140428 bao cao tong ket thang 4 nhuan TT

Mục đích Nắm được quy tắc phòng thí nghiệm Biết cách chuẩn bị dụng cụ Biết sử dụng máy móc, thiết bị phòng thí nghiệm Kiến tập ELISA cúm lợn, cất giống tế bào, trypsin tế bào, mở giống t

BÁO CÁO TRƯỞNG BỘ MÔN HÓA SINH- MIỄN DỊCH

V/v Kết quả học tập nuôi cấy tế bào từ 3/4/2014 đến 26/4/2014

MỤC LỤC

Trang

1 Mục đích 2

2 Thời gian, địa điểm: 2

3 Người thực hiện 2

4 Nội dung học tập 2

5 Kết quả học tập 3

Phụ Lục 1: Hướng dẫn sử dụng máy móc, thiết bị 4

1.Máy hấp: 4

2 Tủ sấy 5

3 Cân chân không 6

4 Kính hiển vi soi ngược 6

5 Máy Ly tâm 7

6 Cabinet 8

Phụ Lục 2: Cách pha các loại môi trường nuôi cấy tế bào 9

1 Quy trình chuẩn bị nước cất 2x 9

2 Quy trình chuẩn bị PBS - 10

3 Quy trình chuẩn bị môi trường MEM1x 11

4 Huyết thanh bào thai bò (FBS) 12

5 Trypsin- EDTA 13

Phụ lục 3: Quy trình mở giống tế bào 13

1.Nguyên vật liệu 13

2.Các bước thực hiện: 14

Phụ lục 4: Quy trình cất giống tế bào 16

1 Nguyên vật liệu 16

2.Các bước thực hiện: 18

Phụ Lục 5: Quy trình tế bào Trypsin 21

1 Nguyên vật liệu 21

2.Các bước thực hiện: 22

Phụ lục 6: Quy trình nuôi cấy sơ phôi một lớp (Đối với 1 phôi) 25

1.NGUYÊN VẬT LIỆU 25

2.Các bước thực hiện: 26

1 Mục đích

Nắm được quy tắc phòng thí nghiệm

Biết cách chuẩn bị dụng cụ

Biết sử dụng máy móc, thiết bị phòng thí nghiệm

Kiến tập ELISA cúm lợn, cất giống tế bào, trypsin tế bào, mở giống tế bào Biết cách nuôi cấy tế bào xơ phôi gà 1 lớp

Biết cách xử lý mẫu Swab, mẫu huyết thanh

2 Thời gian, địa điểm:

Thời gian: 03/04/2014- 26/4/2014

Địa điểm : Phòng thí nghiệm- bộ môn Hóa Sinh- Miễn dịch

3 Người thực hiện

Người thực hiện: BSTY Trần Thị Nhuận

Người hướng dẫn: BSTY Phạm Thi Nga

4 Nội dung học tập

Kiến tập Quy trình cất giống tế bào 1 lần (tế bào MDCK), quy trình mở giống

tế bào 2 lần ( Tế bào Vero,tế bào BHK-21), trypsin tế bào (tế bào MDCK, Tế bào Vero)

Kiến tập quy trình nuôi cấy tế bào xơ phôi gà 1 lớp 1 lần

Thực hành nuôi cấy tế bào xơ phôi gà 1 lớp 2 lần

Thực hành xử lý mẫu Swab, mẫu huyết thanh lấy từ các địa phương: Thạch Thất, Chương Mỹ, Thường Tín, Đông Anh

Kiến tập làm phản ứng ELISA cúm lợn theo KIT

Nắm được các quy trình:

Cách sử dụng máy móc, thiết bị phòng thí nghiệm (Theo phụ lục 1)

Cách pha môi trường nuôi cấy (Theo phụ lục 2)

Quy trình mở giống tế bào (Theo phụ lục 3)

Quy trình cất giống tế bào (Theo phụ lục 4)

Quy trình trypsin tế bào (Theo phụ lục 5)

Quy trình nuôi cấy xơ phôi gà môt lớp (Theo phụ lục 6)

Những việc đã làm được:

Nắm được các nguyên tắc an toàn sinh học trong phòng thí nghiệm

Sử dụng thành thạo các loại máy móc, thiết bị: Cabinet, nồi hấp,tủ sấy, máy lytâm, máy khuấy từ, kính hiển vi soi ngược, máy ly tâm lạnh, máy Vortex, cân chânkhông, máy hút chân không

Biết cách sử dụng pipet 1 kênh

Tự pha được môi trường PBS-, lọc nước cất 2x

Nắm được các bước của quy trình mở giống tế bào, cất giống tế bào, trypsin tếbào và nuôi cấy xơ phôi gà môt lớp

Biết cách chọn trứng có phôi khỏe, mạch máu rõ ràng

Chuẩn bị dụng cụ cho 1 quy trình nuôi cấy

Những việc chưa làm được:

Thao tác sử dụng pipet chưa được thành thạo, đầu pipet vẫn chạm vào thànhống fancol, chai môi trường

Sử dụng pipet đa kênh còn chưa thành thạo

Thao tác mở nắp chai nuôi tế bào, ống fancol vẫn phải dùng hai tay

Thao tác trong Cabinet: thao tác còn ở gần ngoài cửa Cabinet

Thao tác trong quá trình thực hiện chưa dứt khoát, chưa bố trí được thời giancho các bước thực hành: quá trình trypsin tế bào quá lâu, kiểm tra hình thái tế bào trênkính hiển vi lâu làm ảnh hưởng tới môi trường nuôi cấy tế bào

6.Kết luận

Sau một tháng theo học, tôi nhận thấy bản thân học được rất nhiều điều: từ vănhóa giao tiếp nơi công sở, đến các kỹ thuật cơ bản phòng thí nghiệm, tiếp thêm niềmđam mê tâm huyết với nghề, học cách bố trí, sắp xếp công việc, sử dụng thời gian vàocông việc một cách hiệu quả nhất.

Mong muốn của tôi là được tiếp tục theo học các kỹ thuật, được thực hànhnhiều hơn nữa để tôi nâng cao được chuyên môn, đóng góp cho công ty sau này

Hà Nội, ngày 28 tháng 4 năm 2014.

Người thực hiện

Trần Thị Nhuận

Phụ Lục 1: Hướng dẫn sử dụng máy móc, thiết bị

Nguyên tắc: Trước khi sử dụng quan sát tình trạng hoạt động của máy, sau khi sử

dụng máy móc ghi vào sổ theo dõi

1.Máy hấp:

Có 2 loại máy hấp:

Máy hấp sạch chuyên hấp dụng cụ đã xử lý

Máy hấp bẩn chuyên hấp dụng cụ, trang phục bảo hộ chưa qua xử lý

Cấu tạo máy hấp:

Đồng hồ chỉ thị áp suất

Van áp suất

Các nút điều chỉnh nhiệt độ, thời gian

Bình xả nước, van xả nước

Cách vệ sinh máy hấp: Sau khi hấp dụng cụ bẩn phải tiên hành rửa máy hấp.

Kiểm tra van xả áp suất Đảm bảo áp suất về 0

Tắt công tắc điện

Lấy dụng cụ bẩn vừa được hấp

Xả hết nước trong máy

Hòa nước xà phòng: dung chổi rửa rửa sạch bên trong máy Xả nước sạch chođến khi hết xà phòng.

Vệ sinh bên ngoài máy hấp

Thay nước trong bình xả nằm trong giới hạn cho phép

Thao tác sử dụng máy hấp:

Kiểm tra mực nước trong bình xả nước, giữ ở mực nước cho phép

Lắp khay, giá sắt vào trong nồi hấp, đảm bảo lượng nước ngập khay 1-2 cmCho giỏ đựng đồ hấp: các dụng cụ hấp nên xếp tạo độ thông thoáng, dụng cụbao gói xếp trước, dụng cụ thủy tinh xếp lên trên

Đóng cửa nồi hấp, khóa chặt van áp suất

Bật công tắc cài đặt máy bằng các nút điều chỉnh nhiệt độ và thời gian ( 1210C/30-45 phút)

Ấn nút SET/ START Máy hấp hiển thị ở chế độ Sterile

Muốn xem nhiệt độ hiện tại của máy hấp ấn nút CHECK HEAT

Khi lấy đồ hấp ra khỏi máy hấp phải xả van xả áp đảm bảo áp suất về 0 mớiđược mở máy hấp

2 Tủ sấy

Cách sử dụng tủ sấy:

Bước 1: Trước khi mở tủ sấy phải tắt tủ sấy: ấn nút tắt công tắc máy.

Bước 2: Cho dụng cụ cần sấy vào trong tủ sấy, tùy từng dụng cụ mà sấy ở nhiệt độ

khác nhau, hầu hết các dụng cụ được hấp ở 90-1000C/2-3 giờ

Bước 3: Đóng tủ sấy, bật công tắc máy và cài đặt thời gian và nhiệt độ

Cách cài đẳt thời gian:

Giữ 2 nút RAM + TIME, đèn SET hiện màu đỏ, trên đồng hồ hiển thị thờigian

Giữ RAM sau đó TIME để chỉnh giảm thời gian

Giữ RAM sau đó TEMP để tăng thời gian

Sau đó ấn RAM, thời gian đã được cài đặt

Cách cài đặt nhiệt độ:

Giữ 2 nút RAM + TEMP, đèn SET hiện màu đỏ, trên đồng hồ hiển thị nhiệt độ.Giữ RAM sau đó TIME để chỉnh giảm nhiệt độ

Giữ RAM sau đó TEMP để tăng nhiệt độ.

Sau đó ấn RAM, nhiệt độ đã được cài đặt

Bước 4: tủ sấy đã hoạt động, đèn ở chế độ heater.

Bước 1: Cắm nguồn điện.

Bước 2: Cân hóa chất:

Mở cửa cân, đưa máng vào để đựng vật cần cân Sau đó đóng cửa, ấn TARE, đểđồng hồ chỉ thị 0.000 g Cân đủ lượng cần lấy, thao tác cẩn thận, cân chính xác sốlượng cần dùng

Bước 3: Tắt cân

Ấn nút OFF để tắt máy

Bước 4: Vệ sinh cân:

Sau khi cân nguyên liệu xong cần vệ sinh cân sạch sẽ Lau bề mặt cân

Bước 5: Rút nguồn điện Để cân về trạng thái nghỉ.

4 Kính hiển vi soi ngược

Bước 1: Cắm nguồn điện

Sử dụng nguồn điện 110V, cắm vào nguồn điện 110V, không cắm trực tiếp vào

Bước 2: Khởi động máy

Bật công tắc đưa máy về chế độ hoạt động

Xoay ốc điều chỉnh độ sáng của đèn lên tối đa Điều chỉnh độ sang của đènthông qua núm điều chỉnh nguồn sáng

Bước 3: Soi kính

Đặt chai nuôi tế bào hoặc buồng đếm tế bào lên khu vực soi

Điều chỉnh ốc vĩ cấp lấy hình ảnh Sau đó điều chỉnh ốc vi cấp để chỉnh ảnh rõnét

Roto 15ml với tốc độ ly tâm 3500 vòng/ phút

Roto 50ml với tốc độ ly tâm vòng/phút

Nút điều chỉnh thời gian

Cách sử dụng: Máy ly tâm hoạt động dựa trên nguyên lý cân bằng

Bước 1: Cắm điện nguồn điện 220V.

Bước 2: Xếp mẫu vào các ROTO

Khi xếp mẫu phải đảm bảo các mẫu cần ly tâm ở dạng đối xứng và cân bằng.Dùng cân tiểu ly khi cần thiết

Bước 3: Khởi động máy

Đóng nắp máy ly tâm

Ấn MAIN cho máy hoạt động.

Cài đặt vòng quay và thời gian: Nếu ly tâm <2.500 vòng ấn nút LOW nếu lytâm > 2.500 vòng ấn HIGHT

Điều chỉnh số vòng quay vặn nút speed, quan sát trên đồng hồ chỉ thị số vòngtrong khoảng cần ly tâm

Điều chỉnh thời gian: vặn nút TIME chỉ thị trên máy, chỉnh thời gian cần lytâm

Bước 4: Đưa máy về trạng thái nghỉ,

Ấn tắt MAIN, rút ổ điện

6 Cabinet

Trước khi sử dụng cabinet: ở trạng thái không hoạt động, chìa khóa cabinet ở vịtrí số 0, cánh cửa tủ ở vị trí đóng

Vô trùng cabinet 15 phút trước khi sử dụng:

Vặn chìa khóa tủ ở số 2, ấn nút UV lamp

Đèn tử ngoại sáng, đồng thời xuất hiện tiếng kêu

Để tắt tiếng kêu, ta ấn nút Stop Vô trùng tủ trong 15 phút

Sau 15 phút tắt đèn tử ngoại bằng cách ấn nút UV lamp và chìa khóa cabinet ở

vị trí số 0

Cách sử dụng cabinet:

Mở cánh cửa tủ cabinet

Vặn chìa khóa tủ về vị trí số 1, núm quạt gió sẽ tự động hoạt động (không cần

ấn nút FAN) Khi quạt gió hoạt động ấn nút biểu tượng đèn (bên cạnh núm FAN) Tủcấy có 2 màng lọc khí: khí qua màng lọc thì đèn sẽ bật xanh Chỉ được làm việc khi cả

2 đèn đều xanh

Quá trình thao tác trong cabinet phải nhẹ nhàng, tránh đưa luồng không khí từngoài vào sẽ gây tạp nhiễm

Vệ sinh cabinet sau khi sử dụng:

Thu dọn sạch sẽ, không được để lại bất cứ dụng cụ thí nghiệm trong cabinet.Tắt quạt gió và AS, vặn chìa khóa cabinet về vị trí 0

Đậy cánh cửa cabinet lại, vô trùng cabinet 15 phút (giống như các bước ở trên).Tắt cabinet hoàn toàn ( chìa khóa ở vị trí 0)

Chú ý khi sử dụng cabinet:

Trong quá trình sử dụng cabinet, có thể xuất hiện tiếng kêu, để tắt tiếng kêu ấnnút Stop

Không để quá nhiều dụng cụ trong Cabinet lúc làm việc và sau làm việc

Phụ Lục 2: Cách pha các loại môi trường nuôi cấy tế bào

1 Quy trình chuẩn bị nước cất 2x

1.1 Mục đích: là dung môi để pha các môi trường PBS-, MEM 1x

Bước 2: Nối hệ thống lọc với máy hút chân không

Dùng dây gắn hệ thống lọc với đầu vào INLET của máy hút chân không Dùngmáy hút chân không hút hết không khí trong bình, khi đó tạo ra sự chênh lệch áp suất

 nước sẽ đi từ nơi có áp suất cao đến nơi có áp suất thấp

Bước 3: Lọc nước

Cắm điện máy hút chân không, đổ nước cất 2x vào hệ thống lọc chân không.Nước cất sau khi được lọc vào các chai Scott 1 lít, không hấp nước cất quánhiều, khi hấp không vặn nút chai quá chặt sẽ gây nổ

Bước 4: Bảo quản

Sau khi hấp, nước cất 2x được bảo quản ở nhiệt độ phòng.

2 Quy trình chuẩn bị PBS

-2.1 Mục đích: Là môi trường để rửa tế bào chết trong nuôi cấy tế bào

2.2 Nguyên vật liệu pha PBS- 1 lít

Bước 1: Chuẩn bị nước cất

Lấy 1 lượng nước cất 2x vô trùng 200- 300ml

Bước 4: Kiểm tra pH

Có thể sử dụng máy đo pH hoặc giấy đo pH

Dùng pipet hút 1 ít dung dịch nhỏ lên giấy rồi đo pH Dùng NaOH 1N hoặcHCl 1N để điều chỉnh pH của môi trường (pH = 7,2 – 7,4).

Bước 5: Bảo quản

Chia môi trường ra các chai Schott nhỏ vô trùng Đem hấp 1210C/15 phút

Để nguội Bảo quản 40C đến khi sử dụng

3 Quy trình chuẩn bị môi trường MEM1x

3.1 Mục đích: Là môi trường để tế bào sinh trưởng và phát triển

3.2 Nguyên vật liệu pha MEM 1x 1 lít

Bước 1: Lấy 1 lượng nước cất 2x vô trùng 200- 300ml

Bước 2: Cân hoá chất

Dùng máng để cân hóa chất, trước khi cân nên lau sạch máng

Cân MEM bột 9,53g cho vào bình đã có sẵn ít nước Không được lắc ngay sẽđông vón.

Tráng máng  lắc đều với cục khuấy từ

Dùng máng khác cân NaHCO3: 2,2 gam cho tiếp vào bình, tráng máng lắcđều

Bước 3: Bổ sung lượng nước sao cho đủ thể tích 1 lít.

Tiếp tục cho lên máy khuấy từ, lắc đều, cho đến khi tan hoàn toàn

Bước 4: Lọc

Lọc qua màng lọc 0,22µm bằng hệ thống lọc chân không đã được hấp vô trùng

Bước 5: Điều chỉnh pH

Dùng 6ml HCl 1N để điều chỉnh pH về 7,2- 7,4

Bước 6: Bổ sung Gentamycin

Dùng pipet hút 50µg/ 1ml cho vào dung dịch

Bước 7: Bảo quản

Dung dịch sau khi pha được bảo quản ở 40C

4 Huyết thanh bào thai bò (FBS)

Huyết thanh được bảo quản ở -200C

Đông tan huyết thanh

Xử lý nhiệt huyết thanh 560C trong 30 phút

Chia 20ml/ ống ly tâm 50ml

Bảo quản ở -200C cho đến khi sử dụng

5 Trypsin- EDTA

Trypsin bảo quản ở -200C

Đông tan trypsin

Chia 10ml/ ống ly tâm 15ml

Bảo quản ở -200C cho đến khi sử dụng

Phụ lục 3: Quy trình mở giống tế bào

1.Nguyên vật liệu

a Tế bào đã được cất giống trước đó

b Môi trường, hóa chất, sinh phẩm:

4 Tủ ấm CO2 01

2.Các bước thực hiện:

Bước 1: Chuẩn bị Cabinet và đưa môi trường về nhiệt độ phòng

Chuẩn bị Cabinet: Vô trùng Cabinet trong 15 phút

Chuyển môi trường về nhiệt độ phòng:

Mục đích: không làm ảnh hưởng tế bào vì nếu để nhiệt độ quá thấp sẽ gây chết

tế bào

MEM1x, MEM10%, PBS- bảo quản trong tủ lạnh 40C

Chuyển môi trường đang bảo quản trong tủ lạnh đưa ra ngoài để tan đông

Bước 2: Giải đông tế bào cất giống

Mục đích: đưa tế bào về trạng thái hoạt động

Cách tiến hành:

Chuẩn bị ống môi trường 5ml MEM10% để cân bằng môi trường tế bào

Cho ống giống vào bọt xốp, thả vào cốc nước ấm 370C

Thấy môi trường chuyển màu đậm hơn

Khi môi trường đồng nhất, chuyển ống môi trường vào Cabinet

Bước 3: Cân bằng môi trường

Mục đích: Cân bằng môi trường nuôi cấy tế bào

Ly tâm xong, dùng pipet hút hết dung dịch ở phía trên, giữ lại cặn tế bào.

Đánh tan cặn tế bào bằng cách: Rà mạnh đáy ống vào Cabinet hoặc dùng pipetđảo đều

Chú ý:

Trước khi ly tâm, các ống ly tâm phải được đóng chặt nút và bao dán bằngparaffin

Khi hút bỏ môi trường, tránh để đầu type chạm vào cặn tế bào

Bước 5: Hòa tan trong môi trường nuôi cấy tế bào

Mục đích: Hòa tan huyễn dịch tế bào trong môi trường nuôi cấy

Cách tiến hành:

Cho 6ml môi trường MEM10% vào ống ly tâm có chứa cặn tế bào

Dùng pipet đảo đều

Bước 6: Cấy tế bào vào chai nuôi

Mục đích: cung cấp chất dinh dưỡng cho tế bào phát triển

Bước 7: Vệ sinh cabinet sau khi sử dụng

Chuyển các dụng cụ vừa thao tác ra khỏi cabinet

Dùng giấy lau xịt cồn lau sạch Cabinet

Đóng cửa Cabinet, bật UV trong 30 phút

Bước 8: Theo dõi sự phát triển của tế bào

Nuôi tế bào 370C, 5%CO2 Hàng ngày theo dõi tế bào trên kính hiển vi soingược

Phụ lục 4: Quy trình cất giống tế bào

1 Nguyên vật liệu

a Tế bào đã phát triển, tỷ lệ bám đáy 100% (Thường sau 2-3 ngày trypsin)

b Môi trường, hóa chất, sinh phẩm:

Nước cất vô trùng vừa đủ …….1 lít

Pha dung dịch cất giống

Lượng dung dịch cất giống chiếm 50% cần pha 5ml dung dịch cất giống sau khi đãqua màng lọc

Cách pha 6ml dung dịch cất giống 20% PBS, 20% DMSO:

Lấy 1 ống fancol 50ml vô trùng

Dùng pipet hút 3,6 ml MEM10%

Thay đầu type, hút tiếp 1,2ml PBS cho vào ống

Cho tiếp vào ống 1,2ml DMSO

Dùng xilanh, kim tiêm vô trùng hút hết dung dịch cất giống ở ống fancol, lắpxilanh vào đầu lọc 0.45, bơm qua lọc cho vào ống fancol mới

Chú ý : không được cho PBS sau khi cho DMSO, sẽ gây kết tủa

3 Chai nuôi tế bào T25 01

Bước 1: Chuẩn bị Cabinet và đưa môi trường về nhiệt độ phòng

Chuẩn bị Cabinet: Vô trùng Cabinet trong 15 phút

Chuyển môi trường về nhiệt độ phòng:

Mục đích: không làm ảnh hưởng tế bào vì nếu để nhiệt độ quá thấp sẽ gây chết

tế bào

MEM1x, MEM10%, PBS- bảo quản trong tủ lạnh 40C

Chuyển môi trường đang bảo quản trong tủ lạnh đưa ra ngoài để tan đông

Bước 2: Quan sát tế bào

Mục đích: quan sát mức độ phát triển của tê bào, tỷ lệ tế bào bám đáy

Cách tiến hành:

Khi tế bào phát triển tốt, tỉ lệ bám đáy 100%

Bước 3:Loại bỏ môi trường đang nuôi:

Mục đích: loại bỏ tế bào chết

Cách tiến hành:

Lắc nhẹ chai nuôi, lắc ngang chai

Mở nắp chai, nghiêng chai về mặt không có tế bào

Dùng pipet lắp đầu type 5ml hút bỏ môi trường vào cốc thủy tinh đựng rác.

Bước 5: Trypsin tế bào

Mục đích: tách tế bào ra khỏi đáy bình

Không được lắc chai nuôi TB

Bước 6: Trung hòa trypsin

Cho ống fancol chứa huyễn dịch đem ly tâm 700v/phút trong 10 phút.

Dùng pipet hút hết dung dịch ở phía trên, giữ lại cặn tế bào

Hút 3ml môi trường MEM10% cho vào ống, dùng pipet đảo đều hoặcrầ nhẹ đáyống vào mặt cabinet để đánh tan hoàn toàn cặn tế bào

Dùng pipet hút 1 lượng huyễn dịch tế bào sau khi nhuộm nhỏ từ từ vào buồngđếm tế bào

Đếm sô tế bào trên buồng đếm:

Đếm tế bào ở 4 góc, trong mỗi góc có 16 ô vuông nhỏ, đếm số tế bào nằm trongkhung 16 ô vuông nhỏ

Đếm từng tế bào riêng lẻ trong đám tế bào

Đếm theo hình zic zắc

Đếm các tế bào có kích thước tương đồng nhau

Không đếm các tế bào chết bắt màu xanh, chỉ đếm các tế bào còn sống

Ước lượng số tế bào trong 1ml:

số tế bào/1ml = (số tế bào đếm được trong 4góc/4 )x 2 x độ pha loãng tế bào x 104

Bước 9: Ra chai và cất giống tế bào:

Mục đích: Lưu giữ giống tế bào (106 cell/ tube)

Cách tiến hành:

Dùng pipet hút 1,5 ml huyễn dịch tế bào + 3,5 ml môi trường MEM10% FBScho vào ống fancol chứa dung dịch cất giống vừa lọc

Dùng pipet trộn đều môi trường, chia vào ống cất giống,mỗi ống cất 1ml

Xoáy chặt nắp ống, bao dán paraffin