Phương pháp thử nghiệm tế bào (Nuôi cấy tế bào động vật)

• Nuôi cấy in vitro culture duy trì và/ hoặc tăng sinh proliferate tế bào, mô hoặc cơ quan • Các dạng nuôi cấy mô • Nuôi cấy cơ quan • Nuôi cấy mô • Nuôi cấy tế bào... Nuôi cấy mô •

Nuôi cấy mô động vật

Nuôi cấy mô động vật là gì?

• Nuôi cấy in vitro (culture) (duy trì và/ hoặc

tăng sinh (proliferate)) tế bào, mô hoặc cơ quan

• Các dạng nuôi cấy mô

• Nuôi cấy cơ quan

• Nuôi cấy mô

• Nuôi cấy tế bào

Nuôi cấy cơ quan

• Phôi hoặc cơ quan được tách từ cơ thể và được

nuôi cấy in vitro

• Thuận lợi

• Chức năng sinh lý bình thường được duy trì

• Tế bào vẫn duy trì sự biệt hóa

Nuôi cấy mô

• Một phần mô sau khi được tách ra được nuôi trong môi trường nuôi cấy

• Thuận lợi

• Chức năng bình thường có thể được duy trì

• So với nuôi cấy cơ quan thì có thể gia tăng mô (nhưng thường không dễ đạt)

• Bất lợi

• Tổ chức gốc của các mô bị mất

Nuôi cấy tế bào

• Mô sau khi được tách ra thường được phân cắt

thành tế bào (thường sử dụng enzyme), các tế bào sau đó được nuôi trong môi trường nuôi cấy

• Thuận lợi

• Phát triển một dòng tế bào qua nhiều thế hệ

• Có thể làm gia tăng số lượng

• Bất lợi

• Tế bào có thể mất vài đặc tính của sự biệt hóa

EMP04

Tại sao cần phải nuôi cấy tế bào?

• Nghiên cứu

• Tránh được các khó khăn trong nghiên cứu phản ứng tế bào:

• Ảnh hưởng (phá hủy) các mô xung quanh

• Sự thay đổi của động vật thử nghiệm dưới những điều kiện stress của thử nghiệm

• Làm giảm số lượng động vật thử nghiệm

• Có khả năng thương mại hóa với tỷ lệ cao

• Tạo ra các tế bào (vật liệu): vaccine, antibody, hormone

Những thuận lợi của nuôi cấy tế bào

Các dạng nuôi cấy tế bào

1 Nuôi cấy sơ cấp (Primary Cultures)

• Lấy trực tiếp từ mô động vật, phôi hoặc người trưởng

thành

• Thuận lợi:

• Thường duy trì được đặc tính biệt hóa của tế bào in vivo

• Bất lợi:

bào sợi (fibroblast) trở nên trội hơn

• Có thể duy trì in vitro trong thời gian giới hạn

2 Nuôi cấy thứ cấp (Secondary culture)

• Nuôi cấy từ dòng tế bào sơ cấp

• Đã được phân lập bằng cách chọn lọc hoặc tạo dòng

• Các dòng tế bào đồng dạng

• Chu kỳ sống giới hạn in vitro

• Duy trì được các kiểu hình được biệt hóa

• Phụ thuộc vào giá thể nuôi

• Có sự nhiễm do tiếp xúc

Các dạng nuôi cấy tế bào

Thường là những dòng tế bào đơn

Có thể tăng sinh trong môi trường qua nhiều lần cấy chuyển

Có hai loại tế bào

Dòng tế bào (Cell line) Dòng tế bào liên tục (Continuous cell line)

Các dạng nuôi cấy tế bào

1) Dòng tế bào (Cell line)

• Giới hạn chu kỳ sống, thường “già” khoảng 3 chu

kỳ phân chia

• Thường ở dạng lưỡng bội và giữ được vài đặc

điểm của sự biệt hóa

Các dạng nuôi cấy tế bào

Nuôi cấy liên tục

2) Dòng tế bào liên tục (Continuous cell lines)

• Có thể nhân lên không giới hạn

• Có khả năng thay đổi hình dạng bởi:

Quy trình nuôi cấy tế bào

Sự đa dạng của hình thái tế bào phụ thuộc vào loại tế bào

Fibroblastic

Endothelial

Epithelial

Neuronal

Môi trường nuôi cấy tế bào in vitro

Để tế bào tăng trưởng cần những điều kiện gì?

• Cơ chất hoặc dung dịch (flask nuôi cấy tế bào) Dĩa nhựa có thành phần hóa học phù hợp hoặc được tráng với protein ECM

Môi trường lỏng (suspension)

• Chất dinh dưỡng là môi trường nuôi chính

• Điều kiện môi trường (CO2, nhiệt độ 37oC, độ ẩm)

Oxy duy trì ổn định

• Vô trùng tuyệt đối

Môi trường cơ bản

• Duy trì pH và áp suất thẩm thấu (260-320 mOsm/L)

• Cung cấp chất dinh dưỡng và năng lượng

Thành phần của môi trường cơ bản

Muối vô cơ

• Duy trì áp suất thẩm thấu

• Kiểm soát tính thấm của màng (Na+, K+, Ca2+)

• Ion và các cofactor của enzyme

Thành phần môi trường cơ bản

Dung dịch đệm (Bicarbonate và HEPES)

• Dung dịch đệm bicarbonate cung cấp CO2 khí quyển

• HEPES có pH 7.2 – 7.6 (không cần CO2)

Glucose

• Cung cấp năng lượng

Acid keto (oxaloacetate và pyruvate)

• Chất trung gian của chu trình đường phân và chu trình Krebs

• Acid keto được thêm vào môi trường như nguồn năng lượng

• Duy trì sự chuyển hóa tế bào ở mức cao nhất

Môi trường nuôi cấy tế bào in vitro

Thành phần cơ bản của môi trường

• Tiền chất của nhiều cofactor

• Vitamin nhóm B cần cho sự tăng trưởng và tăng sinh của tế bào

• Vitamin phổ biến thường tìm thấy trong môi trường cơ bản

là riboflavin, thiamine và biotin

Các yếu tố khác

• Kẽm, đồng, selenium và chất trung gian tricarboxylic acid

Môi trường nuôi cấy tế bào in vitro

Các chất bổ sung

L-glutamine

• Acid amin thiết yếu (tế bào không tổng hợp được)

• Nguồn năng lượng (chu trình citric acid), sử dụng trong sự tổng hợp protein

• Môi trường lỏng thường không ổn định- thêm vào như chất bổ sung

Acid amin không thiết yếu

• Thường được thêm vào môi trường cơ bản

• Nguồn năng luợng, tổng hợp protein

Môi trường nuôi cấy tế bào in vitro

Chất bổ sung

Yếu tố tăng trưởng và hormone (ví dụ: insulin)

• Kích thích sự vận chuyển glucose và sử dụng glucose

• Hấp thu acid amin

• Duy trì sự biệt hóa

Chất kháng sinh, kháng nấm

• Penicillin, streptomycin, gentamicin, amphotericin B

• Giảm nguy cơ nhiễm vi khuẩn và nấm

• Tế bào có thể trở nên kháng kháng sinh– thay đổi kiểu hình

• Tốt nhất là tránh nuôi trong thời gian dài

Môi trường nuôi cấy tế bào in vitro

Foetal Calf/Bovine Serum (FCS & FBS)

• Yếu tố tăng trưởng và hormone

• Nơi tế bào gắn lên

• Gắn và trung hòa độc tố

Đun 56oC, 30 phút khi sử dụng

• Phá hủy kháng thể và bổ thể

• Phá hủy virus

yếu tố tăng trưởng, hormone và vitamin ảnh hưởng đến sự tăng trưởng của tế bào

Môi trường nuôi cấy tế bào in vitro

Nuôi cấy tế bào trong phòng thí nghiệm như thế nào?

Phục hồi quần thể tế bào

phân lập từ mô đang trữ lạnh

Duy trì tế bào trong môi trường nuôi cấy

Cấy chuyền

Bảo quản đông lạnh

Đếm tế bào

Containment level 2 cell culture laboratory

Typical cell culture flask

‘Mr Frosty’ Used to freeze cells

Cách đếm tế bào bằng buồng đếm hồng cầu

Diagram represent cell count using hemocytometer

Đường cong tăng trưởng lý tưởng trong nuôi cấy tế bào

Phương pháp xác định số lượng tế bào

Phương pháp so màu để xác định số lượng tế bào sống trong sự phát triển của tế bào trong môi trường nuôi cấy

 Hợp chất MTS (muối tetrazolium) bị khử sinh học bởi NADPH/NADH của tế bào tạo sản phẩm màu formazan

 Sản phẩm formazan tỉ lệ thuận với số lượng tế bào trong môi trường nuôi cấy

 Đo độ hấp thụ ở 490 nm

Phương pháp MTS

Phương pháp xác định số lượng tế bào

Phương pháp MTS

Thử nghiệm MTT

Cơ sở: enzyme reductase có trong ty thể

dạng kết tủa