Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử phát hiện đột biến gen α globin gây bệnh hemoglobin h

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI ---***--- NGÔ THỊ TUYẾT NHUNG ỨNG DỤNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN GEN α GLOBIN GÂY BỆNH HEMOGLOBIN H Chuyên n

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

-*** -

NGÔ THỊ TUYẾT NHUNG

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ PHÁT HIỆN

ĐỘT BIẾN GEN α GLOBIN GÂY BỆNH HEMOGLOBIN H

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS.TS TRƯƠNG QUỐC PHONG

i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan: Luận văn “Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử phát hiện

đột biến trên gen α globin gây bệnh Hemoglobin H” là công trình nghiên cứu của

tôi cùng nhóm nghiên cứu tại khoa Di truyền và Sinh học phân tử, Bệnh viện Nhi Trung Ương do BS Ngô Diễm Ngọc là trưởng nhóm Tôi đã nhận được sự đồng ý của trưởng nhóm và tất cả các thành viên trong nhóm nghiên cứu về việc công bố các nội dung thực hiện và kết quả thu được Các nội dung nghiên cứu và kết quả được trình bày trong luận văn là trung thực và rõ ràng

Ngô Thị Tuyết Nhung

ii

LỜI CẢM ƠN

Em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến PGS.TS Trương Quốc Phong, trưởng phòng thí nghiệm Proteomics- Trung tâm nghiên cứu và phát triển công nghệ sinh học- Đại học Bách khoa Hà Nội đã tận tình chỉ bảo em trong suốt quá trình nghiên cứu để hoàn thành luận văn

Em xin chân thành cảm ơn BS Ngô Diễm Ngọc, trưởng khoa Di truyền và Sinh học phân tử- Bệnh viện Nhi Trung Ương đã tạo đạo điều kiện cho em hoàn thành nghiên cứu này

Em xin cảm ơn các thầy cô bộ môn Công nghệ Sinh học và Công nghệ thực phẩm, trường Đại học Bách Khoa Hà Nội đã truyền đạt kiến thức cho em trong quá trình học tập và rèn luyện

Trong thời gian học tập và nghiên cứu tôi đã nhận được sự giúp đỡ tận tình đầy động viên khích lệ của tập thể cán bộ nhân viên khoa Di truyền và Sinh học phân

tử, tôi xin chân thành cảm ơn những giúp đỡ quý báu đó

Cuối cùng, cho phép tôi gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, bạn bè đã luôn quan tâm, cổ vũ cho tôi vững bước trên con đường học tập và nghiên cứu

Hà Nội, tháng 09 Năm 2017

Học viên

Ngô Thị Tuyết Nhung

1

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC 1

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT 4

DANH MỤC HÌNH 6

DANH MỤC BẢNG 6

MỞ ĐẦU 9

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 11

1.1.Lịch sử nghiên cứu bệnh Alpha Thalassemia 11

1.1.1 Thế giới 11

1.1.2.Việt Nam 13

1.2.Cấu trúc phân tử Hemoglobin ở người bình thường 14

1.2.1.Cấu trúc phân tử Hemoglobin 14

1.2.2.Các dạng Hemoglobin trong cơ thể 15

1.3.Bệnh Alpha Thalassemia 17

1.3.1 Khái niệm chung về bệnh Alpha Thalassemia 17

1.3.2.Dịch tễ học bệnh α Thalassemia 17

1.3.3 Đặc điểm lâm sàng bệnh α thalassemia 18

1.3.3.1 Người mang gen α thalassemia 19

1.3.3.2 α thalassemia thể nhẹ 19

1.3.3.3 Bệnh Hemoglobin H (HbH) 19

1.3.3.4 Hội chứng phù thai Hemoglobin Bart’s (Hb Bart’s) 19

1.4.Vị trí, cấu trúc và chức năng của gen α globin 20

1.4.1 Cụm gen α globin 20

1.4.2 Gen α globin 21

1.5 Chẩn đoán bệnh Alpha Thalassemia 22

1.5.1 Xét nghiệm huyết đồ cơ bản 22

1.5.1.1 Xét nghiệm công thức máu 22

1.5.1.2 Điện di Hemoglobin 22

2

1.5.2.Chẩn đoán bằng sinh học phân tử 23

1.5.2.1 Kỹ thuật lai đặc hiệu 24

1.5.2.2 Kỹ thuât khuếch đại alen đặc hiệu (Amplification refractory mutation system- ARMS PCR) 24

1.5.2.3.Kỹ thuật xử lý enzym cắt giới hạn (restriction fragment length polymorphism analysis- RFLP PCR) 25

1.5.2.4 Kỹ thuật GAP-PCR 25

1.5.2.5 Kỹ thuật giải trình tự gen 25

1.5.2.6 Kỹ thuật khuếch đại nhiều đoạn đầu dò phụ thuộc kết nối (Multiplex ligation dependent probe amplification - MLPA) 26

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28

2.1 Đối tượng nghiên cứu 28

2.2.Hoá chất sử dụng 28

2.3.Trang thiết bị 28

2.4.Phương pháp nghiên cứu 29

2.4.1 Tách chiết ADN 29

2.4.1.1 Tách chiết ADN từ máu ngoại vi[54] 29

2.4.1.2.Tách chiết ADN từ dòng tế bào dịch ối sau nuôi cấy 30

2.4.1.3 Xác định nồng độ ADN tổng số 30

2.4.2 Phương pháp PCR sàng lọc 5 đột biến thường gặp trên gene HBA 31

2.4.2.1.Phản ứng Mutiplex Gap PCR sàng lọc đột biến SEA, α3.7, α4.2 31

2.4.2.2.Phản ứng C-ARMS PCR sàng lọc đột biến HbCS, HbQS 33

2.4.3 Phương pháp điện di trên Agarose 34

2.4.3.1 Nguyên tắc 34

2.4.3.2 Quy trình 34

2.4.4 Phản ứng PCR khuếch đại toàn bộ gene HBA1, HBA2 36

2.4.5 Tinh sạch sản phẩm PCR 37

2.4.6 PCR mồi đơn 37

2.4.7.Tinh sạch bằng BigDye X 39

2.4.8 Phân tích trình tự gene 39

2.4.9 Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của kỹ thuật Multiplex Gap- PCR và 39

3

2.5.Vấn đề đạo đức nghề nghiệp……… 42

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 41

3.1 Đánh giá quy trình kỹ thuật sử dụng để phát hiện đột biến gen  globin 41

3.2 Kết quả xác định đột biến gen  globin trên 47 bệnh nhân HbH 44

3.2.1 Kết quả xác định 5 đột biến mất đoạn thường gặp bằng kỹ thuật Multiplex Gap- PCR và C-ARMS PCR 44

3.2.2 Kết quả xác định đột biến điểm hiếm gặp dạng mất đoạn bằng kỹ thuật giải trình tự gen trên bệnh nhân HbH 47

3.2.2.1 Đột biến điểm c.2delT (p.Met1Argfs) trên gen 2 47

3.2.2.2 Đột biến điểm c.92 GA (p.Arg31Lys) trên gen 2 48

3.2.2.3.Đột biến điểm c.426 AT(p.Ter142Tyr)- Hb Pakse trên gen 2 50

3.2.2.4 Đột biến điểm c.81GT(p.Glu27Asp)- Hb Hekinan trên gen 1 51

3.2.3 Tổng hợp kết quả về tỷ lệ các đột biến trên gen α globin của bệnh nhân HbH 52

3.3 Kết quả chẩn đoán trước sinh 54

3.4 Đối chiếu kết quả chẩn đoán trước sinh 56

KẾT LUẬN 58

KIẾN NGHỊ 59

TÀI LIỆU THAM KHẢO 60

4

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

-/ Dị hợp tử +-thal, người mang gen α+-thalassemia

(Silent Carrier) / Dị hợp tử 0-thal, người mang gen α0-thalassemia (Cis)

( thalassemia trait)

-/- Đồng hợp tử +-thal, người mang gen α0-thalassemia

(Trans)( thalassemia trait)

-4.2 Đột biến mất đoạn 1 gen lệch trái 4.2kb

-HbCS Đột biến điểm Hb Constant Spring (TAA>CAA)

-c.2delT Đột biến điểm ATG>A-G codon ATG gen 2

-c.92 G>A Đột biến điểm AGG>AAG codon 31 gen 2

-c.426 A>T Đột biến điểm TAA>TAT, Hb Pakse

-c.81G>T Đột biến điểm GAG>GAT codon 27 gen 1, Hb Hekinan (2β2) Hemoglobin A

C-ARMS-PCR Combine-Amplification Refractory Mutation System-

Polymerase Chain Reaction

HPFH Hereditary persistence of fetal hemoglobin, Hội chứng tồn

dư huyết sắc tố bào thai di truyền

MLPA Multiplex ligation dependent probe amplification

MCV (fL) Mean Corpuscular Volume, thể tích trung bình hồng cầu MCH (pg) Mean Corpuscular Hemoglobin, số lượng hemoglobin trung

bình hồng cầu (pg)

RBC (1012/L) Red Blood Cells, số lượng hồng cầu

TIF Thalassemia International Foundation, Hiệp hội Thalassemia

quốc tế

6

DANH MỤC HÌNH

Hình1.1: Sơ đồ cấu tạo phân tử Hemoglobin 14

Hình 1.2: Chức năng vận chuyển oxy của phân tử Hemoglobin 15

Hình 1.3: Các chuỗi globin ở giai đoạn trước sinh, và sau sinh 16

Hình 1.4: Hội chứng phù thai do Hb Bart’s 20

Hình 1.5: Cấu trúc cụm gen α globin 20

Hình 1.6: Cấu trúc vùng MCS-R trong cụm gen α globin 21

Hình 1.7: Cấu trúc gen α globin 22

Hình 1.8: Điện di Hemoglobin bằng kỹ thuật HPLC 23

Hình 2.1: Sơ đồ qui trình xác định đột biến  globin gây bệnh Hemoblobin H 29

Hình 2.2: Nguyên lý của kỹ thuật GAP-PCR 31

Hình 2.3: Nguyên lý của kỹ thuật C- ARMS-PCR 33

Hình 3.1: (A) Điện di sản phẩm Multiplex GAP-PCR, (B) Điện di sản phẩm C- ARMS-PCR cho 20 mẫu không có đột biến gen  globin 41

Hình 3.2: Điện di sản phẩm PCR của:(A) Kỹ thuật Mutiplex GAP-PCR, (B) Kỹ thuật C-ARMS-PCR của 20 mẫu có đột biến gen  globin 42

Hình 3.3: Điện di sản phẩm PCR của 3 đột biến mất đoạn thường gặp trên gen  globin của các bệnh nhân HbH bằng kỹ thuật Multiplex GAP PCR 44

Hình 3.4: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR của 2 đột biến -HbCS và -HbQS bằng kỹ thuật C-ARMS- PCR 45

Hình 3.5 Kết quả giải trình tự gen  globin phát hiện đột biến điểm c.2delT (p.Met1Argfs) 48

Hình 3.6: Kết quả giải trình tự gen  globin phát hiện đột biến điểm c.92G>A (p.Arg31Lys) 49

Hình 3.7: Kết quả giải trình tự gen  globin phát hiện đột biến điểm c.426A>T (p.Term142Tyr) 50

Hình 3.8: Kết quả giải trình tự gen  globin phát hiện đột biến điểm c.81G>T (p.Glu27Asp) 52

7

Hình 3.9: Hình ảnh điện di chẩn đoán trước sinh bệnh Hb Bart’s bằng kỹ thuật Multiplex GAP PCR 54Hình 3.10 Hình ảnh điện di chẩn đoán trước sinh bệnh Hb Bart’s bằng kỹ thuật C-ARMS PCR 55Hình 3.11 Hình ảnh điện di Hemglobin máu cuống rốn thu thập từ thai bị phù mắc

Hb Bart’s 57

8

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Thành phần Hb ở các giai đoạn phát triển của người bình thường 15 Bảng 1.2: Các thể bệnh α thalassemia và các biểu hiện lâm sàng 18 Bảng 3.1: Bảng tổng kết về độ nhạy và độ đặc hiệu của kỹ thuật PCR 43 Bảng 3.2: Kết quả xác định 5 đột biến mất đoạn thường gặp bằng kỹ thuật Multiplex Gap- PCR C-ARMS PCR 46 Bảng 3.4: Kiểu gen của 47 bệnh nhân HbH 53 Bảng 3.5: Tổng hợp kết quả chẩn đoán trước sinh bệnh  thalassemia 56

9

MỞ ĐẦU

Alpha thalassemia là bệnh di truyền lặn trên nhiễm sắc thể thường, đặc trưng

bởi sự suy giảm hoặc thiếu hụt tổng hợp chuỗi α globin trong phân tử Hemoglobin

Bệnh thuộc nhóm bệnh di truyền phổ biến nhất trên thế giới, là nguyên nhân gây tan máu hàng đầu ở trẻ em

Bệnh α thalassemia xuất hiện ở tất cả các chủng tộc trên thế giới, đặc biệt ở khu vực nhiệt đới, trong đó có khu vực Đông Nam Á Hiện nay, có khoảng 5% dân

số thế giới là người mang gen bệnh α thalassemia, phân bố khác nhau ở từng quốc gia, chủng tộc [37] Trung Quốc, người mang gen α thalassmia chiếm 5-15% dân số [2], Hong Kong 4% [3], Thailand 15-30% [13], Lào 43% [5], Việt Nam 5% [63]

Người bình thường có hai gen α globin nằm trên mỗi NST 16, và có tổng số bốn gen α globin trên hai NST 16 tương đồng (αα/αα) Tùy theo số lượng gen α bị đột biến, gây ra các biểu hiện lâm sàng ở nhiều mức độ khác nhau Bệnh Hemoglobin

H (HbH) là một trong các thể bệnh của bệnh Alpha Thalassemia với ba trên bốn gen

α globin của cơ thể bị đột biến

Trẻ mắc bệnh HbH thường có thiếu máu, tan máu, có thể phải phụ thuộc truyền máu, gây hậu quả nghiêm trọng cho hàng loạt các cơ quan trong cơ thể Nếu không được điều trị, trẻ mắc HbH thể nặng thường tử vong sớm, hoặc muộn hơn vì các biến chứng của bệnh

Tại bệnh viện Nhi Trung Ương, mỗi năm tiếp nhận khoảng 50 trường hợp trẻ

bị HbH mắc mới Các xét nghiệm công thức máu và phân tích thành phần Hemoglobin góp phần đáng kể trong việc hỗ trợ chẩn đoán ban đầu Tuy nhiên, các xét nghiệm này không chỉ ra chính xác kiểu gen đột biến và không thể chẩn đoán trước sinh cho thai nhi Do đó, việc xác định loại đột biến gây bệnh HbH bằng các kỹ thuật phân tử đóng vai trò quan trọng trong việc xác định thể bệnh, là cơ sở thiết yếu cho tư vấn di truyền và chẩn đoán trước sinh bệnh α thalassemia

Vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: Ứng dụng kỹ thuật sinh học

phân tử phát hiện đột biến trên gen α globin gây bệnh Hemoglobin H”

10

Mục tiêu của đề tài:

- Ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử phát hiện các đột biến trên gen α globin gây bệnh Hemoglobin H và chẩn đoán trước sinh bệnh α Thalassemia

Năm 1955 Rigarass [38], và năm 1956 Goutass [15] đều độc lập công bố tìm được HbH trong thành phần Hb của một số bệnh nhi Tuy nhiên, các tác giả khi đó gọi bệnh HbH như một bệnh Hb riêng biệt, chưa tìm thấy mối liên hệ giữa bệnh HbH

và bệnh α thalassemia

Năm 1959 Ramot [10] đã tách được thành phần Hb Bart’s trong máu của bệnh nhân HbH Những phát hiện này giúp các nhà nghiên cứu hướng tới mối liên hệ giữa bệnh HbH và các thể của bệnh α thalassemia Điều này được di truyền phân tử xác minh vào những năm sau này

Năm 1963 Dance đã phát hiện ra cơ chế tạo thành HbH nhờ phát hiện được phần globin của HbH gồm 4 chuỗi β Do khi chuỗi α bị giảm, các chuỗi β tăng tổng hợp tạo các chuỗi β thừa dư Các chuỗi này kết hợp với nhau tạo thành phân tử β4, là phần globin của HbH [65] Tương tự cơ chế như vậy, trong thời kỳ bào thai, các chuỗi

“không α” lúc đó chủ yếu là chuỗi γ Khi chuỗi α giảm hoạt động, các chuỗi γ tăng tổng hợp, tạo các chuỗi γ thừa dư Các chuỗi này sẽ kết hợp tạo thành phân tử Hb Bart’s γ4 Nhờ sự phát hiện này bản chất globin của HbH và Hb Bart’s đã được phát hiện, và từ đó các nhà nghiên cứu đã đi sâu vào bản chất của bệnh

Đầu những năm 60, ngoài việc nghiên cứu những biểu hiện đa dạng của bệnh HbH, các tác giả bắt đầu đi vào nghiên cứu lĩnh vực gen di truyền của bệnh α thalassemia nói chung và các thể bệnh α thalassemia nói riêng [18]

12

Năm 1964, Wealtherall lần đầu tiên đưa ra giả thuyết có 2 cặp gen α globin

Mô hình này đã giải thích được các biểu hiện phong phú của các thể bệnh α thalassemia, cũng như các biểu hiện lâm sàng đa dạng của bệnh HbH ở các dân tộc khác nhau [19]

Trong cùng năm 1964, Wasi đã đưa ra bằng chứng chứng minh cho giả thuyết

có 2 gen α globin Ông đã quan sát tỷ lệ mắc bệnh HbH trong gia đình mắc bệnh là 1/4 Từ đó tác giả cho rằng ngoài gen kinh điển ở 1 trong 2 người bố và mẹ gây bệnh thì còn có 1 gen nhẹ hơn nằm ở người còn lại, có tác dụng tương hỗ với gen kinh điển tạo nên bệnh HbH [32]

Cùng thời gian này, Wasi và cộng sự cũng tiến hành một nghiên cứu trên các bệnh nhân mắc HbH tại Thái Lan, kết quả cho thấy: Điện di máu cuống rốn của 30 trẻ sơ sinh được sinh ra từ các cha mẹ mắc bệnh HbH, đã phát hiện 29/30 trường hợp

có Hb Bart’s Điều đó chứng tỏ hầu như tất cả các trẻ sơ sinh sinh ra từ các cha mẹ mắc bệnh HbH đều là người mang gen α thalassemia [32] Những trẻ này được phân làm 2 nhóm dựa vào những đặc điểm máu ngoại vi: Nhóm thứ nhất gồm 14 trẻ có biến đổi hình thái hồng cầu ngoại vi theo kiểu thalassemia, hồng cầu nhỏ, nhược sắc,

to nhỏ không đều Tăng sức bền thẩm thấu hồng cầu Lượng Hb Bart’s trong máu cuống rốn chiếm 5-6% trong thành phần Hb của cơ thể Nhưng biểu hiện lâm sàng và huyết học trên cho phép xếp nhóm trẻ này vào nhóm α1- thalassemia Nhóm thứ hai: gồm những trẻ còn lại không có biến đổi về hình dáng hồng cầu ngoại vi, hoặc có biến đổi rất ít, không đáng kể Sức bền thẩm thấu hồng cầu đạt mức bình thường Lượng Hb Bart’s trong máu cuống rốn chiêm 1-2% trong thành phần Hb Những biểu hiện trên cho phép xếp nhóm trẻ này vào nhóm α2-thalassemia

Như vậy, quan sát trên cho phép tác giả nhận định rằng bệnh HbH bao gồm cả

2 gen α1 và α2 thalassemia Về mặt di truyền có thể coi bệnh HbH là thể dị hợp tử kép của α1/α2 thalassemia

Năm 1965, Nannakorn đã có một nghiên cứu trên 138 bệnh nhân HbH ở Thailand với những mô tả về đặc điểm huyết học khá đầy đủ Ngoải ra, tác giả còn

Tại Việt Nam, bệnh lý về huyết sắc tố được bắt đầu nghiên cứu từ những năm

1960, tuy nhiên hầu hết đều tập trung vào β Thalassemia và HbE [3] Đối với bệnh α Thalassemia, từ trước năm 1985, bệnh này chưa được phát hiện ở Việt Nam do chưa

áp dụng các kỹ thuật chẩn đoán Dựa vào điều kiện địa lý ở vùng Đông Nam Á, một

số nhà nghiên cứu về huyết học ở nước ta lúc đó dự đoán có thể có bệnh α thalassemia tại Việt Nam Đến năm 1985, dự đoán ấy mới được chứng minh nhờ sự phát hiện bệnh HbH, là một thể bệnh của α thalassemia

Năm 1996, Dương Bá Trực tiến hành nghiên cứu: “Đặc điểm lâm sàng và huyết học bệnh HbH ở trẻ em Việt Nam Bước đầu tìm hiểu tần suất bệnh Alpha Thalassemia ở Hà Nội” Đây là nghiên cứu đầu tiên trên đối tượng bệnh nhân HbH Tuy nhiên, tại thời điểm nghiên cứu, chưa có sự ứng dụng của sinh học phân tử để xác định kiểu gen của bệnh [9]

Năm 2005, Trần Thuỳ Ngân đã ứng dụng kỹ thuật PCR để xác định kiểu gen thalassemia trong vùng dịch tễ sốt rét của tỉnh Bình Phước [5]

-Từ năm 2008 đến 2013, Nguyễn Khắc Hân Hoan đã tiến hành nghiên cứu: “Nghiên cứu tầm soát và chẩn đoán trước sinh bệnh  và  thalassemia” Nghiên cứu tiến hành trên đối tượng là các phụ nữ mang thai Khi người vợ và người chồng có kết quả tầm soát huyết đồ nghi ngờ là người mang gen bệnh thalassemia, được thực hiện xét nghiệm

di truyền phân tử để khẳng định, tư vấn di truyền và chẩn đoán trước sinh [1]

Từ năm 2013 đến 2015, Ngô Diễm Ngọc và cộng sự đã nghiên cứu về mối liên

hệ giữa kiểu gen và kiểu hình của bệnh Alpha Thalassemia trên các bệnh nhân đến khám và điều trị tại bệnh viện Nhi Trung Ương và tiến tới sàng lọc người mang gen,

tư vấn di truyền và chẩn đoán trước sinh[6], [7]

14

Năm 2015, Ngô Thị Tuyết Nhung và cộng sự đã ứng dụng các kỹ thuật phân tử

để chẩn đoán bệnh HbH trên đối trượng bệnh nhi tại bệnh viện Nhi Trung Ương [8]

1.2.Cấu trúc phân tử Hemoglobin ở người bình thường

1.2.1.Cấu trúc phân tử Hemoglobin

Phân tử Hemoglobin (Hb) ở người là một phân tử protein được cấu tạo từ hai cặp chuỗi dimer polypeptide, α và β globin, tạo thành cấu trúc tetramere Phân tử α2β2

là cấu trúc của phân tử Hb ở người trưởng thành Chức năng chính của phân tử này

là vận chuyển oxygen (O2) từ phổi đến các tổ chức, và vận chuyển carbon dioxide (CO2), carbon monoxide (CO), nirtric oxide (NO)theo chiều ngược lại [2333]

Chức năng của phân tử Hb được hình thành dựa trên đặc điểm cấu tạo các chuỗi amino acid của chuỗi globin, bao gồm 7 vòng xoắn của chuỗi α và 8 vòng xoắn của chuỗi β globin Các vòng xoắn này lần lượt gấp lại tạo thành các phân tử dimer

và sau đó tạo thành cấu trúc tetramere 4 chuỗi polypeptide của phân tử Hb khi kết hợp với nhau thì mỗi chuỗi tạo ra ở phần trung tâm một vị trí để gắn phần nhân Hem,

là phân tử sắt-protoporphyrin IX, mang liên kết hóa trị mạnh, do đó phân tử này được bảo vệ khỏi sự xâm nhập của môi trường xung quanh Do đó, cấu trúc phân tử Hb gồm hai phần: phần globin và phần HEM [33]

Hình 1.1: Sơ đồ cấu tạo phân tử Hemoglobin [33]

Phần HEM là phần tạo nên màu đỏ của chất Hb, có cấu trúc chung cho nhiều loài Phần này là một vòng protoporphyrin và một nguyên tử sắt hóa trị II (Hình1.1) Nhân Protoporphyrin gồm 4 vòng pyrol, gắn với nhau qua các cầu nối methan (-CH=)

và một số mạch thẳng gồm methy (- CH3 =), vinyl (- CH = CH2) và propionate (- CH2

15

- CH2 - COOH) Nguyên tử sắt nằm ở trung tâm, có hai mối liên kết chặt chẽ với hai nguyên tử nito và hai mối liên kết giả với hai nguyên tử nito khác, do quá tình chuyển

và nhận điện tích Ở người những rối loạn bệnh lý trong phần HEM ít xảy ra hơn hẳn

so với những rối loạn bệnh lý trong phần globin [33]

Phần globin có bản chất là protein Phần này đặc hiệu cho từng loài Ở người, phần globin được cấu tạo bởi 4 chuỗi polypeptide giống nhau từng đôi một, gắn với nhau Mỗi chuỗi polypeptide gắn với 1 HEM Do đó, mỗi phân tử Hb có 2 đôi chuỗi polypeptide và 4 HEM, có khả năng vận chuyển 4 phân tử oxy [33]

Hình 1.2: Chức năng vận chuyển oxy của phân tử Hemoglobin [33]

1.2.2.Các dạng Hemoglobin trong cơ thể

Trong quá trình phát triển cá thể ở người, các loại chuỗi polypeptide có sự chuyển đổi, loại chuỗi này thay thế chuỗi kia ở từng giai đoạn của cuộc sống Phân tích cấu trúc của các loại Hb khác nhau ở người, các tác giả chia chuỗi polypeptide thành các loại như sau: Chuỗi alpha (α), chuỗi beta (β), chuỗi gamma (γ), chuỗi delta (δ), chuỗi epsilon (ε), chuỗi zeta (ζ) [12]

Bình thường mỗi phân tử Hb có 2 cặp chuỗi polypeptide ở phần globin Các loại Hb khác nhau có các thành phần chuỗi polypeptide khác nhau Trong hồng cầu của người bình thường trưởng thành, hemoglobin A (α2β2) chiếm khoảng 97% trong tổng số Hb của cơ thể, hemoglobin A2 (α2δ2) chiếm ~2% và hemoglobin F (hemoglobin bào thai) (α2γ2) chiếm ~ 1% [12]

Bảng 1.1: Thành phần Hb ở các giai đoạn phát triển của người bình thường

16

Hb Gower (ζ2ε2; α2ε2)

HbF ( α2γ2)

HbA1 (α2β2)

HbA2 (α2δ2)

Hình 1.3: Các chuỗi globin ở giai đoạn trước sinh, và sau sinh [12]

17

1.3.Bệnh Alpha Thalassemia

1.3.1 Khái niệm chung về bệnh Alpha Thalassemia

Thalassemia là một nhóm bệnh di truyền lặn trên NST thường có biểu hiện lâm sàng là tình trạng thiếu máu ở các mức độ khác nhau Thuật ngữ “Thalassemia”

có nguồn gốc từ Hy Lạp, “thalassa” nghĩa là biển, “heama” nghĩa là máu, hay còn gọi

là “bệnh máu vùng biển”, được phát hiện đầu tiên và gặp phổ biến ở các nước thuộc vùng biển Địa Trung Hải [34]

Bệnh thalassemia được phân loại dựa trên loại chuỗi globin nào trong phân tử hemoglobin bị đột biến Chuỗi β globin được mã hóa bởi gen β globin trên NST 11

và chuỗi α globin được mã hóa bởi gen α globin trên NST 16 Ở người bình thường,

có 4 locus gen mã hóa cho chuỗi α globin và 2 locus gen mã hóa cho chuỗi β globin Hai loại chuỗi này tạo nên phân tử α2β2 là hemoglobin A (HbA), chiếm 95% thành phần Hb ở người trưởng thành [26]

Bệnh α thalassemia là bệnh thiếu máu tan máu di truyền gây ra do giảm hoặc mất hẳn sự tổng hợp của chuỗi α globin trong phân tử Hb Sự suy giảm tổng hợp này dẫn đến sự dư thừa của chuỗi β globin tạo phân tử γ4, gọi là Hb Bart’s (thời kỳ bào thai), và β4, và HbH (thời kỳ trưởng thành) [49]

1.3.2.Dịch tễ học bệnh α Thalassemia

Như hầu hết các bệnh về rối loạn gen globin nói chung, bệnh α thalassemia xảy ra ở tất cả các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới với tần số cao Ở một số vùng, tần

số người mang gen α thalassemia có thể chiếm 80-90% dân số [28] Các bằng chứng

về dịch tễ học đã chứng minh rằng các rối loạn về gen globin nói chung và bệnh α thalassemia nói riêng có liên quan đến các khu vực lưu hành bệnh sốt rét, mặc dù cơ chế về vấn đề này tuy đã được nghiên cứu rộng rãi nhưng vẫn chưa được sáng tỏ [71]

Trong tất cả các bệnh về rối loạn gen globin, bệnh α thalassemia là bệnh có sự phân bố rộng rãi nhất Do đó, với sự kết hợp giữa các dạng allen đột biến khác nhau của bệnh α thalassemia, cũng như giữa bệnh α và β thalassemia, đã tạo ra nhiều kiểu hình phong phú của bệnh Và cũng vì thế, bệnh HbH, là α thalassemia thể trung gian được tìm thấy chủ yếu ở Đông Nam Á, Trung Đông và Địa Trung Hải

18

Bệnh α thalassemia xuất hiện ở tất cả các chủng tộc trên thế giới, rất phổ biến

ở Đông Nam Á Hiện nay, có khoảng 5% dân số thế giới là người mang gen bệnh α thalassemia, phân bố khác nhau ở từng quốc gia, chủng tộc [37] Trung Quốc, người mang gen α thalassmia chiếm 5-15% dân số [2], Hong Kong 4% [3], Thailand 15-30% [13], Lào 43% [5], Việt Nam 5% [63]

Thalassemia là một vấn đề toàn cầu Trong khoảng 20 năm tới, ước tính sẽ có khoảng 900,000 trẻ sinh ra mắc bệnh Thalassemia, trong đó 95% số trẻ này thuộc về các nước Châu Á, Ấn Độ, và Trung Đông Sự gia tăng nhanh chóng của quần thể người thalassemia ở các khu vực này đang thay đổi bộ mặt lâm sàng của bệnh thalassemia trên thế giới Ngày nay, dịch tễ học của bệnh thalassemia đã thay đổi một cách đáng kể so với trước đây Thalassemia hiện nay là nhóm bệnh không thuần nhất với sự khác nhau về tính chủng tộc, kiểu hình, kiểu gen, và cách thức điều trị Trước đây, bệnh HbE-β thalassemia và HbH rất hiếm gặp ở Bắc Mỹ và Châu Âu, nhưng ngày nay do sự di dân, các bệnh lý này đã trở nên thường gặp hơn so với bệnh thalassemia thể nặng điển hình [48]

1.3.3 Đặc điểm lâm sàng bệnh α thalassemia

Bệnh α thalassemia được chia thành 4 thể khác nhau tùy theo số lượng gen α globin bị đột biến, với các biểu hiện lâm sàng rất phong phú và khác nhau ở mỗi thể

bệnh (Bảng 1.2)

Bảng 1.2: Các thể bệnh α thalassemia và các biểu hiện lâm sàng

Người mang gen Lâm sàng và huyết học bình thường

α thalassemia thể nhẹ Thiếu máu nhẹ, hồng cầu nhỏ nhược sắc

Bệnh HbH Thiếu máu từ vừa đến nặng, hồng cầu nhỏ, nhược sắc,

tan máu, vàng da, gan lách to

Bệnh Hb Bart’s Thiếu máu nặng, phù toàn thân, tràn dịch màng bụng, gan

lách to, dị tật xương, tim mạch, lưu thai

19

1.3.3.1 Người mang gen α thalassemia

Người mang gen α thalassemia có lâm sàng và huyết học bình thường, không

có biểu hiện thiếu máu hồng cầu nhỏ nhược sắc trên xét nghiệm công thức máu

1.3.3.2 α thalassemia thể nhẹ

Người α thalassemia thể nhẹ thường không có triệu chứng lâm sàng, chỉ được phát hiện qua xét nghiệm công thức máu biểu hiện thiếu máu hồng cầu nhỏ nhược sắc mức độ từ nhẹ đến trung bình Các dấu hiệu khác liên quan đến tình trạng thiếu máu như xanh xao, mệt mỏi, thở nhanh, ngắn thường rất hiếm gặp, hoặc nếu có thì thường liên quan đến các bệnh tật khác kèm theo

1.3.3.3 Bệnh Hemoglobin H (HbH)

Bệnh HbH thường gặp ở những bệnh nhân mang dị hợp tử kép của hai đột biến trên gen α globin, trong đó có một đột biến mất đoạn hai gen và một đột biến mất đoạn một gen Ở những bệnh nhân này, chuỗi α globin chỉ được tổng hợp bằng khoảng 30% so với bình thường Triệu chứng lâm sàng thường gặp nhất ở bệnh nhân HbH là tình trạng thiếu máu (2.6-13.3g/dl) với lượng HbH thay đổi từ 0.8-40%, đôi khi còn

có kèm theo Hb Bart’s ở một vài trường hợp Bệnh nhân thường có lách to Vàng da

có thể xuất hiện ở nhiều mức độ khác nhau Trẻ mắc HbH có thể có biểu hiện chậm lớn Ngoài ra còn có thể có các dấu hiệu do biến chứng khác của bệnh như: nhiễm trùng, các vết loét ở chi dưới, sỏi mật, suy giảm acid folic và có thể có các cơn tan máu cấp sau khi điều trị thuốc hoặc sau các đợt nhiễm trùng nặng Bệnh nhân lớn tuổi hơn có thể kèm theo biểu hiện thừa sắt ở nhiều mức độ khác nhau [41, 69]

1.3.3.4 Hội chứng phù thai Hemoglobin Bart’s (Hb Bart’s)

Hội chứng phù thai do Hb Bart’s là thể bệnh nặng nhất của α thalassemia, do mất hoàn toàn 4 gen α globin, gây nên tình trạng suy giảm hoàn toàn khả năng sản xuất chuỗi α globin

Trẻ mắc Hb Bart’s có thành phần Hb trong hồng cầu chủ yếu là loại Hb không

có chức năng γ4 vàβ4 Tuy nhiên, vẫn còn một lượng Hb bào thai Porland (ζ2γ2) tồn tại, là loại Hb duy nhất có chức năng vận chuyển oxy để duy trì sự sống cho bảo thai

Hình 1.4: Hội chứng phù thai do Hb Bart’s [20]

A: Máu ngoại vi có hồng cầu non, nhỏ, nhược sắc B: Phù thai do Hb Bart’s

1.4.Vị trí, cấu trúc và chức năng của gen α globin

1.4.1 Cụm gen α globin

Cụm gen α globin (α globin cluster) bao gồm các gen chức năng là hai gen α (α2, α1), 1 gen phôi (ζ2), 3 giả gen (ψζ1, ψα2, ψα1), và 1 gen chưa xác định được chức năng (θ1) Các gen này sắp xếp theo trình tự từ đầu 5’ đến đầu 3’ như sau: 5’- ζ2 - ψζ1 - ψα2 - ψα1 - α2 - α1 - θ1 - 3’ (Hình 5) [42]

Hình 1.5: Cấu trúc cụm gen α globin [21]

MCS-có vai trò quan trọng cho sự biểu hiện của gen α globin [15]

Hình 1.6: Cấu trúc vùng MCS-R trong cụm gen α globin [15]

HS-40 là một đoạn trình tự ADN có chiều dài khoảng 40kb nằm ở đầu nguồn của cụm gen α globin, là một vùng DNA có tính nhạy cảm cao và là vị trí gắn với các yếu

tố trong quá trình dịch mã Sự toàn vẹn của vùng HS-40 là yếu tố cần thiết cho sự biểu hiện của gen α globin, nhiều bằng chứng đầy đủ đã chỉ ra rằng mất đoạn vùng HS-40 làm mất hoàn toàn khả năng biểu hiện của cụm gen α globin phía hạ nguồn,

và có biểu hiện như một người mang gen α-thalassemia [15]

1.4.2 Gen α globin

Có 2 gen α globin, α1 và α2, với tổng chiều dài khoảng từ 1 đến 2kb Mỗi gen gồm 3 exon (vùng mã hóa protein), và 2 intron (vùng không mã hóa) Chiều dài và trình tự của các vùng intron tương đối khác nhau và thay đổi giữa các cá thể (Hình 9) [71]

Gen α1 và α2 có chiều dài 850bp, cùng mã hóa cho chuỗi α globin gồm 141 acid amin, là thành phần cấu tạo nên phân tử Hb của cơ thể Trong đó, gen α2 có vai trò gấp đôi gen α1 trong quá trình sản xuất chuỗi α globin Điều này có thể do các tác động khác nhau của các trình tự khởi đầu nằm gần các trình tự mã hóa, làm cho các đột biến trên gen α2 thường dẫn đến các hậu quả nghiêm trọng hơn so với cùng đột biến đó nếu nằm trên gen α1 globin [71]

22

Hình 1.7: Cấu trúc gen α globin [71]

Như vậy, mỗi người bình thường có 2 NST số 16 thì sẽ có tổng số 4 gen α globin mang chức năng Về tổng số, sản phẩm chuỗi α globin được sản xuất từ 4 gen

α globin tương đương với sản phẩm chuỗi β globin được sản xuất từ 2 gen β globin nằm trên NST số 11, tạo ra phân tử Hb có 4 chuỗi globin

1.5 Chẩn đoán bệnh Alpha Thalassemia

1.5.1 Xét nghiệm huyết đồ cơ bản

1.5.1.1 Xét nghiệm công thức máu

Xét nghiệm huyết học được coi là xét nghiệm ban đầu để phát hiện người bệnh

và sàng lọc người mang gen bệnh α-thalassemia, cho phép đánh giá tình trạng thiếu máu (Hb giảm), hồng cầu nhỏ (MCV giảm), nhược sắc (MCH giảm), mức độ giảm tuỳ thuộc vào số lượng gen bị đột biến và loại đột biến ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp chuỗi α globin [31] Tuy nhiên những xét nghiệm này không đặc hiệu và không

có giá trị chẩn đoán xác định

1.5.1.2 Điện di Hemoglobin

Phương pháp điện di Hb được sử dụng để phân tích các thành phần Hb bất thường Đây là loại xét nghiệm quan trọng, đặc biệt đối với người mắc HbH và khi sàng lọc Hb Bart’s trong thời kỳ sơ sinh để phát hiện người lành mang gen α-thalassemia, hoặc được dùng để phát hiện bất kỳ loại Hb bất thường nào khác kết hợp với α-thalassemia Ở người α-thalassemia thể nhẹ, HbA2 trong điện di Hb có thể giảm

sơ sinh [34, 35] Trong thời kỳ sơ sinh, Hb Bart’s cũng có thể được phát hiện bằng phương pháp HPLC hoặc theo phương pháp truyền thống Hb Bart’s là phức hợp của chuỗi γ globin, phản ánh tình trạng hemoglobin bào thai tăng cao trong giai đoạn sơ sinh, chúng sẽ mất đi nhanh chóng vào khoảng thời gian sau đó Nồng độ Hb Bart’s có liên quan đến mức độ nặng nhẹ của bệnh α-thalassemia Nếu nồng độ Hb Bart’s trong giai đoạn sơ sinh lớn hơn 25%, là một chỉ điểm cho bệnh hemoglobin H Khi đó, xét nghiệm di truyền phân tử cần được chỉ định thực hiện để khẳng định chẩn đoán

Hình 1.8: Phân tích Hemoglobin bằng kỹ thuật HPLC

1.5.2 Chẩn đoán bằng sinh học phân tử

Tuỳ theo loại đột biến gây bệnh thuộc dạng đã biết hay chưa biết, tuỳ theo đặc điểm của từng trung tâm chẩn đoán, mà có các lựa chọn kỹ thuật phân tích đột biến gen  globin phù hợp Chúng tôi trình bày một số kỹ thuật sinh học phân tử chính được sử dụng

24

1.5.2.1 Kỹ thuật lai đặc hiệu

Kỹ thuật dot blot (DB) hoặc reserve dot blot (RDB) lần lượt được Kaftos và Saiki mô tả [55], sử dụng một mạch đơn trong phân tử ADN của trình tự đã được xác định (oligoprobe) để lai với phân tử ADN thứ hai chứa trình tự đích theo nguyên tắc

bổ sung (target) với mức độ ổn định tùy thuộc vào chiều dài của các cặp base tham gia vào phản ứng Cả hai phương pháp DB và RDB có điểm chung là đều cần khuếch đại đặc hiệu một đoạn ADN, là đoạn cần được lai với ASO probe đã được cố định sẵn trên màng (RDB) hoặc probe đã được đánh dấu phóng xạ được cố định trên màng dạng dot blots có sẵn (DB) Tuy nhiên hai phương pháp này có những điểm khác nhau Đối với DB, mỗi một probe trong một phản ứng cần được lai và rửa trong một điều kiện khác nhau, và có thể phát hiện một loại đột biến của nhiều mẫu trên cùng một màng Ngược lại đối với RDB sử dụng probe không đánh dấu phóng xạ, thì các đột biến khác nhau chỉ cần lai và rửa tại cùng một điều kiện, và cho phép phát hiện nhiều đột biến của cùng một mẫu trên cùng một màng

1.5.2.2 Kỹ thuât khuếch đại alen đặc hiệu (Amplification refractory mutation system- ARMS PCR)

Kỹ thuật ARMS-PCR sử dụng để phát hiện sự có mặt của alen mang đột biến điểm đã biết Mỗi phản ứng sử dụng các mồi đặc hiệu có trình tự đầu 3’ bổ sung với alen đột biến và một mồi chung ngược chiều với mồi đặc hiệu alen Như vậy, trong mỗi phản ứng cho một đột biến điểm đã biết sẽ bao gồm hai phản ứng khuếch đại, sử dụng cùng một khuôn ADN Trong đó, một sản phẩm sẽ được khuếch đại từ mồi đặc hiệu có trình tự đầu 3’ bổ sung với allen đột biến (mồi đột biến) hoặc allen bình thường (bình thường), và sản phẩm còn lại được khuếch đại từ một mồi chung ngược chiều với mồi đặc hiệu alen Sự hiện diện của các allen đột biến được biểu hiện bằng sản phẩm ADN khuếch đại với các kích thước khác nhau đã biết trước Đây là một phương pháp nhanh, đơn giản, không cần gắn phóng xạ, sử dụng để sàng lọc nhiều đột biến khác nhau trên cùng một bệnh nhân Nhiều y văn đã công bố các nghiên cứu

sử dụng kỹ thuật này trong chẩn đoán bệnh α-thalassemia [43, 16, 21]

1.5.2.4 Kỹ thuật GAP-PCR

Đột biến mất đoạn trên gen α globin được phát hiện GAP-PCR, hay còn gọi là PCR khoảng cách Kỹ thuật sử dụng hai mồi theo nguyên tắc bổ sung với mạch xuôi

và mạch ngược trong vùng ADN chứa đoạn gen bị mất Với các đột biến mất đoạn

có kích thước nhỏ hơn 1 kb, cặp mồi sẽ tạo ra hai sản phẩm, đoạn nhỏ hơn là sản phẩm từ allen bị mất đoạn Với những đột biến mất đoạn lớn, khoảng cách giữa hai mồi quá lớn để có thể khuyếch đại được allen bình thường, mà chỉ có thể khuyếch đại sản phẩm từ allen mang đột biến mất đoạn Trong trường hợp này allen bình thường sẽ được khuyếch đại thông qua một điểm đứt gãy của đột biến, sử dụng một mồi theo nguyên tắc bổ sung với trình tự bị mất và một mồi khác theo nguyên tắc bổ sung với đoạn ADN còn lại Đây là kỹ thuật nhanh, đơn giản, tuy nhiên hạn chế của

kỹ thuật này là cần phải biết được điểm đứt gãy mới thiết kế được cặp mồi tương ứng [37] Hiện nay, các cặp mồi dùng trong phản ứng GAP-PCR cho bệnh α-thalassemia

đã được thiết kế dưới đạng đa mồi Trong đó, đột biến mất đoạn -α3.7, -α4.2 gây α+thalassemia được phát hiện trong cùng một phản ứng, đột biến, αFIL, αTHAI, αSEA

-gây α0-thalassemia được phát hiện trong các phản ứng tiếp theo

1.5.2.5 Kỹ thuật giải trình tự gen

Giải trình tự ADN là phương pháp cho phép phân tích một cách chính xác trình tự nucleotid của từng gen hoặc của một vùng gen được quan tâm, được mô tả lần đầu tiên bởi Sanger và cộng sự vào năm 1977 [56] Nguyên lý của phương pháp

26

dựa trên sự nhân lên của các sợi ADN từ sợi ADN khuôn bằng phương pháp PCR, trong đó sự tổng hợp của mỗi sợi ADN mới được dừng lại tại mọi điểm dọc theo chuỗi Chuỗi được liên tục kéo dài do sự kết hợp ngẫu nhiên của các ddNTP, kèm theo sự có mặt của ADN polymersase và mồi là các chuỗi oligonucleotid dài khoảng 20bp được thiết kế theo nguyên tắc bổ sung với vùng ADN đích cần quan tâm Thông thường các ddNTP được đánh dấu 4 màu huỳnh quang khác nhau Đối với phương pháp này, hệ thống điện di thường sử dụng là điện di mao quản Mỗi khi có một vạch điện di đi qua, phân tử ddNTP cuối cùng ở đầu 3’ của đoạn ADN sẽ phát ra một màu huỳnh quang tương ứng, từ đó máy sẽ nhận diện được các nucleotid, từ đó biết được trình tự của ADN đích Phương pháp này cho phép xác định hầu hết các đột biến điểm, đột biến mất đoạn nhỏ hoặc lặp đoạn của gen Đối với bệnh α-thalassemia, chỉ

có khoảng 10% trường hợp mắc bệnh cần phải giải trình tự gen HbA1 và HbA2 để phát hiện đột biến điểm chưa biết Các vùng được giải trình tự bao gồm: các vùng mã hóa trên gen HbA1, HbA2, vùng ranh giới exon-intron, vùng cận promoter

1.5.2.6 Kỹ thuật khuếch đại nhiều đoạn đầu dò phụ thuộc kết nối (Multiplex ligation dependent probe amplification - MLPA)

Kỹ thuật MLPA dựa trên nguyên lý của sự kết nối đa mồi-probe lai với vùng gen đích, mà vùng gen này thường có kích thước lớn, tiếp theo là chạy PCR định lượng sử dụng cặp mồi PCR universal-tag cho tất cả các cặp probe, rồi sau đó là phân tích đoạn Theo cách thức này MLPA có thể phát hiện các mất đoạn và nhân đoạn xảy ra trong vùng gen phân tích, là một phương pháp chẩn đoán thay thế có giá trị, hoặc là phương pháp bổ sung cho kỹ thuật GAP-PCR khi khảo sát các đột biến mất đoạn đã biết hoặc chưa biết của bệnh α-thalassemia Đối với bệnh α-thalassemia, Probe MCR Holland SALSA P140B được thiết kế để phát hiện những thay đổi về số bản sao của 38 trình tự khác nhau trong vùng gen HbA, chủ yếu được sử dụng để phát hiện các đột biến xóa đoạn, lặp đoạn của một hoặc nhiều trình tự, trong hoặc gần vùng gen HbA1 và HbA2 Các đột biến mất đoạn dị hợp tử sẽ có các đầu tín hiệu giảm từ 35-50% so với mức bình thường Đầu dò 142 và 166 phát hiện trình tự của exon 3 có mặt cả ở gen HbA1 và HbA2 Do đó, chúng sẽ chỉ thể hiện giảm tín hiệu ở mức độ

27 20-25% so với bình thường trong các mẫu bệnh nhân, với ba thay vì bốn bản sao HbA thông thường [50]

28

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

- Mẫu chẩn đoán sau sinh: 2ml máu ngoại vi của 47 bệnh nhi nghi ngờ mắc

bệnh HbH với kết quả điện di huyết sắc tố có H

- Mẫu chẩn đoán trước sinh: 15ml dịch ối vô trùng của 46 bà mẹ có tiền sử

sinh con mắc bệnh HbH, Hb Bart’s đang mang thai ở tuần thai từ 16 đến 18

- Thời gian thu thập mẫu: Các mẫu bệnh phẩm được thu thập tại khoa Di

truyền và Sinh học phân tử, Bệnh viện Nhi Trung ương từ 1/2016 đến 5/2017 2.2.Hoá chất sử dụng

- Tách chiết ADN từ máu ngoại vi và từ dòng tế bào dịch ối sau nuôi cấy: sử

dụng kit tách chiết ADN tổng số của hãng Qiagen (QIAamp DNA mini kit)

- Các hoá chất dùng trong kỹ thuật PCR: primer (Invitrogen), Mutiplex master Mix 2X (Qiagen, Đức), Master mix 2X colorless (Promaga), Taq High Fidelity

(Roche), dNTPs (Invitrogen)

- Ethidium Bromide (Invitrogen), Agarose (Biorad), TBE10X (Invitrogen)

- Kit tinh sạch sản phẩm PCR (QIAquick PCR purification kit- Qiagen, Đức)

- Sequencing kit v3.1 (ABI)

- Salsa MLPA kit P140B4 HBA (MRC- Hà Lan)

29

- Đầu côn có màng lọc 100 µl, 1000 µl, 10 µl

- Khay lạnh

- Hệ thống máy khuếch đại gen ( PCR Eppendoff, Biorad)

- Hệ thống soi gel Biorad

- Máy giải trình tự gene 3130 Genetic Analyser (ABI- Mỹ)

2.4.Phương pháp nghiên cứu

Qui trình tiến hành phân tích gen α globin tại Khoa Di truyền và Sinh học phân

tử, bệnh viện Nhi Trung Ương theo các bước sau:

Hình 2.1: Sơ đồ qui trình xác định đột biến  globin gây bệnh Hemoblobin H

2.4.1 Tách chiết ADN

2.4.1.1 Tách chiết ADN từ máu ngoại vi[54]

- Lấy 20μl Protease vào ống eppedorf 1.5ml vô trùng

- Nhỏ 200μl máu ngoại vi vào ống, lắc đều

- Thêm 200μl dung dịch AL, sau đó vortex 15 giây

30

- Ủ mẫu ở nhiệt độ 560C trong 10 phút

- Nhỏ 200μl cồn tuyệt đối vào và vortex 15 giây

- Chuyển toàn bộ dịch trong ống sang cột lọc, sau đó ly tâm với vận tốc 8000 vòng/ phút trong 1 phút Đổ dịch nổi ở phía dưới ống lọc

- Chuyển cột lọc sang ống sạch, thêm 500μl dung dịch AW1, sau đó ly tâm với vận tốc 8000 vòng/ phút trong 1 phút Đổ dịch nổi phía dưới ống lọc

- Chuyển cột lọc sang ống sạch, thêm 500μl dung dịch AW2, sau đó ly tâm với vận tốc 13000 vòng/ phút trong 5 phút Đổ dịch nổi phía dưới ống lọc

- Chuyển cột lọc sang ống eppendorf 1.5ml vô trùng Nhỏ 200μl dung dịch

AE vào cột lọc Ủ ở nhiệt độ phòng 5 phút

- Ly tâm với tốc độ 8000 vòng/ phút trong 1 phút để thu sản phẩm ADN tổng

số

- Định lượng hàm lượng ADN tổng số trên máy Nano Drop

2.4.1.2.Tách chiết ADN từ dòng tế bào dịch ối sau nuôi cấy

- Nuôi cấy tế bào dịch ối:

- Dịch ối được nuôi cấy trong dung dịch Amniomax Fluid – là môi trường nuôi cấy đặc hiệu chỉ cho tế bào dịch ối Sau khi nuôi cấy từ 10 đến 14 ngày, các tế bào

dịch ối được thu hoạch và rửa sạch bằng dung dịch PBS 1X

- Tách chiết ADN từ tế bào dịch ối: Dòng tế bào dịch ối sau nuôi cấy được hoà

với 200μl dung dịch PBS 1X sau đó sử dụng kit tách ADN tổng số QIAamp DNA

mini kit (Qiagen- Đức) để tách ADN tổng số theo qui trình 2.4.1.1

2.4.1.3 Xác định nồng độ ADN tổng số

- Việc xác định nồng độ ADN sẽ cho phép tính toán thành phần phản ứng PCR đạt hiệu quả tốt Nồng độ ADN được xác định bằng máy Nano Drop của hãng Thermo ở bước sóng 269nm

- Tiến hành đo 2 lần với mỗi mẫu để tránh sai số

31

2.4.2 Phương pháp PCR sàng lọc 5 đột biến thường gặp trên gene HBA

2.4.2.1.Phản ứng Mutiplex Gap PCR sàng lọc đột biến SEA, α3.7, α4.2

Gap-PCR (PCR khoảng cách) là phương pháp được thiết lập để xác định các mất đoạn lớn Phương pháp này dựa trên cơ sở phản ứng PCR cơ bản với cặp mồi PCR được thiết kế bổ sung với trình tự của đoạn gen khi có mặt đột biến mất đoạn, phản ứng PCR được thực hiện và sự có mặt của đột biến được thể hiện bằng sản phẩm ADN khuếch đại với kích thước đã biết Nếu không xảy ra mất đoạn thì phản ứng PCR không thực hiện được do cặp mồi không thể bắt cặp được nên không có sản phẩm PCR

Multiplex Gap-PCR là phương pháp Gap-PCR được sử dụng cùng 1 lúc đồng thời nhiều cặp mồi đặc hiệu khác nhau để xác định đồng thời nhiều đột biến mất đoạn lớn khác nhau Sự có mặt của các đột biến được biểu hiện qua sự có mặt của các sản phẩm ADN khuếch đại với các kích thước khác nhau đã biết

Hình 2.2: Nguyên lý của kỹ thuật GAP-PCR [21]

- Chu trình nhiệt của phản ứng PCR: