KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG MỘT SỐ DƯỢC PHẨM CHỨA HOẠT CHẤT AZITHROMYCIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG CAO ÁP

Pha dung dịch thử: Hòa tan một lượng cân chính xác hỗn hợp thuốc tương đương 0,25 g azithromycin trong ethanol dùng 1 ml ethanol cho 2 mg azithromycin, pha loãng với nước cất để thu được

BỘ MÔN HÓA - -

NGUYỄN VĂN NAM

KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG MỘT SỐ DƯỢC PHẨM

CHỨA HOẠT CHẤT AZITHROMYCIN

BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG CAO ÁP

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH: CỬ NHÂN HÓA DƯỢC

Cần Thơ, 2015

BỘ MÔN HÓA - -

NGUYỄN VĂN NAM

KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG MỘT SỐ DƯỢC PHẨM

CHỨA HOẠT CHẤT AZITHROMYCIN

BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG CAO ÁP

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH: CỬ NHÂN HÓA DƯỢC

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN ThS NGUYỄN THỊ DIỆP CHI

Cần Thơ, 2015

LỜI CẢM ƠN



Qua thời gian dài học tập, rèn luyện trên giảng đường đại học Cần Thơ

và cuối cùng hoàn thành đề tài luận văn, em đã nhận được rất nhiều sự quan tâm và giúp đỡ của quý thầy cô, gia đình và bạn bè Để nhận được những kiến thức và kinh nghiệm quý báu làm hành trang cho công việc sau này, với lòng biết ơn sâu sắc:

Em xin cảm ơn cô Nguyễn Thị Diệp Chi đã giúp đỡ, hướng dẫn tận tình

em trong suốt thời gian thực hiện và hoàn thành đề tài luận văn

Xin được cảm ơn đến các thầy cô trường đại học Cần Thơ, đặc biệt các thầy cô bộ môn Hóa – khoa Khoa Học Tự Nhiên đã dạy dỗ tận tình, truyền đạt cho em những kiến thức chuyên môn quý báu

Em cũng xin chân thành cảm ơn đến ban Giám đốc Trung tâm Kiểm nghiệm Thuốc, Mỹ phẩm, Thực phẩm Thành phố Cần Thơ cùng với các anh chị kiểm nghiệm viên phòng Vật lý – đo lường Em xin gửi lời cảm ơn đến chị Cao Thúy Liễu đã giúp đỡ em trong quá trình thực hiện đề tài và cô Lê Thị Cẩm Thúy đã tạo mọi điều kiện tốt nhất để em hoàn thành đề tài này

Cuối cùng, xin được cảm ơn sâu sắc đến gia đình, tập thể các bạn lớp Hóa Dược 1 K38 cùng cô cố vấn học tập Tôn Nữ Liên Hương đã giúp đỡ, quan tâm và cùng em đi suốt chặng đường đại học vừa qua

Xin chân thành cảm ơn!

Cần Thơ, ngày tháng năm 2015

Nguyễn Văn Nam

Trường Đại Học Cần Thơ Cộng Hòa Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam Khoa Khoa Học Tự Nhiên Độc Lập - Tự Do - Hạnh Phúc

NHẬN XÉT ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

1 Cán bộ hướng dẫn: ThS Nguyễn Thị Diệp Chi

2 Đề tài: “Kiểm tra chất lượng một số dược phẩm chứa hoạt chất

azithromycin bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp”

3 Sinh viên thực hiện: Nguyễn Văn Nam MSSV: B1203472

Lớp: Hóa Dược 1 – Khóa: 38

4 Nội dung nhận xét:

a) Nhận xét về hình thức của LVTN:

b) Nhận xét về nội dung của LVTN (đề nghị ghi chi tiết và đầy đủ):

 Đánh giá nội dung thực hiện của đề tài:

 Những vấn đề còn hạn chế:

c) Nhận xét đối với sinh viên tham gia thực hiện đề tài (ghi rõ từng nội dung chính do sinh viên nào chịu trách nhiệm thực hiện nếu có):

d) Kết luận, đề nghị và điểm:

Cần Thơ, ngày… tháng… năm 2015

Cán bộ hướng dẫn

ThS Nguyễn Thị Diệp Chi

Trường Đại Học Cần Thơ Cộng Hòa Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam Khoa Khoa Học Tự Nhiên Độc Lập - Tự Do - Hạnh Phúc

NHẬN XÉT ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ PHẢN BIỆN

1 Cán bộ phản biện: ………

2 Đề tài: “Kiểm tra chất lượng một số dược phẩm chứa hoạt chất

azithromycin bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp”

3 Sinh viên thực hiện: Nguyễn Văn Nam MSSV: B1203472

Lớp: Hóa Dược 1 – Khóa: 38

4 Nội dung nhận xét:

a) Nhận xét về hình thức của LVTN:

b) Nhận xét về nội dung của LVTN (đề nghị ghi chi tiết và đầy đủ):

 Đánh giá nội dung thực hiện của đề tài:

 Những vấn đề còn hạn chế:

c) Nhận xét đối với sinh viên tham gia thực hiện đề tài (ghi rõ từng nội dung chính do sinh viên nào chịu trách nhiệm thực hiện nếu có):

d) Kết luận, đề nghị và điểm:

Cần Thơ, ngày… tháng… năm 2015

Cán bộ hướng dẫn

Đề tài nghiên cứu trên các mẫu thuốc được lấy trên thị trường gồm 3 lô thuốc viên nang Azissel của công ty Roussel Việt Nam và 3 lô thuốc viên nén bao phim Azithromycin của công ty Cổ phần Dược Hậu Giang

Quy trình định lượng azithromycin bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp với tính tuyến tính tốt (R = 0,9999), độ đúng đạt yêu cầu (tỷ lệ phục hồi 101,3%) và độ chính xác cao (RSD = 0,65%) Kết quả kiểm tra chất lượng 6 lô thuốc đều đạt yêu cầu theo từng tiêu chuẩn cơ sở của mỗi công ty

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN

BỘ MÔN HÓA HỌC

LỜI CAM KẾT

Tôi xin cam kết luận văn này được hoàn thành dựa trên các kết quả nghiên cứu của tôi và những kết quả nghiên cứu này chưa được dùng cho bất

cứ luận văn cùng cấp nào khác

Cần Thơ, ngày tháng năm 2015

Nguyễn Văn Nam

MỤC LỤC



Trang

LỜI CẢM ƠN i

TÓM TẮT iv

LỜI CAM KẾT v

DANH MỤC HÌNH ix

DANH MỤC BẢNG x

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT xi

DANH MỤC PHỤ LỤC xii

CHƯƠNG 1 PHẦN MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu đề tài 1

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

2.1 Tổng quan về azithromycin 2

2.1.1 Nguồn gốc, công thức cấu tạo 2

2.1.2 Tính chất vật lý, tính chất hóa học 2

2.1.3 Dược động học, cơ chế và tác dụng dược lý 3

2.1.4 Chỉ định, tác dụng không mong muốn 4

2.1.5 Liều lượng, cách dùng 4

2.1.6 Dạng bào chế, một số chế phẩm 4

2.2 Một số phương pháp xác định hoạt chất azithromycin 6

2.2.1 Các phương pháp định tính 6

2.2.2 Các phương pháp định lượng 7

2.3 Một số chỉ tiêu kiểm nghiệm thuốc viên nén và viên nang 13

2.3.1 Tính chất 13

2.3.2 Độ đồng đều khối lượng 13

2.3.3 Phép thử độ hòa tan của viên nén và viên nang 14

2.3.4 Định tính 16

2.3.5 Định lượng 16

2.4 Thẩm định quy trình phân tích 16

2.4.1 Kiểm tra tính phù hợp hệ thống 17

2.4.2 Tính tuyến tính 18

2.4.3 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng 19

2.4.4 Độ chính xác 20

2.4.5 Độ đúng 21

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

3.1 Thời gian, địa điểm 23

3.2 Thiết bị, hóa chất 23

3.3 Phương pháp nghiên cứu 25

3.3.1 Phương pháp lấy mẫu 25

3.3.2 Phương pháp phân tích 25

3.3.3 Phương pháp xử lý số liệu 25

3.4 Hoạch định thí nghiệm 26

3.5 Tiến hành thí nghiệm 26

3.5.1 Thử nghiệm các chỉ tiêu yêu cầu kỹ thuật của một số dược phẩm chứa hoạt chất azithromycin 26

3.5.1.1 Tính chất cảm quan 26

3.5.1.2 Độ đồng đều khối lượng 26

3.5.1.3 Độ hòa tan 27

3.5.2 Thẩm định quy trình định lượng hoạt chất azithromycin bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp 31

3.5.2.1 Khảo sát tính phù hợp hệ thống 31

3.5.2.2 Khảo sát tính tuyến tính 32

3.5.2.3 Khảo sát độ đúng 33

3.5.2.4 Khảo sát độ lặp lại 34

3.5.3 Định tính, định lượng các mẫu dược phẩm chứa hoạt chất

azithromycin 35

3.5.3.1 Mục đích 35

3.5.3.2 Thực hiện 35

3.5.3.3 Yêu cầu 37

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38

4.1 Kết quả thử nghiệm các chỉ tiêu yêu cầu kỹ thuật 38

4.1.1 Tính chất cảm quan 38

4.1.2 Độ đồng đều khối lượng 38

4.1.3 Độ hòa tan 39

4.2 Thẩm định quy trình định lượng hoạt chất azithromycin bằng phương pháp HPLC 40

4.2.1 Tính phù hợp hệ thống 40

4.2.2 Tính tuyến tính 41

4.2.3 Độ đúng 43

4.2.4 Độ lặp lại 44

4.3 Định tính, định lượng các mẫu dược phẩm chứa hoạt chất azithromycin 45

4.3.1 Định tính 45

4.3.2 Định lượng 46

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 47

5.1 Kết luận 47

5.2 Kiến nghị 47

TÀI LIỆU THAM KHẢO 48

PHỤ LỤC 50

DANH MỤC HÌNH



Trang Hình 2.1: Công thức cấu tạo của azithromycin 2 Hình 2.2: Một số chế phẩm chứa hoạt chất azithromycin có trên thị trường 5 Hình 3.1: Máy siêu âm, đuổi khí Sonica 3200EP 23

Hình 4.1: Đồ thị biểu diễn mối quan hệ tuyến tính giữa nồng độ chuẩn

DANH MỤC BẢNG



Trang Bảng 2.1: Pha dung dịch phương pháp tạo cặp ion chiết-đo quang 10 Bảng 2.2: Giới hạn cho phép chênh lệch khối lượng đối với viên nén 14 Bảng 2.3: Giới hạn cho phép chênh lệch khối lượng đối với viên nang 14 Bảng 2.4: Giới hạn cho phép về hàm lượng với thuốc viên nang, viên nén 16

Bảng 3.4: Yêu cầu kỹ thuật về chỉ tiêu tính chất cảm quan 26 Bảng 3.5: Cách thực hiện xác định độ đồng đều khối lượng 27 Bảng 3.6: Nồng độ chuẩn azithromycin khảo sát tính tuyến tính 32

Bảng 4.10: Kết quả định tính hoạt chất azithromycin 45 Bảng 4.11: Kết quả định lượng hoạt chất azithromycin 46

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT



Abs Absorbance – Độ hấp thụ quang

As Asymmetry – Tính bất đối xứng

CTCP DHG Công ty cổ phần Dược Hậu Giang

DĐVN IV Dược điển Việt Nam IV (2009)

LOD Limit of detection – Giới hạn phát hiện

LOQ Limit of quantification – Giới hạn định lượng

N Number of Theoritical Plates – Số đĩa lý thuyết

NT Nguyên trạng

P Độ pha loãng

RSD Relative Standard Deviation – Độ lệch chuẩn tương đối

SD Standard Deviation – Độ lệch chuẩn

Spic Diện tích pic

TCCS Tiêu chuẩn cơ sở

TR Retention time – Thời gian lưu

TT Thuốc thử

UV -Vis Ultraviolet -Visible spectroscopy – Quang phổ tử ngoại khả kiến

DANH MỤC PHỤ LỤC



Trang

Phụ lục 4: Sắc ký đồ định tính và định lượng mẫu 59

CHƯƠNG 1 PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Ngày nay, nhu cầu sử dụng các chế phẩm kháng sinh để điều trị bệnh là rất phổ biến Sự ra đời của nhiều dòng kháng sinh mạnh, phổ rộng như cephalosporin, macrolid, quinolon, phenicol…là thành tựu vĩ đại của y học, nó

đã đem lại hiệu quả cao trong điều trị nhiễm khuẩn Tuy nhiên, các thuốc kháng sinh giả, thuốc không đạt chất lượng vẫn còn lưu hành trên thị trường

Do đó, để bảo đảm chất lượng và nâng cao hiệu quả sử dụng kháng sinh thì công tác kiểm tra chất lượng các kháng sinh là rất quan trọng

Azithromycin được phát hiện vào năm 1980, là một kháng sinh macrolid thế hệ 2 Thuốc hấp thu nhanh và đạt nồng độ trong tế bào cao hơn trong huyết tương (từ 10-100 lần), vì vậy azithromycin được điều trị nhiễm khuẩn nội bào tốt[1] Bên cạnh đó, công tác kiểm tra chất lượng các chế phẩm kháng sinh chứa hoạt chất azithromycin trên thị trường là cần thiết và góp phần đảm bảo

an toàn và chất lượng thuốc đến người sử dụng

Hiện nay trên thế giới cũng như tại Việt Nam, có một số phương pháp phổ biến để định lượng hoạt chất azithromycin như phương pháp HPLC, phương pháp vi sinh vật, phương pháp quang phổ huỳnh quang,… Tuy nhiên, việc áp dụng phương pháp định lượng bằng HPLC là hợp lý vì đây là phương pháp có phạm vi ứng dụng rộng rãi, độ nhạy cao, khả năng phân tích tốt và rất phù hợp với điều kiện phòng kiểm nghiệm

Với những vấn đề trên, đề tài “Kiểm tra chất lượng một số dược phẩm chứa hoạt chất azithromycin bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp” được thực hiện Đề tài tiến hành kiểm tra các chỉ tiêu yêu cầu kỹ thuật và thẩm định quy trình phân tích azithromycin bằng HPLC để khẳng định phương pháp này phù hợp với tiêu chuẩn đã quy định

1.2 Mục tiêu đề tài

Kiểm tra một số chỉ tiêu yêu cầu kỹ thuật đối với các dược phẩm chứa hoạt chất azithromycin

Thẩm định phương pháp định lượng hoạt chất azithromycin bằng HPLC

Áp dụng quy trình vừa thẩm định để định tính và định lượng hoạt chất azithromycin trong một số dược phẩm có trên địa bàn thành phố Cần Thơ

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan về azithromycin

2.1.1 Nguồn gốc, công thức cấu tạo [1]

Azithromycin là một kháng sinh macrolid thế hệ 2, được bán tổng hợp từ erythromycin A (chứa vòng lacton 15 cấu tử), được phát hiện vào năm 1980 Công thức phân tử: C38H72N2O12

Phân tử lượng: 749,0

Công thức cấu tạo:

Hình 2.1: Công thức cấu tạo của azithromycin Danh pháp:

3-O-methyl-α-L-ribo-hexopyranosyl)oxy]-2-ethyl-3,4,10-trihydroxy-

(2R,3S,4R,5R,8R,10R,11R,12S,13S,14R)-13-[(2,6-Dideoxy-3-C-methyl-

3,5,6,8,10,12,14-heptamethyl-11-[[3,4,6-trideoxy-3-(dimethylamino)-β-D-xylo-hexopyranosyl]oxy]-1-oxa-6-azacyclopentadecan-15-one

2.1.2 Tính chất vật lý, tính chất hóa học

2.1.2.1 Tính chất vật lý [2]

- Dạng bột màu trắng (hoặc trắng ngà), không mùi, vị đắng

- Năng suất quay cực từ -45°C đến -49°C (dung dịch 20 mg/ml ethanol)

- Không tan trong nước, tan trong dung môi hữu cơ: methanol, ethanol, aceton, diethyl ether, chloroform và dung dịch acid hydrocloric loãng

2.1.2.2 Tính chất hóa học [3],[4]

- Tính base: do các osamin (đường amin) tạo ra, pKa = 8,74

- Tạo muối dễ tan trong nước với các acid vô cơ và hữu cơ

- Phản ứng màu: với các acid HCl, H2SO4 đậm đặc cho màu nâu đỏ (do

sự hiện diện của phần đường 2-desoxy)

- Hấp thụ UV: do có vòng lacton có nhiều dây nối ∆ sẽ hấp thụ ánh sáng ở vùng tử ngoại xa

2.1.3 Dược động học, cơ chế và tác dụng dược lý

2.1.3.1 Dược động học [5]

Hấp thu: Azithromycin hấp thu nhanh và có sinh khả dụng đường uống khoảng 40% Nồng độ thuốc trong tế bào cao hơn trong huyết tương, vì vậy dùng điều trị vi khuẩn nội bào tốt Thức ăn làm giảm hấp thu thuốc

Phân bố: Thuốc được phân bố rộng khắp cơ thể, chủ yếu trong các mô như: phổi, amidan, tiền liệt tuyến, bạch cầu hạt và đại thực bào , cao hơn trong máu nhiều lần Tuy nhiên, nồng độ thuốc trong hệ thống thần kinh trung ương rất thấp

Chuyển hóa: Một lượng nhỏ azithromycin bị khử methyl trong gan, và được thải trừ qua mật ở dạng không biến đổi và một phần ở dạng chuyển hóa Thải trừ: Khoảng 6% liều uống thải trừ qua nước tiểu trong vòng 72 giờ dưới dạng không biến đổi

Cơ chế tác dụng: Azithromycin gắn kết với tiểu đơn vị 50S của ribosom

vi khuẩn gây bệnh, qua đó ức chế quá trình tổng hợp protein của chúng

2.1.4 Chỉ định, tác dụng không mong muốn

2.1.4.1 Chỉ định [5]

Azithromycin được chỉ định dùng trong các trường hợp nhiễm khuẩn do các vi khuẩn nhạy cảm với thuốc như: nhiễm khuẩn đường hô hấp dưới (viêm phế quản, viêm phổi, nhiễm khuẩn da và mô mềm, viêm tai giữa), đường hô hấp trên (viêm xoang, viêm họng, viêm amidan), nhiễm khuẩn đường sinh dục

chưa biến chứng do Chlamydia trachomatis hoặc Neisseria gonorrhoeae

không đa kháng (vi khuẩn cơ hội ở bệnh nhân nhiễm HIV/AIDS)

2.1.4.2 Tác dụng không mong muốn [5]

Azithromycin được dung nạp tốt, tỷ lệ tác dụng không mong muốn thấp Hay gặp nhất là rối loạn tiêu hóa với các triệu chứng như buồn nôn, đau bụng,

co cứng cơ bụng, nôn, đầy hơi, tiêu chảy nhưng thường nhẹ và ít xảy ra hơn so với dùng erythromycin

Ảnh hưởng thính giác: sử dụng lâu dài ở liều cao, azithromycin có thể làm giảm sức nghe có hồi phục ở một số người bệnh

2.1.5 Liều lượng, cách dùng [5]

- Dùng 1 lần mỗi ngày, uống 1 giờ trước bữa ăn hoặc 2 giờ sau khi ăn

- Người lớn: Ngày đầu tiên uống 1 liều 500 mg, và dùng tiếp 4 ngày nữa với liều đơn 250 mg/ngày

- Trẻ em: Liều gợi ý cho trẻ em ngày đầu tiên là 10 mg/kg thể trọng và tiếp theo là 5 mg/kg mỗi ngày, từ ngày thứ 2 đến ngày thứ 5, uống một lần mỗi ngày

- Viên nén và viên nén bao phim tương đương azithromycin 125 mg,

500 mg; viên nén phân tán tương đương azithromycin l00 mg

2.1.6.2 Một số chế phẩm

Một số dạng chế phẩm chứa hoạt chất azithromycin trên thị trường như: viên nén bao phim Azithromycin 250, viên nang Azissel ® 250, thuốc bột pha

hỗn dịch uống Azithromycin 200, viên nang Azithrox 250…

Viên nén bao phim Azithromycin 250 Viên nang Azissel ®

250

Thuốc bột pha hỗn dịch uống

Azithromycin 200

Viên nang Azicine

Viên nang Azithrox 250 Hỗn dịch thuốc Macsure-200

Hình 2.2: Một số chế phẩm chứa hoạt chất azithromycin có trên thị trường

2.2 Một số phương pháp xác định hoạt chất azithromycin

2.2.1 Các phương pháp định tính

2.2.1.1 Phương pháp quang phổ hồng ngoại IR [8]

Nguyên tắc

Chuẩn bị chất thử và chất đối chiếu theo cùng một quy trình và ghi phổ

từ 4000 cm-1 đến 670 cm-1 trong những điều kiện như nhau Cực tiểu độ truyền qua (hay cực đại hấp thụ) trong phổ của chất thử và chất đối chiếu phải tương ứng về vị trí và cường độ

Cách tiến hành

Tiến hành nghiền 1 mg đến 2 mg chất thử với 300 mg đến 400 mg bột mịn kali bromid hoặc kali clorid đã sấy khô Lượng này thường đủ để tạo một viên nén có đường kính 13 mm và cho phổ có cường độ phù hợp Nghiền hỗn hợp cẩn thận và rải đều nó trong một khuôn thích hợp Nén khuôn có hỗn hợp chất thử tới áp suất khoảng 800 MPa trong điều kiện chân không Đặt chất thử trên tấm thali bromo-iodid hoặc trên tấm phẳng khác phù hợp sao cho có sự tiếp xúc đồng đều

Nếu so sánh phổ có sự sai khác, có thể tiến hành theo kỹ thuật sau: Tiến hành pha mẫu thử và mẫu chuẩn đối chiếu trong dung dịch methylen clorid nồng độ 0,9%

2.2.2 Các phương pháp định lượng

Hiện nay, có nhiều phương pháp định lượng hoạt chất azithromycin trong dược phẩm như: phương pháp vi sinh vật, phương pháp HPLC, phương pháp tạo cặp ion chiết-đo quang và phương pháp quang phổ huỳnh quang

2.2.2.1 Phương pháp vi sinh vật [9][10]

Nguyên tắc

Phương pháp khuếch tán dùng môi trường thạch dựa vào sự khuếch tán của kháng sinh từ ống trụ qua lớp thạch đặc ở đĩa Petri vào khoảng phát triển của vi sinh vật tạo ra một vòng ức chế hoàn toàn xung quanh nơi chứa (ống trụ) dung dịch kháng sinh Đo đường kính vòng vô khuẩn

Cách tiến hành

Chuẩn bị dung dịch đệm phosphat pH 6,0 (Hòa tan 8,0 g KH2PO4 và 2,0

g K2HPO4 trong 1000 ml nước cất Tiệt trùng ở 121°C trong 30 phút)

Tạo môi trường nuôi cấy vi sinh: Hòa tan 6 g penton, 1,5 g cao thịt bò và

6 g cao nấm men trong một lượng nước Thêm 13-14 g thạch và đun nóng, lọc Hòa tan 1 g glucose vào hỗn hợp thu được và pha loãng với 1000 ml nước Tiệt khuẩn, chỉnh pH từ 6,5-6,6 Đặt môi trường này vào ống thủy tinh hay bình nón Tiệt trùng ở 115°C trong 30 phút và bảo quản ở nhiệt độ 4°C

Pha dung dịch chuẩn: Hòa tan một lượng chuẩn azithromycin trong acid hydrocloric 0,01 M và pha loãng thành dung dịch chuẩn azithromycin nồng độ

10 mg/ml Lấy một lượng chính xác dung dịch trên và pha loãng với dung dịch đệm phosphat thành nồng độ 1 μg/ml Pha loãng với nước muối sinh lý để được nồng độ 0,125 μg/ml

Pha dung dịch thử: Hòa tan một lượng cân chính xác hỗn hợp thuốc tương đương 0,25 g azithromycin trong ethanol (dùng 1 ml ethanol cho 2 mg azithromycin), pha loãng với nước cất để thu được dung dịch có nồng độ 1 mg/ml

Tạo dịch huyền phù vi khuẩn: Cấy vi khuẩn trên mặt thạch nghiêng và ủ

ở 26-27°C trong 24 giờ Trước khi sử dụng cần tiệt trùng bằng dung dịch natri clorid 0,9%

Đổ 15-20 ml môi trường nuôi cấy vi sinh lên đĩa Petri có đường kính 8

cm hoặc 10 cm và trải đều ở mặt đáy của đĩa Đặt đĩa lên một nền phẳng và để môi trường tạo thành lớp phủ dưới đáy Chuyển 10-15 ml môi trường nuôi cấy

vi sinh đến ống thử đã đun ở 50°C Thêm 300 μl 0,5-1,5% dịch huyền phù vi

khuẩn và trộn đều Đổ một lượng hỗn hợp lên đĩa Petri trải với lớp phủ dưới đáy Đặt đĩa lên một nền phẳng và để nguội Đặt những ống trụ vô trùng (đường kính trong 6-8 mm, cao 10-15 mm, bề dày thành 1-2 mm) đều và chiếm khoảng cách bằng nhau trên mỗi đĩa Petri Thêm từng giọt dung dịch mẫu thử, dung dịch đệm và dung dịch chuẩn lên những ống trụ riêng biệt Ủ những đĩa Petri ở 37°C trong 18-22 giờ Dùng dụng cụ đo có độ chính xác tối thiểu 0,1 mm để đo đường kính vùng ức chế tạo bởi các nồng độ khác nhau của chuẩn và thử

Đánh giá kết quả

Đo đường kính vòng vô khuẩn, kết quả khả quan khi đường kính vòng

vô khuẩn của dung dịch thử lớn hơn của dung dung dịch chuẩn

Thử nghiệm được tính toán dựa trên phân tích thống kê bằng mô hình song song tuyến tính và bằng phương pháp phân tích hồi quy Có thể định lượng một số chủng vi khuẩn:

2.2.2.2 Phương pháp quang phổ huỳnh quang [4]

Nguyên tắc

Azithromycin là một chất không phát huỳnh quang, để tiến hành định lượng, tiến hành làm phản ứng tạo chất phát huỳnh quang Dung dịch Ce(IV) phản ứng với azithromycin tạo thành Ce(III), Ce(III) tạo thành cho huỳnh quang ở bước sóng phát xạ 𝜆𝑒𝑥 254 nm và bước sóng kích thích 𝜆𝑒𝑚 374 nm

Lấy 1 ml dung dịch chuẩn (hoặc dung dịch thử) nồng độ 30 ng/ml vào ống nghiệm Thêm vào 1 ml dung dịch Ce(IV) 0,004 M Lắc kỹ trong vòng 30 giây sau đó đem đun cách thủy ở 80°C trong thời gian 80 phút Sau đó làm lạnh, pha loãng dung dịch sau phản ứng vừa đủ vào bình 100 ml, dung môi nước cất 2 lần Đem dung dịch thu được đi đo cường độ huỳnh quang

Dung dịch so sánh là mẫu trắng được chuẩn bị song song với mẫu thử, chỉ không chứa chất chuẩn phân tích

Tiến hành đo cường độ huỳnh quang của dung dịch thu được tại 𝜆𝑒𝑥 254

Ft, Fc: Cường độ huỳnh quang của dung dịch thử, dung dịch chuẩn

MTB: Khối lượng trung bình viên (g)

mt: Lượng bột thuốc đem định lượng (g)

Nhận xét

Phương pháp có ưu điểm là quy trình đơn giản, dễ thực hiện, độ nhạy của phương pháp cao và thời gian định lượng nhanh chóng Tuy nhiên, phương pháp đòi hỏi thao tác thực hiện phải chính xác và cẩn thận, hóa chất đòi hỏi tinh khiết cao, có thể gây sai số trong quá trình làm phản ứng để tạo chất có khả năng phát huỳnh quang và hỗn hợp nhiều thành phần không thể định lượng được đồng thời

2.2.2.3 Phương pháp tạo cặp ion chiết-đo quang (phương pháp acid màu) [1]

Nguyên tắc

Bromocresol xanh là một acid hữu cơ (pKa = 4,9), trong môi trường nước phân ly tạo ra anion và proton H+ Azithromycin là một base hữu cơ (pKa = 8,4), trong môi trường nước sẽ kết hợp với proton H+ (tạo ra bởi bromocresol xanh) thành cation mới, cation này sẽ kết hợp với anion (do bromocresol xanh phân ly ra) tạo thành một cặp ion azithromycin-bromocresol xanh ở môi trường đệm pH 4,6 Cặp ion này không tan trong nước nhưng tan

trong dung môi hữu cơ, do vậy dùng chloroform để chiết Đo độ hấp thụ của dung dịch ở bước sóng cực đại là 417 nm để xác định hàm lượng azithromycin trong chế phẩm

Cách tiến hành

Lựa chọn acid màu thích hợp: dung dịch bromocresol

Môi trường tạo cặp ion: dung dịch đệm acetat pH 4,6 (hòa tan 5,4 g natri acetat (TT) trong 50 ml nước, thêm 2,4 g acid acetic loãng (TT) và thêm nước vừa đủ 100 ml Điều chỉnh pH nếu cần)

Dung môi chiết: chloroform

Khoảng nồng độ chất màu: tương ứng với azithromycin trong khoảng từ 5-20 μg/ml

Dung dịch chuẩn: dung dịch azithromycin chuẩn trong ethanol 96°, nồng

độ 0,25 mg/ml

Dung dịch thử: cân 1 lượng bột viên tương ứng với 25 mg azithromycin cho vào bình định mức 100 ml, thêm khoảng 70 ml ethanol 96°, siêu âm để hòa tan Thêm ethanol 96° vừa đủ đến vạch, lọc, bỏ 20 ml dịch lọc đầu Dùng

2 bình gạn, lần lượt cho từng bình như Bảng 2.1

Bảng 2.1: Pha dung dịch phương pháp tạo cặp ion chiết-đo quang

Thuốc thử Mẫu trắng

(ml)

Mẫu chuẩn (ml)

Mẫu thử (ml)

đủ, lắc đều, lọc qua phễu lọc có 1 g natri sulfat khan

Đo độ hấp thụ tại bước sóng 417 nm

Đánh giá kết quả

Hàm lượng (%) của hoạt chất azithromycin trong 1 viên thuốc được tính theo công thức sau:

𝐴𝑡 × 𝑚 𝑐 × 𝑃̅ × 𝐶

𝐴𝑐× 𝑚𝑡 × 𝑎 × 100 Trong đó:

At, Ac: Độ hấp thụ của dung dịch thử, dung dịch chuẩn

C: Hàm lượng chất chuẩn (%)

𝑃̅: Khối lượng trung bình viên (g)

mt: Lượng bột thuốc đem định lượng (g)

mc: Lượng cân của azithromycin chuẩn (g)

a: Hàm lượng hoạt chất ghi trên bao bì (g/viên)

Nhận xét

Phương pháp tạo cặp ion chiết-đo quang có độ chính xác cao, tiến hành đơn giản, kỹ thuật không quá phức tạp, nhưng tính đặc hiệu chưa cao khi không định lượng được azithromycin trong chế phẩm đa thành phần, vì có thể ảnh hưởng của các thành phần khác Kết quả phụ thuộc rất nhiều vào thao tác của kiểm nghiệm viên, yêu cầu phải có tay nghề ổn định

2.2.2.4 Phương pháp sắc ký lỏng cao áp

a Định lượng azithromycin theo dược điển Việt Nam IV [8]

Điều kiện sắc ký

Cột thép không gỉ (25 cm×4,6 mm) được nhồi pha tĩnh B (5 μm)

Pha động: Hỗn hợp methanol – nước – ammoniac đậm đặc (80:19,9:0,1) Detector quang phổ tử ngoại đặt ở bước sóng 215 nm

Tốc độ dòng: 1,5 ml/phút

Thể tích tiêm: 20 μl

Cách tiến hành

Dung dịch chuẩn: Hòa tan một lượng azithromycin chuẩn trong pha động

để thu được dung dịch có nồng độ azithromycin khoảng 1,0 mg trong 1 ml

Dung dịch thử: Cân chính xác một lượng bột viên tương ứng với khoảng

50 mg azithromycin vào bình định mức 50 ml, thêm 30 ml pha động và lắc siêu âm 15 phút Pha loãng bằng pha động vừa đủ đến vạch, lắc đều, lọc Tiêm riêng biệt dung dịch thử và dung dịch chuẩn

Hàm lượng (mg) azithromycin trong một viên được tính theo công thức sau:

𝑆𝑡 × 𝑚 𝑐 × 𝐶 × 𝑃𝑡× 𝑀𝑚

𝑆𝑐× 𝑚𝑡× 𝑃𝑐

Trong đó:

St, Sc: Diện tích pic azithromycin của dung dịch thử, dung dịch chuẩn C: Hàm lượng phần trăm chất chuẩn

Mm: Khối lượng trung bình bột thuốc (mg)

mt: Lượng bột thuốc đem định lượng (mg)

mc: Lượng cân của azithromycin chuẩn (mg)

Pt, Pc: Độ pha loãng của dung dịch thử và dung dịch chuẩn

b Định lượng azithromycin với pha động: dung dịch đệm pH 6,5 – Acetonitril – nước (10:35:55) [11]

Dung môi hòa tan: Acetonitril – nước (40:60)

Pha động: Dung dịch đệm pH 6,5 – Acetonitril – nước (10:35:55)

(Pha dung dịch đệm pH 6,5: Hòa tan 230,88 g dikali hydrophosphat vào

6000 ml nước, điều chỉnh về pH 6,5±0,1 bằng acid phosphoric Lọc bằng giấy lọc 0,45 μm và khử khí bằng bể siêu âm)

Cách tiến hành

Dung dịch thử: Cân khối lượng bột thuốc đã nghiền thành bột mịn tương ứng với 100 mg azithromycin cho vào bình định mức 100 ml Thêm 70 ml dung môi hòa tan, khuấy trên máy khuấy từ trong 30 phút và thêm hỗn hợp dung môi hòa tan vừa đủ đến vạch, lắc đều Lấy 10 ml đem ly tâm và lọc phần dịch lọc trong qua giấy lọc 0,45 μm

Dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng 50 mg azithromycin chuẩn cho

và bình định mức 50 ml Thêm 40 ml dung môi hòa tan, khuấy trên máy khuấy

từ trong 30 phút và thêm hỗn hợp dung môi hòa tan vừa đủ đến vạch, lắc đều Lọc qua giấy lọc 0,45 μm

Tiêm lần lượt dung dịch chuẩn và dung dịch thử

Hàm lượng azithromycin (%) trong một viên so với hàm lượng ghi trên nhãn (250 mg) được tính theo công thức sau:

𝑆𝑡 × 𝑚 𝑐× 0,8 × 𝐶 × 𝑀𝑚

𝑆𝑐× 𝑚𝑡Trong đó:

St, Sc: Diện tích pic azithromycin của dung dịch thử, dung dịch chuẩn C: Hàm lượng chất chuẩn (%)

Mm: Khối lượng trung bình bột thuốc trong nang (mg)

mt: Lượng bột thuốc đem định lượng (mg)

mc: Lượng cân của azithromycin chuẩn (mg)

Nhận xét

Tuy phương pháp HPLC đòi hỏi thiết bị đắt tiền, dung môi khá tốn kém nhưng đây là phương pháp phân tích hiện đại, tiến hành nhanh, chuẩn bị đơn giản Phương pháp này có sự chọn lọc, ổn định cao, có thể áp dụng để định tính, định lượng các hoạt chất trong hỗn hợp mà không cần chiết tách

Hơn nữa, phương pháp HPLC pha đảo với detector UV rất hay sử dụng

để phân tích các hợp chất phân cực và hấp thụ UV Với điều kiện sẵn có tại phòng kiểm nghiệm, đề tài đặt vấn đề nghiên cứu thẩm định quy trình định lượng azithromycin bằng phương pháp HPLC theo DĐVN IV

2.3 Một số chỉ tiêu kiểm nghiệm thuốc viên nén và viên nang

2.3.1 Tính chất [8],[12]

Thể chất, màu sắc, mùi phải đạt theo yêu cầu của chuyên luận riêng Viên nang: Nang cứng hoặc nang mềm chứa bột hoặc cốm hoặc chất lỏng

Viên nén: thường có dạng hình trụ dẹt, hai đáy phẳng hoặc cong, có thể khắc chữ, ký hiệu hoặc rãnh Cạnh và thành của viên lành lặn Màu sắc đồng nhất

Cách thử: thử bằng cảm quan

2.3.2 Độ đồng đều khối lượng

Phép thử độ đồng đều khối lượng dùng để xác định độ đồng đều phân liều của chế phẩm, khi không có yêu cầu thử độ đồng đều hàm lượng

2.3.2.1 Áp dụng cho thuốc viên nén [12]

Cách xác định

Cân chính xác 20 viên bất kỳ, tính khối lượng trung bình của viên Cân khối lượng của từng viên và so sánh với khối lượng trung bình, tính độ lệch theo tỷ lệ phần trăm của khối lượng trung bình từ đó tính ra khoảng giới hạn của giá trị trung bình

Yêu cầu

Không được có quá 2 viên có khối lượng nằm ngoài giới hạn chênh lệch

so với khối lượng trung bình quy định và không được có viên nào có khối lượng vượt gấp đôi giới hạn đó

Bảng 2.2: Giới hạn cho phép chênh lệch khối lượng đối với viên nén

Khối lượng trung bình Phần trăm chênh lệch

vỏ nang, để khô tự nhiên cho đến khi hết mùi dung môi, cân khối lượng của vỏ nang

Khối lượng thuốc trong nang là hiệu số giữa khối lượng nang thuốc và khối lượng vỏ nang Tiến hành tương tự với 19 đơn vị khác lấy ngẫu nhiên Tính khối lượng trung bình của thuốc trong nang

Yêu cầu

Độ chênh lệch khối lượng của từng viên nang so với khối lượng trung bình phải đạt theo Bảng 2.3

Bảng 2.3: Giới hạn cho phép chênh lệch khối lượng đối với viên nang

Khối lượng trung bình Phần trăm chênh lệch

Nhỏ hơn 300 mg

Bằng hoặc lớn hơn 300 mg

±10

±7,5

2.3.3 Phép thử độ hòa tan của viên nén và viên nang [12]

Độ hòa tan của một chế phẩm là tỷ lệ hoạt chất được giải phóng ra khỏi dạng thuốc theo thời gian với các điều kiện qui định trong từng chuyên luận Với mỗi chế phẩm có các qui định cụ thể về thiết bị thử, môi trường hòa tan, thời gian thử nghiệm và phầm trăm hoạt chất được giải phóng

Thiết bị: Tùy thiết bị có thể có một bình hoặc 6-8 bình thử Thiết bị kiểu giỏ quay hoặc thiết bị kiểu cánh khuấy

Phương pháp thử

 Chuẩn bị môi trường hòa tan

Môi trường hòa tan được chỉ dẫn trong từng chuyên luận riêng Nếu là dung dịch đệm thì pH phải điều chỉnh để sai khác không quá 0,05 đơn vị Môi trường hòa tan phải loại khí trước khi dùng Cho một thể tích quy định môi trường hòa tan đã đuổi khí vào bình (thể tích quy định ±1%) Làm ấm đến nhiệt độ 37±0,5°C

 Cho viên vào thiết bị

Nếu không có chỉ dẫn khác thì thử đồng thời trên sáu viên, cho mỗi viên vào một bình trụ hoặc một giỏ quay

- Khi sử dụng thiết bị kiểu giỏ quay: cho viên nén hay nang vào giỏ khô, hạ giỏ xuống đúng vị trí trước khi quay

- Khi dùng thiết bị kiểu cánh khuấy: cho viên nén hay nang chìm xuống đáy bình trước khi cánh khuấy quay Có thể dùng dây xoắn kim loại hay thủy tinh giữ viên thuốc nằm dưới đáy bình Chú ý loại bọt khí khỏi bề mặt viên

 Xác định lượng hoạt chất

Mẫu thử lấy ra có thể được lọc bằng giấy lọc hay thiết bị thích hợp Dung dịch thu được có thể được dùng riêng biệt hoặc gộp lại để xác định phần trăm hoặc chất giải phóng

Luận văn tốt nghiệp Đại học GVHD: ThS Nguyễn Thị Diệp Chi

Xác định lượng hoạt chất chứa trong dịch lọc bằng phương pháp được chỉ dẫn trong chuyên luận riêng

Đánh giá kết quả

Lượng hoạt chất được hòa tan của mỗi viên trong số sáu viên đem thử không được ít hơn 70% lượng hoạt chất ghi trên nhãn, trừ khi có chỉ dẫn trong chuyên luận riêng Nếu có một viên không đạt yêu cầu, thử lại với sáu viên khác và tất cả đều phải đạt

2.3.4 Định tính [8]

Tiến hành định tính theo các phương pháp được quy định trong tiêu chuẩn, viên nén và viên nang phải cho các phản ứng của các hoạt chất có trong chế phẩm

2.3.5 Định lượng [8]

Áp dụng đối với viên nang: Cân thuốc trong 20 viên, tính khối lượng trung bình viên, làm đồng nhất bằng cách nghiền (đối với viên nang chứa bột hoặc cốm)

Áp dụng đối với viên nén: Cân 20 viên, xác định khối lượng trung bình viên Nghiền mịn Đối với viên nén bao phim, để thu được kết quả định lượng chính xác phải loại bỏ lớp vỏ bao phim trước khi nghiền

Tiến hành định lượng theo các phương pháp được quy định trong tiêu chuẩn, hàm lượng của từng hoạt chất trong chế phẩm phải nằm trong giới hạn cho phép theo Bảng 2.4

Bảng 2.4: Giới hạn cho phép về hàm lượng đối với thuốc viên nang, viên nén

Lượng ghi trên nhãn Phần trăm chênh lệch Tới 50 mg

Trên 50 mg tới 100 mg Trên 100 mg

Kết quả thẩm định phương pháp có thể được sử dụng để đánh giá chất lượng, độ tin cậy của kết quả phân tích Thẩm định phương pháp phân tích là một phần không thể thiếu nếu muốn có một kết quả phân tích đáng tin cậy

Mục đích [14]

Đây là một quy trình bắt buộc, có tính chất định kỳ Tiến hành thẩm định nhằm đảm bảo phương pháp phân tích phù hợp và kết quả phân tích, đạt độ tin cậy trong suốt quá trình phân tích Sau đó quy trình phân tích được thẩm định này làm cơ sở để đưa vào chuyên luận của dược điển hay làm TCCS để đăng

ký lưu hành

Phạm vi thẩm định, tái thẩm định[15]

Theo yêu cầu của ISO 17025 (tiêu chuẩn về hệ thống quản lý chất lượng

áp dụng chuyên biệt cho phòng thử nghiệm và hiệu chuẩn), phương pháp phân tích phải được thẩm định hay thẩm định lại khi:

- Phương pháp áp dụng không phải là phương pháp tiêu chuẩn

- Phương pháp do phòng thử nghiệm tự xây dựng mới trước khi đưa vào sử dụng thành thường quy

- Có sự thay đổi về đối tượng áp dụng nằm ngoài đối tượng áp dụng của phương pháp đã thẩm định hoặc phương pháp tiêu chuẩn

- Có sự thay đổi các điều kiện thực hiện phương pháp đã được thẩm định (ví dụ: thiết bị phân tích với các đặc tính khác biệt, nền mẫu, người phân tích )

Các chỉ tiêu thẩm định quy trình phân tích

Cơ sở để thẩm định một quy trình phân tích dựa vào các tiêu chuẩn sau:

b Cách xác định

Tiến hành xác định giá trị của 6 lần tiêm lặp lại trên một mẫu chuẩn với phương pháp phân tích đang thực hiện

c Giới hạn đánh giá

Độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của 6 lần tiêm lặp lại của thời gian lưu, diện tích pic và số đĩa lý thuyết không quá 2,0% và giá trị hệ số bất đối xứng của pic không quá 2,0

2.4.2 Tính tuyến tính (Linearity) [15]

a Định nghĩa

Tính chất tuyến tính của một quy trình phân tích là khả năng suy ra các kết quả của phương pháp phụ thuộc giữa độ đáp ứng của đại lượng đo được (y) và nồng độ (x) là một đường thẳng hay trực tiếp tính toán dựa vào tương quan tỷ lệ giữa đại lượng đo được và nồng độ

Cả hai trường hợp đều yêu cầu giữa đại lượng đo được và nồng độ phải

có sự phụ thuộc tuyến tính

b Đại lượng đặc trưng cho độ tuyến tính

Tính chất tuyến tính được biểu thị bằng hệ số tương quan R

Nếu là sự phụ thuộc tuyến tính, ta có khoảng khảo sát đường biểu diễn là một đoạn thẳng tuân theo phương trình sau:

n y x y

x a

i i

i i i

i

/)(

/2 2

b: Giá trị hệ số chặn (giao điểm của đường với y)

n

x a y

n i i i

n i

i i

y y x

x

y y x x R

2 2

1

)()(

))(

(

Sử dụng phân tích hồi quy với kiểm định Student để kiểm tra ý nghĩa của các hệ số (a và b) trong phương trình hồi quy và kiểm định Fisher để kiểm tra tính thích hợp của phương trình hồi quy

Giới hạn phát hiện (LOD: Limit of Detection)

Giới hạn phát hiện của một quy trình phân tích là lượng thấp nhất của chất cần thử trong mẫu còn có thể phát hiện được nhưng không nhất thiết phải xác định chính xác hàm lượng

Thường việc xác định giới hạn phát hiện bằng cách tìm xem chất cần thử

có nồng độ cao hơn hay thấp hơn một giới hạn nào đó Giới hạn này thường được biểu thị bằng phần trăm, phần ngàn, phần triệu (ppm), phần tỷ (ppb),

Giới hạn định lượng (LOQ: Limit of Quantity)

Giới hạn định lượng của một qui trình phân tích là lượng thấp nhất của chất cần thử có trong mẫu thử còn có thể xác định được với độ đúng và độ chính xác thích hợp

Là một thông số của phương pháp định lượng đối với lượng thấp nhất của chất thử trong khung mẫu và được sử dụng đặc biệt trong việc xác định các tạp chất và các sản phẩm phân hủy Có thể được biểu thị bằng sự cho phép

có mặt của chất cần thử trong mẫu đem thử với nồng độ phần trăm, phần ngàn, phần triệu

b Cách xác định

Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng được xác định dựa vào phương trình hồi quy tuyến tính của mẫu thử và các các thông số thống kê (kiểm định Fisher và kiểm định Student)

Giới hạn phát hiện (LOD) được tính theo công thức:

S

SD LOD3,3

Giới hạn định lượng (LOQ) được tính theo công thức:

S

SD LOQ10

Trong đó:

S: Độ dốc (slope) của đường chuẩn

SD: Độ lệch chuẩn của tín hiệu

2.4.4 Độ chính xác (Precision) [13]

a Định nghĩa

Độ chính xác là mức độ sát gần giữa các kết quả thử riêng rẽ với giá trị trung bình thu được khi áp dụng phương pháp đề xuất cho cùng một mẫu thử đồng nhất trong cùng điều kiện xác định

Độ chính xác bị ảnh hưởng bởi sai số ngẫu nhiên (Random error)

Độ chính xác có thể chia thành 3 cấp: độ lặp lại, độ chính xác trung gian

và độ tái lập

- Độ lặp lại (Repeatability): diễn tả độ chính xác của qui trình phân tích

tiến hành trong cùng điều kiện thí nghiệm trong khoảng thời gian ngắn

- Độ chính xác trung gian (Intermediate Precision): biểu thị mức độ

dao động của kết quả trong cùng một phòng thí nghiệm, nhưng được thực hiện các ngày khác nhau; kiểm nghiệm viên khác nhau; hóa chất, thiết bị khác nhau…

- Độ tái lập (Reproducibility): biểu thị độ chính xác giữa các phòng thí

nghiệm (phối hợp nghiên cứu giữa các phòng thí nghiệm thường được áp dụng

để tiêu chuẩn hóa phương pháp) khác điều kiện môi trường phòng thí nghiệm, khác kiểm nghiệm viên, khác thiết bị, dung môi hóa chất

Đại lượng đặc trưng cho độ chính xác là: độ lệch chuẩn hoặc độ lệch chuẩn tương đối

b Cách xác định

Với độ lặp lại:

Xác định tối thiểu 9 lần mẫu thử trong khoảng xác định của phương pháp phân tích (3 lần phân tích/nồng độ × 3 nồng độ khác nhau) hoặc thực hiện tối thiểu 6 lần ở nồng độ 100%

Sau đó đánh giá các kết quả thu được dựa vào SD và RSD

)1(

%100

% 

x

SD RSD

đã được làm đồng nhất trong cùng điều kiện xác định

Độ đúng bị ảnh hưởng bởi sai số hệ thống (Systematic error)

b Đại lượng đặc trưng cho độ đúng

Độ lệch thực nghiệm BIAS: là hiệu giữa hàm lượng thực thêm vào mẫu

μ và hàm lượng tìm lại được 𝑥̅ bằng quy trình

𝑥̅: Hàm lượng xác định được

μ: Hàm lượng của chất chuẩn cho vào

c Cách xác định

Xác định hàm lượng của chất cần thử bằng phương pháp dự kiến

Cho vào mẫu thử một lượng chất chuẩn có hàm lượng bằng 80%, 100%, 120% so với hàm lượng lý thuyết hay hàm lượng ghi trên nhãn, rồi tiến hành bằng phương pháp đề xuất

d Giới hạn đánh giá

Thông thường 98,0% ≤ tỷ lệ phục hồi ≤ 102,0%

RSD tỷ lệ phục hồi ở mỗi mức nồng độ không quá 2,0%

Chú ý:

- Tỷ lệ phục hồi nên được xác định ở khoảng nồng độ cần định lượng

và phải bao gồm nồng độ gần với giới hạn định lượng

- Tỷ lệ phục hồi ở mỗi nồng độ riêng biệt phải đáp ứng với mức giới hạn cho phép chứ không phải lấy tỷ lệ phục hồi trung bình

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian, địa điểm

Đề tài được thực hiện tại Trung tâm Kiểm nghiệm Thuốc, Mỹ phẩm, Thực Phẩm thành phố Cần Thơ Thời gian thực hiện đề tài từ ngày 15/9/2015 đến 30/10/2015

Cân phân tích AD-8121 Cân phân tích Precisa Máy đo pH Schott Lab 850 Máy thử độ hòa tan

Máy siêu âm, đuổi khí Sonica 3200EP

Máy bơm áp lực chân không Bình định mức (25 ml, 50 ml, 100 ml ); bình tam giác; pipet chính xác; cốc thủy tinh; phễu lọc; màng lọc Millipore 0,45 μm

Hình 3.1: Máy siêu âm, đuổi

khí Sonica 3200EP

Hình 3.2: Máy bơm áp lực

chân không

Hình 3.3: Máy thử độ hòa tan Hình 3.4: Cân phân tích Precisa

Hình 3.5: Máy quang phổ UV-VIS 2900

Hình 3.6: Máy HPLC HITACHI L-2000

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Phương pháp lấy mẫu

Mẫu chuẩn

Bảng 3.2: Phương pháp lấy mẫu chuẩn

Tên chất chuẩn Azithromycin dihydrat Azithromycin dihydrat

Nhà sản xuất Mã số mẫu Số lô Tên chế phẩm Hàm lượng CTCP DHG

Phương pháp thẩm định quy trình phân tích, định tính và định lượng mẫu thử dựa trên DĐVN IV

3.3.3 Phương pháp xử lý số liệu

Dữ liệu thu được xử lý bằng phương pháp thống kê, sử dụng phần mềm Microsoft Excel làm công cụ hỗ trợ