BƯỚC ĐẦU PHÂN LẬP CÁC DÒNG VI KHUẨN CÓ TÍNH PROBIOTIC TỪ NEM CHUA

DANH SÁCH CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1 Một số tính chất của vi khuẩn lên men lactic đồng hình 7 Bảng 2.2 Thành phần mật 16 Bảng 3.1 Một số đặc điểm của vi khuẩn Lactobacillus và Streptococc

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

BƯỚC ĐẦU PHÂN LẬP CÁC DÒNG VI KHUẨN

CÓ TÍNH PROBIOTIC TỪ NEM CHUA

Họ và tên sinh viên: VÕ HÀN CHƯƠNG Ngành: BẢO QUẢN CHẾ BIẾN NÔNG SẢN THỰC PHẨM VÀ DINH DƯỠNG NGƯỜI

Niên khóa: 2005 – 2009

Tháng 8/2009

BƯỚC ĐẦU PHÂN LẬP CÁC DÒNG VI KHUẨN CÓ

TÍNH PROBIOTIC TỪ NEM CHUA

Tác giả

VÕ HÀN CHƯƠNG

Khóa luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp bằng Kỹ sư ngành

Bảo Quản Chế Biến Nông Sản Thực Phẩm và Dinh Dưỡng Người

Giáo viên hướng dẫn:

Ts Trương Thanh Long

Tháng 8/2009

LỜI CẢM ƠN

Chân thành cảm ơn Ban giám hiệu, quý Thầy Cô Khoa Công Nghệ Thực Phẩm trường Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh đã dạy dỗ, tạo điều kiện trong suốt quá trình học tập

Con xin gửi lòng biết ơn sâu sắc đến bố mẹ, những người đã có công sinh thành

và yêu thương con Cảm ơn gia đình đã luôn bên cạnh và động viên con trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài này

Em xin chân thành cảm ơn Thầy Trương Thanh Long, người đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn em thực hiện đề tài này

Cuối cùng tôi xin cảm ơn các bạn lớp DH05DD đã luôn động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập

Tp Hồ Chí Minh tháng 8 năm 2009

TÓM TẮT

VÕ HÀN CHƯƠNG, Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh

Đề tài: BƯỚC ĐẦU PHÂN LẬP CÁC DÒNG VI KHUẨN LACTIC CÓ TÍNH PROBIOTICS TỪ SẢN PHẨM NEM CHUA

Giáo viên hướng dẫn: Ts Trương Thanh Long

Nem chua là sản phẩm lên men thịt truyền thống của người Việt Nam Vi khuẩn lactic tham gia vào quá trình lên men và tác dụng có lợi cho hệ vi sinh vật đường ruột Chúng tôi tiến hành nuôi cấy và phân lập các chủng vi khuẩn lactic từ sản phẩm nem chua

Ở thí nghiệm khảo sát sự sống sót của các vi khuẩn lactic qua môi trường pH thấp, thí nghiệm pH 2,5 và pH đối chứng là 6,0, với giá trị pH 2,5, từ 30 ống nghiệm ban đầu chỉ còn lại 8 ống nghiệm có vi khuẩn lactic sống sót (chiếm 26,7%) Số lượng

vi khuẩn dao động từ 104- 107 cfu/ml Với giá trị pH đối chứng 6,0 thì số lượng vi khuẩn khoảng 106- 108 cfu/ml Vi khuẩn lactic sống sót trong 8 ống nghiệm tiếp tục thí nghiệm khả năng sống sót của chúng khi qua môi trường muối mật

Với môi trường muối mật, 8 ống nghiệm chứa vi khuẩn lactic lần lượt thí nghiệm qua môi trường nuôi cấy có 3 nồng độ muối mật là 0%, 0,3% và 0,6% (w/v) muối mật Với 0,3 % muối mật thì chỉ còn 75% ống nghiệm có vi khuẩn lactic sống sót Số lượng vi khuẩn biến đổi từ 105- 107 cfu/ml Với 0,6% muối mật thì chỉ còn 62,5% ống nghiệm có vi khuẩn lactic có khả năng sống sót Số lượng vi khuẩn dao động từ 105- 106 cfu/ml Như vậy môi trường có muối mật làm giảm số lượng vi khuẩn lactic sống sót và nồng độ muối mật càng cao thì số lượng vi khuẩn lactic có khả năng sống sót càng thấp 6 ống nghiệm chứa vi khuẩn lactic sống sót được đưa qua khảo sát tác động đồng thời cả pH thấp 2,5 và muối mật 0,3% (w/v)

Vi khuẩn lactic giảm đáng kể khi chịu tác động đồng thời hai yếu tố pH thấp 2,5 và muối mật 0,3% (w/v) Cụ thể từ 6 ống nghiệm ban đầu thì chỉ còn 2 ống nghiệm

có vi khuẩn lactic có khả năng sống sót Số lượng vi khuẩn trong mỗi ống nghiệm cũng khá thấp, nằm trong khoảng 105 cfu/ml Chủng vi khuẩn lactic sống sót trong hai ống nghiệm này được mang đi định danh

Kết quả định danh: vi khuẩn Lactococcus raffinolactis Như vậy vi khuẩn Lactococcus raffinolactis bước đầu có tính chất của một probiotics

MỤC LỤC

Trang Lời cảm ơn i Tóm tắt ii Mục lục iv Danh sách các bảng viii

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.4 Vi khuẩn lactic trong sản phẩm nem chua 11

2.5 Đại cương về hệ tiêu hóa người 12

2.5.1 Khái quát chung về hệ tiêu hóa người 12

2.5.2 Miệng 13 2.5.2.1 Cấu tạo của miệng 13

2.5.2.2 Sự tiêu hóa ở miệng 13

2.5.4.1 Đại cương về ruột non 15

2.5.5 Dịch tụy và dịch mật 15

2.5.5.1 Dịch tụy 15 2.5.5.2 Dịch mật 15 2.6 Thực phẩm chức năng 17

2.6.1 Định nghĩa về thực phẩm chức năng 17

2.6.2 Phân loại thực phẩm chức năng 17

2.7.2 Khả năng sống sót của probiotics khi qua hệ tiêu hóa người 18

2.7 Một vài kết quả về khả năng sống sót của probiotics khi qua hệ tiêu hóa người 20

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 21

3.2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 21

3.2.1 Dụng cụ và thiết bị 21

3.2.2 Nguyên vật liệu 21

3.4.1 Phương pháp lấy mẫu và xử lý mẫu 22

3.4.2 Kĩ thuất nuôi cấy và phân lập 23

3.4.3 Kĩ thuật đếm số lượng vi khuẩn 24

3.4.4 Nghiên cứu định danh sơ bộ 24

3.4.5 Khảo sát khả năng sống sót của vi khuẩn lactic trong môi trường pH thấp 26

3.4.7 Khảo sát khả năng sống sót của vi khuẩn lactic ở điều kiện môi trường in vitro

có pH = 2,5 trong 3 giờ và muối mật 0,3% (w/v) 27

3.4.7.1 Mục đích 27

3.4.7.2 Tiến hành 27

3.4.8 Định danh vi khuẩn lactic sống sót qua thí nghiệm với môi trường pH thấp và

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31

4.1 Khảo sát khả năng sống sót của vi khuẩn lactic trong môi trường pH thấp 31

4.2 Khảo sát khả năng sống sót của vi khuẩn lactic trong môi trường muối mật 34

4.3 Khảo sát khả năng sống sót của vi khuẩn lactic ở điều kiện môi trường in vitro

có pH = 2,5 trong 3 giờ và muối mật 0,3% (w/v) 37

4.4 Định danh vi khuẩn lactic sống sót qua thí nghiệm với môi trường pH thấp và muối

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 41

5.1 Kết luận 41 5.2 Đề nghị 42 Tài liệu tham khảo 43

Phụ lục1 45

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Trang

Bảng 2.1 Một số tính chất của vi khuẩn lên men lactic đồng hình 7

Bảng 2.2 Thành phần mật 16

Bảng 3.1 Một số đặc điểm của vi khuẩn Lactobacillus và Streptococcus 24

Bảng 4.1 Số lượng chủng vi khuẩn lactic khi qua môi trường có pH thấp 2,5 và pH đối

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Hình 2.1 Những công đoạn chính trong sản xuất nem chua truyền thống 5

Hình 2.2 Cấu tạo hệ tiêu hóa người 13 Hình 3.1 Mẫu nem chua của cơ sở sản xuất nem chua “ Bà Chín” 22

Hình 3.3 Những công đoạn nghiên cứu chính trong phòng thí nghiệm 25

Hình 3.4 Khảo sát khả năng sống sót của vi khuẩn lactic qua môi trường pH thấp 28

Hình 3.5 Khảo sát khả năng sống sót của vi khuẩn lactic qua môi trường muối mật 29

Hình 4.1 Hình ảnh minh họa cho việc định danh bằng bộ kíp API 50 CH 39

Probiotics được xem là thực phẩm chức năng trên thị trường Probiotics là một loài hay là một hỗn hợp vi sinh vật sống trong cơ thể con người và động vật, ảnh hưởng có lợi cho vật chủ nhờ cải thiện hệ vi khuẩn nội sinh (theo Lee, 2009 trích dẫn

từ Havenaar và Veld, 1992) Các vi khuẩn này kích thích chức phận miễn dịch bảo vệ

cơ thể Các thực phẩm chức năng loại này thường được chế biến từ các sản phẩm của sữa, tạo sự cân bằng đường ruột nhờ quá trình lên men của nhóm vi khuẩn lactic Một

sự giải thích có tính khoa học cho ảnh hưởng có lợi của vi khuẩn lactic trong sữa lên men được đề cập lần đầu tiên vào năm 1907 bởi Metchnikoff Ông cho rằng vi khuẩn lactic trong sản phẩm sữa chua có khả năng làm tăng số lượng các vi khuẩn có lợi cho đường ruột, đồng thời ức chế các vi khuẩn gây hại (Saarela và ctv, 2002) Đã có khá nhiều nghiên cứu khẳng định tính probiotics trong các sản phẩm được chế biến từ sữa Thế nhưng việc sử dụng vi khuẩn lactic trong các sản phẩm từ thịt ít được phổ biến Trong đó sản phẩm nem chua là sản phẩm thịt lên men khá đặc trưng của Việt Nam

Nhóm vi khuẩn lactic được ứng dụng trong khá nhiều sản phẩm truyền thống của Việt Nam như nem chua, muối dưa chua, muối cà chua…(Nguyễn Thị Hiền, 2004) Nem chua là sản phẩm thịt lên men truyền thống của người Việt Nam được làm

Sản phẩm nem chua lên men tự nhiên đồng nghĩa với việc nhiều có nhiều loại

vi sinh vật cùng phát triển, trong đó có những vi sinh vật có tính chất probiotics Nói cách khác, khả năng phát hiện vi khuẩn có đặc tính probiotics có thể từ nhiều nguồn thực phẩm lên men khác nhau, trong đó có nem chua Được sự đồng ý của khoa Công Nghệ Thực Phẩm và sự hướng dẫn của thầy Trương Thanh Long, chúng tôi thực hiện

đề tài:

“ Bước đầu phân lập các dòng vi khuẩn lactic có tính probiotic từ sản phẩm nem chua”

1.2 Mục đích

Phân lập và định danh vi khuẩn có tính probiotics từ sản phẩm nem chua

1.3 Nội dung tiến hành

- Khảo sát khả năng sống sót của các dòng vi khuẩn khi đi qua pH thấp và muối mật

- Định danh vi khuẩn lactic có tính probiotics

Chương 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu về sản phẩm nem chua

2.1.1 Tổng quan về nem chua

Nem chua là một sản phẩm lên men từ thịt heo được sản xuất và tiêu thụ rộng rãi ở nước ta Sản phẩm thường được sản xuất bằng thủ công Công nghệ được truyền

từ đời này sang đời khác Một số loại nem chua nổi tiếng có mặt trên thị trường như nem Lai Vung, nem Thanh, nem Chợ Huyện, nem Thủ Đức….Công nghệ sản xuất nem truyền thống sử dụng biện pháp lên men tự nhiên và được gói bằng lá vông, lá chùm ruột, hay lá ổi, được bao bên ngoài bằng nhiều lớp lá chuối dày Trước đây, nem chua chỉ được sản xuất ở một số cơ sở nhỏ lẻ trong cả nước Quá trình lên men chủ yếu dựa vào kinh nghiệm nên chất lượng sản phẩm ít ổn định Nguồn nguyên liệu không được kiểm soát kĩ cũng như quá trình lên men không được kiểm soát dẫn đến chất lượng sản phẩm kém Điều đó làm cho thị trường tiêu thụ sản phẩm này bị hạn chế, chỉ được biết đến ở một số địa phương với những thương hiệu nổi tiếng

Ngày nay sản phẩm nem chua đã có mặt trong một số siêu thị cũng như thị trường nước ngoài nhưng số lượng vẫn còn rất hạn chế Việc chọn lọc nguồn nguyên liệu tốt cũng như có nguồn giống khởi động thuần (starter culture) đã góp phần nâng cao chất lượng sản phẩm nem chua Qui mô sản xuất nem chua theo kiểu công nghiệp dần thay thế cho phương pháp thủ công nhỏ lẻ Phần lớn các cơ sở sản xuất đều đã được cơ giới hóa bởi sử dụng máy móc như máy xay thịt, máy cắt da thành sợi…Những máy này chủ yếu được sản xuất tại thành phố Hồ Chí Minh Chúng thực

sự được người sử dụng đánh giá cao vì hiệu quả về chất lượng cũng như số lượng

Nem chua được người tiêu dùng biết đến bởi hình ảnh một sản phẩm thịt lên men có màu đỏ, bề mặt hơi khô, cấu trúc chắc và vị hỗn hợp rất đặc trưng (cùng lúc có

vị chua, ngọt và vị cay của tiêu) Sau khi nguyên liệu được trộn, định hình và bao gói,

quá trình lên men được thực hiện ở nhiệt độ phòng trong khoảng 3 – 5 ngày Bản chất của quá trình lên men nem chua là quá trình chuyển hóa đường (thêm vào trong quá

trình chế biến) thành axit lactic nhờ hoạt động của vi khuẩn Lactobacillus, Pediococcus, Micrococcus Trong đó vai trò quan trọng nhất là Lactobacillus (Nguyễn

2.1.2 Qui trình sản xuất nem chua

Qui trình sản xuất nem chua truyền thống được trình bày qua Hình 2.1

Hình 2.1 Những công đoạn chính trong sản xuất nem chua truyền thống

Nguyên liệu thịt heo là một trong những yếu tố quan trọng quyết định chất lượng của sản phẩm Theo công nghệ sản chế biến nem truyền thống, thịt heo thường được dùng là thịt mới mổ, thịt “nóng”, không dùng thịt đã ôi, có màu sẫm Tuy nhiên trong sản xuất công nghiệp thịt lạnh hay thịt đông lạnh vẫn có thể được sử dụng Thịt heo được xay nhỏ bằng máy xay thịt, sau đó được đưa ngay vào máy quết thịt để giã Đồng thời người ta sẽ tẩm ướp gia vị để gia vị được ngấm đều vào thịt

Song song với quá trình đó da heo được rửa sạch, luộc chín, thái nhỏ và đem đi làm ráo Thịt nạc và da heo được trộn chung bằng tay hay máy trộn, sau đó đem định hình sản phẩm, khối lượng mỗi đơn vị sản phẩm từ 15 – 50 g Việc bao gói được tiến hành tạo điều kiện yếm khí cho vi khuẩn lactic phát triển biến đổi đường thành axit lactic Axit lactic sinh ra sẽ làm giảm pH của thịt, tạo cấu trúc cho thịt và ức chế sự phát triển của các vi sinh vật gây thối (Nguyễn Thị Hiền, 2004)

Quá trình lên men nem chua kéo dài 3 - 5 ngày ở nhiệt độ phòng Bảo quản sản phẩm ở 40C sẽ giữ được trong khoảng 1 tháng

2.2 Quá trình lên men lactic

Lên men lactic là quá trình chuyển hóa đường thành axit lactic nhờ vi sinh vật Những vi khuẩn lên men lactic được gọi là vi khuẩn lactic Chúng có thể lên men được các đường mono – hoặc disacarit, nhưng không lên men được tinh bột (Nguyễn Thị Hiền, 2004) Lên men lactic có hai dạng: lên men đồng hình và dị hình

¾ Nhóm vi khuẩn lên men lactic đồng hình:

Lên men lactic đồng hình sản phẩm chính là axit lactic

Quá trình này xảy ra nhiều giai đoạn và tạo ra nhiều sản phẩm trung gian Giai đoạn đầu là quá trình đường phân tạo axit pyruvic, sau đó biến axit pyruvic thành axit lactic do vi khuẩn lactic Ngoài ra còn có một phần nhỏ pyruvat bị khử cacboxyl để tạo thành axit acetic, rượu, CO2 Tuy nhiên axit lactic chiếm tỉ lệ khá cao (trên 90%)

Một số vi khuẩn tham gia kiểu lên men này: Lactococcus lactis var lactis, Lactococcus lactis var cremoris, Streptococcus thermophilus, Lactobacillus bulgaricus, Lb casei, Lb delbrueckii, Lb plantarum (Tô Minh Châu, 2000)

Một số đặc điểm của vi khuẩn lactic lên men đồng hình được trình bày ở Bảng 2.1

Bảng 2.1 Một số tính chất của vi khuẩn lên men lactic đồng hình

30 – 350C Dạng nizin Sữa – kem

Bơ chua Pho mai

Lactococcus

lactis var

cremoris

Hình cầu và chuỗi dài

Trực khuẩn 40 – 450C Không Sữa chua

Lb axitophilus Trực khuẩn 37 – 400C Có tính bacteriocin Sữa

Lb delbrueckii Trực khuẩn 54 – 500C Không Tinh bột

Bánh mì

sữa

(Nguồn: Lương Đức Phẩm, 2000)

¾ Nhóm lên men lactic dị hình:

Các vi khuẩn lactic lên men dị hình thiếu các enzyme chủ yếu của con đường EMP,

đó là aldolase, triose phosphate isomerase Do đó chúng không thể phân hủy hết được axit pyruvic mà chuyển thành axit lactic và axit succinic Các sản phẩm phụ của quá trình lên men dị hình không gây ảnh xấu đến chất lượng sản phẩm mà nó còn góp phần tạo hương vị đặc trưng cho sản phẩm

Một số loài vi khuẩn chủ yếu lên men loại này là: Lactobacillus brevis, Lb

buchneri, Lb fermentum, Lb kefir, Lb fructosus, Lb pentoacetum, Leuconostoc

mesenteroides…(Nguyễn Thị Minh Uyên, 2008; Mai Ngọc Đoàn, 2005)

2.3 Vi khuẩn lactic

Vi khuẩn lactic thường có dạng hình cầu (hoặc hình ovan) và hình que Đường

kính của các dạng cầu khuẩn lactic từ 0,5 – 1,5 µm Trực khuẩn đứng riêng lẻ hoặc

thành chuỗi

Tất cả vi khuẩn lactic đều không chuyển động, không sinh bào tử, Gram dương,

kị khí tùy tiện hoặc vi hiếu khí Trực khuẩn thường nhạy cảm hơn liên cầu khuẩn với

độ hiếu khí của môi trường Các loài vi khuẩn lactic có khả năng tạo thành axit rất

khác nhau trong môi trường và như vậy sức chịu axit (hay độ bền với axit) cũng khác

nhau Đa số các trực khuẩn lactic đồng hình tạo thành axit cao hơn (khoảng 2 -3,5%),

liên cầu khuẩn (khoảng 1%) Các trực khuẩn này có thể phát triển ở pH = 4 – 3,8 Cầu

khuẩn không thể phát triển được ở môi trường này Hoạt lực lên men tốt nhất ở trực

khuẩn ở vùng pH = 5,5 – 6 (Lương Đức Phẩm, 2002)

Các vi khuẩn lactic ưa ấm có nhiệt độ sinh trưởng tối thích là 25 – 350C, các

loài ưa nhiệt có nhiệt độ tối thích là 40 – 450C, ưa lạnh phát triển ở nhiệt độ tương đối

thấp (50C hoặc thấp hơn) Khi nhiệt độ tới 60 – 800C hầu hết chúng bị chết sau 10 – 30

phút (Lương Đức Phẩm, 2000)

Một số loại có khả năng tạo màng nhầy Một số khác lại có khả năng đối kháng

lại với thể hoại sinh và các vi sinh vật gây bệnh hoặc làm thối rữa thực phẩm Như

vậy, ngoài khả năng tạo thành axit lactic các loài này còn sinh ra các hợp chất có hoạt

tính kháng sinh (người ta gọi hợp chất này là bacteriocin)

Các vi khuẩn lactic điển hình được phân lập từ thực phẩm bao gồm:

¾ Các trực khuẩn: Lactobacillus, Carnobacterium

¾ Các cầu khuẩn: Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus (Lê Kim Tuyền, 2008)

2.3.1 Lactobacillus

Lactobacillus là những vi khuẩn Gram dương, có dạng que dài, chuỗi dài, hoặc

tế bào riêng lẻ Chúng bao gồm rất nhiều giống là nhân tố lên men, thủy phân các sản

phẩm chứa hàm lượng protein cao như sữa, thịt, rau quả, ngũ cốc Các vi khuẩn thuộc

giống này còn có thể tìm thấy trên các thực phẩm bị hư hỏng như bia, nước trái cây, cá

tẩm gia vị, các sản phẩm thịt lên men và các sản phẩm sữa (Nguyễn Thị Minh Uyên, 2008)

Lactobacillus đòi hỏi môi trường thật sự phù hợp cho sự phát triển của chúng,

giàu axit amin, vitamin và axit béo: đó là những chủng vi khuẩn ưa axit, chúng thường

ít phân giải đạm và béo

Lactobacillus được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp sữa, pho mai, trong sản

xuất choucroute (bắp cải lên men) và tham gia vào các sản phẩm muối, thịt nguội (theo Nguyễn Thanh Khương, 2004 trích dẫn từ J P Guiraud, 1998)

Ngày nay có rất nhiều nghiên cứu về khả năng sống sót của Lactobacillus khi

đi qua hệ dạ dày – ruột người Vì đây là một trong những yếu tố quan trọng quyết định

tính probiotics của vi khuẩn Một số chủng đã được định danh: Lb brevis, Lb plantarum, Lb pacasei, Lb pentosus, Lb fermentum…(Pennacchia và ctv, 2003) Điều

này mở ra một hướng mới trong lĩnh vực ứng dụng vi khuẩn lactic vào sản xuất thực phẩm có tính chất probiotics

2.3.2 Lactococcus

Lactococcus có dạng hình cầu hay hình trứng, kết đôi hay chuỗi Hiện nay đã có

5 loài Lactococcus được nhận biết, đó là Lc lactis, Lc garvieae, Lc plantarum, Lc piscium và Lc raffinolactis Các loài này chủ yếu được tìm thấy trong các sản phẩm sữa: sữa chua, pho mai Lactococcus lactis thường được sử dụng trong các sản phẩm sữa lên men để biến đổi đường thành axit lactic Lc raffinolactis, trước đây được biết với tên Streptococcus raffinolactis, có dạng hình cầu, chúng không thể phát triển được

ở trên 400C, pH 9,2, hoặc nồng độ NaCl trên 4%, được tìm thấy trong sản phẩm sữa

lên men truyền thống ”Dahi” của Bangladesh (Boucher và ctv, 2003)

2.3.3 Leuconostoc

Leuconostoc là vi khuẩn kị khí tùy ý, tế tào dạng hình cầu hay hình thoi dài, sắp

xếp thành chuỗi và tập trung Trong môi trường axit, chúng trở nên dài và nhọn Khi vào môi trường nấm men và cao thực vật chúng phát triển mạnh Lên men đường có giới hạn lượng axit lactic, vì thế chúng ít khi làm đông tụ sữa (Lê Kim Tuyền, 2008)

Leuconostoc được tìm thấy trên lá, ngũ cốc, nho, và các cụm hoa Nhiệt độ

phát triển từ 200C đến 300C và không phát triển ở 450C Leuconostoc được ứng dụng

trong lên men malto – lactic trong rượu vang (Nguyễn Thanh Khương, 2004)

Leuconostoc có vai trò quan trọng trong nền công nghiệp chế biến sữa do chúng

có khả năng lên men sinh CO2 và diacetyl từ citrate của sữa, trong đó hợp chất diacetyl

là hợp chất chính tạo hương cho bơ, phomai tươi, kem chua (Nguyễn Thị Minh Uyên, 2008)

2.3.4 Streptococcus

Các tế bào Streptococcus có dạng hình cầu, Gram dương Chúng phát triển tốt ở

370C Quá trình lên men của chúng là đồng hình sinh axit lactic Trong các loài của

Streptococcus chỉ có St thermophilus được sử dụng làm giống khởi động Chúng thường kết hợp với Lactobacillus ưa nhiệt để trở thành một phần quan trọng trong lên

men sữa chua, phomai

Trong sản xuất sữa chua, việc nuôi cấy hai loài vi khuẩn St thermophilus và Lb bulgaricus cho kết quả sinh ra axit lactic tốt hơn là chỉ sử dụng một loài riêng biệt Lb bulgaricus Hỗn hợp vi khuẩn này có chứa enzyme phân giải protein nên có khả năng

phân tách một số axit amin từ casein Các axit amin này có vai trò như một chất kích

thích hoạt động cho loài St thermophilus (theo Lê Kim Tuyền, 2008 trích dẫn từ Lê

Thị Thiên Thanh và Lê Văn Hoàng, 2002) Trong giai đoạn đầu của quá trình lên men

sữa chua, pH của sữa khoảng 6,8 thích hợp cho sự phát triển của St thermophilus và

lượng axit sinh ra trong giai đoạn này là do hoạt động của loài này tạo ra Sau giai đoạn đầu lên men, hàm lượng axit lactic sinh ra sẽ làm pH của sữa giảm xuống tạo

điều kiện thuận lợi cho Lb bulgaricus phát triển Trước đây người ta cho rằng sự hình thành chất thơm trong sữa chua chỉ có vai trò của St thermophilus Nhưng kết quả nghiên cứu gần đây cũng nhấn mạnh đến vai trò của Lb bulgaricus trong việc tạo nên

hương thơm cho sản phẩm, trong đó thành phần acetaldehyde được coi là thành phần quan trọng góp phần tạo nên hương thơm đặc trưng cho sữa chua (Lê Kim Tuyền, 2008)

2.3.5 Enterococcus

Enterococcus có tế bào hình cầu hay hình trứng (0,6 -2 x 0,6 – 2,5 µm) Chúng được nhận biết trong khi phân lập Streptococcus “miệng” hay “phân” Một số loài Streptococcus “phân” được chuyển thành Enterococcus Đến nay đã có ít nhất 19 loài thuộc giống Enterococcus được nhận biết, chúng được tìm thấy trong những môi

trường khác nhau như ruột người hay động vật, lá, sữa, đất, côn trùng, chim hay những

động vật hoang dã khác Enterococci có mặt trong các loại thực phẩm tự nhiên Chúng

có vai trò quan trọng trong việc làm chín và tạo hương vị cho pho mai và xúc xích chua Chúng được sử dụng như là tác nhân để củng cố sự cân bằng của hệ vi sinh vật

đường ruột (Gustavo, 2008) Một số loài Enterococcus được đề nghị làm probiotics, Enterococcus hoạt động để khởi động quá trình lên men, chống lại các vi khuẩn Gram

âm, tạo môi trường thuận lợi cho Lactobacillus tiếp tục lên men (Nguyễn Thị Minh

Uyên, 2008)

2.3.6 Pediococcus

Pediococcus là những cầu khuẩn Gram dương, thường dính lại thành cặp hai

hay bốn Quá trình trao đổi chất của nó là quá trình lên men đồng hình Chúng là những vi khuẩn yếm khí tùy tiện có thể phát triển trên môi trường rắn với sự có mặt

của không khí Một số chủng Pediococcus khác nhau về tính chịu nhiệt, chịu axit và chịu NaCl Pediococcus có khả năng kháng khuẩn do chúng sinh ra một vài loại

pediocin (bacteriocin), đã được thương mại hóa nhờ khả năng nâng cao tính an toàn

của thực phẩm, đặc biệt là thông qua khả năng ngăn chặn Listeria (Nguyễn Thị Minh

Uyên, 2008)

2.4 Vi khuẩn lactic trong sản phẩm nem chua

Trong những năm gần đây, vi khuẩn lactic được áp dụng khá rộng rãi trên thế giới trong sản xuất lên men từ thịt như xúc xích lên men, lạp xưởng lên men nhằm làm tăng chất lượng cảm quan của sản phẩm và kéo dài thời gian sử dụng

Trong sản phẩm nem chua của Việt Nam, vi khuẩn lactic trở thành giống khởi động lên men đường thành axit lactic Nguyễn Đức Lượng (2000) đã chỉ ra hệ vi

khuẩn len men lactic ở thịt chủ yếu nhờ vào Lactobacillus, Micrococcus, Pediococcus

Theo nghiên cứu của Trịnh Phương Nam (2003), sau khi bao gói sản phẩm, số lượng

Lactobacillus và Streptococcus tăng mạnh trong 3 ngày đầu tiên và giảm trong những

ngày tiếp theo đó Còn theo nghiên cứu của Nguyễn Thanh Khương (2004) thì tiến

triển số lượng của Streptococcus giống với Lactobacillus nhưng chậm hơn, đồng thời

ở những ngày cuối của quá trình lên men, số lượng Streptococcus giảm nhẹ Nguyên nhân là do tác động của sự giảm pH đã tiêu diệt bớt số lượng Streptococcus

Qua một số nghiên cứu về hệ vi sinh vật trên sản phẩm nem chua cho thấy giá trị pH trong 5 ngày đầu tiên giảm trung bình từ 5,8 xuống còn 4,1 Nhóm vi khuẩn

lactic đã được định danh là Lactobacillus plantarum, Lb coprophilus, Lb delbrueckii,

Lb brevis, Lb cellobiosus, Lb leichmanii, Lb axitophilus và Leuconostoc mensenteroides (Nguyễn Thanh Khương, 2004) Còn theo tác giả Hồ Thị Nguyệt Thu

và ctv (2007) thì giá trị pH lúc ban đầu của thịt tươi làm nguyên liệu chế biến là 5,61 ± 0,02, sau đó pH giảm xuống còn 4,00 ± 0,2 sau 5 ngày lên men Vi khuẩn lactic sẽ tăng nhanh trong 4 ngày đầu lên men Với 131 chủng vi khuẩn lactic được định danh

từ các sản phẩm nem chua thì tần số xuất hiện của các chủng là 25,19% Lb brevis, 21,37% Lb plantarum, 14,5% Leuconostoc mensenteroides,12,21% Pediococcus pentosaceus và 11,45 % Lactococcus lactis Một số loài vi khuẩn lactic khác xuất hiện với tần xuất thấp (từ 1,53% đến 3,82%) là Lb paracasei ssp paracasei, Lb fermentum, Lb cellobiosus, Lb collinoides, Leuconostoc lactis

2.5 Đại cương về hệ tiêu hóa người

2.5.1 Khái quát chung về hệ tiêu hóa người

Cấu tạo hệ tiêu hóa ở người là hoàn chỉnh nhất, điển hình cho các loại ăn tạp, dạ dày một túi Hệ tiêu hóa bao gồm các phần chính:

- Khoang miệng, trong đó có răng, lưỡi hầu, các tuyến nước bọt

- Thực quản

- Dạ dày

- Ruột: bao gồm tá tràng, ruột non, ruột già

- Trực tràng và hậu môn

Các tuyến như tuyến tụy, tuyến mật (của gan)

Trong hệ tiêu hóa, hai thành phần tác động chính lên hệ sinh vật có lợi từ nguồn thực phẩm ăn vào là dạ dày, ruột

Hệ tiêu hóa ở người được trình bày qua Hình 2.2

(Nguồn: Trịnh Hữu Hằng, 2007)

Hình 2.2 Cấu tạo hệ tiêu hóa ở người

2.5.2 Miệng

2.5.2.1 Cấu tạo của miệng

Khoang miệng (Cavum oris) là đoạn mở đầu của ống tiêu hóa, nơi tiếp nhận các

dạng vật chất từ bên ngoài Giới hạn của khoang miệng, phía trước là hai môi, phía sau

là hầu (họng), phía trên là vòm khẩu cái, phía dưới là nền miệng cùng với lưỡi và hai bên là má

2.5.2.2 Sự tiêu hóa ở miệng

Sự tiêu hóa ở miệng xảy ra hai quá trình chính: tiêu hóa cơ học và tiêu hóa hóa học Trong đó tiêu hóa cơ học là chính, hóa học là phụ

Tiêu hóa cơ học chủ yếu là cử động nhai của răng làm cắt nhỏ thức ăn, xé nhỏ

và nghiền nát thức ăn, đồng thời thức ăn được trộn đều với nước bọt Nước bọt chỉ chứa một enzyme duy nhất là amylase, nên chỉ phân giải được gluxit, còn protein và lipit vẫn chưa được phân giải

Lượng nước bọt được tiết ra phụ thuộc vào độ khô của thức ăn, các loại thức ăn

có thể tiêu hóa được hay không Thức ăn càng khô thì nước bọt tiết ra càng nhiều Thức ăn có pH kiềm hay axit, nước bọt cũng tiết ra để trung hòa Thức ăn không ăn được nước bọt có ít enzyme, ngược lại, nước bọt có chứa nhiều enzyme và chất nhầy (Trịnh Hữu Hằng, 2007)

2.5.3 Dạ dày

2.5.3.1 Đại cương về dạ dày

Dạ dày (Ventricular) là phần phình lớn nhất của ống tiêu hóa nằm trong khoang

bụng Ở người trưởng thành thể tích dạ dày đạt 3 lít Khi đói, dạ dày hẹp, kích thước

bé, nằm sát cơ hoành Khi có đầy thức ăn, dạ dày phình lớn, phần đáy ngang với rốn

Thành dạ dày được cấu tạo bởi 3 lớp cơ trơn: lớp cơ dọc ở ngoài, lớp cơ vòng ở giữa, lớp cơ chéo ở trong Bao phủ toàn bộ mặt trong là lớp niêm mạc có rất nhiều nếp nhăn Giữa lớp cơ trơn và niêm mạc có tổ chức thần kinh là đám rối Meissner và Auerbach

2.5.3.2 Sự tiêu hóa hóa học ở dạ dày

Trong niêm mạc dạ dày có rất nhiều tuyến vị tiết ra dịch vị Mỗi tuyến vị được cấu tạo bởi các loại tế bào khác nhau, trong đó:

- Tế bào chính tiết ra enzyme pepsinogen và các enzyme tiêu hóa khác

- Tế bào thành (hay tế bào bờ) tiết HCl

- Tế bào cổ tuyến tiết ra chất nhầy mucin

- Tế bào nội tiết tiết hocmon gastrin

Cấu tạo các tuyến vị cũng tạo ra các túi chứa dịch vị Trên bề mặt phủ lớp chất nhầy để bảo vệ tác dụng chính của dịch vị Vùng thân dạ dày, tuyến vị có nhiều tế bào chính và viền nên dịch vị có nhiều enzyme pepsinogen và axit HCl

Dịch vị là một dịch lỏng trong suốt, không màu và quánh có tỉ trọng 1,0008 – 1,0086 Độ pH của dịch vị nguyên chất là 0,9 – 1,5 Khi có lẫn thức ăn thì pH = 1,5 – 2,5 Ở người, trong 24 giờ dạ dày tiết ra khoảng 1,5 – 2 lít (Trịnh Hữu Hằng, 2007)

2.5.4 Ruột non

2.5.4.1 Đại cương về ruột non

Ruột non (intestinum tenue) là đoạn giữa và dài nhất của ống tiêu hóa, ở người

là một ống dài từ 3 – 6 m, rộng 3 cm ở trên và 2 cm ở dưới, gấp 2 – 4 lần chiều cao của

cơ thể (Đinh Quế Châu, 2005)

Ruột non chia làm 3 đoạn chính: đoạn đầu khoảng 20 cm gọi là tá tràng Ống tụy và ống mật đổ vào đoạn đầu của tá tràng Hai đoạn tiếp theo là không tràng chiếm khoảng 2/5 chiều dài, hồi tràng chiếm 3/5 chiều dài ruột

2.5.4.2 Sự tiêu hóa hóa học ở ruột non

Sự tiêu hóa ở ruột non quan trọng nhất là nhờ vào dịch tụy và dịch mật Dịch này làm cho hầu hết các loại thức ăn biến đổi thành những chất đơn giản (như axit amin, glucose, axit béo, và glycerol) để có thể hấp thu được vào máu Dịch ruột tiết ra

do cơ chế cơ học (thức ăn kích thích vào niêm mạc ruột) và cơ chế hóa học (dịch vị) (Trịnh Hữu Hằng, 2007)

Thành phần của dịch tụy bao gồm nước chiếm 98,8%, chất vô cơ 0,7 – 0,8%, chất hữu cơ 0,7 – 0,8% Các chất vô cơ có Na+, K+, Ca++, Mg++, Cl-, HCO3- Trong đó quan trọng nhất là NaHCO3 NaHCO3 có vai trò rất quan trọng tương tự như HCl của dịch vị, nó tạo ra môi trường có pH thích hợp cho các enzyme hoạt động (Trịnh Hữu Hằng, 2007) Các chất hữu cơ bao gồm các enzyme phân giải protein, lipit, glucit, ngoài ra còn có một ít bạch cầu, globulin

2.5.5.2 Dịch mật

- Sự dự trữ và nồng độ mật trong túi mật

Mật liên tục được sản xuất ra bởi tế bào gan, thể tích tối đa của túi mật chỉ có thể dự trữ là 30 – 60 ml Tuy nhiên số lượng mật bài tiết sau 12 giờ là 450 ml mà túi mật không bị ảnh hưởng là do quá trình tái hấp thụ liên tục nước, sodium, chloride và

các ion khác qua tế bào biểu mô túi mật Các hợp chất còn lại trong túi mật là muối

mật, cholesterol, lecithin và bilirubin

Sự tái hấp thu chủ yếu là chuyên chở chủ động sodium qua màng tế bào biểu

mô túi mật, sau đó là sự khuyếch tán chloride và nước Thành phần của mật được trình

bày qua Bảng 2.2

Bảng 2.2: Thành phần mật người

Thành phần mật Mật trong gan Mật trong túi mật

Nước 97,5g/dL 92g/dL Muối mật 1,1g/dL 6g/dL

(Nguồn: Talwar, 2004)

- Muối mật:

Nguyên liệu để tổng hợp muối mật là cholesterol được gan tổng hợp và do máu

mang đến gan Với sự tham gia của các axit amin, glycin, taurin và sự xúc tác của các

enzyme ở mạng nội bào, cholesterol chuyển hóa thành axit mật Các axit mật

glycocholic và taurocholic kết hợp với Na và K tạo ra các muối mật, đó là

glycocholat-Na và taurocholat - glycocholat-Na (hoặc K)

Đối với quá trình tiêu hóa lipit, muối mật có vai trò đặc biệt quan trọng Nó có tác dụng nhũ tương hóa tất cả lipit của thức ăn để cho enzyme lipase có khả năng phân giải lipit chuyển thành axit béo và glycerol Muối mật giúp cho sự hấp thu các sản phẩm tiêu hóa của lipit và và các chất hòa tan của lipit như vitamin A, D, E, K

Trong chứng sơ gan, viêm gan làm giảm sự tiết mật của tế bào gan, kéo theo sự giảm tiêu hóa lipit, lượng lipit trong phân tăng Bệnh kéo dài gây chứng thiếu vitamin nghiêm trọng, nhất là vitamin K Muối mật được hấp thu trở lại ở ruột sẽ quay lại gan

để kích thích gan tăng tiết muối mật

2.6 Thực phẩm chức năng

2.6.1 Định nghĩa thực phẩm chức năng

Cho đến nay chưa có một tổ chức quốc tế nào đưa ra định nghĩa đầy đủ về thực phẩm chức năng, mặc dù đã có nhiều hội nghị quốc tế và khu vực về thực phẩm chức năng (Trần Đáng, 2007) Thuật ngữ “Thực phẩm chức năng” lần đầu tiên được phát biểu tại Nhật Bản năm 1991 với tên: “ Thực phẩm chuyên dùng cho sức khỏe” Thực phẩm chức năng là loại thực phẩm có những hoạt tính sinh học, chúng có thể tác dụng lên một hoặc nhiều chức năng trong cơ thể con người Những hoạt chất này có thể giúp cho tình trạng sức khỏe tốt hơn hoặc giảm bớt nguy cơ gây bệnh Thực phẩm chức năng có thể chứa đựng các hợp chất vi lượng, vitamin, axit béo, sơ thực phẩm, các hợp chất thêm vào trong thực phẩm hoặc probiotics (Rebucci, 2007)

2.6.2 Phân loại thực phẩm chức năng

Hiện nay có nhiều cách để phân loại thực phẩm chức năng, tùy theo bản chất, tác dụng hoặc nguồn gốc…Sau đây là cách phân loại dựa theo bản chất và tác dụng của thực phẩm chức năng (Trần Đáng, 2007)

- Nhóm thực phẩm chức năng bổ sung vitamin và khoáng chất: Loại này rất phát triển

ở Mỹ, Canada, các nước châu Âu, Nhật Bản…như việc bổ sung I - ốt vào muối ăn, sắt vào gia vị, vitamin A vào đường hạt…Việc bổ sung này ở nhiều nước trở nên bắt buộc

- Nhóm thực phẩm chức năng dạng viên: tùy theo nhà sản xuất có các dạng viên nang, viên nén chứa hoạt tính sinh học, vitamin và khoáng chất

- Nhóm thực phẩm chức năng “không béo”, “không đường”, “giảm năng lượng”: được sản xuất để hỗ trợ giảm cân, giảm béo, các loại thực phẩm dành cho người tiểu đường…

- Nhóm nước giải khát, tăng lực: bổ sung năng lượng, vitamin, khoáng chất cho cơ thể khi vận động, thể dục thể thao…

- Nhóm thực phẩm chức năng giàu chất sơ: với vai trò chuyển hóa cholesterol, phòng ngừa nguy cơ suy vành, sỏi mật, tăng cảm giác no, hỗ trợ giảm cân, béo phì, tiểu đường

- Nhóm thực phẩm chức năng đường ruột: hệ vi sinh vật có lợi cho đường ruột

- Nhóm thực phẩm chức năng đặc biệt: dành cho các nhóm lứa tuổi khác nhau như phụ

nữ có thai, người cao tuổi, trẻ ăn dặm…

2.7 Probiotics

2.7.1 Khái quát chung về probiotics

Từ “probiotics” có nguồn gốc từ Hy Lạp có nghĩa là “cho cuộc sống” Tuy nhiên, định nghĩa về probiotics đã phát triển nhiều theo thời gian Theo Lee (2009) trích dẫn từ Lily và Stillwell (1965) đã mô tả trước tiên probiotics như hỗn hợp được tạo thành bởi một động vật nguyên sinh thúc đẩy sự phát triển của đối tượng khác

Định nghĩa chung này sau đó được làm cho chính xác hơn bởi Fuller (1989) Ông định nghĩa probiotics như “một chất bổ trợ thức ăn chứa vi sinh vật sống mà có ảnh hưởng có lợi đến vật chủ bằng việc cải thiện cân bằng hệ vi sinh vật ruột của nó” Khái niệm này sau đó được phát triển xa hơn : “vi sinh vật sống (vi khuẩn lactic và vi khuẩn khác, hoặc nấm men ở trạng thái khô hay bổ sung trong thực phẩm lên men) mà thể hiện một ảnh hưởng có lợi đối với sức khỏe của vật chủ sau khi được tiêu hóa nhờ cải thiện tính chất hệ vi sinh vật vốn có của vật chủ” (theo Lee, 2009 trích dẫn từ Havenaar và Veld, 1992)

2.7.2 Khả năng sống sót của probiotics khi qua hệ tiêu hóa người

Probiotics là một loài hoặc là hỗn hợp vi sinh vật sống trong cơ thể con người

và động vật, tác dụng cải thiện hệ vi sinh vật trong cơ thể con người (theo Lee, 2009 trích dẫn từ Havenaar và Veld, 1992) Sau khi vào đường tiêu hóa, yếu tố đầu tiên tác động đến probiotic là các enzyme trong miệng (amylase, lysosym) trong một thời gian