PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN NẤM MEN TRÊN TRÁI SIM ĐỂ THỬ NGHIỆM LÊN MEN DỊCH QUẢ SIM

PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN NẤM MEN TRÊN TRÁI SIM ĐỂ THỬ NGHIỆM LÊN MEN DỊCH QUẢ SIM Tác giả TRẦN THỊ HOÀI PHƯƠNG Khóa luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp bằng Kỹ sư ngành Bảo Quản Chế B

PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN NẤM MEN TRÊN TRÁI SIM ĐỂ THỬ

NGHIỆM LÊN MEN DỊCH QUẢ SIM

Tác giả

TRẦN THỊ HOÀI PHƯƠNG

Khóa luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp bằng Kỹ sư ngành

Bảo Quản Chế Biến Nông Sản Thực Phẩm

Giáo viên hướng dẫn:

Thạc sĩ Nguyễn Minh Hiền

LỜI CẢM ƠN

Trước tiên con xin ghi ơn công lao to lớn của cha mẹ đã sinh thành và nuôi dưỡng con nên người

Xin chân thành biết ơn!

Ban Giám Hiệu, các thầy cô khoa Công Nghệ Thực Phẩm, trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh đã tận tình giúp đỡ và truyền đạt kiến thức quý báu trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài

Xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cô Nguyễn Minh Hiền, người đã tận tình và hết lòng giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện luận văn tốt nghiệp

Sau cùng, tôi xin gửi lời cám ơn đến toàn thể các bạn sinh viên khóa 31 khoa Công Nghệ Thực Phẩm, những người đã luôn chia sẻ và động viên tôi trong thời sinh viên

Sinh viên Trần Thị Hoài Phương

TÓM TẮT

Cây sim cho trái nhiều Trái sim có vị ngọt, mọng nước Theo đông y, trái sim

còn là một vị thuốc Từ năm 2000, rượu trái sim trở thành đặc sản của đảo Phú Quốc,

tỉnh Kiên Giang Tuy nhiên chất lượng của rượu sim chưa cao và chưa ổn định Một

trong những lý do đó là do chưa tìm được giống nấm men thích hợp cũng như chưa

xây dựng quy trình riêng cho sản phẩm này Nhằm mục đích sử dụng nấm men có sẵn

trên trái sim để lên men rượu sim, chúng tôi đã tiến hành đề tài “Phân lập, tuyển

chọn nấm men để thử nghiệm lên men trên dịch quả sim”

Đề tài được tiến hành từ ngày 27/03 đến ngày 01/08/2009 tại phòng thí nghiệm

Vi sinh, khoa Công Nghệ Thực Phẩm

Để đạt được mục đích đã đề ra, chúng tôi tiến hành phân lập nấm men có trên

trái sim và sau khi phân lập chúng tôi thực hiện các thí nghiệm sau:

- Thí nghiệm 1: Khảo sát khả năng sử dụng đường glucose của các loại nấm

men đã phân lập được với thời gian theo dõi là 12 giờ/1lần trong vòng 132 giờ

- Thí nghiệm 2: Khảo sát khả năng sinh CO2 của các loại nấm men

- Thí nghiệm 3: Kiểm tra số tế bào chết

- Thí nghiệm 4: Kiểm tra số tế bào nảy chồi

- Thí nghiệm 5: Khảo sát khả năng kết lắng của các chủng đã phân lập được

- Thí nghiệm 6: Khảo sát khả năng chịu cồn của các chủng nấm men

- Thí nghiệm 7: Khảo sát khả năng lên men rượu vang từ dịch trái sim

Kết quả thí nghiệm đạt được như sau:

Phân lập được 6 chủng nấm men trên trái sim Trong 6 chủng này tuyển

chọn được chủng men (ký hiệu G2) là tốt nhất G2 có khả năng kết lắng tốt (12,5 mm),

sinh nhiều CO2, chịu được 16% cồn, không tạo thành váng trong quá trình lên men Sử

dụng G2 để lên men dịch trái sim, kết quả thu được sản phẩm có màu đỏ tím của trái

sim độ cồn 12o, hương vị thơm Sản phẩm không bị nhiễm E.coli, Staphylococcus

aureus, coliform

2.1.2 Đặc điểm sinh học, phân bố của cây sim 4

2.2.3 Một số giống nấm men thường gặp trên trái cây 9

2.2.4 Các nhân tố ảnh hưởng đến hoặt tính của nấm men 17

2.4 Các nghiên cứu liên quan 22

Địa điểm: Khoa Công Nghệ Thực Phẩm, Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh 25

4.2.1 Kết quả khảo sát khả năng sử dụng đường glucose của các chủng men

35

4.2.2 Kết quả khảo sát khả năng sinh CO2 của các chủng nấm men 37

4.2.3 Kết quả kiểm tra số tế bào sống chết 39

4.2.4 Kết quả kiểm tra số tế bào nảy chồi 40

4.2.5 Khảo sát khả năng kết lắng của các chủng men 41

4.2.6 Kết quả khảo sát khả năng chịu cồn 42

4.3 Kết quả khảo sát khả năng lên men dịch trái sim 48

4.3.1 Kết quả thí nghiệm khảo sát sự biến đổi của hàm lượng chất khô hòa

4.3.2 Kết quả khảo sát độ cồn của rượu vang ở các nghiệm thức nghiên cứu 49

4.3.3 Kết quả kiểm tra các chỉ tiêu vi sinh trên rượu vang sim thành phẩm 50

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮTctv: cộng tác viên

CFU: colony forming unit

Hình 4.7: Biến thiên độ Brix của G1 đến G6 trong môi trường Hansen lỏng 37

Hình 4.8: Khả năng sinh CO2 của 6 loại men sau 48 giờ 38

Hình 4.13: Khả năng chịu cồn của các chủng nấm men ở nồng độ 12% 44

Hình 4.14: Khả năng chịu cồn của các chủng nấm men ở nồng độ 14% 45

Hình 4.15: Khả năng chịu cồn của các chủng nấm men ở nồng độ 16% 45

Hình 4.16: Sự biến đổi độ Brix của 2 chủng men khảo sát trong thời gian lên men 49

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 4.1: Hình thái khuẩn lạc và tế bào các loại nấm men phân lập được 32

Bảng 4.2: Biến thiên độ Brix của G1 đến G6 trong môi trường Hansen lỏng 36

Bảng 4.8: Kết quả tổng hợp và so sánh một số chỉ tiêu kháo sát của G1 – G6 47

Bảng 4.9: Sự biến đổi độ Brix của 2 chủng men khảo sát trong thời gian lên men sau

Bảng 4.10: Độ cồn của dịch lên men ở các nghiệm thức 50

Trước đây, cứ mỗi mùa sim chín người ta chỉ hái mang ra chợ bán theo từng thúng, ăn cho vui miệng Gần đây, ông Phát chủ doanh nghiệp tư nhân Sơn Phát tại Đảo Phú Quốc, tỉnh Kiên Giang đã đưa ra thị trường gần chục loại rượu sim với nhãn hiệu Sim Sơn và từ đây rượu sim đã trở thành đặc sản của đảo Phú Quốc

Rượu vang sim có màu hồng, vị cay của cồn, chua ngọt như rượu vang nho lại đậm đà hương vị Tuy nhiên, rượu sim ở đảo Phú Quốc được làm bằng cách ngâm ủ thủ công, chỉ ủ với đường rồi pha thêm rượu Loại sản phẩm này có thời gian bảo quản thấp, chất lượng chưa cao, không ổn định, dễ hư hỏng Một trong những lý do đó là do chưa tìm được giống nấm men thích hợp cũng như chưa xây dựng quy trình riêng cho sản phẩm này Theo ông Phát: “bí quyết để rượu sim ngon, ổn định chính là việc tạo ra men giống riêng, có thể khống chế và kiểm soát quá trình lên men” (http://www.nhandan.org.vn) Nhằm mục đích sử dụng nấm men có sẵn trên trái sim

để lên men rượu sim, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu “Phân lập, tuyển chọn

nấm men trên trái sim để thử nghiệm lên men dịch quả sim”

1.2 Mục đích

- Phân lập và tuyển chọn các chủng men trên trái sim

Cây sim có tên khoa học là

Rhodomyrtus tomentosa wight (Myrtus

tomentosa Ait, Myrtus canes ceus Lour)

Nó còn có tên đồng nghĩa khác là

Rhodomyrtus parviflora Alston, thuộc họ

sim (Myrtacea) Ở mỗi nước, cây sim có

một tên gọi khác nhau Ở nước ta, sim

còn được gọi bằng nhiều tên khác như:

Hồng Sim, Đương Lê, Sơn Nhậm, Đào

Kim Nương, Trợ Quân Lương, Co Nim

(Thái), Mạc Nim (Tày), Piểu Nim (Dao)

và ở nước ngoài, sim được gọi bằng tên:

Rose myrtle, Hill Guava, Downy rose

myrtule, Hill – goosebberry (Anh),

Myrte tomenteux (Pháp) (Đỗ Huy Bích

và ctv, 2004) Hình 2.1: Cây sim

(Nguồn: http://forum.ctu.edu.vn)

Hình 2.2: Cây và hoa sim

(Nguồn: http://aquat1.ifas.ufl.edu)

+ Phân loại:

Cây sim được chia làm hai loại là Hồng sim và Tiểu sim

Hồng sim (Rhodomyrtus tomentosa Ait, Hassk) Tiểu mộc cao 1,5 m Lá có

phiến hình xoan, bầu dục Mặt dưới lá màu trắng, có lông dày Hoa đơn hay tụ lại 3 hoa, đài có lông, lá dài 4 – 5 mm, hoa màu đỏ tươi, cánh hoa cao 1,5 – 2,0 cm nhiều tiểu nhị, bầu noãn hạ Quả màu tím, mang nhiều lông mịn, mọc ở rừng, thưa ở độ cao

10 – 1.500 m Lá dùng rửa vết loét, trị tiêu chảy (Phạm Hoàng Hộ, 1999)

Tiểu sim (Rhodamnia Dumetorum, Pỏi Mer) Tiểu mộc, nhánh hơi vuông Lá

mọc đối, phiến thon hay hình xoan, chóp lá có mũi, mặt dưới lá mốc trắng, lá có ba gân chính, mọc thành chùm ngắn ở nách lá Hoa trắng, nhiều tiểu nhị, bầu noãn hạ, có lông Quả đen, có lông trắng, dễ rụng, cơm ngọt, hạt vàng, to 2,5 – 3 mm Rễ, lá trị đau bao tử, phụ nữ sau sanh (Phạm Hoàng Hộ, 1999)

2.1.2 Đặc điểm sinh học, phân bố của cây sim

Cây sim là loại cây ăn quả mọc hoang dại, nhỏ, cao 1 – 2 m có khi 3 m, cành 4 cạnh, vỏ thân róc thành từng mảng Lá mọc đối, hình thuôn hơi hẹp ở phía cuống, phía đầu tù hơi rộng, dài 4 – 7 cm rộng 2 – 4 cm, có lông mịn ở mặt dưới, phiến lá dày, mép hơi cong xuống, có lông mịn Hoa có màu hồng tím mọc đơn hoặc từng chùm 3 bông

ở kẽ lá Quả mọng màu tím sẫm, mẫm Hạt nhiều có hình móng ngựa (Đỗ Huy Bích và ctv, 2004)

Cây sim đặc biệt ưa sáng, có sức sống mãnh liệt, có khả năng chịu hạn, chịu đất chua phèn, ngập úng tốt (Đỗ Huy Bích và ctv, 2004)

Tại Việt Nam, trước đây cây sim phát tán khắp nơi Sim là cây quen thuộc khắp các tỉnh vùng núi trung du và núi thấp, những vùng đồi trọc, sim cũng có ở Trung Bộ

và Nam Bộ Việt Nam Chúng thường mọc rải rác hay tập trung trên các đồi cây bụi hay đồng cỏ (Đỗ Huy Bích và ctv, 2004) Hiện nay, ở đảo Phú Quốc người ta đã đưa cây sim từ rừng về trồng vào rẫy, khuôn viên gia đình bằng cách gieo hạt vào mùa xuân hoặc lấy cây non mọc tự nhiên về trồng Để cho quả sai, to, thơm, ngọt có thể bón thêm phân cho cây

Trên thế giới cây sim có ở miền Nam Trung Quốc, Philippin, Malayxia, Indonexia, các nước vùng nhiệt đới Châu Á Ở Philippin, người ta trồng để lấy quả và búp sim khô dùng làm thuốc Ở Ấn Độ, người ta gieo hạt sim lúc còn tươi khi cây mầm cao khoảng 20 cm mới đem trồng (http://www.issg.org)

2.1.3 Thành phần hóa học

Quả sim có vị ngọt chát, mùi thơm, chứa các flavon - glucoside, manvidin - 3glucoside, các hợp chất phenol, các acid amin, đường và axit hữu cơ, tanin, sắc tố anthoxyanozit Thân và lá sim có nhiều hợp chất triterpen như betulin, acid betulinic, taraxerol, 3 β acetoxy - 11α - 12 α epoxy oieanan 28 - 13 β olid Liu Yan He, Hou,

Ai Zun (1976) đã chiết từ lá sim được một loại tanin và đặt tên là tomentosin (Đỗ Huy Bích và ctv, 2004)

2.1.4 Công dụng

Quả sim chín dùng để ăn tươi, một vài nơi dùng để chế rượu với cách làm như rượu nho, có màu rất đẹp Quả sim có vị ngọt, tính bình, có tác dụng là vị thuốc, chữa thiếu máu lúc có mang, suy nhược khi mới ốm dậy Khi kết hợp trái sim với một số loại thảo mộc khác thì có tác dụng chữa một số bệnh Ví dụ như:

+ Băng huyết, thổ huyết: Quả sim khô sao đen như than, nghiền thành bột mịn,

cho vào lọ có nút kín để dùng dần Mỗi lần uống 12 – 15 g, chiêu thuốc bằng nước sôi Đối với vết thương bên ngoài, có thể dùng bột thuốc bôi vào

+ Đại tiện xuất huyết: Quả sim khô 20 g, nước 400 ml, sắc còn 300 ml, chia 2 phần uống trong ngày, dùng liên tục 3 – 5 ngày

+ Thoát giang (lòi dom, trực tràng lòi ra ngoài hậu môn): Quả sim tươi 30 – 60

g (khô 15 – 30 g) nấu với dạ dày lợn, dùng làm thức ăn trong bữa cơm (http://www.vnexpress.net)

Lá sim có vị chát, tính bình, có tác dụng thanh nhiệt, lợi thấp, tiêu phong, giải độc Tại một số vùng ở Việt Nam, người ta dùng búp và lá sim non sắc uống chữa đau bụng, tiêu chảy, kiết lỵ Lá sim còn là thuốc cầm máu hoặc dùng để chữa vết thương, vết loét Đặc biệt, lá sim được nhiều cơ sở nghiên cứu làm thuốc chữa bỏng có kết quả tốt Năm 1965, bệnh viện Móng Cái đã dùng cao lá sim để cầm máu trong cắt amidan

và chữa bỏng Nghiên cứu cho thấy đối với bỏng diện tích không quá 30% đều có kết quả tốt khi điều trị bằng lá sim So với dầu cá và syntomyenin, cao lá sim có ưu điểm

là tạo thành một màng mỏng bao bọc vết thương, làm vết bỏng se nhanh, chóng lên da non, ít tiết dịch, không có mủ, không gây xót và giảm đau nhanh (Đỗ Huy Bích và ctv, 2004) Những bài thuốc chữa bệnh từ lá sim như:

+ Cầm máu trong phẫu thuật amidan: 1 kg lá băm nhỏ nấu với 20 lít nước, nấu nhiều lần rồi cô thành 250 g cao, dùng cao lá sim bôi nhiều lần trong ngày, thường dùng 10 – 12 ngày

lỵ Một số nơi còn dùng búp sim phối hợp với búp ổi (hoặc vỏ ổi), riềng, chữa tiêu chảy rất có hiệu quả

Rễ sim có vị ngọt, chua, chát, tính bình, có tác dụng khử phong, trừ thấp, chữa

tử cung xuất huyết, cơ năng đau xương, viêm khớp Ở Trung Quốc, rễ sim còn chữa viêm gan, ngộ độc, trĩ (liều dùng 15 – 30 g sắc nước uống) Rễ sim cũng cũng có tác dụng chữa bệnh như:

+ Chữa băng huyết: Rễ cây sim, rễ địa nệm mỗi vị 50 – 60 g, ngải diệp 15 – 30

g sao hơi vàng, thêm 600 ml nước, sắc đặc chia làm 2 lần uống nóng trong ngày

+ Viêm gan virus: Rễ sim khô 30 g, sắc kỹ với nước, chia 2 lần uống sau bữa

ăn Mỗi liệu trình 20 ngày Nếu vàng da nặng, thêm điền cơ hoàng, nhân trần, bạch hoa xà thiệt thảo mỗi thứ 15 g, kê cốt thảo 30 g, cùng sắc uống

+ Đau đầu, hen (dạng hư hàn): Dùng rễ sim khô 60 g, sắc nước uống

+ Phong thấp, bị thương lâu ngày nên khớp xương đau nhức: Rễ sim khô 60 g sắc lấy nước, hòa với rượu uống

+ Tiểu đường: Dùng rễ sim khô 30 – 60 g cùng với thịt lợn nạc nấu lên ăn trong bữa cơm hằng ngày

+ Trĩ lở loét: Dùng rễ sim khô 40 – 50 g, hoa hòe 15 – 20 g, nấu kỹ với lòng

lợn; bỏ bã thuốc, ăn lòng lợn và uống nước canh Dùng liên tục trong nhiều ngày (http://www.vnexpress.net)

Từ năm 2000, doanh nghiệp tư nhân Sơn Phát ở Phú Quốc bắt đầu nghiên cứu sản xuất rượu sim Đến năm 2004, gần một chục sản phẩm khác nhau về rượu sim ra

giá thu mua trái sim để làm rượu ngày càng tăng cao hơn các loại trái cây khác và sản lượng trái sim dùng làm rượu không đủ đáp ứng theo nhu cầu của các nhà sản xuất trên đảo Hiện nay ở đảo Phú Quốc đã sản xuất được loại rượu vang đỏ có màu tự nhiên rất tươi của trái sim rừng kết hợp với một số trái cây khác có nồng độ 12 – 14% ethanol Rượu sim Phú Quốc hiện nay được sản xuất theo qui mô nhỏ, phương pháp ngâm ủ thủ công là chính, nên sản lượng thấp và chưa kiểm soát được chất lượng Tuy nhiên do rượu sim của Phú Quốc mang tính độc đáo riêng mà không vùng miền nào

có, nên dễ gắn liền với sự phát triển chung của dịch vụ du lịch tại đảo, cùng với xu hướng hiện nay người tiêu dùng ngày càng ưa chuộng những sản phẩm có nguồn gốc nguyên liệu từ thiên nhiên nên rượu sim cũng là một trong những sản phẩm đáp ứng tốt nhu cầu đó (http://www.nhandan.org.vn)

Chính những lợi ích của cây sim mang lại nên vào ngày 6/3/2009 tại Phú Quốc, trung tâm Khuyến Nông – Khuyến Ngư quốc gia đã tổ chức một chương trình hội thảo lớn về chuyên đề bảo tồn, phát triển cây trồng vật nuôi bản địa gắn với du lịch sinh thái trong đó chủ yếu là định hướng phát triển các sản phẩm từ sim và hồ tiêu sau thu hoạch ở huyện đảo Phú Quốc Định hướng các dạng sản phẩm có thể phát triển từ trái sim bao gồm: si – rô sim, giấm sim, mứt đông sim, trà hoa sim, nước hoa, xà bông (http://www.sggp.org.vn)

đôi khi có hình chai như Saccharomyces ludwigii hoặc hình ống dài như Pichia Trong

cùng một loài hình dáng tế bào cũng có thể thay đổi tùy thuộc vào điều kiện môi trường, điều kiện nuôi cấy và tuổi của tế bào (Lương Đức Phẩm, 2000)

Nấm men có kích thước từ 4 – 20μ thậm chí 25m μ Chiều rộng tế bào thường m

3 – 5 μ và chiều dài 5 – 10 m μ hoặc hơn nữa Kích thước này cũng thay đổi tùy theo m

điều kiện của môi trường sống Trong môi trường lỏng nấm men sinh ra một lớp màng bao bọc như tấm voan mỏng Trong môi trường đặc, tế bào nấm men có màu trắng đục, vàng hoặc hồng nhạt Tế bào nấm men trong tự nhiên có thể đứng riêng rẻ hoặc sau khi nảy chồi vẫn dính với nhau tạo thành chuỗi (Lê Xuân Phương, 2001)

2.2.2 Cấu tạo tế bào nấm men

Thành phần cơ bản chủ yếu của tế bào nấm men là nước và các chất khô tính theo % như sau:

Bảng 2.1: Các axit amin và vitamin có trong nấm men

Axit amin Mg/g men khô Vitamine Mg/g men khô

B1 B2 B3 B5 B6

H Inozit

24 – 50

30 – 60 2,0 – 19,0

370 – 750

14 – 39 0,6 – 0,7

6000 - 15000

(Nguồn: Lương Đức Phẩm, 2006) Phân bố: Nấm men có khắp mọi nơi trên trong tự nhiên, chúng có mặt ở trong đất, trong nước, trong hoa quả, cũng là nguồn cung ứng nấm men của tự nhiên khi chúng ta muốn phân lập chúng để nghiên vứu và sử dụng (Lê Xuân Phương, 2001)

Nấm men có thể sinh sản theo lối nảy chồi, phân chia hoặc sinh bào tử (Lương Đức Phẩm, 2000)

2.2.3 Một số giống nấm men thường gặp trên trái cây

2.2.3.1 Giống Saccharomyces

Tế bào có hình cầu, hình oval, hình elíp Sinh sản bằng nảy chồi, lên men đường tốt và có khả năng tạo tới 18% cồn ethylic nhưng không đồng hóa được muối nitrat, các loài của giống này rất phổ biến trong tự nhiên và gồm 18 loài (Lương Đức Phẩm, 2006)

¾ Saccharomyces cerevisiae

S cerevisiae phân lập được từ nấm men bánh mì và được sử dụng để lên men

bánh mì, vang và bia Tế bào có hình elíp, oval hoặc tròn kích thước trung bình (3 – 8)

x (5 – 12) μ m, sinh sản theo lối nảy chồi và tạo thành bào tử Có khả năng lên men glucose, galactose, sacarose, 1/3 rafinose, mantose

S cerevisiae là loại men được sản xuất với quy mô công nghiệp lớn nhất thế

giới, là chủng chịu được độ đường cao nhất và cho độ rượu cao nhất (Lương Đức

lên men 12 – 13ocồn trong dịch nước nho

Một số chủng được dùng làm men bánh mì, loại men chìm có độ kết lắng tốt được dùng trong sản xuất bia (Lương Đức Phẩm, 2006)

¾ Saccharomyces chevalieri

S chevalieri được phân lập từ dịch quả nho lên men tự nhiên và từ vang non

của dịch quả cọ và nước dừa Tế bào có hình elíp, hình oval, trong lên men quả nho có thể tạo ra 16ocồn

oval, phát triển tốt ở dịch nho, có thể chịu đựng đến 18ocồn

S oviformis thường được dùng trong sản xuất rượu vang từ dịch quả có hàm

lượng đường cao (Lương Đức Phẩm, 2006; Bùi Ái, 2003)

Hình 2.7: Saccharomyces oviformis

(Nguồn: Lương Đức Phẩm, 2006)

¾ Saccharomyces chodati Steiner

Theo Lodder S chodati Steiner được phân lập từ nước nho lên men tự nhiên từ

Thụy Sĩ, không lên men được saccharose nhưng lên men tốt glucose và fructose (Lương Đức Phẩm, 2006)

Hình 2.8: Saccharomyces chodati Steiner

(Nguồn: Lương Đức Phẩm, 2006)

2.2.3.2 Giống Pichia

Tế bào có hình oval hay hình elíp, phát triển rất tốt trên bề mặt rượu vang, bia,

có khả năng chịu cồn < 12% Đồng hóa được đường theo con đường oxy hóa, oxy hóa

rượu thành axit hữu cơ Khi phát triển Pichia tạo thành những màng có những hạt bột

màu trắng, làm thay đổi thành phần và hương vị của vang, tạo cho vang có nhữn axit hữu cơ bay hơi và ester của axit này

Có khả năng chịu được sunfit có (nồng độ H2SO3 500 mg/l mới ức chế được chúng) (Lương Đức Phẩm, 2006)

2.2.3.3 Giống Hansenula

Tế bào có hình oval hoặc tròn, Hansenula khi lên men tạo thành màng trên bề

mặt dịch, lớp màng này khô và nhẵn, mầu trắng xám Trên bề mặt thạch cũng tạo thành từng màng , lúc đầu có mầu trắng, mờ đục không bóng và dày đặc sau đó trở nên nhăn nheo

Trong quá trình lên men tạo màng sau 2 – 3 ngày và lắng cặn, lên men rượu và tích tụ cồn 2 – 3% cồn Khi môi trường lên men có đủ oxy và nồng độ rượu < 13%

Hansenula oxy hóa đường, rượu, axit hữu cơ làm pH của môi trường chuyển từ axit

sang kiềm

Trong công nghiệp lên men Hansenula là men dại rất nguy hiểm, chúng làm

đục rượu vang, chuyển hóa đường thành rượu ethylic, butyric, các axit, các ester làm cho vang có mùi thơm gắt (Lương Đức Phẩm, 2006)

Hình 2.10: Hansenula

(Nguồn: Lương Đức Phẩm, 2006)

2.2.3.4 Giống Candida

Giống Candida có 81 loài Tế bào hình oval hoặc hình trụ dài, có thể phát triển

trong rượu vang, bia khi những sản phẩm này còn một lượng rất nhỏ đường sót, rượu

và axit hữu cơ Ở rượu vang chúng tạo ra mùi vị lạ làm giảm chất lượng sản phẩm Trên bề mặt môi trường chứa đường và rượu ethylic, men này tạo màng mờ đục, lúc đầu phẳng nhẵn, sau nhăn nheo và có màu trắng xám (Lương Đức Phẩm, 2006)

Hình 2.11: Candida mycoderma

(Nguồn: Lương Đức Phẩm, 2006)

2.2.3.5 Giống Schizosaccharomyces Linder

Tế bào Schizosaccharomyces có hình trụ hai đầu lượn tròn Phát triển rất mạnh

trên nước táo và gây nguy hiểm cho sản xuất, vì chúng có thể lên men đường đồng thời lên men axit malic tạo thành rượu và CO2 Có thể đồng hóa được glucose, saccharose, maltose, dextrin từ tinh bột (Lương Đức Phẩm, 2006; Lê xuân Phương,

2001)

Hình 2.12: Schizosaccharomyces pombe

(Nguồn: Lương Đức Phẩm, 2006)

2.2.3.6 Giống Hanseniaspora

Hình 2.13: Hanseniaspora apiculata

(Nguồn: Lương Đức Phẩm, 2006)

2.2.3.7 Giống Brettanomyces Kufferath

Hình dáng của tế bào không xác định, luôn thay đổi Lên men chậm, bắt đầu sinh trưởng ở dịch quả sau 5 ngày, tạo trên bề mặt một lớp màng mỏng có màu trắng xám

Brettanomyces kufferath có thể phát triển ở nhiệt độ cao (tối thích là 31 –

32oC), dưới 12độcồn ngừng phát triển, nhạy cảm với SO2 (bị ức chế hoàn toàn ở nồng

độ 100 mg SO2 /l)

Hình 2.14: Brettanomyces

(Nguồn: Lương Đức Phẩm, 2006)

2.2.3.8 Giống Torulopsis berlese

Tế bào có hình tròn Giống này có tính lọc thẩm thấu nên có thể phát triển ở dịch có tới 50% đường.có thể tìm thấy các men này ở rỉ đường, các loại dịch quả, phát

2.2.3.9 Giống Rhodotorula

Thường tìm thấy trong dịch quả, tế bào đa hình thái, hình tròn, oval, có thể bị kéo dài ra hoặc uốn cong, các men thuộc giống này có màu đỏ (Lương Đức Phẩm, 2006)

2.2.4 Các nhân tố ảnh hưởng đến hoặt tính của nấm men

Trong nhiều loại rượu, men là nhân tố chính tạo ra hương vị cho rượu Men cũng góp phần tạo độ trong cho sản phẩm Khi rượu đã lên men hoàn toàn nó thường

bị vẩn đục và cặn, tạo ra bởi những tế bào men đã chết Chính vì thế người ta dùng nhiều kỹ thuật khác nhau để lọc cặn ra khỏi rượu Nếu rượu chứa cặn trong thời gian dài sẽ làm tăng độ béo, có mùi vị của bánh mì và bánh biscuits (http://www.wineworld.vn)

Nấm men đòi hỏi phải có những điều kiện nhất định mới có thể lên men, các điều kiện chính để lên men như:

Nồng độ đường: Trong dịch quả thường có hàm lượng đường không đều do vậy người ta thường bổ sung thêm đường saccharose Nấm men có khả năng lên men các loại đường đơn giản như mono-disaccharide Nồng độ đường có ảnh hưởng lớn đến năng lực lên men Đa số các loại nấm men hoặt động bình thường trong môi trường có hàm lượng đường dưới 20% Có một số chủng hoạt động ở môi trường có nồng độ đường cao hơn(Lương Đức Phẩm, 1998; Lê Xuân Phương, 2001)

Oxy: Hầu hết các chủng nấm men trong lên men rượu vang thuộc giống

Saccharomyces Chúng là nhóm kỵ khí tùy tiện, khi trong môi trường đủ lượng oxy

nấm men phân hủy đường dùng làm nguồn năng lượng và cấu tạo tế bào tăng sinh khối Trong quá trình lên men giai đoạn đầu yêu cầu oxy để nấm men sinh sản, tăng sinh khối Trường hợp kỵ khí, nấm men sử dụng phần oxy hòa tan trong môi trường để sinh trưởng và chủ yếu là lên men (Lương Đức Phẩm, 1998; Lê Xuân Phương, 2001)

pH môi trường: Đối với dịch quả có pH = 2,8 – 3,8 thường cho rượu vang ngon, khoảng pH tối thích của nấm men là 4 – 6 Tuy nhiên trong sản xuất rượu vang người

Nồng độ rượu và khí CO2: Có tác dụng kìm hãm cũng như khả năng lên men của nấm men Sự sinh sản của nấm men sẽ bị chậm lại khi nồng độ rượu có trong môi trường là 2% và sẽ bị ngừng lại ở nồng độ rượu 5%, đa số nấm men chỉ lên men được tới nồng độ 5% Khí CO2 ức chế sự lên men, nhưng việc thoát khí CO2 có tác dụng tốt đến quá trình lên men (Lê Xuân Phương, 2001)

2.3 Rượu vang

2.3.1 Giới thiệu chung về rượu vang

Rượu vang là loại đồ uống lên men trực tiếp từ nước quả Khi quá trình lên men kết thúc người ta không chưng cất mà để lắng trong tự nhiên, gạn lọc và hoàn thành sản phẩm Rượu vang vốn có nguồn gốc từ quả nho, nên gọi là “Vin” hoặc “Wine” (Lương Đức Phẩm, 1998)

Ngày nay người ta mở rộng khái niệm vang để chỉ các loại nước uống lên men không qua chưng cất từ các quả khác như táo, dâu, chuối, cam, mơ, mận, đào,… cũng được gọi là vang Vang là thức uống không qua chưng cất nên vang có giá trị dinh dưỡng cao như đường sót lại, vitamin, các axit hữu cơ, muối khoáng Vì vậy vang là

đồ uống rất được ưa thích ở châu Âu, châu Mỹ như ở Pháp mỗi ngày tiêu thụ ½ lít vang nho trên một người (Trần Quý Thắng, 1999; Lê xuân Phương, 2001) Ở Việt Nam, người dân mới làm quen với vang khoảng 100 năm nay Rượu vang thường phổ biến ở thành thị

Năm 1987, Pasteur đã công bố những nghiên cứu đầu tiên của mình về quá trình lên men Ông chỉ ra cơ sở của sự lên men, xác định rõ vai trò của nấm men trong lên men rượu (Nguyễn Đình Thưởng và ctv, 2000) Mỗi nước có một phương thức sản xuất vang khác nhau, với hàng trăm loại vang nổi tiếng ra đời Hiện nay, có 2 phương pháp lên men cơ bản: lên men tự nhiên và lên men nhờ các chủng nấm men thuần khiết (Lương Đức Phẩm, 2006) Ở một số nước (Pháp, ) người ta vẫn để nước quả lên men tự nhiên, không cấy nấm men Nhưng nhìn chung ở các xí nghiệp rượu vang Mỹ

và nhiều nước khác người ta xử lý nước quả bằng SO2 để loại bỏ hệ nấm men tự nhiên

và các vi khuẩn tạp, sau đó mới cấy vào chủng nấm men thuần thích hợp Phương pháp sản xuất vang từ chủng nấm men thuần khiết có những ưu điểm: Thời gian lên

dịch quả được lên men triệt để, nồng độ cồn thu được cao hơn trong lên men tự nhiên 0,1 – 1o, vang sáng màu hơn (Trần Quý Thắng, 1999)

2.3.2 Các nguyên liệu sử dụng sản xuất vang

Tất cả các loại quả tươi, có chứa đường, các axit hữu cơ (axit malic, axit citric, axit tartric) các polyphenol, các chất màu, và các chất thơm, protit, vitamin, muối khoáng, không chứa chất độc hại thì có thể lên men vang (Lê Xuân Phương, 2001) Thành phần hóa học của các loại quả ảnh hưởng nhiều đến chất lượng vang đặc biệt đến mùi vị của vang Nói chung, quả để sản xuất vang phải có hương thơm dễ chịu và một lượng axit hữu cơ thích hợp (Trần Quý Thắng, 1999)

2.3.3 Thành phần của vang

Rượu vang có bốn thành phần chính: tanin, cồn, axit và mùi vị

- Tanin là những chất bảo quản tự nhiên có tác dụng giữ cho rượu vang khỏi oxy hóa Nói chung, rượu càng có nhiều tanin, càng có thể ủ lâu Thông thường thì rượu đỏ mới có tanin Khi rượu còn non thường có mùi thơm của hoa quả, mùi vị của rượu sẽ phát triển đa dạng theo thời gian Điều này nhận thấy rõ trong những chai rượu ngon để lâu năm Khi mức độ tanin đạt tới độ cân bằng, không lấn át các vị khác, lúc

đó là thời điểm lý tưởng nhất để uống

- Cồn là sản phẩm của quá trình lên men đường tự nhiên trong trái cây Hàm lượng đường trong trái cây sẽ quyết định nồng độ cồn của rượu, hàm lượng cồn phụ thuộc vào hàm lượng đường có trong nguyên liệu, nhiệt độ, nấm men Khi rượu đạt tới

14ocồn thì nấm men sẽ ngưng phát triển và chết Vì thế rượu vang có nồng độ trên 15ohầu hết là có pha thêm cồn Quá trình chuyển đổi đường thành cồn rất quan trọng trong quá trình sản xuất rượu Nhiều nhà làm rượu vang hiện đại luôn tập trung vào việc kiểm soát quá trình lên men Quá trình lên men luôn sinh nhiệt vì vậy họ kiểm soát điều kiện lên men và duy trì ở nhiệt độ mát để giữ được những hương vị của trái cây Quá trình lên men luôn diễn ra tự nhiên nhờ nấm men sẵn có trong trái cây, nhưng

7g/l axit tổng số nên axit hữu cơ còn có tác dụng ngăn cản sự hoặt động của các vi khuẩn làm hỏng rượu, cần thiết với con người trong việc tham gia vào chu trình Crebs

để cung cấp năng lượng cho cơ thể Tuy nhiên cũng có axit hữu cơ có tác dụng tiêu cực: axit bay hơi, axit béo, axit formic, propionic (Trần Quý Thắng, 1999)

- Mùi vị: Vị của rượu rất đa dạng, nó tùy thuộc vào giống, loại (được trồng ở đâu, vụ thu hoạch, thời tiết năm đó thế nào, thời điểm thu hoạch, qui trình sản xuất, ) (http://www.wineworld.vn)

2.3.4 Vi sinh vật tham gia vào quá trình sản xuất rượu vang

Hệ vi sinh vật lên men rượu vang tự nhiên tương đối phức tạp và không đồng nhất trong các giai đoạn của quá trình lên men Trong nước quả tươi có sẵn những nhóm vi sinh vật khác nhau từ môi trường xung quanh và chủ yếu là từ vỏ quả, thân, cuống và thiết bị ép dịch, thiết bị lên men Phần lớn trong phức hệ này là nấm mốc (76 – 90%), nấm men (9 – 22%), số còn lại là vi khuẩn không sinh hoặc sinh bào tử, xạ khuẩn Trong điều kiện thiếu oxy nấm men có khả năng phát triển và tăng sinh khối nhanh hơn nấm mốc, đồng thời lên men và tích tụ rượu Chính dung dịch rượu và điều kiện kỵ khí ức chế nấm mốc tạo điều kiện cho nấm men phát triển, chiếm ưu thế trong quá trình lên men tự nhiên Các loài nấm men cũng cạnh tranh nhau Loài nào có khả năng đồng hóa đường nhanh tạo độ cồn cao mới dần chiếm ưu thế trong quá trình lên men (Bùi Ái, 2003; Lương Đức Phẩm, 1998)

Theo dõi quá trình lên men tự nhiên ở nhiều nơi người ta thấy rằng, một vài

ngày đầu, các nấm men dại (men hình thoi hoặc hình chùy Kloeckera) chiếm ưu thế

(70% - 80% tổng số nấm men), sau đó đến các nấm men hình elíp hay hình oval

(S.vini, S.cerevisiae), nhanh chóng phát triển, lên men mạnh, lượng đường tiêu hao

nhanh và tích tụ rượu ethylic Vi sinh vật trong lên men dịch quả có số lượng và thành phần giống loài là không đồng nhất Các giống, loài của nấm men khác nhau, thậm chí

ở các vùng khác nhau cũng không giống nhau về tốc độ sinh trưởng, hoạt lực lên men, khả năng sinh rượu, khả năng chịu cồn cũng như khả năng sinh ra các sản phẩm thứ cấp làm ảnh hưởng đến hương vị của vang (Lê Xuân Phương, 2001)

Trước đây, rượu vang được sản xuất theo phương pháp truyền thống Sản phẩm

ổn định, không chủ động điều khiển được quá trình lên men vì phụ thuộc vào nấm men

có sẵn trong dịch quả Đầu thế kỷ 20, người ta bắt đầu khắc phục những nhược điểm

ấy bằng cách loại bỏ, hạn chế các nấm men dại và các vi sinh vật có sẵn trong dịch quả Các công nghệ đặc biệt đó là thanh trùng Pasteur, hoặc sunfit hóa môi trường bằng lượng alhydryt sunfit tính toán Vang sản xuất bằng giống nấm men thuần khiết cho quá trình lên men ổn định, lượng đường sót không đáng kể, ngăn chặn được sự phát triển của nấm men dại và các vi sinh vật không có lợi, nâng cao hiệu xuất sinh rượu, giảm thời gian lên men, lắng trong nhanh, chất lượng vang ổn định hơn (Lương Đức Phẩm, 2006)

Hansen đã nghiên cứu và phân lập được những loài nấm men rượu vang và nấm men bia Nấm men vang có hình elíp hoặc elíp kéo dài, hình cầu hoặc oval Ở điều kiện thích hợp, nấm men vang sinh sản bằng cách nảy chồi, sử dụng đường trong quá trình hô hấp và lên men (Lương Đức Phẩm, 2006) Môi trường tự nhiên mà nấm men vang thích nghi là các loại nước trái cây Nấm men vang có khả năng chịu đựng đối với cồn ethanol cao

Trong công nghiệp sản xuất cồn, bia, vang và các đồ uống có rượu người ta thường sử dụng các loại nấm men sau:

- S cerevisiae

- S uvarum

- Schizosaccharomyces pombe

- Kluyveromyces

2.3.5 Các biến đổi chủ yếu xảy ra trong quá trình lên men

Quá trình lên men rượu là quá trình phân giải yếm khí đường thành rượu dưới tác dụng của vi sinh vật hay là quá trình phân giải các chất để thu năng lượng cho hoặt động sống của vi sinh vật

Cơ chế của quá trình:

Phương trình tổng quát:

C6H12O6 + 2ADP + 2H3PO4 = 2C2H5OH + CO2 + 2ATP + 2H2O

Thực tế trong quá trình dùng đường lên men rượu ta thu được 50% là rượu ethanol, 45% là CO2, 4% sản phẩm phụ như glyxerin, andehyt, và 1% đường còn sót lại làm thức ăn xây dựng tế bào cho nấm men (Lê Xuân Phương, 2001)

2.3.6 Công nghệ sản xuất vang hiện nay

Nguồn trái cây ở nước ta rất đa dạng và phong phú, chúng ta có thể sử dụng nhiều loại để lên men và sản xuất rượu vang Chỉ cần lựa chọn chính xác các loại dịch quả và xây dựng một quy trình kĩ thuật ổn định, tối ưu để sản xuất rượu vang đạt chất lượng cao

Hiện nay trên thị trường xuất hiện nhiều loại rượu vang trái cây Theo hiệp hội rượu bia và nước giải khát Việt Nam, hiện trong nước có hơn 15 doanh nghiệp sản xuất và đóng chai rượu vang với sản lượng mỗi năm tăng đều khoảng 12 – 13 triệu lít (http://vietbao.vn) Trước đây phần lớn là sản xuất chỉ ở quy mô gia đình, ngày nay đã phát triển ở quy mô công nghiệp Một số nhà máy lớn đã sử dụng dịch quả mơ, dâu, táo, để sản xuất như: rượu vang Thăng Long (1983), vang Gia Lâm (1985), vang Tây

Đô, vang Hồng Hà (1986) vang Đà Lạt Ngoài ra một số địa phương như Vĩnh Phú tận dụng nguồn quả tự nhiên như chuối, dứa, mận, mơ, để sản xuất vang đạt tiêu chuẩn chất lượng cao Đặc biệt rượu vang Đà Lạt nổi tiếng với các loại vang trắng, vang đỏ

đã tạo được chỗ đứng trên thị trường trong nước được nhiều người ưa chuộng (Tạp chí

đồ uống Việt Nam, 2009; Trần Quý Thắng, 1999)

Hiện nay đã có nhiều thương hiệu vang sim có chỗ đứng trên thị trường như: Sim Sơn với các nhãn hiệu đa dạng: vang Phú Quốc SimSơn®, Mỏ Quạ SimSơn®, Hải Mã SimSơn®, rượu sim rừng, mật sim SimSơn®, , cơ sở sim rừng Song Lê, cơ

sở rượu sim Thành Long (http://songcuulong.net)

2.4 Các nghiên cứu liên quan

Hiện nay, chưa có nhiều nghiên cứu liên quan đến trái sim Gần đây Viện sinh học nhiệt đới thành phố Hồ Chí Minh thuộc viện khoa học Việt Nam đã nghiên cứu quy trình sản xuất rượu vang sim và đã chuyển giao công nghệ cho cơ sở Thành Long,

Sơn để nghiên cứu sản xuất rượu sim và một số sản phẩm từ sim như jelly sim Kết quả bước đầu đang nghiên cứu theo quy mô phòng thí nghiệm

Tuy nhiên, việc phân lập nấm men từ các loại trái cây thì đã có rất nhiều Nguyễn Quang Hào và cộng tác viên đã phân lập được 8 chủng nấm men ký hiệu từ Đ1 đến Đ8 Chủng Đ6 được chọn để lên men rượu vang từ dịch quả điều Tiến hành định danh dựa trên khả năng lên men các loại cacbohydrate đã xác định được chủng

Đ6 là Sacchromyces vini (trích Nguyễn Quang Hào và ctv, 1997) Năm 2007, Hoàng

Thị Giang tiếp tục phân lập nấm men trên trái điều ở Buôn Mê Thuột và chọn chủng nấm men thích hợp nhất để lên men rượu vang từ dịch quả điều Tác giả đã phân lập được 6 chủng nấm men khác nhau ký hiệu từ N1 đến N6 Sau quá trình tuyển chọn và sàng lọc, tác giả chọn được chủng N2 là tốt nhất Chủng N2 có đặc điểm về khuẩn lạc như đường kính 1 – 2 mm, tròn đều, bờ phẳng vun cao, trắng đục, bán trong và bề mặt bóng Sử dụng chủng N2 để lên men dịch điều với tỷ lệ men bổ sung vào dịch lên men

là 7% v/v (mật độ tế bào là 108 tb/ml), sản phẩm rượu vang thu được có màu vàng, hương thơm của trái điều, độ cồn đạt được là 17,19% Hàm lượng axit trong rượu là 5,55% và lượng đường khử là 0,8 g/l (trích Hoàng Thị Giang, 2007)

Người ta cũng tiến hành phân lập và định danh nấm men trên trái cacao được 4

chủng là Hansenia spora, Galactomyces reessii, Candida sorboxylosa, Cadida fructu

(trích Trần Xuân Ngạch và ctv, 2002)

Để tận dụng phần lớp thịt vỏ quả cà phê thải ra từ công nghệ chế biến cà phê nhân, Huỳnh Tiến Đạt (2005) đã phân lập, tuyển chọn chủng nấm men trên vỏ quả cà phê đồng thời khảo sát khả năng lên men dịch vỏ quả cà phê để chế biến rượu vang Kết quả phân lập được 9 chủng nấm men, ký hiệu S1 đến S9 Chọn được chủng S1 là chủng tốt nhất Tác giả đã khảo sát khả năng lên men của chủng S1 so với chủng

Saccharomyces cerevisiae 28 khi lên men của dịch cà phê nguyên chất và hỗn hợp

dịch cà phê với dịch nho Kết quả cho thấy hỗn hợp dịch cà phê và dịch nho (tỉ lệ 7:3)

(70%), khi lên men không tạo váng, kết lắng tốt (chiều cao cột kết lắng 15 mm) (trích Hoàng Thị Sinh, 2008)

Cũng trên nguyên liệu xơ mít, Nguyễn Thị Cẩm Hương (2007) đã phân lập được 7 chủng nấm men ký hiệu S1 đến S7 Tác giả đã sàng lọc và tuyển chọn được chủng S1 là chủng thích hợp nhất trong 7 chủng để tiến hành lên men dịch xơ mít Sản phẩm có độ cồn cao, hương vị êm dịu

Các đề tài về phân lập nấm men trên trái cây đều với mục đích để sử dụng nấm men phân lập, tuyển chọn được để lên men trên cơ chất đã phân lập Một trong những

lý do là nấm men phân lập được sẽ thích nghi rất nhanh với có chất lên men Đó cũng

là cơ sở khoa học khi chúng tôi thực hiện đề tài này

Chương 3

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

Địa điểm: Khoa Công Nghệ Thực Phẩm, Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh Thời gian: Từ ngày 27/03/2009 đến 1/08/2009

3.2 Nguyên vật liệu

3.2.1 Trái sim

Sim được thu hái tại ấp Cửa Lấp, xã Dương Tơ, huyện Phú Quốc, tỉnh Kiên Giang Chọn trái còn tươi, nguyên vẹn, không bị dập nát và sâu bệnh, trái đạt độ chín sinh lý

Hình 3.1: Trái sim nguyên liệu

3.2.2 Môi trường nuôi cấy nấm men

- Môi trường Hansen dùng để phân lập nấm men

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Sơ đồ tiến trình thực hiện đề tài

Khảo sát khả năng sử dụng đường glucose của các loại nấm men đã phân lập được

Khảo sát khả năng sinh CO2

Kiểm tra số tế bào chết Kiểm tra số tế bào nảy chồi Khảo sát khả năng kết lắng của các chủng đã phân lập được

Khảo sát khả năng chịu cồn của các chủng nấm men

Lên men thử nghiệm

So sánh khả năng lên men

của các chủng men