PHÂN LẬP HỢP CHẤT TỪ CAO DICHLOROMETHANE CỦA CÂY CAM THẢO ĐẤT (SCOPARIA DULCIS LINN)

vii 2.3.3 Tổng hợp thành phần hóa học đã được nghiên cứu trên cây Cam thảo đất Scoparia dulcis L.. Trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu trên cây Cam thảo đất về thành phần h

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN

- -

BÙI MINH PHÚC

ĐỖ DUY PHÚC

PHÂN LẬP HỢP CHẤT TỪ CAO DICHLOROMETHANE CỦA CÂY CAM THẢO ĐẤT

(SCOPARIA DULCIS LINN)

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH: CỬ NHÂN HÓA DƯỢC

2015

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN

- -

BÙI MINH PHÚC

ĐỖ DUY PHÚC

PHÂN LẬP HỢP CHẤT TỪ CAO DICHLOROMETHANE CỦA CÂY CAM THẢO ĐẤT

(SCOPARIA DULCIS LINN)

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH: CỬ NHÂN HÓA DƯỢC

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

Ts TÔN NỮ LIÊN HƯƠNG

2015

Ts Tôn Nữ Liên Hương, Người Cô kính mến, dưới sự dìu dắt của Cô đã

giúp chúng em nhận thấy được rất nhiều khoảng trống trong kiến thức mà rất cần được trao dồi và bổ sung Cô đã tận tình truyền đạt kinh nghiệm, tiếp thêm nguồn động lực khi chúng em nản lòng Ngoài ra, Cô đã tạo cho chúng em mọi điều kiện thuận lợi cả về vật chất lẫn tinh thần để chúng em hoàn thành thật tốt khóa luận

PGs Ts Bùi Thị Bửu Huê, Ts Lê Thanh Phước, Ts Nguyễn Trọng Tuân, Bộ môn Hóa, Khoa Khoa Học Tự Nhiên, Trường Đại Học Cần Thơ đã

tạo điều kiện thuận lợi, giúp đỡ chúng em hoàn thành tốt luận văn này

Các anh chị, cùng các bạn bè phòng Hóa Hữu Cơ - Khoa Khoa Học Tự

Nhiên Trường Đại học Cần Thơ đã nhiệt tình giúp đỡ chúng em trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Cuối cùng, chúng em xin thành kính cảm ơn Ba Mẹ đã luôn động viên

cho chúng con về mặt tinh thần và vật chất

Xin chân thành cảm ơn !

ii

Trường Đại Học Cần Thơ Cộng Hòa Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam

Khoa Khoa Học Tự Nhiên Độc Lập - Tự Do - Hạnh Phúc

NHẬN XÉT ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

1 Cán bộ hướng dẫn: Ts Tôn Nữ Liên Hương

2 Đề tài: Phân lập hợp chất từ cao dichloromethane của cây Cam thảo đất

(Scoparia dulcis Linn)

3 Sinh viên thực hiện: Bùi Minh Phúc MSSV: B1203492

Đỗ Duy Phúc MSSV: B1203493 Lớp: Hóa Dược – Khóa: 38

4 Nội dung nhận xét:

a) Nhận xét về hình thức của LVTN:

b) Nhận xét về nội dung của LVTN (đề nghị ghi chi tiết và đầy đủ):

 Đánh giá nội dung thực hiện của đề tài:

c) Nhận xét đối với sinh viên tham gia thực hiện đề tài (ghi rõ từng nội dung

chính do sinh viên nào chịu trách nhiệm thực hiện nếu có):

2 Đề tài: Phân lập hợp chất từ cao dichloromethane của cây Cam thảo đất

(Scoparia dulcis Linn)

3 Sinh viên thực hiện: Bùi Minh Phúc MSSV: B1203492

Đỗ Duy Phúc MSSV: B1203493 Lớp: Hóa Dược – Khóa: 38

4 Nội dung nhận xét:

a) Nhận xét về hình thức của LVTN:

b) Nhận xét về nội dung của LVTN (đề nghị ghi chi tiết và đầy đủ):

 Đánh giá nội dung thực hiện của đề tài:

 Những vấn đề còn hạn chế:

c) Nhận xét đối với sinh viên tham gia thực hiện đề tài (ghi rõ từng nội dung chính do sinh viên nào chịu trách nhiệm thực hiện nếu có):

d) Kết luận, đề nghị và điểm:

Cần Thơ, ngày… tháng… năm 2014

Cán bộ phản biện

iv

TÓM TẮT

Nghiên cứu thành phần hóa học cây Cam thảo đất (Scoparia dulcis L.) mọc ở tỉnh An Giang Kết quả cho thấy từ phân đoạn cao chiết dichloromethane của cây Cam thảo đất phân lập được ba hợp chất lần lượt là 5,6,7,8,3',4'-hexamethoxyflavone (nobiletin), 5,7,8,4'-tetramethoxyflavone (tetra-O-methylisoscutellarein) và 6-methoxybenzoxazolin-2-one (coixol) Trong đó nobiletin và tetra-O-methylisoscutellarein lần đầu tiên được phân lập từ cây Cam thảo đất Cấu trúc của chúng được xác định bằng các phương pháp phổ hiện đại như ESI-MS, 1D-NMR và so sánh với tài liệu đã công bố

Từ khóa: Scoparia dulcis L., 5,6,7,8,3',4'-hexamethoxyflavone, tetramethoxyflavone, nobiletin, tetra-O-methylisoscutellarein, 6- methoxybenzoxazolin-2-one, coixol.

5,7,8,4'-v

ABSTRACT

Chemical constituents of Scoparia dulcis L growing in An Giang province was investigated The result showed that three compounds 5,6,7,8,3',4'-hexamethoxyflavone (nobiletin), 5,7,8,4'-tetramethoxyflavone (tetra-O-methylisoscutellarein) and 6-methoxybenzoxazolin-2-one (coixol) were isolated from the dichloromethane extract In which, nobiletin and tetra- O-methylisoscutellarein were firstly isolated from Scoparia dulcis L Their structures were elucidated by modern spectroscopic methods as ESI-MS, 1D- NMR and by comparsion to published data

Keywords: Scoparia dulcis L., 5,6,7,8,3',4'- hexamethoxyflavone, tetramethoxyflavone, nobiletin, tetra-O-methylisoscutellarein, 6- methoxybenzoxazolin-2-one, coixol.

5,7,8,4′-vi

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

TÓM TẮT iv

ABSTRACT v

DANH SÁCH BẢNG viii

DANH SÁCH HÌNH iix

DANH SÁCH PHỤ LỤC x

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT xi

CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU 1

1.1 LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI 1

1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 1

1.3 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU 1

1.3.1 Đối tượng nghiên cứu 1

1.3.2 Phạm vi nghiên cứu 2

1.4 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 2

1.5 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 2

1.6 Ý NGHĨA THỰC TIỄN VÀ KHOA HỌC 2

1.6.1 Ý nghĩa thực tiễn 2

1.6.2 Ý nghĩa khoa học 2

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 TỔNG QUAN THỰC VẬT 3

2.1.1 Giới thiệu cây Cam thảo đất 3

2.1.2 Nguồn gốc, phân bố và sinh thái 3

2.1.3 Phân loại khoa học 3

2.1.4 Mô tả thực vật 4

2.2 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ DƯỢC TÍNH CỦA CÂY CAM THẢO ĐẤT 5 2.2.1 Trong y học dân gian cổ truyền 5

2.2.2 Các hoạt tính sinh học của Cam thảo đất đã được nghiên cứu 5

2.3 TỔNG HỢP KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY CAM THẢO ĐẤT TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC 8

2.3.1 Các nghiên cứu trong nước 8

2.3.2 Các nghiên cứu ngoài nước 8

vii

2.3.3 Tổng hợp thành phần hóa học đã được nghiên cứu trên cây Cam thảo đất

(Scoparia dulcis L.) 9

CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM 20

3.1 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

3.1.1 Hóa chất 20

3.1.2 Thiết bị 20

3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

3.2.1 Phương pháp chiết xuất 21

3.2.2 Phương pháp phân lập các hợp chất 21

3.2.3 Phương pháp khảo sát và xác định cấu trúc của các hợp chất 21

3.3 THỰC NGHIỆM 21

3.3.1 Thu mẫu 21

3.3.2 Điều chế các loại cao 22

3.4 PHÂN LẬP, TINH CHẾ CÁC HỢP CHẤT TỪ CAM THẢO ĐẤT 24

3.4.1 Khảo sát phân đoạn cao chiết dichloromethane 24

3.4.2 Khảo sát phân đoạn SP1 24

3.4.3 Khảo sát phân đoạn SP1.1 25

3.4.4 Khảo sát phân đoạn SP1.3 25

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27

4.1 XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC VÀ ĐỊNH DANH HỢP CHẤT 27

4.1.1 Hợp chất CTD.DC01 27

4.1.2 Hợp chất CTD.DC02 29

4.1.3 Hợp chất CTD.DC03 31

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 33

5.1 KẾT LUẬN 33

5.2 KIẾN NGHỊ 33

TÀI LIỆU THAM KHẢO 34

PHỤ LỤC 37

viii

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 2.1 Chi tiết hoạt tính sinh học cây Cam thảo đất (S.dulcis) 7

Bảng 2.2 Thành phần hóa học đã công bố của loài Cam thảo đất (Scoparia dulcis L.) 10

Bảng 3.1 Kết quả sắc ký nhanh cột khô cao DC 24

Bảng 3.2 Kết quả sắc ký nhanh cột khô phân đoạn SP1 25

Bảng 4.1 Số liệu phổ 1D-NMR của CTD.DC01 () và nobiletin (#) 28

Bảng 4.2 Số liệu phổ 1D-NMR của CTD.DC02 () và tetra-O-methylisoscutellarein (#) 30

Bảng 4.3 Số liệu phổ 1D-NMR của CTD.DC03 () và coixol (#) 32

ix

DANH SÁCH HÌNH

Hình 2.1 Cây Cam thảo đất Scoparia dulcis L 4 Hình 2.2 Lá và hoa của Cam thảo đất Scoparia dulcis L 5

Hình 4.1 Cấu trúc hóa học của hợp chất DC01 (nobiletin) 28

Hình 4.2 Cấu trúc hóa học của hợp chất DC02 (tetra-O-methylisoscutellarein)

30

Hình 4.3 Cấu trúc hóa học của hợp chất DC03 (coixol) 32

Sơ đồ 3.1 Qui trình điều chế cao thô từ cây Cam thảo đất (S.dulcis) 23

x

DANH SÁCH PHỤ LỤC Phụ lục 1.1 Bản mỏng DC01 (trái) và DC02 (phải) trong các hệ giải ly khác

nhau 37

Phụ lục 1.2 Bản mỏng DC03 dưới đèn UV bước sóng 365 nm trong các hệ giải ly khác nhau 37

Phụ lục 2.1 Phổ ESI-MS của CTD.DC01 38

Phụ lục 2.2 Phổ 1H NMR của CTD.DC01 39

Phụ lục 2.3 Phổ 1H NMR giãn rộng của CTD.DC01 40

Phụ lục 2.4 Phổ 13C NMR của CTD.DC01 41

Phụ lục 2.5 Phổ 13C NMR giãn rộng CTD.DC01 42

Phụ lục 2.6 Phổ DEPT của CTD.DC01 43

Phụ lục 2.7 Phổ DEPT giãn rộng của CTD.DC01 44

Phụ lục 3.1 Phổ ESI-MS của CTD.DC02 45

Phụ lục 3.2 Phổ 1H-NMR của CTD.DC02 46

Phụ lục 3.3 Phổ 1H-NMR giãn rộng của CTD.DC02 47

Phụ lục 3.4 Phổ 13C-NMR của CTD.DC02 48

Phụ lục 3.5 Phổ 13C-NMR giãn rộng của CTD.DC02 49

Phụ lục 3.6 Phổ DEPT-NMR của CTD.DC02 50

Phụ lục 3.7 Phổ DEPT-NMR giãn rộng của CTD.DC02 51

Phụ lục 4.1 Phổ ESI-MS của CTD.DC03 52

Phụ lục 4.2 Phổ 1H-NMR của CTD.DC03 53

Phụ lục 4.3 Phổ 1H-NMR giãn rộng của CTD.DC03 54

Phụ lục 4.4 Phổ 13C-NMR của CTD.DC03 55

Phụ lục 4.5 Phổ 13C-NMR giãn rộng của CTD.DC03 56

Phụ lục 4.6 Phổ DEPT-NMR của CTD.DC03 57

Phụ lục 4.7 Phổ DEPT-NMR giãn rộng của CTD.DC03 58

xi

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

13C-NMR Carbon (13) Nuclear Magnetic Resonance

1D-NMR 1 Direction Nuclear Magnetic Resonance

1H-NMR Proton Nuclear Magnetic Resonance

ESI-MS Electrospray Ionization Mass Spectroscopy

GC - MS Gas chromatography–mass spectrometry

Việt Nam nằm trong vùng nhiệt đới với điều kiện khí hậu thuận lợi cho

sự phát triển của các loài thực vật Chính điều kiện đó, đã tạo nên một thảm thực vật phong phú và đa dạng Trong đó, có rất nhiều loại cây là nguồn dược liệu quý hiếm mà từ xưa ông cha ta đã biết dùng để chữa bệnh và được lưu truyền trở thành các bài thuốc dân gian

Trong số các nguồn dược liệu, cây Cam thảo đất (Scoparia dulcis L.) là

loài thực vật thân thảo đã được sử dụng thông dụng trong các bài thuốc dân gian không chỉ ở Việt Nam mà còn ở một số quốc gia như Trung Quốc, Nhật Bản, Ấn Độ, Braxin, Peru, [1]

Trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu trên cây Cam thảo đất về thành phần hóa học cũng như các hoạt tính sinh học và dược học của cây Tuy nhiên, nghiên cứu trong nước thì còn rất hạn chế Xuất phát từ thực tiễn trên, việc nghiên cứu và khảo sát thành phần hóa học của Cam thảo đất là vấn đề

đáng quan tâm nên chúng em đã chọn đề tài tốt nghiệp là “Phân lập hợp chất

từ cao dichloromethane của cây Cam thảo đất (Scoparia dulcis Linn)”

1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

Mục tiêu nghiên cứu của đề tài là phân lập và xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất từ cao dichloromethane của cây Cam thảo đất nhằm đóng góp thêm thông tin về thành phần hóa học của cây cũng như nguồn dược liệu phong phú của nước ta

1.3 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU

1.3.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là toàn bộ các bộ phận (rễ, thân, lá, hoa, quả,

hạt, ) của cây Cam thảo đất (Scoparia ducis L.) thuộc họ Scrophulariaceae

được thu hái ở tỉnh An Giang

2

1.3.2 Phạm vi nghiên cứu

Phân lập 3 hợp chất từ cao chiết dichloromethane của cây Cam thảo đất

(Scoparia dulcis Linn)

1.4 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU

Đề tài nghiên cứu được tiến hành thực hiện từ tháng 8/2015 đến tháng 12/2015 Tại phòng Thí nghiệm Hữu Cơ–Khoa Khoa Học Tự Nhiên, trường Đại học Cần Thơ

1.5 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

Thu nguyên liệu tại tỉnh An Giang Điều chế cao tổng methanol (Me) và các cao phân đoạn petroleum ether (PE), dichloromethane (DC), ethyl acetate

(EA) của cây Cam thảo đất (Scoparia dulcis L.)

Sử dụng các phương pháp thường quy trong nghiên cứu các hợp chất tự nhiên như sắc ký cột, sắc ký cột nhanh–khô với các hệ dung môi thích hợp, kết tinh lại, để phân lập 3 hợp chất từ cao dichloromethane

Phân tích tìm nghiệm phổ, so sánh với tài liệu tham khảo để giải đoán cấu trúc các hợp chất phân lập được

Viết báo cáo luận văn

1.6 Ý NGHĨA THỰC TIỄN VÀ KHOA HỌC

1.6.1 Ý nghĩa thực tiễn

Tìm hiểu về công dụng của cây Cam thảo đất trong y học cổ truyền Việt Nam Nghiên cứu nguồn nguyên liệu tự nhiên có tiềm năng ứng dụng làm thuốc

1.6.2 Ý nghĩa khoa học

Cung cấp thêm thông tin về đặc điểm nhận dạng, khu vực phân bố, phương pháp tách chiết, thành phần hóa học của cây Cam Thảo đất

3

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 TỔNG QUAN THỰC VẬT

2.1.1 Giới thiệu cây Cam thảo đất

Cam thảo đất có tên khoa học là Scoparia dulcis Linn Tùy theo từng

vùng miền mà Cam thảo đất có tên gọi khác nhau: Dã cam thảo, Cam thảo nam hay Thổ cam thảo [1,2]

Tên nước ngoài: Goat–weed, Scoparia–weed hay Sweet–broom (Anh), Vassourinha (Bồ Đào Nha), Typycha kuratu (Nhật Bản), Escobilla (Peru) [1-3]

2.1.2 Nguồn gốc, phân bố và sinh thái

Cam thảo đất (Scoparia dulcis L.) có khoảng 10 loài trên thế giới, phân

bố chủ yếu ở nhiệt đới Trung Mỹ, được thuần hóa trên tất cả các vùng nhiệt đới của thế giới Ở nước ta, cây mọc khắp nơi từ Bắc vào Nam Ở miền Nam Trung Quốc đặc biệt là ở vùng Quảng Tây, nhân dân cũng dùng cây này với tên Dã cam thảo Tại Ấn Độ, Malaixia, Thái Lan, Châu Mỹ đều có [1]

Là loại cây liên nhiệt đới, nên có thể sinh sống và mọc khắp nơi ở các vùng đất hoang, dọc bờ đường, trên các dãi cát của các con sông hoặc ven bờ ruộng Cây ưa ánh sáng ẩm và thường mọc thành đám ở các bãi sông, ruộng hoang, nương rẫy, Cam thảo đất sinh trưởng mạnh vào mùa hè Đến mùa thu, sau khi quả già thì tàn lụi Ngày nay, khi giá trị của cây Cam thảo đất được nâng cao, người ta có xu hướng trồng Cam thảo đất, thường được trồng vào mùa xuân và hè Cũng giống như các loại dược liệu khác, cây Cam thảo đất thường đào toàn cây luôn cả rễ, rửa sạch cát, có thể dùng tươi hoặc sấy khô dùng dần Nguồn Cam thảo đất ở Việt Nam khá phong phú và có thể khai thác

ở nhiều địa phương, đáp ứng nhu cầu làm thuốc hiện nay [2]

2.1.3 Phân loại khoa học [1-3]

4

2.1.4 Mô tả thực vật

Thân: cây thân thảo mọc thẳng, cao từ 30–80 cm, có cây cao 100 cm (ở

Thất Sơn), thân tròn, nhẵn, màu xanh, có 4–6 sọc lồi [1]

Lá: đơn, mọc đối hay mọc vòng ba lá một, phiến lá hình mác hay hình

trứng ngược, dài 1,5–3 cm, rộng 8–12 mm, mép lá nửa phía trên có răng cưa

to, phía dưới nguyên, không lông Phiến lá kéo dài, mặt trên sẫm, mặt dưới nhạt Không có lá kèm Gân lá hình lông chim lồi ở mặt dưới, 4–5 cặp gân phụ hơi lồi ở mặt dưới Cuống lá dài 5–7 mm [1]

Hoa: nhỏ, màu trắng, mọc riêng lẻ hay thành từng đôi ở nách lá Hoa gần

đều, lưỡng tính, mẫu 4, đôi khi gặp mẫu 5 Cuống hoa mảnh, dài 4–6 mm, màu xanh Lá đài 4, đôi khi 5 lá đài, màu xanh, hình bầu dục, dài khoảng 2,5

mm, có gân nổi ở mặt ngoài, mép có lông, tồn tại và đồng trưởng với quả Cánh hoa 4 dính nhau ở dưới thành ống rất ngắn; trên chia thành 4 phiến hình bầu dục, gần như đều nhau, dài khoảng 2 mm, uốn cong ngược ra bên ngoài khi hoa nở, nhiều lông màu trắng, dạng sợi, dài gần bằng nhị đính ở miệng ống tràng Hạt phấn hình bầu dục, có rãnh, 2 lá noãn ở vị trí trước–sau, dính liền thành bầu trên 2 ô, mỗi ô đựng nhiều noãn, đính noãn trung trụ, 1 vòi nhụy dài khoảng 1,5 mm đính ở đỉnh bầu Ra hoa vào tháng 5 đến tháng 7 [1,2]

Quả: nang nhỏ, hình cầu bên trong chứa nhiều hạt nhỏ [1]

Hình 2.1 Cây Cam thảo đất Scoparia dulcis L

5

Hình 2.2 Lá và hoa của Cam thảo đất Scoparia dulcis L

2.2 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ DƯỢC TÍNH CỦA CÂY CAM THẢO ĐẤT 2.2.1 Trong y học dân gian cổ truyền

Nhân dân nhiều vùng ở Việt Nam cũng như nhân dân vùng Quảng Tây (Trung Quốc) dùng thay vị Cam thảo bắc để chữa sốt, chữa say sắn độc và giải độc cơ thể Tại Malaixia, Cam thảo đất được dân gian dùng làm thuốc chữa

ho Người dân trên đảo Angti dùng rễ Cam thảo đất làm thuốc để chữa bệnh lậu, kinh nguyệt quá nhiều Ở Ấn Độ, cây được dùng để điều trị bệnh đái tháo đường nhưng có tác giả đã không công nhận công hiệu của thuốc này [1]

Amellin là một hợp chất chống đái tháo đường, dùng uống làm giảm đường huyết và các triệu chứng của bệnh đái tháo đường, tăng hồng cầu Cũng giống như insulin, amellin không làm hạ đường huyết dưới mức bình thường,

sự giảm lượng đường trong máu và nước tiểu diễn ra dần dần Nó làm tăng mức dự trữ chất kiềm bị hạ thấp ở người bệnh đái tháo đường và làm giảm hàm lượng sắt trong huyết thanh và các chất tạo cetone trong máu Nó ngăn cản sự tiêu hao mô và dẫn tới sự tiêu thụ tốt hơn protein trong chế độ ăn, làm giảm mỡ trong mô mỡ, thúc đẩy quá trình làm lành các vết thương [2]

2.2.2 Các hoạt tính sinh học của Cam thảo đất đã được nghiên cứu

Cam thảo đất được xem như một nguồn dược liệu quan trọng Do có thành phần hóa học đa dạng nên Cam thảo đất có nhiều hoạt tính sinh học đáng chú ý như hoạt tính kháng vi sinh vật, kháng nấm, kháng viêm, chống oxi hóa, điều hòa đường huyết và huyết áp, trên cả cao chiết và hoạt chất tinh khiết được phân lập từ cây Một số công trình nghiên cứu về hoạt tính sinh học đáng chú ý của cây trên thế giới:

Năm 1992, Toshimitsu Hayasi và các cộng sự của mình khảo sát hoạt

tính ức chế β-glucuronidase trên cao chiết ethanol 70% của Cam thảo đất

Ngoài ra, theo tài liệu công bố của Fulda, S vào năm 2008, betulinic acid trong Cam thảo đất được thử nghiệm trong điều trị ung thư, nó cũng có hoạt tính chống ung thư (ung thư não ác tính và ung thư xương), kháng virus (bao gồm cả virus HIV) [6]

Năm 2009, nghiên cứu về đánh giá hiệu quả làm giảm đường huyết của

scoparic acid D phân lập từ cao chiết ethanol của Scoparia dulcis L trên chuột

đái tháo đường của Latha, M và cộng sự [7]

Từ năm 2010 đến 2013, công bố của Beh, J.E và cộng sự về hoạt tính giảm đường huyết trong máu Tiến hành khảo sát khả năng làm giảm lượng

đường huyết của 10 phân đoạn từ cao chiết nước của Scoparia dulcis Kết quả

chỉ ra rằng phân đoạn 7 có hoạt tính ở nồng độ 50 µg/ml Phân đoạn 7 được phân tích bằng cách sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC

cho thấy có bốn hợp chất có hoạt tính: quercetin, p-coumaric acid, luteolin và

apigenin [8,9]

Năm 2011, Zulfiker, A.H và cộng sự tiến hành khảo sát hoạt tính kháng khuẩn trên các chủng vi khuẩn Gram (-) và Gram (+), kháng nấm (dựa trên đường kính vùng ức chế), gây độc tế bào trên cao chiết ethanol của Cam thảo đất Kết quả cho thấy, cao chiết ethanol có sự hiện diện của nhều flavonoid, alcaloid, tanin, carbohydrate, glycoside, Những thành phần này giúp Cam thảo đất có khả năng kháng khuẩn, kháng nấm Ngoài ra, những hợp chất terpenoid được phân lập từ cao ethanol cũng cho hiệu quả kháng khuẩn [10] Bên cạnh đó Tsai, J.S cùng cộng sự đã nghiên cứu khả năng kháng viêm của cao ethanol 70% và betulinic acid Cơ chế kháng viêm của cao chiết ethanol

và betulinic acid được cân nhắc liên quan đến sự ức chế interleukin-1β 1β), cyclooxygenase-2 (COX-2) và giảm mức độ malondialdehyde (MDA) và

(IL-NO, tăng hoạt tính của superoxide dismutase (SOD), glutathione peroxidase (GPx) và glutathione reductase (GRd) Betulinic acid là một trong những thành phần chính trong cao ethanol Qua đó cho thấy cao chiết ethanol, betulinic acid

có vai trò quan trọng trong việc điều trị các bênh do viêm gây ra [11]

7

Năm 2015, nhóm nhà nghiên cứu Wankupar, W đã đánh giá hoạt tính làm sạch gốc tự do trên hai loại cao chiết methanol, cao chiết nước của Cam

thảo đất (Scoparia dulcis L.) và xác định thành phần hóa học trong hai loại cao

chiết bằng phương pháp GC-MS Kết quả phân tích GC-MS cho thấy sự hiện diện của nhiều hợp chất khác nhau trong cao methanol như 2-hexyldecanoic

acid methyl ester (6,10%), dextromoramide (31,88%), (Z)-7-Hexadecenyl acetate (51,51%), cis-5-eicosenoic acid methyl ester (3,98%), 2-heptadecyl

imidazoline (3,85%) and methyl eicosanoate (2,64%) Trong cao chiết nước

còn chứa: methyl-2-pyrrolidone (4,83%), N 1-acetylspermine (15,59%), Lascorbic acid 2,6-dihexadecanoate (22,71%) Khả năng làm sạch gốc tự do trong cao methanol cao hơn cao nước [12]

-(+)-Từ những nghiên cứu trên cho thấy trong những năm qua các nhà khoa học trên thế giới đã và đang nghiên cứu rất nhiều về thành phần hóa học và các hợp chất có hoạt tính sinh học từ loài Cam thảo đất Ở trong nước, nghiên cứu về hoạt tính sinh học của Cam thảo đất còn rất hạn chế, chưa có tài liệu nghiên cứu nào được công bố chính thức

Bảng 2.1 Chi tiết hoạt tính sinh học cây Cam thảo đất (S.dulcis)

Nguồn gốc Hoạt tính nghiên cứu Mẫu thử nghiệm

Ấn Độ [7,12] Hạ đường huyết ở chuột Scoparic acid D

Chống oxi hóa Cao methanol và cao nước

Brazil [13]

Giảm đau Cao H2O Kháng viêm Cao ethanol (95%) và cao H2O Tăng huyết áp Cao H2O

Giảm huyết áp Cao chloroform Tăng hoạt tính của thuốc an thần

Barbiturate Cao ethanol (95%) và cao H2O

Bangladesh

[5,10,14]

Giảm đau, kháng viêm, lợi tiểu, tăng hoạt tính thuốc an thần Barbiturate

Phân đoạn có scoparinol Kháng khuẩn và kháng nấm Cao ethanol

Gây độc tế bào ung thư

iso-dulcinol, 4-epi-scopadulcic

acid B, dulcinol, dulcidiol, scopadiol

8

2.3 TỔNG HỢP KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY CAM THẢO ĐẤT TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC

2.3.1 Các nghiên cứu trong nước

Tình hình nghiên cứu về thành phần hóa học của loài Cam thảo đất trong nước vẫn còn là một đề tài khá mới, chưa được tìm hiểu và nghiên cứu nhiều Năm 2006, nhóm nhà khoa học Phan Minh Giang và cộng sự đã khảo sát thành phần hóa học và hoạt tính những diterpenoids loại scopadulan từ Cam thảo đất ở Việt Nam [19]

Qua các tài liệu, cho thấy trong nước chỉ nghiên cứu về tác dụng và hoạt tính sinh học của Cam thảo đất dựa vào các bài thuốc dân gian Nghiên cứu khảo sát thành phần hóa học của cây Cam thảo đất trong nước còn rất hạn chế

2.3.2 Các nghiên cứu ngoài nước

Trên thế giới, các công trình nghiên cứu về thành phần hóa học của cây được tiến hành rất sớm ở một số nước như Nhật Bản, Ấn Độ, Đài Loan, với nhiều công trình đã được công bố

Đài Loan [11] Kháng viêm (ức chế COX-2) Cao ethanol 70% và betulinic

acid

Nigeria [15]

Kháng khuẩn: Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis

Cao ethanol (95%)

Kháng nấm: Periconia species, Candida albicans

và trên chuột) Scopadulcic acid B

Hoa kỳ

[17,18]

Ức chế H+, K+–ATPase Scopadulcis acid B Chống sốt rét Scopadulcis acid A

9

Từ những năm 1966 đến 1969 các hợp chất thông thường như sitosterol, hexacosanol, D-mannitol, đã được tìm thấy trong cây Sau đó là các hợp chất đặc trưng của loài như dulciol, scropanol, dulciolone cũng được phân lập [20] Năm 1976, Chen, C.M và Chen, M.T đã công bố về hợp chất 6-methoxybenzoxazolinone và một loại triterpene là ifflaionic acid từ rễ cây Cam thảo đất Bài viết được đăng trên tạp chí Phytochemistry số 15 [20] Sau đó hàng loạt diterpene và triterpene được tìm thấy trong cây Như vào năm 1981, Mahato, S.B và cộng sự đã phân lập được friedelin, glutinol, alpha-amyrin, betulinic acid, ifflaionic acid và dulcioic acid [21] Ở Nhật Bản,

từ năm 1987 đến 1999, Hayashi, T và cộng sự đã công bố hàng loạt nghiên cứu về loại cây này và tìm thấy nhiều hợp chất như scopadulcic acid A, scopadulcic acid B, scoparic acid A, scopadulin, Các công bố này đều được đăng trên tạp chí Phytochemistry [22-25]

Năm 1988, Kawasaki, M và cộng sự đã phân lập 11 hợp chất flavonoid như apigenin, scutellarein, luteolin, linarin, scutellarin, và một số dẫn xuất của chúng từ dịch chiết ethanol 70% của cây Cam thảo đất [26]

Năm 2003, Ahsan, M và cộng sự xác định được cấu trúc của các

diterpene sau: 4-epi scopadulcis acid B, dulcidiol, iso-dulciniol, scopanodal

cùng với hai diterpene đã được biết thông qua các nghiên cứu trước bằng phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR [27]

Càng về những năm gần đây, thành phần hóa học của loài Cam thảo đất càng được nghiên cứu rộng rãi, hàng loạt những dẫn xuất glycoside của các flavone và bezoxazinone được tìm thấy trong cây, như các nghiên cứu của Safo, O.D và cộng sự (2009), Wu, W.H và cộng sự (2012) [28,29]

Còn nhiều nghiên cứu từ nhiều quốc gia khác về thành phần hóa học của loài cây này đã được công bố ở các nước như Bangladesh, Thái Lan, Hàn Quốc, cho thấy tầm quan trọng của việc tìm hiểu thông tin hóa học về một loại cây có nhiều hoạt tính sinh học và dược học như cây Cam thảo đất

(S.dulcis)

2.3.3 Tổng hợp thành phần hóa học đã được nghiên cứu trên cây Cam

thảo đất (Scoparia dulcis L.) [20-30]

Thông qua các tài liệu nghiên cứu cho thấy rằng thành phần hóa học

chính trong Cam thảo đất (Scoparia dulcis Linn) là benzoxazinoid, flavonoid

và terpenoid

10

Các hợp chất đã được phân lập từ loài Scoparia dulcis (L.) được trình

bày ở bảng sau:

Bảng 2.3 Thành phần hóa học đã công bố của loài Cam thảo đất (Scoparia dulcis L.)

(amu) Benzoxazinoid

C 15 H 19 O 9 N (357,3)

C 16 H 21 O 10 N (387,3)

C 15 H 10 O 6

(286,2 amu)

13

Cynaroside

C 21 H 20 O 11

(448,4 amu)

34

Betulinic acid

C 30 H 48 O 3

(456,7 amu)

37

Glutinol

C 30 H 50 O (426,7 amu)

41

Stigmasterol

C 29 H 48 O (412,7 amu)

20

CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM 3.1 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1.1 Hóa chất

Silica gel 60 (0,04–0,06 mm), bản mỏng tráng sẵn (Merck, F256)

Dung môi: methanol (Me), petroleum ether (PE), dichloromethane (DC),

chloroform (C), ethyl acetate (EA), n-Hexan (Hex), acetone (Ac)

Natri sulfate (Na2SO4) dùng để làm khan dung môi tránh có sự lẫn nước vào dung môi

Sulfuric acid (H2SO4) đậm đặc, vanillin dùng để pha thuốc thử hiện hình

và một số hóa chất thông dụng khác có trong phòng thí nghiệm

3.1.2 Thiết bị

Máy cô quay chân không Heidolph

Bản silica gel 60 F254 Merck tráng sẵn

Máy soi UV bước sóng 254 nm và 365 nm

Cân phân tích GR-200 và cân kỹ thuật GM 612

Tủ sấy Ecocell

Bếp điện dùng để nướng bản mỏng Blacker®

Cột sắc ký có đường kính (d) và chiều dài (l) như sau:

 Bình cô quay loại 50 mL, 250 mL, 500 mL, 1000 mL

Phễu, đũa thủy tinh, giấy lọc

Các thiết bị để ghi phổ:

Phổ MS ghi trên máy Agilent Technogies

Phổ 1H-NMR, 13C-NMR kết hợp với phổ DEPT-NMR 135 và 90, ghi trên máy cộng hưởng từ hạt nhân Bruker Avance ở tần số 500 MHz cho phổ

1H-NMR và 125 MHz cho phổ 13C-NMR

21

3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.2.1 Phương pháp chiết xuất [31]

Chiết là phương pháp dùng một dung môi (đơn hay hỗn hợp) để tách lấy một chất hay một nhóm các chất từ hỗn hợp cần nghiên cứu Các phương pháp chiết rắn-lỏng, lỏng-lỏng hoặc kết hợp cả hai thường được sử dụng Trong các phương pháp trên có thể ứng dụng kết hợp đun nóng (chiết nhiệt độ cao, chiết soxhlet), chiết có sự trợ giúp của vi sóng, sóng siêu âm, tùy nhu cầu cần lấy những hợp chất mà có thể dùng phương pháp thích hợp Phương pháp chiết rắn-lỏng sử dụng trong đề tài này là phương pháp chiết ngâm dầm (maceration) Kỹ thuật này không đòi hỏi thiết bị phức tạp, có thể dễ dàng thao tác với một lượng lớn mẫu Ngâm nguyên liệu trong một bình chứa thủy tinh hoặc bằng thép Phương pháp chiết lỏng-lỏng dùng điều chế các loại cao, sử

dụng bình lóng để lắc chiết

3.2.2 Phương pháp phân lập các hợp chất [31]

Các phương pháp chung được áp dụng để phân lập những hợp chất tinh khiết chủ yếu là các phương pháp sắc ký bao gồm sắc ký cột nhanh–khô, sắc

ký cột hở, sắc ký lớp mỏng để theo dõi quá trình sắc ký

Ngoài ra còn áp dụng một số phương pháp như kết tinh, kết tinh lại, để tinh chế các hợp chất

3.2.3 Phương pháp khảo sát và xác định cấu trúc của các hợp chất

Các chất tinh khiết phân lập ra sẽ được xác định những hằng số lý hoá đặc trưng như: màu sắc, Rf, tính tan, hấp thu quang phổ Sau đó để xác định cấu trúc các hợp chất sẽ sử dụng các phương pháp phổ hiện đại như: phổ khối lượng (Mass Spectroscopy), phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy, 1D-NMR) Phổ được đo tại phòng NMR-Viện Hóa học-Viện hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, số 18 Hoàng Quốc Việt, Quận Cầu Giấy, Hà Nội

3.3 THỰC NGHIỆM

3.3.1 Thu mẫu

Mẫu nguyên liệu 40 kg Cam thảo đất (rễ, thân, lá, hoa, quả, ) được thu hái tại tỉnh An Giang Sau đó tiến hành rửa sạch, loại bỏ phần hư, đem phơi gió đến khô Sau đó xay nhuyễn thành bột nguyên liệu với khối lượng m bằng

8 kg

22

3.3.2 Điều chế các loại cao

3.3.2.1 Điều chế cao methanol

Mẫu bột được cho vào các túi vải, buộc kín miệng và ngâm trong các bình thủy tinh lớn có nắp đậy Rót methanol vào bình cho đến xấp xỉ bề mặt của túi vải Giữ yên ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ, để cho dung môi xuyên thấm vào cấu trúc tế bào thực vật và hòa tan các hợp chất thiên nhiên Sau 24 giờ, dung dịch chiết được lọc ngang qua giấy lọc, cô quay thu hồi dung môi Lặp đi lặp lại nhiều lần cho đến khi chiết kiệt hết các chất trong nguyên liệu bột ta thu được cao MeOH dạng sệt khối lượng m1 bằng 1000 g Cao tổng hòa tan trong một lượng nước vừa phải xấp xỉ 1:1 (v/v) tiến hành phương pháp chiết lỏng-lỏng với các dung môi có độ phân cực tăng dần để được cao thành phần

Hiệu suất điều chế cao tổng: 1

3.3.2.2 Điều chế cao petroleum ether

Chuẩn bị bình lóng loại 500 mL, lấy mỗi lần khoảng 200 ml cao methanol

đã hòa vào nước cho vào bình lóng cùng 200 mL dung môi ether dầu hỏa Lắc đều, để yên bình lóng trên giá đỡ khoảng 15 phút, sau đó mở khóa tách lấy lớp

PE ở trên, lớp dưới tiếp tục chiết với PE cho đến khi màu của lớp PE phía trên nhạt dần và được kiểm tra bằng SKLM Nếu thấy không còn vết nữa ta tiến hành cô quay thu hồi dung môi thu được cao PE với khối lượng m2 = 80 g Hiệu suất chiết cao PE từ cao tổng: 2

2 1

80

1000

m H m

3.3.2.3 Điều chế cao dichloroform

Lấy lớp Me-H2O tiếp tục cho vào bình lóng với dung môi DC 200 mL/lần) Lắc đều và để yên trong vòng 15 phút, sau đó tách lớp DC ở dưới, kiểm tra lớp DC bằng SKLM cho đến khi không còn thấy vết, gom lớp DC lại

cô quay thu hồi dung môi thu được cao DC với m3 = 40 g

Hiệu suất chiết cao DC từ cao tổng: 3

3 1

40

1000

m H m

3.3.2.4 Điều chế cao ethyl acetate

Lấy lớp Me-H2O tiếp tục cho vào bình lóng với 200 mL dung môi EA Lắc đều và để yên trong vòng 15 phút, sau đó tách lớp EA ở trên, kiểm tra