tr nhôm là nguyên nhân gây chết các neuron vận động sau khi tiêm ợ

Một số chất bổ trợ được sử dụng trong vaccine thú y và tác dụng của chúng:

• Muối nhôm: kéo dài sự biểu hiện của kháng nguyên

• Yếu tố bề mặt (saponin, lysolecthin,…) hoạt hóa sự biểu hiện của kháng nguyên

• Nhũ dầu: kéo dài sự biểu hiện kháng nguyên

• Thành phần cấu tạo của vi khuẩn: hoạt hóa đại thực bào và tế bào lympho Phức hợp carbonhydrate: hoạt hóa đại thực bào

2.8.2 Tác dụng của chất bổ trợ

Chất bổ trợ giúp kháng nguyên di chuyển đến các hạch lympho, tại đây chúng được tế bào lympho T nhận diện Nhờ vậy mà có nhiều lympho T được hoạt hóa để tham gia tạo kháng thể

Chất bổ trợ như một tác nhân bảo vệ vật lý giúp kháng nguyên kéo dài sự biểu hiện bên trong cơ thể được tiêm vaccine Qua hệ miễn dịch có thêm thời gian để tăng cường điều chỉnh tế bào lympho T và B

Chất bổ trợ giúp tăng sức chịu đựng tại nơi tiêm, giải tỏa những phản ứng phụ nguy hiểm

Chất bổ trợ không chỉ tăng cường đáp ứng miễn dịch đặc hiệu quả mà còn tăng cường đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu

2.8.3 Chất bổ trợ MONTANIDE (chất bổ trợ sử dụng trong đề tài này)

Montanide được sử dụng bởi công ty SEPPIC (trụ sở chính tại công ty Paris, Pháp), là chất bổ trợ tăng cường tính hiệu quả và sự ổn định của vaccine, ngoài ra nó còn làm giảm những phản ứng phụ trên cơ thể được tiêm vaccine thương phẩm trên nhiều loài như heo, bò, cá…và chỉ được sử dụng trong thú y

Đặc điểm Montanide:

• Dạng chung dịch dầu hỗn hợp Anhydro mannitlether octodecenoate

• pH 5-7

• Không mùi, có màu vàng

o

• Điểm sôi >100 C

• Điểm bốc cháy >100oC

• Không tự bốc cháy, không tự nổ

• Không hòa tan trong nước, hòa tan trong các dung môi

• Lưu trữ: cần bảo quản ở nhiệt độ lạnh

Chương 3

NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài

3.2.1 Đối tượng khảo sát

Gồm 20 heo nái sinh sản và đàn heo con của chúng

Dung dịch formol 0,5% dùng để bất hoạt vi khuẩn

3.2.4 Môi trường nuôi cấy

EMB (Eosin Methylen Blue)

TSA (Tryptone Soya Agar)

TSB (Tryptone Soya Broth)

3.3 Nội dung nghiên cứu

Phân lập vi khuẩn E coli từ mẫu phân heo con tiêu chảy ở trại để sản xuất

auto-vaccine

Đánh giá hiệu quả của auto-vaccine trên heo nái và heo con thí nghiệm vaccine)

(auto-3.4 Đối tượng nghiên cứu

Mẫu máu: heo nái 20 con, 1 mẫu/ con

Heo con 60 con, 1 mẫu/ con Mẫu phân:

Phân tiêu chảy: lấy 82 mẫu phân/ 82 heo con tiêu chảy

Phân không tiêu chảy: 120 mẫu/ 120 heo con

và đậy nút bông ống nghiệm cẩn thận

Mẫu được để trong thùng có chứa đá và vận chuyển nhanh về phòng thí nghiệm

Mẫu được cấy ngay hoặc để trong tủ lạnh 4 – 80C không quá 24 giờ

3.5.1.2 Phân lập vi khuẩn E coli

Mẫu phân

EMB

Trắc nghiệm IMViC