Các phương pháp và công cụ trong công nghệ sinh học nano

Dynamics Light Scattering DLS: Ph ương pháp tán xạ ánh sáng ng pháp tán x ánh sáng ạ ánh sángđ ng h c ộng học ọc Phư ng pháp tán x ánh sáng đ ng h c là m t kỹ thu t trong v t lý cóạ ánh

Công nghệ sinh học nano là sự giao thoa của công nghệ nano và sinh học,

và là sự kết hợp của nhiều lĩnh vực nghiên cứu công nghệ cao Nói một cách khác, Công nghệ sinh học nano là công nghệ sinh học ở mức độ siêu nhỏ (mức

độ nm) liên quan đến phương pháp sử dụng vật liệu và thiết bị công nghệ nano

để nghiên cứu hệ sinh học Ứng dụng của công nghệ sinh học nano gia tăng rất nhanh, đặc biệt trong lĩnh vực y học Một số thiết bị công nghệ sinh học nano đã được chế tạo tại Việt Nam

Để phục vụ cho nền công nghệ sinh học nano, hiện nay có một số công cụ

và phương pháp như:

1 Dynamics Light Scattering (DLS): Phương pháp tán xạ ánh sáng động học

2 Automic Force Microscopy (AFM): Hiển vi lực nguyên tử

3 Transmision Electron Microscopy (TEM): Hiển vi điện tử truyền qua

4 Scanning Electron Microscopy (SEM): Hiển vi điện tử quét

5 Fluorescent microscopy: Hiển vi huỳnh quang

6 Confocat microscopy: Hiển vi đồng tiêu

7 Super-resolution microscopy STED: Hiển vi siêu phân giải STED

8 Bioassays: Các phép thử sinh học như ELISA, Western blotting

1 Dynamics Light Scattering (DLS): Ph ương pháp tán xạ ánh sáng ng pháp tán x ánh sáng ạ ánh sáng

đ ng h c ộng học ọc

Phư ng pháp tán x ánh sáng đ ng h c là m t kỹ thu t trong v t lý cóạ ánh sáng động học là một kỹ thuật trong vật lý có ộng học là một kỹ thuật trong vật lý có ọc là một kỹ thuật trong vật lý có ộng học là một kỹ thuật trong vật lý có ật trong vật lý có ật trong vật lý có

th đư c s d ng đ xác đ nh c u hình phân b kích thử dụng để xác định cấu hình phân bố kích thước của các hạt nhỏ ụng để xác định cấu hình phân bố kích thước của các hạt nhỏ ịnh cấu hình phân bố kích thước của các hạt nhỏ ấu hình phân bố kích thước của các hạt nhỏ ố kích thước của các hạt nhỏ ước của các hạt nhỏ ủa các hạt nhỏc c a các h t nhạ ánh sáng động học là một kỹ thuật trong vật lý có ỏ trong huy n phù ho c polyme trong dung d ch ền phù hoặc polyme trong dung dịch ặc polyme trong dung dịch ịnh cấu hình phân bố kích thước của các hạt nhỏ

+ Nguyên lý hoạt động

Kích thước hạt được đo bằng DLS: Các hạt lơ lửng trong một chất lỏng

liên tục trải qua chuyển động ngẫu nhiên, và kích thước của các hạt trực tiếp ảnh hưởng đến tốc độ của chúng Hạt nhỏ di chuyển nhanh hơn so với những hạt lớn hơn Trong DLS, ánh sáng đi qua mẫu, và ánh sáng tán xạ được phát hiện và ghi nhận ở một góc độ nhất định Sự phụ thuộc vào thời gian của cường

độ tán xạ cho thấy các hạt đang chuyển động nhanh như thế nào Từ thông tin này, có thể tính toán kích thước trung bình của hạt cũng như sự phân bố kích thước

Đo điện thế Zeta bằng ELS: Trong ánh sáng tán xạ điện di (ELS) tốc độ

của các hạt được đo bằng sự hiện diện của một điện trường Sự di chuyển các hạt nhanh hơn, thì điện thế zeta của các hạt cao hơn Nói chung, điện thế zeta cường độ lớn có nghĩa là các hạt sẽ đẩy nhau mạnh hơn, tạo ra một dung dịch huyền phù ổn định hơn

+ Ứng dụng

DLS được sử dụng để mô tả kích thước của các hạt khác nhau bao gồm protein, polyme, micelles, carbohydrate, hạt nano, tế bào sinh học và gel Phép

đo này phụ thuộc vào kích thước của lõi hạt, kích thước của cấu trúc bề mặt, nồng độ hạt và loại ion trong môi trường

2 Automic Force Microscopy (AFM): Hiển vi lực nguyên tử

Kính hiển vi lực nguyên tử (AFM) là một thiết bị quan sát cấu trúc vi mô

bề mặt của vật rắn dựa trên nguyên tắc xác định lực tương tác nguyên tử giữa một đầu mũi dò nhọn với bề mặt của mẫu, có thể quan sát ở độ phân giải nanomet

Cấu tạo của AFM gồm có 6 bộ phận chính

• Một mũi nhọn

• Cần quét (cantilever)

• Nguồn Laser

• Phản xạ gương (miroir )

• Hai nửa tấm pin quang điện (photodiod)

• Bộ quét áp điện

Bộ phận chính của AFM là một mũi nhọn được gắn trên một thanh rung

(cantilever) Mũi nhọn thường được làm bằng Si hoặc SiN và kích thước của

đầu mũi nhọn là một nguyên tử Khi mũi nhọn quét gần bề mặt mẫu vật, sẽ xuất hiện lực Van der Waals giữa các nguyên tử tại bề mặt mẫu và nguyên tử tại đầu mũi nhọn (lực nguyên tử) làm rung thanh cantilever Lực này phụ thuộc vào khoảng cách giữa đầu mũi dò và bề mặt của mẫu Dao động của thanh rung do lực tương tác được ghi lại nhờ một tia laser chiếu qua bề mặt của thanh rung, dao động của thanh rung làm thay đổi góc lệch của tia lase và được detector ghi lại Việc ghi lại lực tương tác trong quá trình thanh rung quét trên bề mặt sẽ cho hình ảnh cấu trúc bề mặt của mẫu vật

Kính hiển vi lực nguyên tử ứng dụng chụp ảnh cắt lớp nhanh ; mô tả, phân tích, xác định đặc điểm bề mặt ; đo cơ học đơn phân tử ; kiểm soát chất lượng, kiểm tra khuyết tật vật liệu Hơn thế nữa, AFM còn được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như : công nghệ nano, công nghệ bán dẫn, dược phẩm, sinh học, công nghệ vật liệu.,v…v…

3 Transmision Electron Microscopy (TEM): Hiển vi điện tử truyền qua

Kính hiển vi điện tử truyền qua là một thiết bị nghiên cứu vi cấu trúc vật rắn, sử dụng chùm điện tử có năng lượng cao chiếu xuyên qua mẫu vật rắn mỏng và sử dụng các thấu kính từ để tạo ảnh với độ phóng đại lớn (có thể tới hàng triệu lần), ảnh có thể tạo ra trên màn huỳnh quang, hay trên film quang học, hay ghi nhận bằng các máy chụp kỹ thuật số

Kính hi n vi đi n t truy n qua (TEM) Là công c r t h u hi u choện tử truyền qua (TEM) Là công cụ rất hữu hiệu cho ử dụng để xác định cấu hình phân bố kích thước của các hạt nhỏ ền phù hoặc polyme trong dung dịch ụng để xác định cấu hình phân bố kích thước của các hạt nhỏ ấu hình phân bố kích thước của các hạt nhỏ ữu hiệu cho ện tử truyền qua (TEM) Là công cụ rất hữu hiệu cho các nghiên c u v t li u và y h c Khi đo TEM ta có th xác đ nh đứu vật liệu và y học Khi đo TEM ta có thể xác định được hình ật trong vật lý có ện tử truyền qua (TEM) Là công cụ rất hữu hiệu cho ọc là một kỹ thuật trong vật lý có ịnh cấu hình phân bố kích thước của các hạt nhỏ ư c hình

d ng, kích thạ ánh sáng động học là một kỹ thuật trong vật lý có ước của các hạt nhỏc trung bình c a h t và s phân tán c a h t trong môiủa các hạt nhỏ ạ ánh sáng động học là một kỹ thuật trong vật lý có ự phân tán của hạt trong môi ủa các hạt nhỏ ạ ánh sáng động học là một kỹ thuật trong vật lý có

trư ng ch t Khi chùm đi n t chi u t i m u v i t c đ cao và trong ph mấu hình phân bố kích thước của các hạt nhỏ ện tử truyền qua (TEM) Là công cụ rất hữu hiệu cho ử dụng để xác định cấu hình phân bố kích thước của các hạt nhỏ ếu tới mẫu với tốc độ cao và trong phạm ớc của các hạt nhỏ ẫu với tốc độ cao và trong phạm ớc của các hạt nhỏ ố kích thước của các hạt nhỏ ộng học là một kỹ thuật trong vật lý có ạ ánh sáng động học là một kỹ thuật trong vật lý có

vi r t h p, các đi n t b tán x b i th tĩnh đi n gi a h t nhân nguyên tấu hình phân bố kích thước của các hạt nhỏ ện tử truyền qua (TEM) Là công cụ rất hữu hiệu cho ử dụng để xác định cấu hình phân bố kích thước của các hạt nhỏ ịnh cấu hình phân bố kích thước của các hạt nhỏ ạ ánh sáng động học là một kỹ thuật trong vật lý có ởi thế tĩnh điện giữa hạt nhân nguyên tử ếu tới mẫu với tốc độ cao và trong phạm ện tử truyền qua (TEM) Là công cụ rất hữu hiệu cho ữu hiệu cho ạ ánh sáng động học là một kỹ thuật trong vật lý có ử dụng để xác định cấu hình phân bố kích thước của các hạt nhỏ

và l p mây đi n t c a v t li u gây ra nhi u x đi n t Chùm đi n tớc của các hạt nhỏ ện tử truyền qua (TEM) Là công cụ rất hữu hiệu cho ử dụng để xác định cấu hình phân bố kích thước của các hạt nhỏ ủa các hạt nhỏ ật trong vật lý có ện tử truyền qua (TEM) Là công cụ rất hữu hiệu cho ễu xạ điện tử Chùm điện tử ạ ánh sáng động học là một kỹ thuật trong vật lý có ện tử truyền qua (TEM) Là công cụ rất hữu hiệu cho ử dụng để xác định cấu hình phân bố kích thước của các hạt nhỏ ện tử truyền qua (TEM) Là công cụ rất hữu hiệu cho ử dụng để xác định cấu hình phân bố kích thước của các hạt nhỏ nhi u x t v t li u ph thu c vào bễu xạ điện tử Chùm điện tử ạ ánh sáng động học là một kỹ thuật trong vật lý có ừ vật liệu phụ thuộc vào bước sóng của chùm vật liệu tới và ật trong vật lý có ện tử truyền qua (TEM) Là công cụ rất hữu hiệu cho ụng để xác định cấu hình phân bố kích thước của các hạt nhỏ ộng học là một kỹ thuật trong vật lý có ước của các hạt nhỏc sóng c a chùm v t li u t i vàủa các hạt nhỏ ật trong vật lý có ện tử truyền qua (TEM) Là công cụ rất hữu hiệu cho ớc của các hạt nhỏ kho ng cách m t ph ng m ng trong tinh th , tuân theo đ nh lu t Bragg:ặc polyme trong dung dịch ẳng mạng trong tinh thể, tuân theo định luật Bragg: ạ ánh sáng động học là một kỹ thuật trong vật lý có ịnh cấu hình phân bố kích thước của các hạt nhỏ ật trong vật lý có

Kính hiển vi điện tử có độ phân giải giới hạn bởi bước sóng của sóng điện

tử, nhưng do sóng điện tử có bước sóng rất ngắn nên chúng có độ phân giải vượt xa các kính hiển vi quang học truyền thống, và kính hiển vi điện tử truyền qua hiện đang là loại kính hiển vi có độ phân giải tốt nhất tới cấp độ hạ nguyên tử Nhờ tương tác giữa chùm điện tử với mẫu vật, kính hiển vi điện tử truyền qua còn cho phép quan sát các cấu trúc điện từ của vật rắn và đem lại nhiều phép phân tích hóa học với chất lượng rất cao

Ứng dụng chính của kính hiển vi điện tử truyền qua là cung cấp hình ảnh phóng đại cao của cấu trúc bên trong của một mẫu

Hiển vi điện tử truyền qua được dùng để nghiên cứu về vật liệu có kích thước nano cho biết các thông tin về những đặc trưng hình thái, cấu trúc, kiểm soát được chất lượng của vật liệu được chế tạo (như tính đồng nhất về cấu trúc

và kích thước, độ lặp lại, sự sai hỏng, khả năng phân tán…)

4 Scanning Electron Microscopy (SEM): Hiển vi điện tử quét

Là kính hiển vi điện tử có thể tạo ra ảnh với độ phân giải cao của bề mặt mẫu vật bằng cách sử dụng một chùm điện tử hẹp quét trên bề mặt mẫu Khi điện tử tương tác với bề mặt mẫu vật, sẽ có các bực xạ phát ra, sự tạo ảnh trong SEM và các phép phân tích được thực hiện thông qua việc phân tích các bức xạ phát ra từ tương tác của chùm điện tử với bề mặt mẫu vật

Ứng dụng:

- Phép phân tích huỳnh quang catốt: Các ánh sáng phát ra do tương tác của chùm điện tử với bề mặt mẫu Phép phân tích này rất phổ biến và hữu ích cho việc phân tích các tính chất quang, điện của vật liệu

- Phân tích phổ tia X: Tương tác giữa điện tử với vật chất có thể sản sinh phổ tia X đặc trưng, rất hữu ích cho phân tích thành phần hóa học của vật liệu

- Một số hính hiển vi điện tử quét hoạt động ở chân không siêu cao có thể phân tích phổ điện tử Auger, dùng để phân tích tinh tế bề mặt

Mặc dù không có độ phân giải tốt như kính hiển vi điện tử truyền qua nhưng kính hiển vị điện tử quét lại có điểm mạnh là phân tích mà không cần phá hủy mẫu vật và có thể hoạt động ở chân không thấp

5 Fluorescent microscopy: Hiển vi huỳnh quang

Kính hiển vi huỳnh quang là kính hiển vi quang học sử dụng huỳnh quang

và lân quang phản xạ và hấp thụ để nghiên cứu tính chất của các chất hữu cơ hoặc chất vô cơ Thuật ngữ kính hiển vi huỳnh quang đề cập đến bất kỳ kính hiển vi nào sử dụng huỳnh quang để tạo ra hình ảnh

Mẫu vật được chiếu sáng bằng ánh sáng của một bước sóng đặc biệt (hoặc nhiều bước sóng) được hấp thụ bới các chất huỳnh quang, khiến chúng phát ra ánh sáng có bước sóng dài hơn (ví dụ, màu sắc khác hơn so với ánh sáng hấp thụ) Ánh sáng chiếu được tách ra từ huỳnh quang phát ra yếu hơn nhiều thông qua việc sử dụng một bộ lọc quang phổ Bộ phận quan trọng của kính hiển vi

huỳnh quang là nguồn ánh sáng( phổ biến là đèn hồ quang xenon hay đèn hơi thủy ngân, hoặc cao cấp hơn là đèn năng lượng cao LED và laser), các bộ lọc kích thích, các gương lưỡng sắc (hoặc bộ tách chùm lưỡng sắc), và bộ lọc phát xạ

Cấu tạo kính hiển vi huỳnh quang

Các bộ lọc và gương lưỡng sắc đươhc lựa chọn để phù hợp với đặc điểm quang phổ kích thích và phát xạ của chất huỳnh quang được sử dụng để đánh dấu mẫu vật Theo cách này, sự phân bố của một huỳnh quang duy nhất (màu sắc) được chụp ảnh tại một thời điểm Hình ảnh nhiều màu sắc của một số loại huỳnh quang được tạo ra bằng cách kết hợp một số hình ảnh đơn màu

Kính hiển vi huỳnh quang được sử dụng phổ biến nhất là kính hiển vi Epiflourescence, trong đó sự kích thích của chất huỳnh quang và dò tìm ánh sáng huỳnh quang được thực hiện thông qua cùng một đường truyền sáng (tức thông qua vật kính) Loại kính huỳnh quang này được sử dụng rộng rãi trong sinh học

và là cơ sở cho nhiều mẫu thiết kế kính hiển vi tiên tiến

Cách thức hoạt động

Kính hiển vi huỳnh quang sử dụng đèn thủy ngân hoặc đèn xenon để tạo ra ánh sáng cực tím Ánh sáng này đi vào kính hiển vi huỳnh quang chạm vào gương lưỡng sắc – một tấm gương phản xạ một dải bước sóng này và cho phép một dải bước sóng khác đi qua Gương lưỡng sắc phản chiếu ánh snags cực tím đến mẫu vật Ánh sáng cực tím kích thích sự phát huỳnh quang từ các phân tử

trong mẫu vật Vật kính thu nhận ánh sáng có bước sóng huỳnh quang được tạo

ra Ánh sáng huỳnh quang này đi qua gương lưỡng sắc và một bộ lọc chắn (loại

bỏ các bước sóng không phải huỳnh quang), và cuối cùng vào thị kính để tạo thành hình ảnh

Sơ đồ kính hiển vi huỳnh quang

Kỹ thuật kính hiển vi huỳnh quang rất hữu dụng để quan sát cấu trúc và đo lường hoạt động sinh lý và sinh hóa trong tế bào sống Các chỉ thị huỳnh quang khác nhau luôn có sẵn để nghiên cứu nhiều hợp chất sinh lý quan trọng như DNA, canxi, magie, natri, pH và các enzym

6 Confocat microscopy: Hiển vi đồng tiêu

Kính hiển vi đồng tiêu sử dụng kỹ thuật kính hiển vi quang học/huỳnh quang có khả năng tăng độ phân giải của hệ quan sát nhờ sử dụng lỗ hội tụ (pinhole) và chùm sáng quét được hội tụ vào một điểm nhỏ trên mặt phẳng tiêu (point illumination) Ánh sáng phản xạ sẽ tạo lại hình ảnh của vật, được ghi lại bởi các CCD camera trong đa số kính hiển vi đồng tiêu hiện nay với độ phân giải tới khoảng 100 nm ở độ phóng đại 1500 lần hoặc thấp hơn nữa, vượt xa các kính quang học truyền thống vốn bị giới hạn bởi hiện tượng nhiễu xạ (200 nm) Gần

đây, kính hiển vi đồng tiêu đang được phát triển rộng rãi trong các ngành khoa học vật liệu, nghiên cứu y sinh, khoa học tế bào, bán dẫn

Nguyên lý hoạt động của kính hiển vi huỳnh quang

Kính hiển vi đồng tiêu về bản chất là một dạng tân tiến hơn của kính hiển

vi huỳnh quang Điểm khác biệt là kính hiển vi đồng tiêu có độ phân giải lớn hơn nhờ sử dụng các lỗ hội tụ để loại đi các ánh sáng không hội tụ hoàn toàn (out-of- focus) và chùm tia được quét trên mẫu vật (do kích thước mũi chùm tia được hội tụ rất nhỏ) Mẫu vật thường được nhuộm bởi các chất huỳnh quang (fluorophores) như cyanine, DAPI hay các protein tổng hợp

Chùm sáng sơ cấp được phát ra từ các đèn halogen, đèn thủy ngân hoặc điốt quang năng lượng cao (high-power LED) với các kính hiển vi đồng tiêu truyền thống (confocal microscopy) hay từ các đèn laser trong các kính đồng tiêu quét laser (laser scanning confocal microscopy) Đôi lúc là ánh sáng trắng được cho đi qua các tấm lọc màu (filter) để lựa chọn ánh sáng đơn sắc có màu sắc cần thiết, thường từ 680 nm (đỏ và hồng ngoại), 550 nm (xanh lá cây),

480 nm (xanh dương) cho tới 280 - 400 nm (dải cực tím) Việc lựa chọn bước sóng cho phép tạo ra sự huỳnh quang ở các loại fluorophores khác nhau Ánh sáng sơ cấp được cho đi qua một lỗ hội tụ sơ cấp để loại bỏ các tia bị cầu sai (spherical aberration) hoặc kém hội tụ (out-of-focus).Sau đó, ánh sáng đi qua một gương lọc/bán mạ (dichroic mirror) và được hội tụ tại một điểm rất nhỏ trên mặt phẳng tiêu của mẫu vật, với độ sâu trường ảnh (depth-of-field) vào khoảng vài trăm nanomet (do vậy tạo ra được ảnh ba chiều của mẫu vật) Ánh sáng

phản xạ hoặc ánh sáng huỳnh quang (ánh sáng thứ cấp) sẽ được phản chiếu tại gương lọc (do có bước sóng dài hơn bước sóng cho phép của gương), đi qua thêm một pinhole loại ánh sáng out-of-focus thứ hai trước khi đi vào bộ phận ghi ảnh Các kính hiển vi đồng tiêu có thị kính quan sát như kính quang học truyền thống, nhưng có thể được trang bị các CCD camera hoặc CMOS để ghi ảnh, đặc biệt cần thiết vì mắt người mẫn cảm và không quan sát được tia laser hay tia cực tím

Hình ảnh cuối của vật là ảnh ba chiều (khác với kính quang học truyền qua truyền thống là ảnh hai chiều) Ở các phiên bản đặc biệt, các kính hiển vi đồng tiêu được gắn thêm các máy đo thời gian cực nhanh để ghi ảnh bốn chiều của vật (cỡ nano giây tới mili giây) cho các ứng dụng đo thời gian của các hoạt động tế bào (time-lapse microscopy)

Kính hiển vi đồng tiêu là một dụng cụ quang học cho phép vượt xa khả năng quan sát của các kính hiển vi truyền thống, do đó được áp dụng để quan sát các chi tiết vốn quá nhỏ để quan sát bởi các kính hiển vi quang học thông thường (dưới 200 nm) Các ứng dụng hiện nay bao gồm các ngành y sinh học (nghiên cứu tế bào), bán dẫn (quan sát vật liệu ở dạng ảnh ba chiều)

Kính hiển vi đồng tiêu có độ phân giải cao mà kết cấu và điều khiển không quá phức tạp, giá thành rẻ hơn các kính hiển vi điện tử nhưng độ phân giải tốt hơn nhiều so với kính hiển vi quang học thông thường, có thể xuống tới dưới 10 nm ở các biến thể hoặc ở độ phóng đại trung bình (1500 lần, càng phóng đại, độ phân giải càng giảm), đồng thời có độ sáng rất cao và phân biệt tốt các chi tiết nhờ sử dụng các chất nhuộm màu Khả năng ghi ảnh ba chiều và

đo thời gian của kính hiển vi đồng tiêu cũng là một lợi điểm, cho phép nghiên cứu "chiều cao" của các chi tiết trong mạch bán dẫn hay thời gian hoạt động của các tế bào sống (các hoạt động nội bào, phân chia hoặc phát triển), đồng thời không yêu cầu phải phá hủy mẫu vật Một ưu điểm nữa của kính hiển vi đồng tiêu là tốc độ quét nhanh (cỡ mili giây) nếu so với các kỹ thuật quét khác như