KHẢO SÁT TỈ LỆ NHIỄM VIRUS VIÊM NÃO NHẬT BẢN TRÊN HEO VÀ BIẾN ĐỘNG KHÁNG THỂ MẸ TRUYỀN TRÊN HEO CON Ở MỘT SỐ TRẠI THUỘC HUYỆN CỦ CHI THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT TỈ LỆ NHIỄM VIRUS VIÊM NÃO NHẬT BẢN TRÊN HEO VÀ BIẾN ĐỘNG KHÁNG THỂ MẸ TRUYỀN TRÊN HE

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT TỈ LỆ NHIỄM VIRUS VIÊM NÃO NHẬT BẢN TRÊN HEO VÀ BIẾN ĐỘNG KHÁNG THỂ MẸ TRUYỀN TRÊN HEO CON Ở MỘT SỐ TRẠI THUỘC HUYỆN CỦ CHI THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

Họ và tên sinh viên: NGUYỄN HỮU TRUNG Ngành: DƯỢC THÚ Y

Niên khoá: 2004 – 2009

Thành phố Hồ Chí Minh

Tháng 09/2009

KHẢO SÁT TỈ LỆ NHIỄM VIRUS VIÊM NÃO NHẬT BẢN TRÊN HEO VÀ BIẾN ĐỘNG KHÁNG THỂ MẸ TRUYỀN TRÊN HEO CON Ở MỘT SỐ TRẠI THUỘC HUYỆN CỦ CHI THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

Tác giả NGUYỄN HỮU TRUNG

Khoá luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp bằng Bác sĩ Thú y chuyên ngành Dược thý y

Giáo viên hướng dẫn

TS LÊ ANH PHỤNG

Tp Hồ Chí Minh Tháng 09/2009

LỜI CẢM TẠ

Thành kính ghi ơn

Con xin suốt đời ghi ơn Cha, Mẹ người đã sinh thành, nuôi con lớn khôn và dạy dỗ con nên người như ngày hôm nay

Xin chân thành biết ơn

Ban giám hiệu trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh cùng toàn thể quý thầy, cô khoa Chăn Nuôi – Thú Y đã tận tình giảng dạy, truyền đạt tri thức cho em trong suốt thời gian học tập tại trường

Chân thành biết ơn TS Lê Anh Phụng đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho em trong suốt quá trình thực tập và hoàn thành luận văn

Tôi xin cảm ơn tất cả bạn bè đã giúp đỡ và ủng hộ tôi trong quá trình học tập cũng như quá trình thực hiện luận văn tốt nghiệp

MỤC LỤC

Chương 1 MỞ ĐẦU 2

1.1 Đặt vấn đề 2

1.2 Mục đích đề tài 3

1.3 Yêu cầu của đề tài 3

CHƯƠNG 2 CƠ SỞ LÝ LUẠN 4

2.1 Tổng quan về bệnh VNNB 4

2.1.1 Đặc điểm chung của bệnh 4

2.1.2 Tình hình bệnh viêm não Nhật Bản 4

2.1.2.1 Tình hình bệnh ở các nước 4

2.1.2.2 Tình hình bệnh viêm não Nhật Bản ở việt nam 6

2.1.3 Những nghiên cứu về bệnh viêm não Nhật Bản 6

2.1.3.1 Những nghiên cứu trên thế giới 6

2.1.3.2 Những nghiên cứu ở việt nam 8

2.2 Căn bệnh 9

2.2.1 Đặc diểm hình thái của virus 9

2.2.2 Sức đề kháng 9

2.2.3 Đặc tính nuôi cấy và khả năng gây bệnh tích tế bào 9

2.2.4 Đặc tính ngưng kết hồng cầu 10

2.3 Truyền nhiễm học 10

2.3.1 Động vật cảm thụ 10

2.3.2 Động vật trung gian truyền bệnh 10

2.2.3 Chất chứa căn bệnh 11

2.3.4 Cơ chế sinh bệnh 11

2.3.5 Vòng truyền lây virus viêm não Nhật Bản .12

2.4 Triệu chứng – bệnh tích 13

2.4.1 Triệu chứng 13

2.4.1.1 Triệu chứng bệnh trên heo 13

2.4.1.2 Triệu chứng bệnh trên người 13

2.4.1.3 Các loài khác 14

2.4.2 Bệnh tích 14

2.4.2.1 Bệnh tích đại thể 14

2.4.2.2 Bệnh tích vi thể 14

2.5 Chuẩn đoán bệnh VNNB trên heo 15

2.5.1 Chuẩn đoán dựa trên lâm sàng 15

2.5.1.1 Dựa vào dịch tễ 15

2.5.1.2 Chẩn đoán phân biệt 15

2.5.2 Chẩn đoán phòng thí nghiệm 15

2.5.2.1 Chẩn đoán virus học 15

2.5.2.2 Chẩn đoán huyết thanh học 16

2.6 Điều trị 16

2.7 Phòng bệnh 16

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VA PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

3.1 Thời gian và địa điểm 18

3.1.1 thời gian tiến hành đề tài 18

3.1.2 Địa điểm tiến hành đề tài 18

3.2 Vật liệu thí nghiệm 18

3.2.1 mẫu khảo sát 18

3.2.2 Hồng cầu ngỗng 19

3.2.3 Kháng nguyên viêm não Nhật Bản 19

3.2.4 Dụng cụ 19

3.3 Nội dung 19

3.4 Phương pháp nghiên cứu 19

3.4.1 Bố trí lấy mẫu huyết thanh heo 19

3.4.2 Cách lấy mẫu – bảo quản mẫu 20

3.4.3 Chuẩn bị hồng cầu (hc) ngỗng: 21

3.4.4 Xử lý huyết thanh 21

3.4.4.1 Xử lý với kaolin 21

3.4.4.2 Xử lý với hồng cầu 21

3.4.5 Chuẩn độ kháng nguyên (phản ứng HA: haemagglutination) 21

3.4.6 Xử lý huyết thanh (mẫu) 23

3.4.7 Phương pháp thực hiện phản ứng hi (haemagglutination inhibition) 24

3.4.8.Các chỉ tiêu theo dõi: 27

3.4.9 Phương pháp sử lý số liệu 28

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẠN 29

4.1 Tỷ lệ nhiễm chung 29

4.2 Tỷ lệ nhiễm virus VNNB ở heo trên theo trại chăn nuôi 30

4.3 Tỷ lệ nhiễm virus VNNB trên heo thịt ở trại chăn nuôi 31

4.4 Tỷ lệ nhiễm virus VNNB trên nhóm heo sinh sản ở các trại 34

4.5 Tỷ lệ nhiễm virus VNNB trên nhóm heo sinh sản 35

4.6 Hiệu giá kháng thể chống virus VNNB trên heo dương tính 36

4.7 Hiệu giá kháng thỂ kháng virus VNNB trên trại khảo sát 38

4.8 Hiệu giá kháng thể trên các nhóm heo 40

4.9 Tỷ lệ mẫu dương tính trên heo con sinh ra bởi nái nhiễm virus vnnb 42

4.10 Hiệu giá kháng thể của heo con qua các thời điểm khảo sát 44

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 48

5.1 KẾT LUẬN 48

5.2 ĐỀ NGHỊ 49

TÀI LIỆU THAM KHẢO 50

PHỤ LỤC 53 

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Sơ đồ bố trí lấy mẫu huyết thanh heo ở các trại ………… ……… 18

Bảng 3.2 Bố trí lấy mẫu huyết thanh heo con sinh ra bởi heo nái có kết quả dương tính……… 19

Bảng 3.3 Sơ đồ thực hiện phản ứng HA ……… 22

Bảng 3.4 Sơ đồ thực hiện phản ứng HI ……… 24

Bảng 3.5 Kiểm tra đơn vị ngưng kết của kháng nguyên ……… 25

Bảng 4.1 Tỷ lệ mẫu dương tính ……… 27

Bảng 4.2: Tỷ lệ nhiễm virus VNNB trên từng trại khảo sát … ……… 28

Bảng 4.3 Tỷ lệ mẫu dương tính virus VNNB trên heo thịt ……… ………… 29

Bảng 4.4 Tỷ lệ nhiễm virus VNNB trên heo nái ở các trại ……… 31

Bảng 4.5 Tỷ lệ nhiễm virus VNNB trên từng nhóm heo ……… 32

Bảng 4.6 Hiệu giá kháng thể chống virus VNNB trên heo dương tính ……… 33

Bảng 4.7 Hiệu giá kháng thể chống virus VNNB theo trại khảo sát……… 35

Bảng 4.8 Hiệu giá kháng thể kháng virus VNNB trên các nhóm heo……… 36

Bảng 4.9 Tỷ lệ mẫu dương tính qua các giai đoạn khảo sát ……… 38

Bảng 4.10 Hiệu giá kháng thể các mẫu dương tính qua các thời điểm khảo sát … 39

Bảng 4.11 Chỉ số MG qua từng giai đoạn khảo sát……… 40

DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ VÀ HÌNH

Hình 2 1: Muỗi Culex ……… 10

Biểu đồ 4.1: Tỷ lệ heo nhiễm virus VNNB trên các trại khảo sát……… 21

Biểu đồ 4.2: Tỷ lệ nhiễm VNNB trên heo thịt ở các trại chăn nuôi ……… 30

Biểu đồ 4.3: Tỷ lệ nhiễm virus VNNB trên heo nái ……… 32

Biểu đồ 4.4: Tỷ lệ nhiễm virus VNNB trên các nhóm heo sinh sản ……… 33

Biểu đồ 4.5: Tỷ lệ các mức hiệu giá kháng thể kháng virus VNNB ……… 34

Biểu đồ 4.6: Chỉ số MG trong dàn heo khảo sát của các trại ……… 36

Biểu đồ 4.7: Chỉ số MG trong các nhóm heo khảo sát ……… 37

Biểu đồ 4.8 Tỷ lệ mẫu huyết thanh heo con dương tính qua các thời điểm khảo sát 39

Biểu đồ 4.9: Chỉ số MG qua các thời điểm ……… 41

TÓM TẮT LUẬN VĂN

“Khảo sát tỷ lệ nhiễm Virus VNNB trên heo và biến động kháng thể mẹ truyền trên heo con

ở một số trại thuộc huyện Củ Chi, Tp HCM.”

Mẫu huyết thanh heo được lấy 01/03/2009 đến 30/08/2009 tại 04 trại thuộc huyện Củ Chi, xét nghiệm tại phòng vi sinh, khoa Chăn Nuôi – Thú Y, trường Đại học Nông Lâm Tp HCM

Mẫu huyết thanh heo được lấy ngẫu nhiên chia làm hai đợt

Đợt 01 Mẫu được lấy trên các đối tương Thịt, Hậu bị, Nái đẻ 1-3 lứa, Nái đẻ nhiều hơn 03 lứa với tổng số mẫu là 216

Đợt 02 Mẫu được lấy từ heo con sinh ra bởi heo nái có kết quả dương tính ở đợt 01 Thời điểm lấy mẫu là 07, 14, 21, 28 ngày tuổi Tổng số mẫu là 48

Mẫu khảo sát được lấy trên 04 trại heo thuộc huyện Củ Chi, Tp HCM Nhằm khảo sát về tỷ

lệ nhiễm virus viêm não Nhật Bản, xác định hiệu giá mẫu huyết thanh dương tính Biến động của kháng thể mẹ truyền chống virus VNNB trên heo con Trong thời gian từ 01/03/2009 đến 30/08/2009

Qua xét nghiệm huyết thanh heo bằng phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu ngỗng nhằm phản ánh tình trạng nhiễm virus viêm não Nhật Bản trên đàn heo khảo sát, chúng tôi ghi nhận một

• Tỷ lệ mẫu dương tính ở heo con 07 ngày tuổi là 100% giảm dần theo thời điểm 14 ngày tuổi còn 66,7%, Thời điểm 21 ngày tuổi còn 41,6%, Thời điểm 28 ngày tuổi còn 16,6%

• Hiệu giá kháng thể giảm từ 1/80 ( chiếm 50%) ở 07 ngày tuổi đến 1/20 ( chiếm 50%) ở

14 ngày tuổi Chỉ số MG thời điểm 07 ngày tuổi từ 62 xuống 10 lúc 14 ngày tuổi Trong khảo sát này kháng thể mẹ truyền chống virus viêm não Nhật Bản chỉ bảo vệ heo con tới 11 ngày tuổi

Tuy nhiên, ở Việt Nam lâu nay, người ta chỉ nghiên cứu bệnh trên người còn bệnh trên heo không được chú ý mà chỉ coi heo là một mắt xích quan trọng trong việc lây lan bệnh cho người mà thôi Ngành chăn nuôi heo ở nước ta hiện nay đang trên đà phát triển mạnh nhưng trong chăn nuôi gia đình ở các tỉnh cũng như một số trại chăn nuôi heo tập trung nhất là các trại heo ở Thành Phố Hồ Chí Minh thường xuyên gặp phải hiện tượng rối loạn sinh sản Điều này ảnh hưởng rất lớn đến năng suất chăn nuôi và hiệu quả kinh tế

Theo tài liệu của OIE (Tổ chức dịch tể Thế Giới), nước ta nằm trong vùng dịch tể của bệnh Viêm Não Nhật Bản B Bệnh có ở nhiều nước Châu Á như: Nhật, Phần viễn tây của Nga, Hàn Quốc, Trung Quốc, Đài Loan, Philipin, Singapore, Malaysia, Hồng Kông, Việt Nam, Lào, Thái Lan, Miến Điện, Srilanka, Ấn Độ và một số đảo ở Thái Bình Dương…Nguyên nhân gây rối loạn sinh sản ở heo có nhiều như: Dịch tả heo, Aujeszky, Parvovirus, Leptospirosis… Theo khuyến cáo của OIE thì Virus Viêm Não Nhật Bản B cũng là nguyên nhân chính gây nên sẩy thai và chết sau sinh trên heo ở các nước Đông Á Xuất phát từ thực tiễn chăn nuôi heo hiện nay, được sự phân công của khoa Chăn Nuôi Thú Y- Trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài:

“KHẢO SÁT TỈ LỆ NHIỄM VIRUS VIÊM NÃO NHẬT BẢN TRÊN HEO VÀ BIẾN ĐỘNG KHÁNG THỂ MẸ TRUYỀN TRÊN HEO CON Ở MỘT SỐ TRẠI THUỘC HUYỆN CỦ CHI THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH”

Dưới sự hướng dẫn của:

Tiến sĩ.Lê Anh Phụng

1.2 Mục đích đề tài

-Xác định tỉ lệ nhiễm virus Viêm Não Nhật Bản B trên các hạng heo (nái, hậu bị, thịt, con ) khu vực Củ Chi, Tp Hồ Chí Minh

-Khả năng truyền kháng thể từ mẹ qua con ở heo mẹ bị nhiễm

1.3 Yêu cầu của đề tài

-Dùng phản ứng HI để phát hiện kháng thể viêm não Nhật Bản trên mẫu huyết thanh heo

CHƯƠNG 2

CƠ SỞ LÝ LUẬN

2.1 TỔNG QUÁT VỀ BỆNH VIÊM NÃO NHẬT BẢN

2.1.1 Đặc điểm chung của bệnh

Viêm não Nhật Bản B (JE: Japanese Encepphalists B) hiện nay gọi là bệnh viêm não Nhật Bản (VNNB) là bệnh truyền nhiễm chung giữa người và động vật

(zoonosis), bệnh do một loại Arbovirus nhóm B gây ra Bệnh lan tràn từ súc vật sang con người qua các loài muỗi (đặc biệt là muỗi Culex, Aedes) Lâm sàng có biểu hiện

thần kinh phong phú (run, co giật, liệt…), tỷ lệ tử vong cao, khi khỏi thường dể lại nhiều di chứng Trên người, bệnh ở thể nhẹ hoặc bán cấp tính, đôi khi bệnh xảy ra viêm não, gây tử vong ở trẻ em, hoặc sảy thai ở thai phụ Trên heo chủ yếu gây xáo trộn sinh sản như: sẩy thai, chết thai, heo con sinh ra chết (Trần Thanh Phong, 1996)

2.1.2 Tình hình bệnh viêm não Nhật Bản

2.1.2.1 Tình hình bệnh ở các nước

Bệnh VNNB được ghi nhận thường xuyên ở các nước Đông Nam Á như: Indonesia, Philippine, Singapore, Malaysia, Hồng Kông, Việt Nam, Thái Lan, Lào , Miến Điện Ngoài ra, bệnh còn được ghi nhận ở Nhật Bản, Liên Xô cũ, Triều Tiên, Trung Quốc, Đài Loan, Bangladesh, Nepal, Skrilanka, Ấn Độ và quần đảo Thái Bình Dương

Bệnh này được phát hiện đầu tiên ở Nhật Bản từ những năm 1871, nhưng mãi đến năm 1924 mới biết rõ về lâm sàng của bệnh khi có 1 vụ dịch lớn với hơn 6000 người mắc bệnh Dịch bệnh kéo dài tử tháng 8 đến tháng 10 và cao điểm là cuối tháng

8 với con số tử vong lên đến 60% Sau đó Yamaguchi đã tiến hành xét nghiệm 152 mẫu huyết thanh heo ở thành phố Hufu (Nhật) từ năm 1985 đến năm 1986: kết quả có

106 mẫu huyết thanh heo dương tính chiếm tỷ lệ 70%

Bệnh đã xuất hiện ở Hàn Quốc năm 1958, trong trận dịch có 6897 ca mắc bệnh Sau đó năm 1982, bệnh xuất hiện trở lại nước này với số người mắc bệnh là 2975 ca

Năm 1969, ở Thái Lan, một ổ dịch xảy ra ở thung lũng Chiang Mai với 685 ca bệnh trên người và người ta con ghi nhận heo ở đây cũng bị nhiễm virus VNNB Cũng tại miền Bắc nước này, hằng năm những ổ dịch xuất hiên với hàng ngàn ca bệnh và hàng trăm người chết Điều này cho thấy, viêm não Nhật Bản là một trong những nguyên nhân hàng đầu dẫn đến tử vong và tàn tật ở trẻ em Còn ở miền Đông, kết quả điều tra huyết thanh học cho thấy các vùng lưu hành bệnh VNNB B ở người, tỷ lệ nhiễm virus viêm não B lên đến 70% (Burke, 1985)

Bệnh được ghi nhận ở Úc năm 1995, sau khi xét nghiệm 96 mẫu huyết thanh của người ở vùng Timika bằng phương pháp ELISA, cho thấy có 9 mẫu huyết thanh

có kháng thể kháng virus VNNB (Huỳnh Thị Thu Hương, 2002)

Ờ Trung Quốc, người ta ước lượng có hơn 10.000 trường hợp mắc bệnh mỗi năm và số tử vong chiếm 10% số mắc bệnh (Phạm Sỹ Lăng và Nguyễn Thiện, 2002)

Riêng ở Ấn Độ mỗi năm có 3 đến 4 ngản người mắc bệnh Còn các nước khác thuộc Đông Nam Á (Mianma, Nepal, Malaysia…) hàng năm đều xảy ra các ổ dịch VNNB B (OMS, 1984)

Trong các vùng dịch tễ, khi xảy ra các ổ dịch VNNB ở người thì súc vật trong cùng khu vực có tỷ lệ nhiễm virus rất cao Heo là vật nuôi phổ biến ở rất nhiểu nước Châu Á (như Nhật Bản và Đài Loan), mẫn cảm với virus VNNB hơn các loài vật nuôi khác (như ngựa, dê, cừu, …) Bệnh do virus VNNB ở heo cũng gây ra những tổn thất nghiêm trọng bởi tỷ lệ nhiễm và tỷ lệ chết của heo đều cao Ở nhật trong các ổ dịch xảy ra tư năm 1947-1949, nhiểu địa phương có tỷ lê heo nái bi sẩy thai, tỷ lệ heo con

có hội chứng viêm não và chết lên đến 50-70% trên tổng đàn Ở miền Đông Thái Lan, kết quả điều tra huyết thanh học cho thấy ở các vùng lưu hành bệnh VNNB trên người thì tỷ lệ heo nhiễm virus VNNB lên đến 70% (Burke, 1985)

2.1.2.2 Tình hình bệnh viêm não Nhật Bản ở Việt Nam

Việt Nam là một trong những nước nằm trong vùng dịch tễ của bệnh VNNB có nguy cơ tăng nhanh về số lượng người mắc bệnh Bệnh thường phổ biến ở miền Bắc, nhưng trong những năm gần đây, bệnh lan tràn ở các tỉnh phía nam nhiều trận dịch làm nhiều người chết Bệnh đã trở gây thành mối lo ngại cho sức khỏe cộng đồng và cho ngành chăn nuôi heo nái sinh sản

Virus VNNB được phát hiện lần đầu tiên trên người ở miền Bắc năm 1952 (Pujirdo và

Prevot, 1953), trên não chim liếu điếu - Garrulus Perpicillates (Đỗ Quan Hà, 1964), trên muỗi Aedes (Viện Pasteur Tp HCM, 1963), trên muỗi Culex (Nguyễn Thị Kim

Thoa, 1974) và não heo tại Thanh Hóa (Đỗ Quang Hà, 1975) Theo viện vệ sinh dịch

tễ Hà Nội (1998), tỷ lệ huyết thanh dương tính với virus viêm não Nhật Bản trên trẻ

em 10 đến 12 tuổi rất cao như ở: Bình Dương (67%), Bình Định (93,7%), Sóc Trăng (58,3%), Hải Phòng (75,6%), Hà Tây (67,7%)… Bệnh viêm não Nhật Bản trên người

đã xuất hiện rải rác tại 53/61 tỉnh thành của Việt Nam (Bộ y tế, 1999) Trên heo, tỷ lệ nhiễm virus viêm não Nhật Bản ở một số địa phương theo các nhà nghiên cứu như ở

Mỹ Tho là 82% (Đỗ Quang Hà và Vũ Thị Quế Hương, 1978), ở Tp HCM là 75% (Lê Hồng Phong, 1995), ở vùng đồng bằng Nam Bộ là 70,4% (Lê Hùng Thịnh, 1994), ở khu vực miền Trung và Tây Nguyên là 30,2% (TTTY vung Đà Nẵng, 1998), tại Đồng Tháp từ 41,76% đến 63,43% (Trần Thanh Phong, Nguyễn Ngọc Tuân và Hồ Nguyễn Thiện Trung, 2003)

2.1.3 Những nghiên cứu về bệnh viêm não Nhật Bản

2.1.3.1 Những nghiên cứu trên Thế Giới

Nhật Bản là nước đầu tiên phát hiện ra căn bệnh viêm não Điều đó đã chứng minh

có rất nhiều người đã nghiên cứu bệnh này ở Nhật, chẳng hạn như:

• Futaki (1924), Kaneko (1925) đã mô tả vụ dịch năm 1924 lan tràn ở nhiều vùng của Nhật Bản, bệnh được gọi là viêm não Nhật Bản B hay viêm não mùa hè (Futaki, 1924) hay viêm não Nhật Bản (Takaki, 1925)

• Kaneko, Uchiyama và kawakava (1925), nghiên cứu về đặc điểm tổn thương não do virus VNNB gây ra

• Fujita (năm 1933), phân lập được nguyên nhân gây bệnh, sau đó Taniguchi đã tiến hành định danh và đặc tên virus phân lập từ ngựa là virus VNNB B vao năm 1936 Cũng vào năm này Bertrand, Miyashita, Miyake đã nêu lên đặc him tổn thương giải phẩu bệnh lý của VNNB, đặc biệt là hiện tượng viêm quanh mạch Cách vài năm sau đó (1959) Kakimura nghiên cứu về lâm sang về dịch tễ của dịch VNNB ở Nhật Sau đó Shiraki và cộng sự trình bày trong hội thảo quốc tế về “Tình hình VNNB B ở Nhật”, năm 1963

• Những năm gần đây (1976, 1977), Hisamura, Osaga và cộng sự đã chứng minh vai trò của virus trong rối loạn sinh sản của heo đực Những nghiên cứu của Shimura (1954), Sugimuri (1977), Joo (1979) và các cộng sự đã phát hiện ra phương thức tác động của virus lên phôi và thai trên heo nái mang thai

• Ngoài ra còn các nghiên cứu của Fujita, Mitamura, Jonhson đã nghiên cứu về

bề mặt virus, về tính chất virus, về tính gây bệnh thực nghiệm, phân lập được

virus từ muỗi Culex tritaeniorhynchus Mitamura và cộng sự đã nghiên cứu về

các thay đồi theo mùa (khí hậu) với số lượng muỗi và sự hiện diện của virus trong muỗi

Song song với tình hình nghiên cứu ở Nhật, thì việc nghiên cứu bệnh VNNB cũng được đẩy mạnh ở các quốc gia khác:

- Ở Nga, Sublaize và Petriseva (1940-1941) lần lượt phân lập được virus và xác định được vật chủ trung gian truyền bệnh là các giống muỗi Culex và muỗi Aedes

- Ở Thái Lan có Sabin AB (1947), Hullinghorot, Tong Tai Choi (1949) và Sabin Wang (1964) nghiên cứu dịch tễ học của bệnh viêm não

- Ngoài ra còn có các nghiên cứu của Hemson và cộng sự (1956-1957), nghiên

cứu về sự truyền bệnh của muỗi Culex tritaeniorhynchus Vào năm 1973, Self

và cộng sự đã xác định được vật chủ trung gian truyền bệnh VNNB B là muỗi

Culex tritaeniorhynchus

- Với tình hình bệnh ngày càng lan rộng ra các nước, việc nghiên cứu không còn

là của riêng một quốc gia nào mà nó đã trở thành mối lo chung của cả cộng đồng thế giới Do dó Tổ chức Y tế Thế giới (WHO,1979), đã có những báo cáo

về bệnh VNNB là bệnh gây nguy hiểm trên người và gây thiệt hại trầm trọng trên đàn heo sinh sản

2.1.3.2 Những nghiên cứu ở Việt Nam

Theo ghi nhận của các nhà khoa học, ở nước ta hiện nay có trên 50 chủng virus VNNB đã phân lập được của cả hai miền Bắc và miền Nam (các chủng virus và năm phân lập được ghi trong phụ lục)

Những nghiên cứu được tiến hành từ nhiều năm nay và ngày càng thu được những kết quả đáng lo ngại

Năm 1953, Pujirdo và Prevot đã nhận xét sơ bộ về 98 trường hợp viêm não theo mùa trong quân đội Pháp-Việt Ngay năm sau (1954), họ đã đưa ra những xác nhận đầu tiên về sự hiện diện của virus VNNB ở Việt Nam

Năm 1960, Trịnh Ngọc Phan và Phạm Song đã có những nhận xét về kết quả điều trị 60 trường hợp viêm não tiên phát

Năm 1964, Đỗ Quang Hà và ctv ở Viện vệ sinh dịch tễ Hà Nội đã phân lập được 4 chủng virus là HN-51, HN-59, HN-60,LĐ-67 và đến 1975 mới phân lập được chủng TH-L-560

Năm 1992, Lê Hồng Phong và ctv đã dùng phản ưng HI để phát hiện tỷ lệ nhiễm virus VNNB trên 195 heo nái và heo đực giống trong số 260 heo (chiếm tỷ lệ 75%) Ngoài ra ông còn phát hiện tỷ lệ nhiễm trên bò là 10%

Năm 1994, Lê Hùng Thịnh đã điều tra tổng số 648 mẫu huyết thanh ở các trại heo thuộc Tp HCM đã có 363 mẫu dương tính chiếm tỷ lệ là 56,02% Cũng năm 1994, Nguyễn Việt Thanh đã điều tra tổng số 405 mẫu huyết thanh heo ở khu vực đồng bằng Nam Bộ và có 285 mẫu dương tính chiếm tỷ lệ 70,73%

Sau đó năm 1997, Ngô Đức đã nghiên cứu 554 mẫu huyết thanh heo các loại,

số mẫu dương tính chiếm tỷ lệ là 55,05%

Năm 2002, Huỳnh Thị Thu Hương đã điều tra tình hình nhiễm virus VNNB trên heo huyện Củ Chi với 907 mẫu huyết thanh, tỷ lệ heo mang kháng thể kháng virus VNNB là 24,37%

2.2 CĂN BỆNH

2.2.1 Đặc diểm hình thái của virus

Virus VNNB được xếp vào giống Flavivirus, họ Flaviviridae được tách ra từ họ

Togaviridae hình cầu, kích thước trung bình từ 40-70 nm, trọng lượng phân tử 4*106 , nhân chứa một sợi ARN Cápsid có cấu trúc hình khối nhiều mặt (có 32 capsome) Phần vỏ giàu lipid Virus qua được lọc Seitz, Berkefeld V và N (Đỗ Quang Hà, 1998)

2.2.2 Sức đề kháng

Virus kém chịu đựng nhiệt độ cao Ở 60oC virus chết sau 10 phút, ở 70oC virus chết sau 5 phút Trái lại, ở nhiệt độ lạnh (-70oC) thì nó vẫn giữ nguyên độc lực trong nhiều năm

Các hóa chất như cồn, ether, aceton làm mất hoạt lực của virus sau 3 ngày Lysol tiêu diệt virus sau 5 phút, phenol 1% virus chết sau 10 phút, formol 0,5% virus chết sau 48 giờ Virus bền vững ở pH: 9 và không bị lắng bởi protaminesulfat (Phạm Sỹ Lăng và Nguyễn Thiện, 2002)

2.2.3 Đặc tính nuôi cấy và khả năng gây bệnh tích tế bào

Virus VNNB nhân lên nhanh chóng trên nhiều loại tế bào một lớp tiên phát (sơ cấp) cũng như một số dòng tế bào có nguồn gốc từ các loại động vật có vú và chim hay trên mô của muỗi Virus tạo thể vùi trên tế bào thận khỉ (LLC-MK2, Vero), chuột lang ( BHK-21) và thận heo, tế bào dòng C6/36 của muỗi Aedes albopictus, tế bào

LSTM-AP-61

Khi nuôi cấy virus trên tế bào thận chuột thì sau 60 phút đã có những virus này hiên diện trong nguyên sinh chất của một vài tế bào, những tế bào khác chưa thay đổi Sau 3 đến 4 ngày, hầu như các tế bào thoái hóa hoặc bung ra khỏi thành của chai nuôi cấy Khi quan sát bằng kính hiển vi điện tử, nhận thấy virus đã nhân lên ở mức độ cao

và tập trun g rải rác thành những đám lớn hoặc rải ràc trong nguyên sinh chất tế bào (Đố Quang Hà và Vũ Thĩ Quế Hương, 1998)

Theo Nguyễn Duy Thanh (1992), Virus có thể nuôi cấy trong phôi gà, trên tế bào phôi gà (màng CAM: Chorio Allantoic Membrane) và tạo plaque trên tế bào xơ phôi gà (C.E.F: Chicken Embryo Fibroplast)

2.2.4 Đặc tính ngưng kết hồng cầu

Virus viêm não Nhật Bản có khả năng gây ngưng kết hồng cầu gà, vịt, ngỗng,

bồ câu, chim và các loại cầm khác Nhưng tốt nhất là hồng cầu gà con 1 ngày tuổi và hồng cầu ngỗng

2.3 TRUYỀN NHIỄM HỌC

2.3.1 Động vật cảm thụ

Theo nghiên cứu điều tra về dịch tễ ở các nước Đông Nam Á, Chu và Joo (1993) đã xác định các loài thú nuôi cảm nhiễm virus VNNB gồm: heo, ngựa, bò, dê, cừu, chó, thỏ, trong đó heo mẫn cảm hơn các loài thú khác Nhiêu loài dộng vật hoang cũng cảm nhiểm virus như: chuột cống, chuột nhắt, khỉ, thằn lằn và nhiều loài chim

trời thuộc họ Ardidae (Diệc-Cò) Một số loài gia cầm như gà, vịt, bồ câu cũng cảm

nhiễm virus Phần lớn những loài thú này đồng vai trò tàng trữ virus trong tự nhiên (nguồn dịch tự nhiên) và truyền lây mầm bệnh sang người Bệnh thường nặng trên thú non

Động vật thí nghiệm gồm chuột bạch 2 đến 4 ngày tuổi, khỉ (tiêm vào não) và heo (tiêm virus vào tĩnh mạch tai heo nái mang thai)

Trên người, tỷ lệ trẻ em mắc bệnh cao hơn người lớn gấp 5 đến 10 lần Nhóm tuổi thường mắc bệnh nhất là từ 2 đến 7 tuổi với triệu chứng viêm não, viêm màng não dẫn đến tử vong (14-20%) hoặc để lại nhiều di chứng chậm phát triển thần kinh, liệt vận động, liệt toàn thân, tàn tật suốt đời (Huỳnh Phương Liên, 1999)

2.3.2 Động vật trung gian truyền bệnh

Nghiên cứu của các nhà khoa học từ lâu đã biết được vai trò môi giới của một

số loài muỗi truyền virus VNNB B cho người và súc vật Loài muỗi truyền bệnh chủ

yếu là Culex tritaeniorhynchus (Self và ctv, 1973) Trong tự nhiên người ta cũng phát hiện virus VNNB B tồn tại và phát triển được ở 1 số loài muỗi thuộc giống Culex,

Aedes và Anopheles Thí nghiệm truyền virus VNNB B cho các loài thằn lằn bằng loài

muỗi C pipiens pallens đã thành công

Khi nhiễm virus muỗi cái có thể truyền virus sang đời con của nó Muỗi Culex

tritaeniorhynchus sinh sản phát triên nhiều nhất ở đồng ruộng, đốt chim, gia súc và

người Muỗi ưa hoạt động trong và xung quanh nhà từ 18 giờ đến 20-22 giờ, giảm dần

và ngừng hoạt động lúc 8 giờ sáng (Nguyễn Duy Thanh, 1992)

Trong tự nhiên, heo bị nhiễm virus do muỗi đốt Hiện tượng nhiễm virus huyết xảy ra từ sau 12 giờ đến 2 ngày, kháng thể được tạo trong máu sau 1- 4 tuần khi bị nhiễm (Scherner và ctv, 1959) Qua vết đốt của muỗi, virus vào máu gây viremia và phát tán đến các mạch máu của các mô có nhiều mạch máu như gan, lách, cơ và virus tiếp tục sinh sản Sau đó, virus nhanh chóng đến hệ thống thần kinh trung ương qua đường dịch não tủy và tủy sống, tế bào mạng lưới nội mô, đại thực bào, hoặc những tế

bào lâm ba Nhưng chính cơ quan sinh dục chịu tác động mạnh nhất, tại đây virus gây viêm dịch hoàn (ở heo đực giống) hoặc nhân lên trong phôi, hậu quả làm chết phôi ở heo nái Trên thực nghiệm, tiêm virus vào tĩnh mạch heo nái mang thai có thể phát hiện virus ở bào thai sau 7 ngày Một số trường hợp virus không qua được nhau thai,

do đó người ta cho rằng virus gây bệnh trên phôi còn tùy thuộc vào giai đoạn của thai

kì Khi nái mắc bệnh vào 1/3 giữa của thai kì (nái có chửa 40- 60 ngày) tác hại thất rõ nhất Thai chết là do sự nhân lên không kiểm soát của virus dẫn đến sự phá hủy các tế bào của thai làm cho các thai này không sống được đến giai đoạn thai có khả năng miễn dịch Tuy nhiên, khi tuổi thai trên 85 ngày tuổi ít bị ảnh hưởng Ở trên người và trên chuột, virus viêm não Nhật Bàn xâm nhập và phá hoại chủ yếu các neuron thần kinh, đặc biệt ở vùng thân não, các hạch thần kinh và lớp trong cùng của vỏ não

2.3.5 Vòng truyền lây virus viêm não Nhật Bản (Bùi Quý Huy, 2002)

2.4 TRIỆU CHỨNG - BỆNH TÍCH

2.4.1 Triệu chứng

2.4.1.1 Triệu chứng bệnh trên heo

Ở heo con 1-3 tháng tuổi mắc bệnh thể hiện trạng thái viêm não tủy với các triệu chứng thần kinh rõ ràng như: run, co giật,…(Phạm Sỹ Lăng và Nguyễn Thiện, 2002)

Ở heo trưởng thành thì ngược lại, phần lớn heo mắc bệnh thể hiện các triệu chứng lâm sang không rõ rệt, hoặc thể hiện bệnh ẩn tính (Phạm Sỹ Lăng và Nguyễn Thiện, 2002)

Trên heo nái bị bệnh có triệu chứng viêm tử cung và âm đạo chảy dịch Đặc biệt ở heo nái mang thai khi bị nhiễm virus, virus xâm nhập vào thai làm chết thai, sẩy thai, hậu quả heo mẹ có thể bị tử vong Ở Nhật Bản các chuyên gia thú y đã xác định trong một

số vùng dịch tễ heo cái bị sẩy thai và chết thai với tỷ lệ 50 – 70 % Một số nái có hiện tượng thai chết lưu khi nhiễm virus (Phạm Sỹ Lăng và Nguyễn Thiện, 2002)

Ở heo đực giống, có triệu chứng viêm dịch hoàn cấp tính khi bị nhiễm virus Kiểm tra tinh dịch của những con đực nhiễm virus các nhà khoa học đã phát hiện có virus hiện diện

2.4.1.2 Triệu chứng bệnh trên người

Các trường hợp bệnh nhẹ: có các triệu chứng như: nhức đầu, sốt nhẹ, khó chịu trong vài ngày và rất dễ bị bỏ qua, sau đó có thể xuất hiện triệu chứng lâm sàng của 1 bệnh viêm não điển hình, hay bệnh đột phát với sốt cao nhức đầu dữ dội Trong một vụ dịch thì cứng gáy, nhức đầu, sốt và thay đổi cảm giác là 4 triệu chứng đủ để chẩn đoán nghi bệnh viêm não Nhật Bản (Đỗ Quang Hà, 1998)

Các trường hợp nặng: bệnh nhân sốt cao, ngủ li bì, rối loạn tiếng nói Co giật thường gặp ở trẻ em Đau mình mẩy và rồi loạn tiêu hóa Trí giác lẫn lộn, mê sản, hôn

mê và cứng toàn thân Các phản xạ nông và sâu đều thay đổi Sốt cao liên tục từ 2 – 4 ngày nhưng nhịp tim tương đối chậm (Đỗ Quang Hà, 1998)

2.4.1.3 Các loài khác

Ngựa và bò cũng là những vật nuôi mẫn cảm, nhiễm virus viêm não B với tỷ lệ cao Ngựa nhiễm virus VNNB thường ở thể hiện thể ẩn tính, rất ít trường hợp có triệu chứng lâm sàng rõ rệt Cơ quan Dịch tễ Thế Giới (OIE) thông báo rằng ở các vùng dịch tể Châu Á năm 1748- 1967, số ngựa bệnh có triệu chứng lâm sàng chỉ ở tỷ lệ 44,8/100 ngàn ngựa bị nhiễm virus Ngựa nhiễm bệnh có triệu chứng lâm sàng như: sốt cao (40oC - 41,5oC), sợ ánh sang, các bắp thịt run rẩy, đi loạng choạng không định hướng Ở Trung Quốc, ngưới ta đã điều tra về dịch tễ, thấy vịt có tỷ lệ dương tính là 20% khi kiểm tra huyết thanh (Phạm Sỹ Lăng- Nguyễn Thiện, 2002)

2.4.2 BỆNH TÍCH

2.4.2.1 Bệnh tích đại thể

Bệnh tích đáng chú ý hoặc thai chết hoặc heo con sinh ra yếu ớt là do viêm não, não tích nước, phù thủng dưới da, xoang ngực tích nước, xuất huyết màng thanh mạc, hạch lâm ba xung huyết, hoại tử điểm ở gần gan và lách, xung huyết ở màng não và tủy sống (Burn, 1950)

Ở heo nọc, có lượng lớn dịch nhầy ở bao dịch hoàn và có nhiều fibrin ở dịch hoàn phụ và bao dịch hoàn (Phạm Sỹ Lăng và Nguyễn Thiện, 2002)

Mổ khám ngựa chết do bệnh, người ta cũng thấy một số tổn thương ở não và tủy sống gần giống như ở heo (Phạm Sỹ Lăng và Nguyễn Thiện, 2002)

Ở người bệnh, có não phù và xung huyết do hiện tượng tụ máu ở não Não to và nặng, tĩnh mạch nổi rõ, có nhiều chấm xuất huyết Bệnh tích này còn thấy ở nhiều nội tạng khác (Nguyễn Duy Thanh, 1992)

2.4.2.2 Bệnh tích vi thể

Quan sát bệnh tích vi thể ở não với điểm đặc trưng là viêm não không có mủ với sự xâm nhập của tế bào bạch cầu đơn nhân, tế bào lâm ba, tương bào và các tế bào thần kinh thoái hóa

Ở heo nọc, có hiện tượng phù thủng ở dịch hoàn, viêm với sự thâm nhiễm của các tế bào ở mô kẻ của dịch hoàn phụ và tinh mạc (Bùi Quý Huy, 2002)

Ở người, khi bị nhiễm bệnh thì có sự xâm nhiễm của tế bào đa nhân, đơn nhân,

tế bào lâm ba và đại thực bào vây quanh huyết quản (chủ yếu là quanh tĩnh mạch) ở

phần chất xám Sau đó đến các tế bào thần kinh thoái hóa và tiêu tan để lại những khoảng trống rỗng (không có tế bào), có ranh giới rõ rệt, hình tròn hoặc hình bầu dục,

có khuynh hướng kết hợp nhau, thường gặp trong chất xám nhiều nhất ở lớp trong của

vỏ não Các ổ hoại tử này không thể hồi phục được Ngoài ra còn có hiện tượng tiêu

mỡ thần kinh, quá sản tế bào thần kinh đệm, tổn thương phân phối rộng rãi ở đại não, trung não, tiểu não, thân não, tủy sống và vỏ não (Nguyễn Duy Thanh, 1992)

2.5 CHUẨN ĐOÁN BỆNH VNNB TRÊN HEO

2.5.1 Chẩn đoán dựa trên lâm sàng

Dựa vào các triệu chứng lâm sàng đặc trưng của bệnh trên heo như là: sẩy thai

ở heo nái, hội chứng viêm não ở heo con và viêm dịch hoàn ở heo đực

2.5.1.1 Dựa vào dịch tễ

Để chuấn đoán heo bị bệnh viêm não Nhật Bản, trước hết ta phải dựa vào tính chất dịch tễ của bệnh như vùnh đó đã từng xảy ra bệnh viêm não Nhận Bản, có xuất hiện muỗi là yếu tố trung gian gây bệnh, heo ở đó thường bị sẩy thai…

2.5.1.2 Chẩn đoán phân biệt

Cần phân biệt bệnh viêm não với các bệnh gây xáo trộn thần kinh và các bệnh gây rối loạn sinh sàn khác (Trần Thanh Phong, 1996)

2.5.2 Chẩn đoán phòng thí nghiệm

Để chẩn đoán bệnh được chính xác, thì không chỉ dựa vào dịch tễ học hay chỉ dựa vào triệu chứng, mà cần phải phối hợp chúng với những xét nghiệm phòng thí nghiệm thì mới cho kết quả chính xác nhất Có 2 cách xét nghiệm phòng thí nghiệm:

2.5.2.1 Chẩn đoán virus học

Lấy bệnh phẩm là máu trong giai đoạn nhiễm virus huyết (3 -4 ml) cho vào lọ

có hòn bi thủy tinh lắc đều 15 – 20 phút để chống đông hoặc lấy từ mô não, mô lách từ thú chết (không được quá 3-4 giờ sau khi chết) Sau đó tiêm ruyền vào não và phúc mạc chuột bạch mới đẻ rồi tiến hành nuôi cấy và giám định virus nhờ vào phản ứng miễn dịch huỳnh quang (trực tiếp, gián tiếp), phản ứng trung hòa

2.5.2.2 Chẩn đoán huyết thanh học

Một số kỹ thuật chẩn đoán mới trong lĩnh vực huyết thanh miễn dịch đã được

áp dụng để chẩn đoán bệnh viêm não Nhật Bản trên người và súc vật trong những năm gần đây, trong đó dùng phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI), phản ứng miễn dịch enzyme (ELISA), phản ứng trung hòa (VNT) và kỹ thuật huỳng quang kháng thể (IFAT) Các phương pháp này giúp cho việc chẩn đoán bệnh sớm và chính xác

2.6 ĐIỀU TRỊ

Ở người hiện chưa có thuốc đặc trị Biện pháp điều trị thường là nâng cao sức chống đỡ của cơ thể dối với virus, làm cho cơ thể tự tạo miễn dịch chống lại virus Do vậy, thời gian điều trị phải kéo dài 1- 2 tháng Sau khi hồi phục, một số người (đặc biệt

là trẻ em) thường để lại di chứng rõ rệt Di chứng có thể mất đi sau một thời gian nhưng có thể kéo dài trong suốt cuộc đời Những di chứng thường gặp là lật chân hoặc tay, teo cơ từng bộ phận… Nếu trong giai đoại cấp tính thì phải hồi sức cấp cứu và điều trị triệu chứng như: hạ sốt, điều hòa phản ứng của hệ thần kinh, chống phù não, chống co giật, chống suy hô hấp, trợ sức, trợ tim mạch (Nguyễn Duy Thanh, 1992)

Tuy nhiên, theo Phạm Sỹ Lăng và Nguyễn Thiện (2002), thì việc sử dụng kháng nhiễm tố Alpha A (Interferon- Alpha A) đem lại kết quả tốt trong việc điều trị bệnh viêm não B ở ngươì, nhưng lại không có kết quả trong việc điều trị heo bệnh

Nhưng đối với gia súc mắc bệnh lâm sàn thì biện pháp tốt nhất là không điều trị, mà đem xử lý để diệt nguồn bệnh, tránh lây lan trong đàn

Do đó ta phải sức quan tâm giải quyết bệnh viêm não B ở người và động vật mắc bệnh Việc chăm sóc điều trị, trợ sức cẩn thận chu đáo là biện pháp hết sức quan trọng làm cho bệnh nhân hồi phục dần trong thời gian dài (Phạm Sỹ Lăng và Nguyễn Thiện, 2002)

nhằm tạo miễn dịch chủ động chống virus viêm não B Ở nước ta, biện pháp này được sử sụng (rộng rãi từ nhiều năm nay) phòng bệnh viêm não Nhật Bàn

có hiệu quả cho người chủ yếu là trẻ em (ở heo vẫn chưa có vaccine phòng ngừa bệnh VNNB)

- Diệt côn trùng là môi giới truyền bệnh mà chủ yếu là diệt muỗi Culex trong mùa lây lan bệnh cũng là biện pháp quan trọng để phòng bệnh Biện pháp này ở Việt Nam cũng như nhiều nước trong vùng dịch tễ viêm não B đã thực hiện thường xuyên và có hiệu quả cao trong việc phòng bệnh

- Khi dịch bệnh xảy ra thì việc chẩn đoán và phát hiện người bệnh để điều trị và súc vật mang mầm bệnh để xử lý là biện pháp cần thiết

Vaccin dùng trong phòng bệnh viêm não Nhật Bàn

Có vaccine nhược độc và vaccine vô hoạt Hầu hết là dung trên người, đôi khi

có thể dùng trên thú

Ở người tiêm vaccine VNNB cho trẻ em từ 1-15 tuổi, trẻ <3 tuổi tiêm 0,5 ml, trẻ > 3 tuổi tiêm 1ml Tiêm 2 liều, mỗi liều cách nhau 7 ngày, một năm sau khi tiêm mũi thứ 2 thì tiêm mũi thứ 3 (theo quy trình tiêm phòng của Viện Vệ sinh Dịch Tể Trung ương)

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1Thời gian và địa điểm

3.1.1 Thời gian tiến hành đề tài

Từ ngày 1-3 đến ngày 30-8-2009

3.1.2 Địa điểm tiến hành đề tài

-Địa điểm lấy mẫu máu xét nghiệm: Mẫu máu được lấy tại các trại heo ở huyện Củ Chi thuộc Hợp Tác Xã Chăn Nuôi Heo An Tòan Tiên Phong

Gồm:

+Trại Chí Trung (A)

+Trại Thanh Phong (B)

+Trại Cô Liên (C)

+Trại Lai (D)

-Địa điểm xét nghiệm :

Phòng thí nghiệm vi sinh truyền nhiễm, khoa chăn nuôi thú y

3.2 Vật liệu thí nghiệm

3.2.1 Mẫu khảo sát

Huyết thanh các nhóm heo : nái đẻ, hậu bị, sơ sinh, thịt

Mẫu xét nghiệm:

Nái đẻ, hậu bị, thịt: 216 mẫu

Heo sơ sinh (07, 14, 21, 28 ngày tuổi): 48 mẫu

3.2.2 Hồng cầu ngỗng

Khi lấy máu ngỗng nên chọn ngỗng đực trắng (ngỗng thuần hay không bị lai) đã

trưởng thành và không ở trong giai đọan thay lông

3.2.3 Kháng nguyên viêm não Nhật Bản

Là kháng nguyên chết, được chiết với acetone – erther từ não chuột được

tiêm virus Kháng nguyên này thuộc chủng Nakayama được viện Pasteur TP.HCM

Dùng phản ứng HI để phát hiện kháng thể trên các nhóm heo từ đó khảo sát

những yếu tố liên quan trại heo, lứa heo lên tình trạng nhiễm

Dùng phản ứng HI xác định kháng thể mẹ truyền, biến đổi kháng thể này theo

thời gian (7 ngày, 14 ngày, 21 ngày,28 ngày tuổi)

3.4 Phương pháp nghiên cứu

3.4.1 Bố trí lấy mẫu huyết thanh heo

Mẫu huyết thanh được lấy ngẫu nhiên trên 04 trại ở Củ Chi với số lượng 216 Với số

mẫu được bố trí theo bảng 2.1:

Bảng 3.1: Sơ đồ bố trí lấy mẫu huyết thanh heo ở các trại

Hạng heo Trại

Hậu bị Nái Thịt Tổng cộng

A 15 51 6 72

B 8 30 5 43

C 5 35 5 45

D 5 45 6 56 Tổng 33 161 22 216 Sau khi có kết quả xét nghiệm ta chọn một số con nái có kết quả dương tính, tiến hành

lấy mẫu heo con sinh ra bởi những nái này trung bình số con trong bầy là 10 Mỗi bầy

chọn 02 con theo thời điểm là 7, 14, 21, 28 ngày tuổi

Bảng 3.2 Bố trí lấy mẫu huyết thanh heo con sinh ra bởi heo nái có kết quả dương

3.4.2.Cách lấy mẫu – Bảo quản mẫu

Lấy máu tĩnh mạch tai: Dùng đay khớp mõm heo lại, lấy thun cột ở gốc tai, sát

trùng vị trí đâm kim trên tĩnh mạch tai bằng cồn iod 1% Dùng syringe vô trùng hút

2ml máu Rút syringe ra, một tay bấm chặt vị trí đâm kim để máu không chảy ra ngoài

(3 – 5 phút) và tay kia kéo pittông đến vạch 5ml để tạo khoảng trống trong khoang

syringe, để syringe nằm nghiêng tránh lắc mạnh trong khoảng 30 phút cho máu đông

lại Bảo quản mẫu trong thùng đá rồi chở về phòng thí nghiệm

Mỗi mẫu lấy được ghi rõ ký hiệu và thông tin về mẫu trong bảng danh sách lấy

mẫu

Bảo quản mẫu:

-Máu trong syringe để 1 giờ ở nhiệt độ phòng, sau đó để qua đêm ở 40C

-Hút lấy huyết thanh cho vào ống eppendorf

-Bảo quản huyết thanh ở -700C cho đến khi xét nghiệm

Lưu ý: Mẫu huyết thanh đạt yêu cầu là mẫu không bị dung huyết

-Pha huyễn dịch HC 8% trong dung dịch DGV, bảo quản 40C

-Từ huyễn dịch HC 8% pha loãng 1/24 trong dung dịch VAD có pH: 6,2 để được huyễn dịch HC 0,33% dùng trong phản ứng HI

-Hồng cầu đặc dùng xử lý huyết thanh Bảo quản ở 40C

3.4.4.Xử lý huyết thanh

3.4.4.1 Xử lý với Kaolin

Lấy huyết thanh trộn với dung dịch borat pH=9 và dung dịch kaolin 25% theo

tỷ lệ 1:4:5 (100µl huyết thanh + 400µl ddBorat + 500µl kaolin)

Lắc kỹ hỗn dịch này 5 phút/ lần, trong 20 phút

Ly tâm 2500 vòng/ phút trong 15 phút

Chiết huyết thanh bên trên

Huyết thanh sau khi xử lý có độ pha loãng 1/10

3.4.4.2 Xử lý với hồng cầu

Cho 1ml huyết thanh đã xử lý với Kaolin vào ống nghiệm, để trong nước đá tan, cho thêm 1 giọt hồng cầu đặc Cho tiếp xúc 20 phút, lắc nhẹ mỗi 5 phút

Ly tâm 2500 vòng/ phút trong 10 phút

Chiết huyết thanh bảo quản ở 40C

3.4.5.Chuẩn độ kháng nguyên ( phản ứng HA: Haemagglutination)

Mục đích: Phản ứng được dùng để xác định khả năng gây ngưng kết hồng cầu của

virus và được dùng để chuẩn độ virus

Nguyên lý: Virus viêm não Nhật Bản có khả năng gây ngưng kết với hồng cầu nhờ enzyme hemagglutinine Trong hỗn dịch có chứa hồng cầu, nếu có sự hiện diện của virus này, chúng ta sẽ quan sát thấy hiện tượng hồng cầu bị ngưng kết Trong trường hợp ngược lại, hồng cầu sẽ tự lắng xuống và tạo nên hiện tượng đóng nút Phản ứng

ngưng kết hồng cầu (HA) được dùng để chuẩn độ virus có khả năng gây ngưng kết hồng cầu và tìm ra độ pha loãng tương ứng của huyễn dịch virus dùng để thực hiện phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI)

- Sau đó cho 50µl huyễn dịch hồng cầu 0,33% (có pH: 6,2%) lần lượt vào mỗi giếng của 12 giếng

- Trộn đều

- Để yên ở nhiệt độ phòng 30 phút rồi đọc kết quả

Cách đọc kết quả phản ứng ngưng kết ( HA ):

- Phản ứng dương tính: Hồng cầu ngưng kết che kín cả đáy giếng

- Phản ứng âm tính: Hồng cầu lắng tụ thành cụm hình tròn (hồng cầu đóng nút) dưới đáy giếng

Hiệu giá kháng nguyên là độ pha loãng cuối cùng của kháng nguyên còn khả năng ngưng kết hồng cầu dương tính Ở độ pha loãng này, ta gọi là 1 đơn vị ngưng kết hồng cầu (hay 1 đơn vị HA)

Giả sử từ giếng 1 đến giếng 9 có hồng cầu ngưng kết thì:

- Ở giếng 9, nồng độ pha loãng tương ứng 1 đơn vị HA, ký hiệu giếng thứ n

- Ở giếng 8, nồng độ pha loãng tương ứng 2 đơn vị HA, ký hiệu giếng thứ n-1

- Ở giếng 7, nồng độ pha loãng tương ứng 4 đơn vị HA, ký hiệu giếng thứ n-2

- Ở giếng 6, nồng độ pha loãng tương ứng 8 đơn vị HA, ký hiệu giếng thứ n-3

Để đảm bảo kết quả tốt cho phản ứng HI, ta sử dụng nồng độ virus ở giếng thứ n-3 (8

(KN: Kháng nguyên virus, HC: Hồng cầu)

3.4.6.Xử lý huyết thanh (mẫu)

- Hút lấy 400µl dung dịch Borat pH: 9 cho vào ống nghiệm thủy tinh 5ml Thêm vào

100µl huyết thanh , rồi cho thêm 500µl dung dịch kaolin 25%, trộn đều Để tiếp xúc ở

nhiệt độ phòng 15 phút, cứ mỗi 5 phút lắc đều 1 lần Sau đó ly tâm 2500 vòng/15 phút

- Cho 50µl hồng cầu đặc vào phần nước nổi, lắc đều Để tiếp xúc 40oC/15 phút, ly tâm

2500 vòng/15 phút, lấy phần nước nổi làm phản ứng (huyết thanh đã xử lý có độ pha

loãng 1/10)

3.4.7.Phương pháp thực hiện phản ứng HI (Haemagglutination Inhibition)

Mục đích: Phản ứng HI được dùng để chuẩn độ kháng thể có trong huyết thanh heo Nguyên lý: Trong phản ứng HI, có sự tham gia của hồng cầu, kháng nguyên virus và kháng thể đặc hiệu Kháng thể đặc hiệu này sẽ kết hợp với virus không thể gắn với hồng cầu, hồng cầu tự do sẽ lắng xuống tạo nên hiện tượng đóng nút hồng cầu (phản ứng HI dương tính) Nếu kháng thể không tương ứng với kháng nguyên virus, kháng nguyên sẽ có phản ứng kết hợp với hồng cầu và gây nên hiện tượng ngưng kết hồng cầu (phản ứng HI âm tính)

Các thành phần tham gia phản ứng HI

- Dung dịch Borat có pH: 9

- Huyết thanh đã xử lý (pha loãng 1/10)

- Kháng nguyên virus (chủng Nakayama)

- Tiếp tục cho 25µl kháng nguyên (có 8 đơn vị HA) vào mỗi giếng của tất cả các giếng trừ giếng thứ 10 và 12, lắc đều

- Để tiếp xúc 1 giờ ở nhiệt độ phòng hoặc để qua đêm ở 40C

- Các giếng đối chứng được thực hiện:

+ Đối chứng huyết thanh: Cho 25µl huyết thanh (đã xử lý) vào giếng thứ 10 để chứng tỏ huyết thanh đã loại hết những chất gây ngưng kết hồng cầu không đặc hiệu + Đối chứng kháng nguyên: Cho 25µl kháng nguyên (có 8 đơn vị HA) vào giếng thứ 11 để chứng tỏ kháng nguyên có đầy đủ tính gây ngưng kết hồng cầu ngỗng + Đối chứng hồng cầu: (giếng thứ 12) để chứng tỏ hồng cầu còn khả năng lắng

tụ tốt (đóng nút), không bị dung huyết