KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ CAO CHIẾT LÁ ME (Tamarindus indica L.)

iv TÓM TẮT Nghiên cứu thành phần hóa học, định tính, khảo sát hoạt tính kháng DPPH và kháng vi khuẩn của lá Me Tamarindus indica L.. Do đó, đề tài “Khảo sát thành phần hóa học và hoạt t

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN

- -

NGUYỄN THỊ TRANG

KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ CAO CHIẾT LÁ ME

(Tamarindus indica L.)

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

CHUYÊN NGÀNH HÓA DƯỢC

2017

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN

NGUYỄN THỊ TRANG

KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ CAO CHIẾT LÁ ME

(Tamarindus indica L.)

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH: CỬ NHÂN HÓA DƯỢC

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN Ths HUỲNH ANH DUY

2017

i

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên, con xin gửi lòng biết ơn sâu sắc đến cha mẹ cũng như tất cả những người thân yêu trong gia đình đã luôn tạo mọi điều kiện tốt nhất về vật chất lẫn tinh thần giúp con hoàn thành quá trình học tập của mình

Trong quá trình nghiên cứu và thực hiện luận văn, em đã học hỏi được nhiều kiến thức, kinh nghiệm, kỹ năng chuyên môn rất bổ ích và sự giúp đỡ rất tận tình từ quý Thầy Cô và bạn bè Em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến:

Thầy Ths Huỳnh Anh Duy – người đã dành nhiều thời gian hướng dẫn, chỉ bảo và truyền đạt nhiều kinh nghiệm quý bảo để em hoàn thành tốt luận văn Thầy đã tạo mọi điều kiện tốt nhất cho em trong suốt thời gian nghiên cứu và thực hiện luận văn

Thầy Ts Nguyễn Trọng Tuân là cố vấn học tập của lớp đã tận tình giảng dạy, quan tâm và giúp đỡ em trong quá trình học tập và thực hiện luận văn

Quý Thầy Cô Trường Đại học Cần Thơ, đặc biệt là các Thầy Cô trong

Bộ môn Hóa, Bộ môn Sinh Khoa Khoa học Tự nhiên, đã tận tình giảng dạy và truyền đạt cho em những kiến thức quý báu suốt quá trình học tập trên giảng đường

Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn đến các anh chị học viên cao học, các anh chị khóa 39 của Bộ môn Hóa, Bộ môn Sinh và các bạn sinh viên lớp Hóa dược K40 những người đồng hành, cùng em chia sẽ kinh nghiệm và giúp đỡ em rất nhiều trong suốt thời gian qua

Xin chân thành cảm ơn!

NHẬN XÉT ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

1 Cán bộ hướng dẫn: Ths Huỳnh Anh Duy

2 Đề tài: Khảo sát thành phần hóa học và hoạt tính sinh học từ cao chiết

lá Me (Tamarindus indica L.)

3 Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thị Trang MSSV: B1401561

Lớp: Hóa Dược 2 Khóa: 40

4 Nội dung nhận xét:

a) Nhận xét về hình thức của LVTN:

b) Nhận xét về nội dung của LVTN (đề nghị ghi chi tiết và đầy đủ):

 Đánh giá nội dung thực hiện của đề tài:

 Những vấn đề còn hạn chế:

c) Nhận xét đối với sinh viên tham gia thực hiện đề tài (ghi rõ từng nội dung chính do sinh viên nào chịu trách nhiệm thực hiện nếu có):

d) Kết luận, đề nghị và điểm:

Cần Thơ, ngày… tháng… năm 2017

Cán bộ hướng dẫn

Ths Huỳnh Anh Duy

iii

3 Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thị Trang MSSV: B1401561

Lớp: Hóa Dược 2 Khóa: 40

4 Nội dung nhận xét:

a) Nhận xét về hình thức của LVTN:

b) Nhận xét về nội dung của LVTN (đề nghị ghi chi tiết và đầy đủ):

 Đánh giá nội dung thực hiện của đề tài:

 Những vấn đề còn hạn chế:

c) Nhận xét đối với sinh viên tham gia thực hiện đề tài (ghi rõ từng nội dung chính do sinh viên nào chịu trách nhiệm thực hiện nếu có):

d) Kết luận, đề nghị và điểm:

Cần Thơ, ngày… tháng… năm 2017

Cán bộ phản biện

iv

TÓM TẮT

Nghiên cứu thành phần hóa học, định tính, khảo sát hoạt tính kháng DPPH

và kháng vi khuẩn của lá Me (Tamarindus indica L.) thu hái tại huyện An Minh,

tỉnh Kiên Giang đã được thực hiện Kết quả cho thấy, lá Me có chứa: alkaloid, steroid-triterpenoid, flavonoid và đường khử Hợp chất TI01 đã được phân lập

từ tủa của phân đoạn ethyl acetate và có cấu trúc được xác định là hợp chất vitexin hay là 5,7-dihydroxy-2-(4-hydroxy-phenyl)-8-(3,4,5-trihydroxy-6 (hydroxymethyl) tetrahydro-2H-pyran-2-yl)-4H-chromen-4-one Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của các phân đoạn ethyl acetate, dichloromethane, petroleum ether cho thấy các cao đều có hiệu quả làm sạch gốc tự do tương đối cao với giá trị EC50 lần lượt là 13,19 µg/mL, 62,72 µg/mL, 110,67 µg/mL Khảo

sát khả năng kháng một số dòng vi khuẩn như: Escherichia coli, Vibrio

parahaemolitycus, Bacillus cereus và Staphylococcus aureus của các cao ethyl

acetate, dichloromethane, petroleum ether và chất TI01 bằng phương pháp đục

lỗ Kết quả cho thấy, các cao ethyl acetate, dichloromethane và chất TI01 đều

có khả năng kháng Escherichia coli, Vibrio parahaemolitycus, Bacillus cereus

và Staphylococcus aureus

Từ khóa: EC 50 , kháng khuẩn, kháng oxy hóa, MIC, Tamarindus indica L., vitexin.

v

ABSTRACT

Study on the chemical composition, qualitative and investigational

activities of DPPH resistance and bacterial resistance of Tamarindus indica L

collected in An Minh district, Kien Giang province was conducted The results showed that the leaf contains: alkaloid, steroid-triterpenoid, flavonoid and reducing sugar The compound TI01 was isolated from the precipitate of the ethyl acetate fraction and structurally determined to be a compound of vitexin

or 5,7-dihydroxy-2-(4-hydroxy-phenyl)-8-(3,4,5-trihydroxy-6 (hydroxymethyl) tetrahydro-2H-pyran-2-yl) -4H-chromen-4-one Analysis of the antioxidant activity of the ethyl acetate, dichloromethane, petroleum ether fractions showed that the highs had a relatively high free radical cleansing efficiency of 13.19 μg / mL, 62.72 μg / mL, 110.67 μg / mL Investigation of resistance to some strains

of bacteria such as Escherichia coli, Vibrio parahaemolyticus, Bacillus cereus and Staphylococcus aureus of ethyl acetate, dichloromethane, petroleum ether

and TI01 by punching method The results showed that high ethyl acetate,

dichloromethane and TI01 were resistant to Escherichia coli, Bacillus cereus,

Vibrio parahaemolyticus and Staphylococcus aureus.

Key words: EC 50 , antibacterial, antioxidant, MIC, Tamarindus indica L., vitexin

vi

Trường Đại Học Cần Thơ Cộng Hòa Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam

Đề tài:

KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH

SINH HỌC TỪ CAO CHIẾT LÁ ME (Tamarindus indica L.)

LỜI CAM KẾT

Tôi xin cam kết luận văn này được hoàn thành dựa trên các kết quả nghiên cứu của tôi và các kết quả của nghiên cứu này chưa được dùng cho bất

cứ luận văn cùng cấp nào khác

Cần Thơ, ngày tháng năm 2017

Cán bộ hướng dẫn Sinh viên ký tên

Ths Huỳnh Anh Duy Nguyễn Thị Trang

vii

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

TÓM TẮT iv

ABSTRACT v

MỤC LỤC vii

DANH SÁCH BẢNG xii

DANH SÁCH HÌNH xiii

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT xiv

CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU 1

1.1 Lý do chọn đề tài 1

1.2 Mục tiêu đề tài 1

1.3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 1

1.3.1 Đối tượng nghiên cứu 1

1.3.2 Phạm vi nghiên cứu 1

1.4 Nội dung nghiên cứu 2

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Tổng quan thực vật 3

2.1.1 Khái quát 3

2.1.2 Phân loại thực vật 3

2.1.3 Mô tả thực vật 4

2.1.4 Sinh thái và phân bố 5

2.2 Các nghiên cứu về mặt dược tính của cây Me 5

2.2.1 Kinh nghiệm dân gian 5

2.2.2 Các hoạt tính sinh học của Me đã được nghiên cứu 5

2.2.2.1 Hoạt tính kháng khuẩn (antibacterial activity) 5

2.2.2.2 Hoạt tính kháng nấm (antimycotic activity) 6

2.2.2.3 Hoạt tính kháng viêm (antiinflammatory activity) 6

2.2.2.4 Hoạt tính kháng oxy hóa (antioxidant activity) 6

2.2.2.5 Khả năng điều hòa lipid huyết (anti-hyperlipidemia) 6

viii

2.2.2.6 Hoạt tính hạ glucose huyết ở bệnh đái tháo đường

(antihyperglycemic (antidiabetic) activity) 6

2.2.2.7 Hoạt tính chống viêm loét dạ dày (antiulcerogenic activity) 7

2.3 Tổng quan tình hình nghiên cứu thành phần hóa học trong và ngoài nước 7

2.3.1 Các nghiên cứu ngoài nước 7

2.3.1.1 Các hợp chất dễ bay hơi 8

2.3.1.4 Flavonoid 9

2.3.1.5 Các hợp chất Tanin 10

2.3.2 Trong nước 10

2.4 Sơ lược về gốc tự do và kháng oxy hóa 11

2.4.1 Gốc tự do và tác hại 11

2.4.2 Các phương pháp đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa 12

2.5 Phương pháp DPPH 12

2.5.1 Nguyên tắc 12

2.5.2 Cơ chế kháng oxy hóa 14

2.6 Vài nét về các vi khuẩn gây bệnh thường gặp 14

2.6.1 Vi khuẩn Escherichia coli 14

2.6.1.1 Lịch sử phát hiện và môi trường sống 14

2.6.1.2 Đặc điểm hình thái 15

2.6.1.3 Khả năng gây bệnh 15

2.6.2 Vi khuẩn Vibrio parahaemolitycus 16

2.6.2.1 Lịch sử phát hiện và môi trường sống 16

2.6.2.2 Đặc điểm hình thái 17

2.6.2.3 Khả năng gây bệnh 17

2.6.3 Vi khuẩn Bacillus cereus 18

2.6.3.1 Lịch sử phát hiện và môi trường sống 18

2.6.3.2 Đặc điểm hình thái 18

2.6.3.3 Khả năng gây bệnh 18

2.6.4 Vi khuẩn Staphylococcus aureus 19

ix

2.6.4.1 Lịch sử phát hiện và môi trường sống 19

2.6.4.2 Đặc điểm hình thái 19

2.6.4.3 Khả năng gây bệnh 20

CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

3.1 Phương tiện nghiên cứu 21

3.1.1 Hóa chất 21

3.1.2 Thiết bị và dụng cụ 21

3.2 Phương pháp nghiên cứu 21

3.2.1 Phương pháp cô lập hợp chất 21

3.2.2 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của hợp chất 22

3.3 Thực nghiệm 22

3.3.1 Thu hái và xử lý mẫu 22

3.3.2 Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài 22

3.3.3 Điều chế các loại cao 22

3.3.4 Các phương pháp định tính thành phần hóa học 24

3.3.4.1 Khảo sát sự hiện diện của alkaloid 24

3.3.4.2 Khảo sát sự hiện diện của flavonoid 24

3.3.4.3 Khảo sát sự hiện diện của steroid – triterpenoid 25

3.3.4.4 Khảo sát sự hiện diện của đường khử 25

3.3.4.5 Khảo sát sự hiện diện của saponin 26

3.3.4.6 Khảo sát sự hiện diện của tanin 26

3.3.5 Khảo sát tủa của phân đoạn EA 26

3.3.5.1 Khảo sát tủa trong phân đoạn EA 26

3.3.5.2 Khảo sát phân đoạn B5 27

3.3.6 Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa DPPH 27

3.3.6.1 Chuẩn bị hóa chất 27

3.3.6.2 Quy trình thử nghiệm 28

3.3.7 Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn bằng phương pháp đục lỗ 30

3.3.7.1 Môi trường LB (Luria-Bertami) 30

x

3.3.7.2 Dung dịch đệm PBS 1X 30

3.3.7.3 Độ đục chuẩn (McFarland) 30

3.3.7.4 Chuẩn bị các đĩa thạch LB đặc 31

3.3.7.5 Chuẩn bị chủng vi khuẩn và pha hỗn dịch vi khuẩn 31

3.3.7.6 Trải vi khuẩn lên đĩa thạch 32

3.3.7.7 Đục lỗ tạo giếng thạch 32

3.3.7.8 Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn 32

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33

4.1 Kết quả định tính thành phần hóa học cao phân đoạn của lá Me (Tamarindus indica L.) 33

4.2 Hợp chất TI01 34

4.2.1 Các đặc tính của TI01 34

4.2.2 Nhận danh cấu trúc TI01 34

4.2.3 Hoạt tính sinh học của vitexin 37

4.3 Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của chất TI01 và cao phân đoạn lá Me với vitamin C bằng phương pháp DPPH 37

4.3.1 Hoạt tính kháng oxy hóa của vitamin C (ascorbic acid) 37

4.3.2 Hoạt tính kháng oxy hóa của cao EA 38

4.3.3 Hoạt tính kháng oxy hóa của cao DC 39

4.3.4 Hoạt tính kháng oxy hóa của cao PE 40

4.3.5 So sánh hiệu quả kháng oxy hóa của cao phân đoạn EA, DC, PE vào giá trị EC50 41

4.4 Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn 41

4.4.1 Đối chứng âm 41

4.4.2 Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao phân đoạn EA, DC, PE, chất TI01 của lá Me và kháng sinh thương mại 41

4.4.2.1 Khảo sát hoạt tính kháng Bacillus cereus 42

4.4.2.2 Khảo sát hoạt tính kháng Escherichia coli 43

4.4.2.3 Khảo sát hoạt tính kháng Vibrio parahaemolitycus 43

4.4.2.3 Khảo sát hoạt tính kháng Staphylococcus aureus 44

xi

CHƯƠNG 5 46

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 46

5.1 Kết luận 46

5.2 Kiến nghị 46

TÀI LIỆU THAM KHẢO 47

PHỤ LỤC 52

xii

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 3 1 Kết quả tủa của phân đoạn EA 27

Bảng 3 2 Quy trình thử nghiệm với chất đối chứng vitamin C 28

Bảng 3 3 Quy trình thử nghiệm với cao EA 29

Bảng 3 4 Quy trình thử nghiệm với cao DC 29

Bảng 3 5 Quy trình thử nghiệm với cao PE 30

Bảng 4.1 Kết quả định tính một số nhóm hợp chất trong cao PE, DC, EA của lá Me 33

Bảng 4.2 Kết quả định tính hợp chất flavonoid từ tủa trong phân đoạn EA của lá Me 34

Bảng 4.3 ố liệu phổ 1D-NMR của TI01 và vitexin 36

Bảng 4.4 Hiệu suất ức chế (I%) và hàm lượng chất kháng oxy hóa tương đương µg/mL vitamin C của cao EA 38

Bảng 4.5 Hiệu suất ức chế (I%) và hàm lượng chất kháng oxy hóa tương đương µg/mL vitamin C của cao DC 39

Bảng 4.6 Hiệu suất ức chế (I%) và hàm lượng chất kháng oxy hóa tương đương µg/mL vitamin C của cao PE 40

Bảng 4.7 Phương trình hồi quy và giá trị EC50 của vitamin C và các cao phân đoạn 41

Bảng 4.8 Khả năng kháng B cereus của cao EA, DC, PE, chất TI01 và Euvioxcin 42

Bảng 4.9 Khả năng kháng E Coli của cao EA, DC, PE, chất TI01 và Euvioxcin 43

Bảng 4.10 Khả năng kháng V parahaemolitycus của cao EA, DC, PE, chất TI01 và Euvioxcin 44

Bảng 4.11 Khả năng kháng S aureus của cao EA, DC, PE, chất TI01 và Euvioxcin 44

xiii

DANH SÁCH HÌNH

Hình 2.1 Thân và lá cây me (Tamarindus indica L.) 4

Hình 2.2 các hợp chất dễ bay hơi 8

Hình 2.3 các hợp chất acid 8

Hình 2.4 Khung cơ bản của flavanone 9

Hình 2.5 Khung cơ bản của flavon 9

Hình 2.6 Khung cơ bản của flavonol 9

Hình 2.7 Khung cơ bản của flavan-3-ol 10

Hình 2.8 Dẫn xuất của khung flavan-3-ol 10

Hình 2.9 Các hợp chất Tanin 10

Hình 2.10 Phản ứng trung hòa gốc tự do DPPH 13

Hình 2.11 Cơ chế kháng oxy hóa của các hợp chất phenolic 14

Hình 2.12 Escherichia coli 15

Hình 2.13 Vibrio parahaemolitycus 17

Hình 2.14 Bacillus cereus 18

Hình 2.15 Staphylococcus aureus 19

Hình 3.1 Sơ đồ tổng quát điều chế các loại cao từ bột lá Me 23

Hình 4.1 Hợp chất TI01 34

Hình 4.2 Kết quả SKLM của TI01 soi UV nhúng hiện hình trong H2SO4 20% 34

Hình 4.3 Cấu trúc của hợp chất TI01 (vitexin) 37

Hình 4.4 Đường chuẩn khả năng kháng oxy hóa tổng số in vitro của vitamin C 38

Hình 4.5 Khả năng kháng B cereus chất TI01 42

xiv

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

13C-NMR Carbon (13) Nuclear Magnetic Resonance

1D-NMR One Dimensional Nuclear Magnetic Resonance

1H-NMR Proton Nuclear Magnetic Resonance

B cereus Bacillus cereus

1

CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU 1.1 Lý do chọn đề tài

Cây Me (Tamarindus indica L.) thuộc chi Tamarindus, họ Đậu (Fabaceae)

có giá trị sử dụng cao, các bộ phận của cây Me đều được sử dụng đặt biệt là dùng trong các bài thuốc dân gian Quả Me có vị chua, tính mát, có tác dụng thanh nhiệt, giải nắng, giúp tiêu hóa và nhuận tràng Vỏ cây Me có vị chát, làm săn da, dùng làm thuốc cầm máu, trị tiêu chảy, lỵ và nấu nước ngậm, súc miệng chữa viêm lợi răng Lá Me có tác dụng giải độc, trị bệnh ngoài da, thường tắm cho trẻ em để phòng bệnh ngoài da vào mùa hè

Các nghiên cứu trên thế giới cho thấy lá Me có hoạt tính kháng nấm, kháng viêm, khả năng hạ lipid huyết, hạ glucose huyết Nhưng tại Việt Nam, cây Me

(Tamarindus indica L.) được trồng ở nhiều nơi, lá Me được sử dụng làm thuốc

nhưng chỉ dựa vào kinh nghiệm dân gian mà chưa được nghiên cứu đầy đủ về thành phần hóa học, hoạt tính kháng oxy hóa và kháng khuẩn Do đó, đề tài

“Khảo sát thành phần hóa học và hoạt tính sinh học từ cao chiết lá Me

(Tamarindus indica L.)” được thực hiện với mong muốn tìm hiểu được thành

phần hóa học của và hoạt tính sinh học của lá cây Me để tạo cơ sở khoa học cho việc ứng dụng chúng trong y học trong nước và ngoài nước

1.2 Mục tiêu đề tài

Nghiên cứu thành phần hóa học và khảo sát hoạt tính sinh học từ cao chiết

lá cây Me (Tamarindus indica L.)

1.3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

1.3.1 Đối tượng nghiên cứu

Cây Me (Tamarindus indica L.) thuộc họ Đậu (Fabaceae) lá Me thu hái

tại huyện An Minh, tỉnh Kiên Giang

Vi khuẩn gây bệnh gồm: Escherichia coli, Vibrio paraheamolitycus,

Staphylococcus aureus, Bacillus cereus được cung cấp bởi viện Nghiên cứu và

Phát triển Công nghệ Sinh học, trường Đại học Cần Thơ

1.3.2 Phạm vi nghiên cứu

Phân lập được 01 hợp chất và xác định cấu trúc hóa học Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa và kháng khuẩn từ cao phân đoạn lá Me

2

1.4 Nội dung nghiên cứu

Thu lá cây Me (Tamarindus indica L.) tại huyện An Minh, tỉnh Kiên

Giang Điều chế cao

Dựa vào các phương pháp hóa học định tính các hợp chất có trong cao phân đoạn EA, DC, PE

Áp dụng các phương pháp thường qui trong nghiên cứu hợp chất thiên nhiên như phương pháp sắc ký, kết tinh lại để cô lập chất

Tiến hành đo phổ các chất đã phân lập, phân tích phổ, từ đó xác định cấu trúc chất

Thử hoạt tính kháng oxy hóa của các cao phân đoạn EA, DC, PE bằng phương pháp kháng DPPH

Bằng phương pháp đục lỗ trên đĩa thạch khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết EA, DC, PE và chất phân lập được

Cây Me (Tamarindus indica L) phân bố rộng khắp các tỉnh ở Việt Nam và

nhiều hơn ở các tỉnh phía nam Đó là loại cây gỗ ưa sáng, có biên độ sinh thái tương đối rộng và có thể sống trên nhiều loại đất Cây Me được trồng vừa làm bóng mát, vừa lấy lá, quả ăn và làm thuốc [2]

Cây Me tên khoa học là Tamarind indica L hay Tamarindus indica L

thuộc họ Đậu Fabaceae Các bộ phận của cây Me được sử dụng với nhiều mục đích khác nhau trong lĩnh vực thực phẩm hay dược phẩm

2.1.2 Phân loại thực vật

Tên khoa học: Tamarindus indica L

Họ: Fabaceae

Tên Việt Nam: Me

Tên nước ngoài: Asam jawa (Malaysia); Sampalok, Kalomagi (Philipines); Ampul, Ampil và Khoue me (Campuchia); Khaam, Makkham (Lào); Makham, Bakham, Sokham (Thái Lan) [3]

Lá: Lá kép lông chim chẵn, dài 8 đến 10cm, gồm 10 đến 20 đôi lá chét

thuôn, gốc bằng, đầu tù, hai mặt nhẵn, mặt dưới rất nhạt dài 20 mm rộng 2 mm [2,3]

Hoa: Cụm hoa mọc ở kẽ lá và đầu cành thành chùm đơn hoặc chùy có

lông tơ, dài 5-10 cm, lá bắc sớm rụng, dài có ống loe dần về phía đỉnh Năm răng có 2 cái dính liền, tràng 3 cánh có những vệt đỏ Hai cánh bên hình mác hẹp, cánh giữa rất nhọn, khum Nhị 8 hàn liền ở phía dưới thành lưỡi hẹp, bầu nhẵn [2, 3]

Quả: Quả dẹt, dài 7-10 cm, hơi cong, vỏ ngoài màu vàng nâu, thịt nhầy

chua Hạt: Hạt 3-10, dẹt, cứng, bóng và có màu nâu đậm, có thể có đường rạch

đôi để tăng cường khả năng nảy mầm Mùa hoa tháng 5-6, mùa quả tháng 7-8 [2, 3]

Hình 2.1 Thân và lá cây me (Tamarindus indica L.)

5

2.1.4 Sinh thái và phân bố

Cây Me (Tamarindus indica L.) là loài thực vật phân bố ở vùng nhiệt đới

Châu Phi và được trồng rộng rãi ở các nước trong vành đai nhiệt đới ở cả Bắc

và Nam bán cầu

Cây Me phân bố rộng khắp trên nước ta nhưng trồng nhiều hơn ở phía nam, cây ưa sáng có biên độ sinh thái rộng, chịu được khô hạn và có thể sống được trên nhiều loại đất Có rễ cọc khỏe, cây Me chịu được gió to hoặc bão các

từ vùng hoang mạc Hoa thụ phấn nhờ côn trùng và gió, thời gian quả tồn tại trên cây dài đến 8 tháng [2]

2.2 Các nghiên cứu về mặt dược tính của cây Me

2.2.1 Kinh nghiệm dân gian

Quả Me: có khả năng chữa chảy máu chân răng (bệnh Scorbut), đau gan,

vàng da, rối loạn tiết mật, viêm dạ dày mạn tính, khó tiêu, nôn ọe khi có thai hoặc có thai sinh chán ăn, ốm nghén

Hạt Me: Rang chín, xát bỏ vỏ, ngâm vài giờ trong nước, rồi nấu chè hoặc

luộc ăn dặm thay cơm để tẩy giun

Lá Me: Nấu nước tắm phòng chữa mẫn ngứa, rôm sảy, sắc đặc bôi trị ghẻ

Võ thân và cành Me: Đem cạo sạch lớp vỏ ngoài phơi khô, tán bột Bột

có vị chát, kích thích tiêu hóa, rắc lên vết thương để cầm máu, ngâm chữa viêm lợi răng, sắc uống trị tiêu chảy lỵ

Gỗ Me: Chữa kém ăn, bệnh gan, táo bón mạn tính cho người già và phụ

nữ có thai [2-4]

2.2.2 Các hoạt tính sinh học của Me đã được nghiên cứu

2.2.2.1 Hoạt tính kháng khuẩn (antibacterial activity)

Cao chiết ethanol, methanol, nước của lá Me có khả năng ức chế vi khuẩn

Gram âm (Escherichia coli, Proteus mirabilis, Pseudomonas aerugenosa,

Salmonella typhi, Salmonella paratyphi, Shigella flexnerri) và vi khuẩn Gram

dương (Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis và Streptococcus pyogenes)

Nghiên cứu này thực hiện theo phương pháp khuếch tán đĩa và xác định nồng

độ ức chế tối thiểu Quan sát thấy được rằng khả năng chống Proteus mirabilis

của cao acetone là cao nhất [5]

6

2.2.2.2 Hoạt tính kháng nấm (antimycotic activity)

Nghiên cứu cao chiết nước lá Me đối với nấm Fusarium incarnatum,

Alternaria citri, Colletotrichum musae, Colletotrichum sp Và Gibberella avenaceum ở các nồng độ từ 10, 20… 100% Cao nước lá me ở nồng độ 100%

ức chế nấm Alternaria citri (87,59%), Gibberella avenaceum (51,67%),

Fusarium incarnatum (42,11%) [6]

2.2.2.3 Hoạt tính kháng viêm (antiinflammatory activity)

Cao chiết ethanol lá Me đã được chứng minh không gây độc tính cấp đối với chuột ở các nồng độ 500, 700, 1000 mg/kg trọng lượng Ở các nồng độ 500,

750 và 1000 mg/ kg trọng lượng, cao chiết ethanol lá me cũng đã được nghiên cứu có khả năng kháng viêm với tỷ lệ lần lượt là 59,28%, 70% và 73,63% [7]

2.2.2.4 Hoạt tính kháng oxy hóa (antioxidant activity)

Cao chiết lá Me đã được khảo sát tính an toàn và khả năng kháng oxy

hóa in vitro Kháng oxy hóa được xác định thông qua khả năng kháng hoạt

động của DPPH (IC50= 44.36 μg/mL) [8]

2.2.2.5 Khả năng điều hòa lipid huyết (anti-hyperlipidemia)

Cao chiết lá Me cũng đã được chứng minh có khả năng điều hòa lipid huyết thông qua các các chỉ số cholesterol tổng (TC), triglycerid (Tg), LDL_C (Low-density lipoprotein cholesterol), HDL_C (High-density lipoprotein

cholesterol) in vivo Năm 2016, Citra et al., đã chứng minh cao chiết lá Me có

khả năng hạ TC và Tg ở chuột ăn khẩu phần cao cholesterol (P<0,05) khi so sánh với nghiệm thức đối chứng Tuy nhiên, LDL-cholesterol và HDL-C khác biệt không có ý nghĩa thống kê (P>0,05) [9]

2.2.2.6 Hoạt tính hạ glucose huyết ở bệnh đái tháo đường (antihyperglycemic (antidiabetic) activity)

Cao chiết methanol lá Me ở các nồng độ 50, 100, 200 mg/kg trọng lượng

đã được chứng minh có khả năng hạ glucose huyết ở chuột bệnh đái tháo đường Nồng độ 200 mg/ kg trọng lượng có khả năng hạ glucose huyết là tốt nhất [10]

7

2.2.2.7 Hoạt tính chống viêm loét dạ dày (antiulcerogenic activity)

Cao chiết ethanol lá Me ở liều 200 mg/kg và 400 mg/kg trọng lượng chuột

ức chế sự tổn thương dạ dày gây ra bở CRU (Cold restraint stress) là 68,14%, IND (Indomethacin) là 73,8% và PL (Pyloric Ligation) là 76,14% so với thuốc Omeprazole Khả năng ức chế sự tổn thương dạ dày cao có thể là do cao chiết ethanol lá Me có chứa các hợp chất saponin, tannin, alkaloid, carbohydrate, steroid, anthocyanin [11]

2.3 Tổng quan tình hình nghiên cứu thành phần hóa học trong và ngoài nước

2.3.1 Các nghiên cứu ngoài nước

Ở Ấn Độ, V K Bhatia và các cộng sự đã phân lập được các hợp chất có

trong lá Me (Tamarindus indica L.) bằng phương pháp sắc ký giấy vào năm

1965 Các hợp chất đó có chứa hai cặp đồng phân vitexin và isovitexin; orientin

và iso-orientin [12]

Năm 1975 Peter L Lee và các cộng sự đã nghiên cứu thành phần các chất

dễ bay hơi có trong cây Me (Tamarindus indica L.) Nghiên cứu này đã xác định

được 61 hợp chất dễ bay hơi bằng phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ MS) [13]

(GC-Năm 2005, hàm lượng polyphenolic trong hạt và thịt quả của cây Me

(Tamarindus indica L.) đã được định lượng bởi Y Sudjaroen và các cộng sự

bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Theo nghiên cứu trong hạt có chứa: procyanidin tetramer, procyanidin hexamer, procyanidin trimer, procyanidin pentamer, procyanidin B2 and (-)-epicatechin và trong thịt quả có chứa: (+)-catechin, (-)-epicatechin, procyanidin B2, procyanidin trimer, procyanidin tetramer, procyanidin pentamer, procyanidin hexamer, taxifolin, apigenin, eriodictyol, luteolin, naringenin [14]

Năm 2007, Andreanus A.Soemardji đã nghiên cứu tổng quan về thành

phần hóa học và công dụng của cây Me (Tamarindus indica L.) Kết quả nghiên

cứu cho thấy trong thân cây có chứa: citric acid, nicotinic acid, 1-malic acid, pipecolic acid, vitexin, isovitexin, orientin, isoorientin, vitamin B3, tinh dầu (geranial, geraniol, limonene), cinnamates, serine, beta-alanine, pectin, praline, phenylalanine, leucine, kali Trong lá có chứa: vitexin, isovetexin, orientin, isiorientin, 1-malic acid, tannin, glycosides và peroxidase [3]

Tên gọi R1 R2 R3 R4 R5 R6 Apigenin

Luteolin Vitexin Isovitexin Orientin Iso- orientin

H Glc

H Glc

H

Taxifolin:

R1=R2=R3=R4= OH

Năm 2017, kết quả nghiên cứu của Bùi Ngọc Tân đã xác định được thành

phần hóa học chủ yếu có trong hạt và thịt của quả Me (Tamarindus indica L.)

là protein thô, chất béo thô, tro, sợi thô và cacbohydrate Bằng các phương pháp hiện đại như: phổ NMR, phổ khối nhiều lần ESI-MS, các phương pháp tán xạ ánh sáng LS, tán xạ tia X góc nhỏ SAXS và SEM đã xác định được một

Hình 2.8 Dẫn xuất của khung flavan-3-ol

Hình 2.9 Các hợp chất Tanin

11

galactoxyloglucan có cấu trúc không gian có dạng hình cầu, cấu trúc bề mặt có dạng vô định hình Bên cạnh đó, các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của các cao chiết từ thịt quả và hạt của quả Me cho thấy các hợp chất chứa trong thịt quả và hạt có khả năng ức chế sự phát triển của các tế bào ung thư, kháng khuẩn, kháng oxy hóa và chống đông máu [15]

Hiện nay, ở Việt Nam lá Me chưa được nghiên cứu về thành phần hóa học cũng như hoạt tính sinh học

2.4 Sơ lược về gốc tự do và kháng oxy hóa

2.4.1 Gốc tự do và tác hại

Gốc tự do là những nguyên tử, phân tử hay những mảnh nguyên tử, phân

tử có chứa một hay nhiều electron độc thân liên kết lớp ngoài cùng, có khả năng tồn tại độc lập trong một khoảng thời gian nhất định Gốc tự do là những phần tử có khả năng phản ứng cao, dễ dàng lấy đi điện tử của của phân tử khác nhằm bền vững hoá lớp vỏ điện tử của mình nhưng đồng thời sinh ra một gốc

tự do mới, gốc tự do mới lại tiếp tục phản ứng với phân tử khác và tạo thành phản ứng dây chuyền [16]

Stress oxy hóa là hiện tượng khi các gốc tự do có vai trò quan trọng trong

cơ thể, là những chất chuyển hóa trung gian có hoạt tính mạnh, vượt quá sự kiểm soát của cơ thể tấn công vào hệ thống các mô, cơ quan, các base trong nucleic acid, các amino acid trong chuỗi protein, các acid béo chưa bão hoà…

và gây ra hàng loạt biến đổi có hại cho cơ thể như: lão hóa, các vấn đề tim mạch, thoái hóa thần kinh, các bệnh ung thư Tuy nhiên, quan điểm hiện đại cho rằng stress oxy hóa không hẳn luôn có hại Tùy thuộc vào mức độ biểu hiện, nó có thể đóng vai trò quan trọng trong một số quá trình quan trọng trong

cơ thể như trong lộ trình truyền tín hiệu, sự tổng hợp các enzyme chống oxy hóa, các quá trình tự sửa chữa, sự nhân lên hay chết theo chương trình của tế bào Vì thế, sự điều hòa các chất chống oxy hóa không đúng cách có thể gây

ra các tác động tiêu cực đến cơ thể sống [16]

Chất chống oxy hóa là những phân tử có thể ức chế quá trình oxy hóa của các phân tử khác Các chất chống oxy hóa sẵn có trong cơ thể như superoxide dismutase, catalase, glutathinone peroxidase là những enzyme điều hòa, duy trì lượng anion superoxide, H2O2 và các hydroperoxide tương ứng ở mức độ cho phép Tuy nhiên, do một số nguyên nhân làm cho lượng anion superoxide,

H2O2 và các hydroperoxide tương ứng tăng quá mức cho phép cơ thể không còn đủ khả năng tự bảo vệ mình, nhưng nhờ vào những nghiên cứu các chất kháng oxy hóa từ thực vật đã góp phần hỗ trợ cho hệ thống bảo vệ của cơ thể,

12

ngăn chặn oxy hóa không mong muốn như các: carotenoid, flavonoid, vitamin

C, E… và các hợp chất trao đổi thứ cấp từ thực vật đã và đang được quan tâm nghiên cứu [17]

2.4.2 Các phương pháp đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa

Ở mức độ in vitro, có nhiều phương pháp khác nhau để đánh giá khả năng

kháng oxy hóa nhưng nhìn 3 phương pháp thường được sử dụng là quang phổ, điện hóa học và sắc kí Phương pháp quang phổ dựa trên phản ứng của một gốc tự do (DPPH, HORAC, TRAP); cation gốc tự do (ABTS) hay phản ứng tạo phức (FRAP, PFRAP) với một chất chống oxy hóa có khả năng cho một nguyên tử hydrogen Phương pháp đo điện hóa học dựa vào sự khác biệt về điện trước và sau khi phản ứng Trong các phương pháp này, kỹ thuật quét thế vòng tuần hoàn và biamperometry được sử dụng phổ biến nhất Các phương pháp sắc kí cũng cho phép xác định khả năng kháng oxy hóa toàn phần nhưng

có ưu điểm là cho phép tách riêng các thành phần kháng oxy hóa từ đó có thể định lượng được chính xác các thành phần có hoạt tính kháng oxy hóa [18, 19]

Ở mức độ in vivo, một vài phương pháp có thể kể đến như sau: đánh giá

khả năng khử Fe của huyết tương, khả năng khử glutathione (GSH), phương pháp superoxide dismutase (SOD), Catalase (CAT), thử nghiệm hoạt tính của

-glytamyl transpeptidase, mức độ peroxi hóa của lipid, thử nghiệm LDL [20] Trong tất cả các phương pháp thử, DPPH và LPO là phương pháp được

sử dụng phổ biến nhất ở mức độ in vitro để đánh giá khả năng kháng oxy hóa

[21] Vì thế, phương pháp thử nghiệm hoạt tính kháng oxy hóa thông qua khả năng làm sạch gốc tự do DPPH được sử dụng để đánh giá hoạt tính kháng oxy

hóa của lá Me (Tamarindus indica L.)

2.5 Phương pháp DPPH

2.5.1 Nguyên tắc

Phương pháp DPPH là một phương pháp đơn giản, nhanh chóng, ít tốn kém và được sử dụng rộng rãi để đánh giá khả năng làm sạch gốc tự do hoặc các chất cho nguyên tử hydrogen của các hợp chất Ngoài ra, phương pháp này còn được sử dụng để định lượng chất chống oxy hóa trong một hệ thống hỗn hợp nhiều chất [20]

Trong phương pháp này, DPPH được sử dụng như một chất phản ứng để đánh giá hoạt động làm sạch gốc tự do của chất kháng oxy hóa Chất kháng oxy hóa có khả năng cho một nguyên tử hydrogen để khử gốc tự do DPPH màu tím thành dạng ổn định diphenyl-picrylhydrazine (DPPH-H) có màu vàng Khả

13

năng chống oxy hóa của chất kháng oxy hóa được đánh giá bằng sự thay đổi

độ hấp thu của DPPH, ở bước sóng 517 nm [21]

Hình 2.10 Phản ứng trung hòa gốc tự do DPPH

Khả năng kháng oxy hóa của một chất được biểu hiện bằng giá trị EC50, nồng độ chất chống oxy hóa để có thể ức chế 50% gốc tự do DPPH Giá trị

EC50 càng nhỏ, hoạt tính kháng oxy hóa càng mạnh

EC50 là một giá trị dùng để đánh giá khả năng ức chế mạnh hoặc yếu của mẫu khảo sát EC50 được định nghĩa là nồng độ (µg/mL) của mẫu tại đó nó có thể ức chế 50% gốc tự do, tế bào hoặc enzyme, mẫu có hoạt tính càng cao thì giá trị EC50 sẽ càng thấp

Giá trị EC50 được xác định bằng phương pháp lập phương trình đường chuẩn y = ax + b Với các giá trị x bao gồm nhiều nồng độ khác nhau Khi phần trăm (%) ức chế tuyến tính với nồng độ mẫu, cho y = 50% và thay vào phương trình đã có, từ đó được giá trị x chính là EC50

Khả năng ức chế gốc tự do DPPH được xác định thông qua phần trăm

ức chế I (%) được tính theo công thức sau:

I (%) =𝐴𝑐−𝐴𝑠

𝐴𝑐 x100 Với Ac: giá trị mật độ quang của mẫu trắng (control)

As: giá trị mật độ quang của mẫu thử (sample)

14

2.5.2 Cơ chế kháng oxy hóa

Cơ chế phản ứng của các hợp chất phenolic (ArOH) với DPPH được biểu diễn theo hai cơ chế là cơ chế chuyển dịch electron (Hydrogen Atom Transfer-HAT) và cơ chế dịch chuyển electron mất tuần tự proton (Squential Proton Loss Electron Transfer SPLET) Trong cơ chế HAT, nguyên tử H trong liên kết O-H dịch chuyển trực tiếp từ ArOH đến DPPH Thay vào đó, cơ chế SPLET khởi đầu bằng sự deproton hóa tạo ion phenolic (ArO-) rồi DPPH nhận một electron từ ArO- Sự tương quan giữa 2 cơ chế HAT và SPLET được biểu diễn

ở Hình 2.12, có thể thấy dung môi dùng để hòa tan hỗn hợp phản ứng có thể ảnh hưởng đến phản ứng của chất chống oxy hóa với DPPH thông qua cơ chế HAT Dung môi có thể đóng vai trò là chất cho hay nhận liên kết hydrogen [22]

2.6 Vài nét về các vi khuẩn gây bệnh thường gặp

2.6.1 Vi khuẩn Escherichia coli

2.6.1.1 Lịch sử phát hiện và môi trường sống

Vi khuẩn Escherichia coli trước đây còn được gọi là Bacterium coli

commune hay Bacilus coli communis, do Theodor Escherich (1857-1991) phân

lập đầu tiên vào năm 1885 từ phân trẻ em bị tiêu chảy Vi khuẩn E coli thuộc

nhóm vi khuẩn đường ruột họ Enterbacteriaceae, là một loại trực khuẩn sống thường xuyên trong ruột người và một số động vật, chiếm tới 80% vi khuẩn sống ở ruột, tập trung nhiều ở đại tràng nên còn gọi là vi khuẩn đại tràng Vi

khuẩn E coli có thể sống hiếu khí, kỵ khí Chúng phát triển ở nhiệt độ từ 5-40

oC Nhiệt độ tối ưu nhất cho sự phát triển là 37 oC, pH thích hợp từ 7,2-7,4

nhưng có thể phát triển ở pH từ 5,5-8 Trong điều kiện thích hợp, vi khuẩn E

coli phát triển rất nhanh, thời gian cho một thế hệ chỉ khoảng 20-30 phút [23,

15

2.6.1.2 Đặc điểm hình thái

E coli là vi khuẩn Gram âm, có hình que, hai đầu tròn, kích thước dài

ngắn khác nhau, nhưng thường từ 2-3 µm x 0.6 µm Các tế bào vi khuẩn thường đứng riêng lẻ, cũng có khi ghép thành từng đôi một, có khi kết với nhau thành

từng đám hoặc một chuỗi ngắn Phần lớn, vi khuẩn E coli có khả năng di động

nhờ có tiêm mao ở xung quanh thân Không có khả năng hình thành bào tử, có khả năng hình thành giáp mô khi gặp môi trường dinh dưỡng tốt [23, 26]

2.6.1.3 Khả năng gây bệnh

Trong điều kiện bình thường E coli không gây bệnh mà còn có khả năng

tổng hợp một số vitamin nhóm B, E, K và đối kháng với một số vi khuẩn có

hại khác như: Salmonella, Shigella nhờ việc tiết ra colixin nhưng khi cơ thể

suy yếu, dẫn đến sức đề kháng giảm thì một số chủng trở nên cường độc và có khả năng gây bệnh [25]

Vi khuẩn E coli có khả năng gây bệnh cho tất cả các loài động vật

máu nóng Tạo ra hội chứng tiêu chảy, viêm ruột, chảy máu đường ruột đã trở thành mối lo về sức khoẻ không chỉ ở con người mà cả ở gia súc trên toàn thế giới

Vi khuẩn E coli có thể gây bệnh được là do nhiều yếu tố như: khả năng

bám dính, khả năng xâm nhập, các loại kháng nguyên, yếu tố kháng khuẩn, khả năng kháng kháng sinh và độc tố Nhưng quan trọng nhất là 2 yếu tố độc lực chính: kháng nguyên bám dính (fimbriae) và độc tố đường ruột (enterotoxin)

(http://pixgood.com/e-coli-bacteria-microscope.html)

Hình 2.12 Escherichia coli

16

Kháng nguyên bám dính

Kháng nguyên bám dính cho phép vi khuẩn bám dính trên tế bào biểu

mô lông ruột non để từ đó gây nên những biến đổi bệnh lý kèm theo Khả năng bám dính của vi khuẩn vào tế bào biểu mô ruột của vật chủ hoặc lớp màng nhầy của tế bào đóng vai trò quan trọng trong quá trình gây bệnh của vi

khuẩn Đa số các chủng vi khuẩn E coli phân lập được từ gia súc non bị

tiêu chảy đều có một kháng nguyên bề mặt gọi là pili Kháng nguyên này quyết

định độc lực chủ yếu vì nó làm cho vi khuẩn E coli bám dính vào thành ruột

Sự tăng nhanh của tế bào vi khuẩn dường như có liên quan đến khả năng bám dính của chúng vào tế bào biểu mô của ruột để tránh sự đào thải khỏi ruột non do nhu động ruột [26]

Độc tố đường ruột

Độc tố đường ruột do vi khuẩn sản sinh ra gắn vào receptor trên tế bào ruột non của vật chủ gây nên những biến đổi chức năng sinh lý màng tế bào, dẫn đến việc tăng cường bài xuất nước và các chất điện giải ra khỏi màng tế bào, cuối cùng gây chết gia súc do mất nước, rối loạn trao đổi chất điện giải [27, 28]

2.6.2 Vi khuẩn Vibrio parahaemolitycus

2.6.2.1 Lịch sử phát hiện và môi trường sống

Vibrio parahaemolitycus được Fujino phát hiện lần đầu tiên vào mùa hè

năm 1951, tại vùng ven biển Nhật Bản sau các vụ ngộ độc do ăn phải tôm, cua,

cá, hàu Vi khuẩn V parahaemolitycus là những vi khuẩn kỵ khí, vi khuẩn

phát triển trong môi trường có NaCl với nồng độ 1%-8% và phát triển tốt nhất

ở nồng độ NaCl là 2%-4%, không thể sinh trưởng trong môi trường có nhiệt độ dưới 4 oC và không có muối Vi khuẩn V parahaemolitycus có thể sống trong

môi trường pH rất cao 8,5-9,5 và bị tiêu diệt nhanh trong môi trường acid 32]

[29-17

2.6.2.2 Đặc điểm hình thái

V parahaemolitycus là những vi khuẩn Gram âm, hình que thẳng hoặc hơi

uốn cong, có dạng dấu phẩy, sống hoại sinh, kích thước từ 0,5-0,8 µm x 1,4-2,4

µm Chúng không sinh bào tử và chuyển động nhờ một hay nhiều tiêm mao

mảnh nằm ở một đầu của vi khuẩn [29-32]

2.6.2.3 Khả năng gây bệnh

Vi khuẩn V parahaemolitycus có thể xâm nhập vào cơ thể thông qua

đường tiêu hóa Khi ăn phải những hải sản sống hoặc nấu chưa chín, thường là

hàu Nhiễm phải V parahaemolitycus qua đường tiêu hóa là nguyên nhân chủ yếu gây ra viêm dạ dày ruột cấp tính. Các V parahaemolitycus cũng xâm nhập

vào cơ thể thông qua những vết thương nhưng không phổ biến bằng đường tiêu

hóa Cơ chế gây bệnh của vi khuẩn V parahaemolyticus chưa được làm sáng tỏ

[34]

Hai biến thể (T3SS2α và T3SS2β ) gây bệnh của V parahaemolitycus nằm

trên nhiễm sắc thể số hai và chúng có khả năng truyền ngang các gen gây bệnh cho nhau. Mỗi biến thể chứa gen T3SS, có khả năng tiêm protein độc vào tế bào chủ để gây rối loạn chức năng tế bào vật chủ, gây chết tế bào do apoptosis [33-36]

(http://imgarcade.co/)

Hình 2.13 Vibrio parahaemolitycus

18

2.6.3 Vi khuẩn Bacillus cereus

2.6.3.1 Lịch sử phát hiện và môi trường sống

Năm 1887 Bacillus cereus được phân lập bởi Frankland từ không khí Sau đó không lâu dịch B cereus đầu tiên bùng phát ở Mỹ năm 1969 Vào năm

1971, các vụ ngộ độc B cereus được ghi nhận có biểu hiện đau và buồn nôn sau khi ăn từ 1-5 giờ Vi khuẩn B cereus có khả năng phát triển trong khoảng nhiệt

độ rất rộng từ 10-50 ° C, nhiệt độ tối ưu 28-35° C, có thể sống trong môi trường

pH 4,9-9,3 và trong môi trường chứa 7,5% NaCl [37]

2.6.3.2 Đặc điểm hình thái

Hình 2.14 Bacillus cereus

(http://www.phys.org) Bacillus cereus là vi khuẩn hiếu khí, bào tử dạng hình ovan, kích thước

2,0-4,0 µm x 0,5-1,5 µm, không tạo giáp mô, không có khả năng di động Vi

khuẩn B cereus có khả năng sinh nha bào, Gram dương khi tế bào tăng trưởng

sớm và cũng có thể thành Gram âm khi tăng trưởng muộn [37]

2.6.3.3 Khả năng gây bệnh

Vi khuẩn Bacillus cereus phân bố nhiều trong tự nhiên, nhiễm vào các loại thức ăn đêm hay trữ lạnh lâu, thường gây ngộ độc thực phẩm Bacillus

cereus sản sinh một lượng lớn các chất độc ngoại bào và enzyme lecithinase,

protease, lactamase, sphingomyelinase, cereolysin và haemolysin Trong đó có hai loại độc tố chủ yếu là độc tố gây tiêu chảy (diarrhoed toxin) và độc tố gây nôn mửa (emetic toxin) Độc tố gây tiêu chảy bản chất là một loại protein gây hủy hoại biểu bì và niêm mạc ruột gây tiêu chảy có thể nguy hiểm đến tính mạng

và được vi khuẩn sản sinh trên thịt, rau quả, gia vị Độc tố gây nôn mửa bản chất là phospholipit có tính ổn định cao không bị phân hủy ở nhiệt độ cao và dịch dạ dày Vi khuẩn nhiễm trong gạo, cơm nguội và các loại đậu Ngoài ra vi khuẩn còn gây ra một loạt các nhiễm trùng cục bộ và toàn thân như viêm nội

19

tâm mạc, viêm màng não, viêm xương, nhiễm trùng vết mổ, nhiễm khuẩn huyết

và đặc biệt enzyme hemolyzin là một protein gây độc mạnh có thể gây chết người, độc tố này có thể trung hòa bởi cholesterol trong huyết thanh nhưng nó

đã góp phần cho sự phát triển của vi khuẩn [38,39]

2.6.4 Vi khuẩn Staphylococcus aureus

2.6.4.1 Lịch sử phát hiện và môi trường sống

Khoảng 20% dân số loài người là vật mang lâu dài của Staphylococcus aureus Chúng là một trong những nguyên nhân chính gây ngộ độc thực phẩm,

thuộc họ Staphylococcaceae, do Robert Koch (1843-1910) phân lập từ mủ ung nhọt vào năm 1878 và được Loius Pasteur (1880) nghiên cứu từ thời kỳ đầu

của lịch sử ngành vi sinh vật học Vi khuẩn S aureus có khả năng phát triển

trong khoảng nhiệt độ rất rộng, từ 7-45 oC, nhiệt độ cực thuận 30-45 oC, có thể sống trong môi trường pH 4,2-9,3 với độ pH thuận lợi là 7-7,5 và trong môi trường chứa 15% NaCl [40]

2.6.4.2 Đặc điểm hình thái

S aureus là những vi khuẩn hiếu khí hay kỵ khí, hình cầu, không di động,

Gram dương, đường kính 0,5-1,5 µm, không hình thành bào tử, tế bào xếp

thành hình chùm nho Trong bệnh phẩm thì vi khuẩn thường tập hợp thành từng đôi hoặc tạo thành những đám nhỏ [41, 42]

(http://www.rsc.org)

Hình 2.15 Staphylococcus aureus

20

2.6.4.3 Khả năng gây bệnh

S aureus cư trú trên người lành, gây bệnh khi có điều kiện thuận lợi Bệnh

do S aureus có thể lan truyền trực tiếp nhưng thường gián tiếp qua không khí,

đồ dùng, dụng cụ, thức ăn các bệnh thường gặp là nhiễm khuẩn ngoài da, niêm

mạc, nhiễm trùng huyết, nhiễm độc thức ăn và viêm ruột cấp, viêm phổi

Khuẩn ngoài da, niêm mạc

Vi khuẩn S aureus gây viêm nang lông (đinh râu), mụn nhọt, đầu đinh,

chắp, lở, áp xe, nhiễm trùng vết thương, vết mổ, vết bỏng Từ đó có thể gây

biến chứng nhiễm trùng huyết, viêm tắc tĩnh mạch xoang hang Vi khuẩn S

aureus còn gây viêm mũi họng, viêm xoang, viêm tai giữa [43]

Nhiễm trùng huyết

Vi khuẩn S aureus xâm nhập vào máu sinh sản phát triển gây nhiễm

trùng máu Nhiễm trùng máu thường thứ phát sau nhiễm trùng da Biểu hiện nhiễm trùng máu là sốt cao thành cơn, ớn lạnh, rét run, đau cơ, mạch nhanh,

thở nhanh Không những vậy, vi khuẩn S aureus còn có thể gây biến chứng

nhiễm khuẩn di căn, áp xe di căn, sốc nhiễm khuẩn, vãng khuẩn huyết (vi khuẩn

S aureus đi qua máu gây ổ viêm ở phổi, màng phổi, thận, não, tuỷ xương,

màng tim ) [43]

Nhiễm độc thức ăn và viêm ruột cấp

Bệnh gây ra do vi khuẩn S aureus tiết độc tố vào thực phẩm, người ăn

thực phẩm đó và bị ngộ độc Không cần có sự hiện diện của vi khuẩn còn sống trong thực phẩm mà chỉ cần có độc tố của chúng Loại này thường có tính chất cục bộ, ít có khả năng truyền nhiễm

Viêm ruột cấp gặp ở bệnh nhân dùng kháng sinh phổ rộng kéo dài, tiêu

diệt vi khuẩn S aureus không gây bệnh, tụ cầu có độc tố ruột phát triển gây

bệnh [43]

Viêm phổi

Viêm phổi do S aureus rất ít gặp Nó chỉ xảy ra khi viêm đường hô hấp

do virus hoặc sau nhiễm trùng máu Tuy vậy, cũng có trường hợp viêm phổi

tiềm phát do S aureus ở trẻ em hoặc người suy yếu Tỷ lệ tử vong ở những bệnh

nhân này khá cao [43]

Hóa chất khác: Nước cất (H2O), acid formic, dung dịch thuốc thử H2SO420% Na2SO4 (Trung Quốc), Tryptone, Yeast extract (Himadia), NaCl, agar, 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH), dimethyl sulfoxide (Merck)

Silica gel (Merck) cỡ hạt 0,063-0,200 mm, bản silica gel 60 F254 Merck tráng sẵn dùng cho SKC và SKLM pha thường

3.1.2 Thiết bị và dụng cụ

Tủ sấy (sấy dụng cụ thủy tinh), tủ cấy vô trùng (cấy khuẩn), nồi hấp (hấp môi trường và đĩa petri), máy cô quay chân không Heidolph, máy soi UV (soi bản mỏng), cân phân tích GR-200, cân kỹ thuật GM 612, bếp điện các loại cột sắc ký, đĩa petri

Các thiết bị dùng để ly trích: cốc, ống đong, bình cô quay, phễu, đũa thủy tinh, giấy lọc

Các dụng cụ dùng để cấy khuẩn: pince, đèn cồn, micropipette, que cấy

3.2 Phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Phương pháp cô lập hợp chất

Chiết cao tổng bằng phương pháp ngâm dầm với ethanol 70o Thời gian ngâm bột mẫu khoảng 24 giờ Sau đó, dịch chiết được lọc qua giấy lọc, cô quay dịch lọc thu được cao tổng (cao ethanol)

Chiết lỏng-lỏng cao tổng lần lượt với các dung môi phân cực tăng dần PE,

DC, EA để thu được các cao phân đoạn

Sử dụng phương pháp SKC với hệ dung môi thích hợp để phân lập chất

Sử dụng SKLM để theo dõi quá trình SKC và đánh giá mức độ tinh sạch của hợp chất

22

3.2.2 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của hợp chất

Cấu trúc hóa học của các hợp chất được xác định bằng phương pháp phổ nghiệm Các loại phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1D-NMR) được đo tại Viện Hóa học Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam (Số 18 Hoàng Quốc Việt, quận Cầu Giấy, Hà Nội)

Xác định các tính chất vật lý của hợp chất cô lập như màu sắc, dạng tinh thể, Rf, khả năng hòa tan trong các loại dung môi

Dựa vào kết quả phân tích phổ kết hợp với các thông số vật lý, dữ liệu phổ tham khảo để đề nghị cấu trúc các hợp chất đã phân lập được

3.3 Thực nghiệm

3.3.1 Thu hái và xử lý mẫu

Thu hái nguyên liệu lá của cây Me (Tamarindus indica L.) tại huyện An

Minh, tỉnh Kiên Giang

Xử lý nguyên liệu lá cây Me sau khi thu hái được rửa sạch, loại bỏ phần

hư, chặt cắt nhỏ Phơi khô trong bóng râm, sau đó sấy ở 60oC đến khi khối lượng không đổi nghiền thành bột mịn (1kg)

3.3.2 Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài

Thời gian từ tháng 6/2016 đến tháng 12/2016

Địa điểm: Phòng thí nghiệm Hóa Sinh, phòng thí nghiệm Động vật-thực vật 1 khoa Khoa học Tự nhiên, Trường Đại học Cần Thơ

3.3.3 Điều chế các loại cao

Bột nguyên liệu được cho vào các túi vải, sau đó chiết kiệt với ethanol bằng phương pháp ngâm dầm Sau khoảng 24 giờ mỗi lần ngâm, dịch chiết được lọc qua giấy lọc để loại bã Chiết nhiều lần cho đến khi chiết kiệt các chất trong bột nguyên liệu, thu được cao tổng ethanol Chiết lỏng-lỏng lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần lần lượt là PE, DC, EA Dịch chiết từng phân đoạn đem cô quay thu hồi dung môi để thu được các cao tương ứng

- Cô quay đuổi dung môi

Bỏ bã bột còn lại Cao tổng EtOH (1L)

- Chiết kiệt với PE

- Cô quay đuổi dung môi

Cao PE (10,3 g) Dịch chiết còn lại

- Chiết kiệt với DC

- Cô quay đuổi dung môi

Cao DC (8,4 g) Dịch chiết còn lại

- Chiết kiệt với EA

- Cô quay đuổi dung môi

24

3.3.4 Các phương pháp định tính thành phần hóa học

Tiến hành định tính các hợp chất thiên nhiên có trong các cao PE, DC, EA

và tủa ở phân đoạn EA nhằm đánh giá sơ bộ thành phần hóa học lá cây Me Các hợp chất được định tính là: alkaloid, flavonoid, steroid-triterpenoid, đường khử, saponin, tanin

3.3.4.1 Khảo sát sự hiện diện của alkaloid

a Thuốc thử Mayer

Hòa tan 1,36 g HgCl2 trong 60 mL nước cất và hòa tan 5 g KI trong 10

mL nước cất Trộn đều hai dung dịch trên và thêm nước cho đủ 100 mL, thu được thuốc thử Mayer Nhỏ vài giọt thuốc thử vào mẫu thử nếu có alkaloid sẽ xuất hiện kết tủa màu trắng hoặc vàng nhạt [44]

b Thuốc thử Wagner

Hòa tan 1,27 g I2 và 2 g KI trong 20 mL nước cất Thêm nước cho đủ 100

mL Nhỏ vài giọt thuốc thử Wagner vào ống nghiệm dịch chiết nếu có alkaloid thì sẽ xuất hiện tủa màu nâu [43]

3.3.4.2 Khảo sát sự hiện diện của flavonoid

a Tác dụng với H 2 SO 4 đậm đặc

Nhỏ vài giọt H2SO4 đậm đặc vào ống nghiệm chứa mẫu thử Nếu trong mẫu thử có chứa flavon và flavonol thì dung dịch xuất hiện màu vàng đậm đến màu cam và có phát huỳnh quang đặc biệt Mẫu thử có chứa chalcon, auron thì cho màu đỏ hoặc xanh dương-đỏ còn nếu mẫu thử có chứa flavanon thì có màu

từ cam đến đỏ [44]

b Tác dụng với dung dịch 1% NaOH/ etanol

Nhỏ dung dịch NaOH vào một dung dịch flavonoid hòa tan trong etanol,

sẽ có màu từ vàng đến cam-đỏ Nếu là flavon, isoflavon, isoflavanon, flavanon, chalcon, leucoantocyanidin sẽ có màu vàng Flavonol cho màu từ vàng đến cam Auron cho màu đỏ đến đỏ tím [44]

c Phản ứng Cyanidin của Wilstatter (phản ứng Shinoda)

Chuẩn bị hai ống nghiệm, cho vào mỗi ống 2mL cao chiết hòa tan trong methanol Ống 1 làm đối chứng Ống 2 cho thêm 1mL alcol tert-butil hoặc alcon isoamyl; 0,5 ml HCl đậm đặc; 3-5 hạt magnesium kim loại Đun nhẹ trong vài phút, sẽ xuất hiện màu ở lớp alcol phía trên Nếu cao chiết có chứa flavon,