Nghiên cứu tối ưu điều kiện chiết khấu isoflavones từ mầm đậu tương và khảo sát một số hoạt tính sinh học

Trên thế giới, isoflavones được tìm thấy trong một số loài thực vật như: đậu tương, cỏ ba lá, cỏ linh lăng, sắn dây cũng như nhiều loại đậu khác nhau, trong đó hàm lượng cao nhất là ở đậ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

-

NGUYỄN THU HOÀI

NGHIÊN CỨU TỐI ƯU ĐIỀU KIỆN CHIẾT XUẤT ISOFLAVONES

TỪ MẦM ĐẬU TƯƠNG

VÀ KHẢO SÁT MỘT SỐ HOẠT TÍNH SINH HỌC

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Hà Nội – 2017

-

NGUYỄN THU HOÀI

NGHIÊN CỨU TỐI ƯU ĐIỀU KIỆN CHIẾT XUẤT ISOFLAVONES

TỪ MẦM ĐẬU TƯƠNG

VÀ KHẢO SÁT MỘT SỐ HOẠT TÍNH SINH HỌC

Chuyên ngành : Công nghệ sinh học

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS TS ĐỖ THỊ HOA VIÊN

LỜI CẢM ƠN

Sau quá trình học tập, nghiên cứu và tiến hành các thí nghiệm để hoàn thành luận văn này, trước tiên tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS TS Đỗ Thị Hoa Viên, bộ môn Công nghệ sinh học, trường Đại học Bách Khoa Hà Nội đã tận tình hướng dẫn, cung cấp những thông tin quý giá và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi hoàn thành luận văn thạc sĩ này

Tôi xin cảm ơn các anh chị và các bạn thực tập cùng phòng thí nghiệm C10 Đại học Bách Khoa Hà Nội đã giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện đề tài Qua đây tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo cùng tập thể cán

101-bộ, nhân viên Viện Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm, trường Đại học Bách Khoa Hà Nội đã dạy dỗ, chỉ bảo tận tình trong thời gian tôi học tập tại trường

Sau cùng tôi xin cảm ơn sự quan tâm giúp đỡ, động viên của gia đình và bạn bè đã dành cho tôi trong suốt quãng thời gian qua

Luận văn được thực hiện dưới sự hỗ trợ kinh phí của đề tài độc lập cấp Nhà nước, mã số ĐTĐL.CN-28/15

Xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 15 tháng 08 năm 2017 Học viên

Nguyễn Thu Hoài

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan: Kết quả của luận văn này là kết quả nghiên cứu tôi đã thực hiện dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS TS Đỗ Thị Hoa Viên trường Đại học Bách khoa Hà Nội, cùng sự giúp đỡ của tập thể các cán bộ nghiên cứu, nghiên cứu sinh, học viên, sinh viên đang học tập và làm việc tại phòng thí nghiệm 101-C10, Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, trường Đại học Bách khoa Hà Nội

Nội dung luận văn có tham khảo và sử dụng các tài liệu, thông tin được đăng tải trên các tác phẩm, tạp chí và trang web theo danh mục tài liệu kham khảo của luận văn

Tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm với sự cam đoan trên

Hà Nội, ngày 15 tháng 08 năm 2017

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN 1

LỜI CAM ĐOAN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CÁC BẢNG vi

DANH MỤC CÁC HÌNH vii

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT viii

MỞ ĐẦU ……… 1

CHƯƠNG 1 – TỔNG QUAN 3

1.1 Đậu tương 3

1.1.1 Giới thiệu về đậu tương 3

1.1.2 Các thành phần có giá trị dinh dưỡng trong đậu tương 4

1.1.3 Phôi đậu tương 4

1.2 Isoflavones trong hạt và phôi đậu tương 5

1.2.1 Cấu trúc isoflavones 5

1.2.1.1 Genistein 6

1.2.1.2 Daidzein 8

1.2.1.3 Glycitein 9

1.2.2 Cơ chế tác động của isoflavones 9

1.2.3 Cơ chế hấp thu isoflavones 10

1.2.4 Tác dụng của isoflavones đối với sức khỏe 12

1.3 Tình hình nghiên cứu chiết xuất isoflavones trên thế giới và Việt Nam 16

CHƯƠNG 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊNCỨU 19

2.1 Nguyên vật liệu 19

2.1.1 Nguyên liệu 19

2.1.2 Hóa chất 19

2.1.3 Thiết bị 19

2.2 Phương pháp nghiên cứu 20

2.2.1 Phương pháp công nghệ 20

2.2.1.1 Phương pháp tách axit béo khỏi phôi đậu tương 20

2.2.1.2 Sàng lọc yếu tố có ý nghĩa cho quá trình trích ly isoflavones bằng dung môi ethanol và thu nhận chế phẩm isoflavones 20

2.2.1.3 Phương pháp quy hoạch thực nghiệm 20

2.2.1.4 Trích ly isoflavones bằng dung môi ethanol và thu nhận chế phẩm isoflavones 20

2.2.1.5 Xử lý dịch chiết thu được bằng enzyme 21

2.2.1.6 Tinh chế isoflavones 22

Tinh chế bằng dung môi ethyl acetat 23

Tinh chế isoflavones bằng phương pháp chiết pha rắn SPE 23

Tinh chế isoflavones bằng sắc kí cột mở 23

2.2.1.7 Xử lý số liệu 23

2.2.2 Phương pháp phân tích 23

2.2.2.1 Định tính bằng phản ứng hóa học đặc trưng với NaOH 23

2.2.2.2 Định tính bằng phản ứng hóa học đặc trưng với dung dịch chì acetat bão hòa (CH3COO)2Pb 24

2.2.2.3 Định tính bằng sắc kí bản mỏng 24

2.2.2.4 Định lượng isoflavones 24

CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27

3.1 Tối ưu hóa các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết cao tổng 27

3.1.1 Chọn miền khảo sát các yếu tố 27

3.1.2 Thiết kế mô hình thí nghiệm 27

3.1.3 Xây dựng mô hình toán học và tối ưu hóa 29

3.2 Tinh chế isoflavone 32

3.2.1 Kết quả chiết xuất và xử lý dịch sau chiết 32

+ Chiết xuất và thu nhận dịch chiết tổng số 32

+ Xử lý dịch chiết tổng số bằng enzyme β-glucosidase 32

+ Kết tủa protein bằng ethanol 32

3.2.2 Kết quả tinh sạch bằng sắc kí cột 33

3.2.3 Kết quả tinh sạch bằng chiết pha rắn SPE 33

3.2.4 Kết quả tinh sạch bằng dung môi ethyl acetat 34

3.3 Kết quả phân tích định tính isoflavones trong các mẫu dịch chiết isoflavones tổng số sau tinh sạch 34

3.3.1 Định tính bằng phản ứng hóa học đặc trưng với NaOH 34

3.3.2 Định tính bằng phản ứng hóa học đặc trưng với dung dịch chì acetat bão hòa (CH3COO)2Pb 36

3.3.3 Định tính bằng sắc kí bản mỏng 37

3.4 Kết quả phân tích định lượng isoflavones 39

KẾT LUẬN 45

KIẾN NGHỊ 46

TÀI LIỆU THAM KHẢO 47

PHỤ LỤC 50

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1: Thành phần dinh dưỡng trong 100g hạt đậu tương 4

Bảng 1.2: Tỷ lệ sử dụng đậu tương trung bình ở một số nước 13

Bảng 3.1: Giá trị mã hóa và giá trị khảo sát của các yếu tố thực nghiệm 27

Bảng 3.2: Ma trận thực nghiệm chiết xuất isoflavones tổng số 28

Bảng 3.3: Kết quả phân tích hồi quy 30

Bảng 3.4: Hàm lượng chất khô tuyệt đối trong các dịch chiết đã xử lý 33

Bảng 3.5: Khối lượng chất khô trong mẫu sau tinh sạch 34

Bảng 3.8: Độ tinh sạch của isoflavones sau tinh sạch bằng ba phương pháp 43

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1: Cấu trúc hóa học của 12 loại isoflavones trong đậu tương 6

Hình 1.2: Cấu trúc hóa học của genistein 6

Hình 1.3: Cơ chế thủy phân genistin 7

Hình 1.4: Cấu trúc hóa học của daidzein 8

Hình 1.5: Cấu trúc hóa học của glycitein 9

Hình 1.6: Qúa trình chuyển hóa thành equol 11

Hình 3.1: Bề mặt đáp ứng của từng cặp yếu tố ảnh hưởng đến lượng cao chiết thu được 31

Hình 3.2: Phản ứng định tính isoflavones với NaOH 35

Hình 3.3: Phản ứng định tính isoflavones với (CH3COO)2Pb 20% 37

Hình 3.4: Sắc ký đồ sắc kí bản mỏng 38

Hình 3.5: Phổ đồ HPLC mẫu tinh sạch bằng dung môi 42

Hình 3.6: Phổ đồ HPLC mẫu tinh sạch bằng sắc kí cột mở 42

Hình 3.7: Phổ đồ HPLC mẫu tinh sạch bằng phương pháp chiết pha rắn SPE 43

Sơ đồ 2.1: Quy trình tinh chế isoflavones 29

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

MỞ ĐẦU

Đậu tương (hay đậu nành) là một loại hạt rất phổ biến ở nước ta Đậu tương

có thành phần dinh dưỡng cao, giàu protein, lipid, vitamin và muối khoáng Protein đậu tương có phẩm chất tốt nhất trong số các protein thực vật bởi vì nó chứa đầy đủ các axit amin không thay thế Các điều tra về dịch tễ học đã chứng minh người Châu Á, đặc biệt là người Nhật Bản có thói quen sử dụng các thực phẩm từ đậu tương thì nguy cơ mắc các chứng bệnh thời kì mãn kinh, loãng xương, bệnh tim mạch, ung thư vú, ruột kết, ung thư tuyến tiền liệt thấp hơn nhiều so với các châu lục khác [6] Một trong những hoạt chất quý góp phần tạo nên các khả năng phòng bệnh, chữa bệnh của đậu tương là các isoflavones có hoạt tính estrogen

Isoflavones là các hợp chất phytoestrogen thực vật thuộc nhóm polyphenol,

cơ chế hoạt động và chức năng gần giống như hormone nữ trong cơ thể Các nghiên

cứu trên động vật và in vitro đã cung cấp những bằng chứng thuyết phục cho thấy

những tác động tích cực của isoflavones đến các bệnh ung thư phụ thuộc hormone Các nghiên cứu ở phụ nữ tiền mãn kinh cho thấy chế độ ăn với đậu tương giàu isoflavones có thể giảm các triệu chứng tiêu cực Trong nghiên cứu ở động vật, isoflavones làm giảm đáng kể sự hình thành khối u Ngoài ra, isoflavones được nhiều công trình khoa học chứng minh là có tác dụng giúp kéo dài tuổi thanh xuân, làm đẹp da và một số chức năng liên quan tới chống lão hóa Trên thế giới, isoflavones được tìm thấy trong một số loài thực vật như: đậu tương, cỏ ba lá, cỏ linh lăng, sắn dây cũng như nhiều loại đậu khác nhau, trong đó hàm lượng cao nhất

là ở đậu tương Hàm lượng isoflavone trong phôi được đánh giá là cao hơn hẳn so với các bộ phận khác của hạt 12 loại isoflavones được tìm thấy trong đậu tương được chia làm 4 nhóm: aglycone, glycoside, malonyl glycoside và acetyl glycoside, trong đó dạng glycoside chiếm đa số, nhưng dạng aglycone (bao gồm daidzein, genistein và glycitein) lại có hoạt tính cao hơn rất nhiều [6, 17]

Với điều kiện địa lý đặc thù với khí hậu nhiệt đới gió mùa nên Việt Nam có một thảm thực vật phong phú với tính đa dạng sinh học cao Sản lượng và diện tích trồng đậu tương ở nước ta liên tục tăng trong những năm vừa qua Đây là nguồn

nguyên liệu phong phú, thuận lợi cho nghiên cứu và sản xuất chế phẩm isoflavones

Để góp phần nghiên cứu và khai thác các chất có hoạt tính sinh học cao trong đậu

tương mà điển hình là isoflavones, chúng tôi thực hiện đề tài: ”Nghiên cứu tối ưu

điều kiện chiết xuất isoflavones từ mầm đậu tương và khảo sát một số hoạt tính

sinh học” đã được tiến hành gồm các nội dung chính sau:

- Nghiên cứu tối ưu hóa quy trình chiết xuất isoflavones bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm

- Nghiên cứu lựa chọn điều kiện tách chiết và tinh chế isoflavones từ mầm đậu tương

CHƯƠNG 1 – TỔNG QUAN

1.1 Đậu tương

1.1.1 Giới thiệu về đậu tương

Đậu tương hay đỗ tương, đậu nành, tên khoa học là Glycine max (L) Merrill,

thuộc bộ Đậu (Fabales), phân họ Cánh bướm Fabaceae (Papilionaceae) Đậu tương

là cây thân thảo hàng năm Thân cây mảnh, có lông, cao từ 0,8-0,9 m, cành hướng lên trên Lá mọc cách, có ba lá chét hình trái xoan, đầu lá gần nhọn, hơi không đều

ở gốc Hoa màu trắng hoặc màu tím, xếp thành chùm Qủa thõng, hình lưỡi liềm, gân bị ép, trên quả có nhiều lông mềm màu vàng, tập trung ở giữa các hạt Hạt đậu tương màu vàng là loại tốt nhất nên được trồng và sử dụng nhiều nhất [1,6]

Đậu tương có nguồn gốc từ Trung Quốc sau đó được truyền bá sang Nhật Bản vào thế kỉ thứ 8, rồi dần có mặt ở các nước Châu Á khác như Thái Lan, Malaysia, Hàn Quốc, Việt Nam Đầu thế kỉ 18, đậu tương được đưa sang Châu Âu, rồi du nhập vào Châu Mỹ và phát triển mạnh ở những nước thuộc miền Trung Mỹ

và đồng bằng sông Missisipi [1]

Đậu tương được coi là loại thực phẩm quan trọng chỉ đứng sau lúa mì, lúa nước và ngô Đậu tương có thể trồng trong suốt mùa hè và mùa thu, trồng xen trên các cánh đồng lúa Ngày nay, Hoa Kỳ đang đứng đầu thế giới về sản lượng đậu tương toàn thế giới, sau đó đến Trung Quốc và Ấn Độ Tại Việt Nam, đậu tương đang được trồng tại 25 trong số 63 tỉnh thành cả nước, với khoảng 65% diện tích tại các khu vực phía Bắc và 35% diện tích tại các khu vực phía Nam

Hạt đậu tương có giá trị kinh tế cao Hạt có nhiều hình dạng như tròn, dẹt và

có thể có các màu vàng, xanh, trắng Trong đó hạt có màu vàng có giá trị dinh dưỡng và kinh tế cao nhất

Hạt đậu tương có ba bộ phận:

+ Vỏ hạt: Chiếm 8% trọng lượng hạt Vỏ hạt là lớp ngoài cùng, dễ ngấm nước và dính với phôi ở một rãnh nhỏ hình bầu dục Vỏ có tác dụng bảo vệ phôi trong quá trình tàng trữ Vỏ chứa sắc tố anthocyanin quyết định màu sắc của hạt

+ Phôi: Chiếm 2% trọng lượng hạt Phôi là rễ mầm, là phần sinh trưởng của hạt khi hạt lên mầm

+ Tử diệp: Chiếm 90% trọng lượng hạt Gồm hai lá mầm tích trữ chất dinh dưỡng của hạt, chiếm phần lớn khối lượng hạt

1.1.2 Các thành phần có giá trị dinh dưỡng trong đậu tương

Hạt đậu tương có thành phần dinh dưỡng cao, hàm lượng protein trung bình

từ 38 - 40%, lipid từ 18 - 20%, giàu nguồn sinh tố và muối khoáng Đậu tương là loại hạt duy nhất mà giá trị của nó được đánh giá đồng thời cả ở protein và lipid Protein đậu tương có phẩm chất tốt nhất trong số các protein thực vật, với hàm lượng protein từ 38 - 40%, cao hơn ở thịt, cá và gấp hai lần hàm lượng protein có trong các loại đậu đỗ khác Hàm lượng của các axit amin có chứa lưu huỳnh như methionin, cystein trong đậu tương tương đương với hàm lượng các chất này trong trứng Hàm lượng casein, đặc biệt là của lysine rất cao, gần gấp rưỡi trong trứng Vì thế khi nói tới giá trị của protein đậu tương cao là nói tới sự đầy đủ và cân đối của các loại axit amin thiết yếu [8]

Bảng 1.1: Thành phần dinh dưỡng trong 100g hạt đậu tương [5]

1.1.3 Phôi đậu tương

Phôi đậu tương (soy germ) là một bộ phận của hạt đậu tương, là bộ phận duy trì và đảm bảo sự sống của hạt và sẽ phát triển thành một cây mới Hạt đậu tương bao gồm vỏ hạt, hai lá mầm và phôi Các hoạt chất sinh học và chất dinh dưỡng cần

thiết là khác nhau ở các bộ phận khác nhau Phôi chỉ chiếm 2% trọng lượng hạt nhưng lượng isoflavones trong phôi được đánh giá là cao hơn hẳn trong vỏ hạt và lá mầm Theo nghiên cứu của Tiến sĩ Berhow (USDA-ARS), lá mầm chứa 0,13 - 0,35% isoflavones, còn trong phôi chứa 0,97 - 2,07% isoflavones [16] Ngoài ra phôi đậu tương chứa 40% protein, axit béo thiết yếu, omega 3 và 6, lecthin, vitamin

và saponin

Phôi đậu tương là một trong các phụ phẩm của công nghiệp chế biến hạt đậu tương Hạt đậu tương sau khi thu hoạch được làm sạch và bảo quản Khi bắt đầu chế biến, hạt đậu được làm sạch một lần nữa sau đó sấy khô Sau khi đảm bảo độ ẩm thích hợp là 6 - 8%, hạt đậu được phá mảnh sau đó thổi khí để tách vỏ Các mảnh và phôi đậu tương đi qua thiết bị sàng với kích thước lỗ sàng thích hợp để phân tách mảnh và loại riêng phôi đậu tương

1.2 Isoflavones trong hạt và phôi đậu tương

Năm 2005, các nhà khoa học Brazil đã tiến hành phân tích 18 mẫu đậu tương Kết quả cho thấy isoflavones tồn tại ở dạng tự do (aglycone) và dạng liên kết (glycoside), bao gồm: daidzin, genistin, glycitin, các malonyl và acetyl tương ứng của chúng Trong một số trường hợp chúng có mặt ở cả bốn dạng hóa học với mỗi dạng chứa ba đồng phân tạo nên 12 loại Dạng aglycone gồm daidzein, genistein và glycitein Dạng glycoside gồm: daidzin, genistin, glycitin Dạng glycoside kết hợp với nhóm acetyl (6OAceGlc) gồm: 6’’- O-acetyl daidzin, 6’’- O-acetyl genistin, 6’’- O-acetyl glycitin Dạng glycoside kết hợp với nhóm malonyl (6OMalGlc) gồm: 6’’- O-malonyl daidzin, 6’’- O-malonyl genistin, 6’’- O-malonyl glycitin Cấu trúc cơ

bản của isoflavones gồm 2 vòng benzen (A) và (B) nối với một dị vòng pyron (C) [11]

Năm 2007, các nhà khoa học Hàn Quốc đã thực hiện nghiên cứu so sánh hàm lượng isoflavones trong phôi, lá mầm, hạt và vỏ hạt đậu tương Kết quả cho thấy tỷ lệ trung bình của isoflavones trong phôi là 2887µg/g, trong hạt là 575µg/g, trong lá mầm 325µg/g, và trong vỏ hạt là 33µg/g Như vậy trong hạt đậu tương thì isoflavones tập trung phần lớn ở phôi [13]

Hình 1.1: Cấu trúc hóa học của 12 loại isoflavones trong đậu tương

Hàm lượng aglycone (daidzein, genistein, glycitein) trong đậu tương không cao (0,2 - 1,5mg/g) nhưng chúng lại là những phytoestrogen có hoạt tính sinh học cao, được cơ thể hấp thu nhanh hơn, với lượng lớn hơn so với dạng glycoside Trong đó, aglycone glycitein có hoạt tính mạnh hơn cả daidzein và genistein, mặc

dù nó chỉ chiếm khoảng 5 - 10% tổng lượng isoflavones

1.2.1.1 Genistein

Hình 1.2: Cấu trúc hóa học của genistein

Genistein là chất đầu tiên được tìm thấy trong các isoflavones và có hàm lượng cao trong đậu tương Hầu hết các loại thực phẩm đậu tương chứa khoảng 1 - 2mg genistein trên mỗi gram protein [12] Genistein thuộc dạng aglycone của isoflavones genistin, có tên đầy đủ là 7-Dihydroxy-3-(4-hydroxyphenyl) chromen-4-one hay 4',5,7- trihydroxyisoflavones, công thức phân tử là C15H10O5

Genistein đã được chứng minh là một phytoestrogen và có khả năng phát huy nhiều tác dụng cũng như ảnh hưởng khác nhau khi có mặt trong cơ thể Trong

số các isoflavones, genistein có hoạt động của estrogen mạnh nhất Genistein giúp chống lại bệnh loãng xương, làm giảm bớt các triệu chứng thời kỳ mãn kinh, giảm nguy cơ một số bệnh ung thư liên quan đến hormone, chủ yếu là ung thư vú và ung thư tuyến tiền liệt, ức chế tổng hợp cholesterol và este hóa cholesterol [12] Nhưng trong đậu tương hàm lượng genistin (thuộc dạng glycoside) lại nhiều hơn so với lượng aglycone genistein Naim và cộng sự đã chỉ ra rằng 99% isoflavones trong đậu tương được tìm thấy ở dạng glycoside [21] Genistin có cấu trúc hóa học tương

tự genistein là 4',5,7- trihydroxyisoflavones -7- glycoside, chỉ khác ở liên kết với phân tử D-glucoza nhờ liên kết β

- Qúa trình thủy phân genistin thành genistein:

Qúa trình xảy ra khi genistin bị enzym glucosidase cắt ở liên kết glycoside, loại đi phân tử glucoza để chuyển hóa thành genistein không tan trong nước

β-Hình 1.3: Cơ chế thủy phân genistin

- Sự hấp thụ genistein:

Genistein được hấp thụ tốt trong ruột, sau đó được chuyển tới máu, vào gan, ống mật và quay trở lại ruột Genistein ở dạng aglycone được hấp thu nhiều hơn so với genistin ở dạng glycoside [17]

1.2.1.2 Daidzein

Hình 1.4: Cấu trúc hóa học của daidzein

Daidzein là dạng aglycone của daidzin Dạng isoflavones này được tìm thấy trong tự nhiên ở dạng daidzin glycoside 6’’- O-malonyl genistin và 6’’- O-acetyl daidzin Daidzein liên kết với các thụ thể estrogen, có cả hoạt tính estrogen yếu cũng như tác dụng chống lại estrogen Daidzein là loại isoflavones nhiều thứ hai trong đậu tương Trong các sản phẩm từ đậu tương không lên men như đậu phụ, daidzein chủ yếu ở dạng glycoside, còn trong các sản phẩm lên men như natto, miso, tempeh thì dạng aglycone daidzein chiếm hàm lượng nhiều hơn

Daidzein được tạo thành từ glycoside daidzin Qúa trình lên men hoặc tiêu hóa các thực phẩm đậu tương giúp cắt đứt các phân tử đường của glycoside daidzin tạo ra aglycone daidzein Điều này thường xảy ra trong dạ dày (thủy phân axit) và trong ruột (hoạt động của enzym vi khuẩn) Sau đó, nó có thể được hấp thu vào máu hoặc được chuyển hóa hơn nữa bằng vi khuẩn đường ruột tạo thành chất chuyển hóa equol và O-desmethylangolensin (O-DMA) Mức độ trao đổi chất này là khác nhau

ở mỗi người và phụ thuộc vào lượng vi khuẩn có trong đường ruột và chế độ ăn hàng ngày Theo nghiên cứu, sau khi hấp thu, khoảng 80 - 90% daidzein chuyển thành O-DMA, và khoảng 30 - 50% daidzein chuyển hóa thành equol (equol có khả năng chống oxi hóa rất lớn và hoạt tính estrogen, cao gấp khoảng 100 lần so với daidzein) [12,17]

Daidzein là chất rắn hầu như không tan trong nước, có khả năng làm giảm các tác nhân gây ung thư vú, chống xơ vữa động mạch và hội chứng loãng xương Daidzein được cho rằng có thể kích thích sự tạo thành các tế bào xương Ngoài ra nó còn là một nhân tố trao đổi của quá trình tổng hợp ipriflavone Ipriflavone được chứng minh là có khả năng chống lại hiện tượng loãng xương ở cả người và động vật

1.2.1.3 Glycitein

Hình 1.5: Cấu trúc hóa học của glycitein

Glycitein là dạng aglycone của glycitin Glycitein là một isoflavones methyl hóa, có hàm lượng ít nhất, khoảng 5 - 10% isoflavones tổng số trong đậu tương Glycitein là một phytoestrogen với hoạt tính estrogen yếu hơn so với các isoflavones khác Tuy nhiên, trong phôi đậu tương, glycitein chiếm khoảng 40%

Glycitein là chất rắn, tan rất ít trong nước Nó có cấu trúc hóa học tương

tự daidzein và genistein, ngoại trừ khả năng chống oxi hóa thì các hoạt tính khác của glycitein không giống như hai chất còn lại, do một chút khác nhau về cấu trúc hóa học đã tạo nên sự khác biệt về hoạt tính sinh học So với isoflavones trong đậu tương thì hoạt tính estrogen của glycitein thấp hơn 20 lần so với daidzein và 200 lần

so với 17β-estradiol [15]

Các nghiên cứu chỉ ra rằng, sau khi sử dụng thực phẩm từ đậu tương, glycitein được tìm thấy trong huyết tương, điều đó chứng tỏ nó có cơ chế hấp thụ tương tự như daidzein và genistein [15]

1.2.2 Cơ chế tác động của isoflavones

Từ lâu thói quen sử dụng nhiều sản phẩm từ đậu tương đã đem lại nhiều lợi ích cho sức khỏe Isoflavones là chủ đề của nhiều nghiên cứu khoa học, chứng minh bằng hơn 1700 ấn phẩm khoa học có đề cập đến isoflavones Các nghiên cứu dịch tễ học cũng cho thấy người Châu Á với thói quen tiêu thụ một lượng lớn các sản phẩm

từ đậu tương từ đó làm giảm nguy cơ mắc bệnh ung thư vú, ung thư tuyến tiền liệt, các triệu chứng mãn kinh, bệnh tim và loãng xương [17] Điều đó được giải thích bởi khả năng liên kết với thụ thể estrogen và do quá trình trao đổi hormone hoặc ức chế sự tăng sinh tế bào của isoflavones Thêm vào đó, do có cấu trúc giống như estrogen của cơ thể nên isoflavones được gọi là các phytoestrogen, các hợp chất tự nhiên có hoạt tính estrogen

Trong thập niên 80, các nhà khoa học đã phát hiện ra thụ thể α và β của estrogen Estrogen hoạt động bằng cách liên kết với các thụ thể trên tế bào, từ đó tạo ra một số phản ứng Thụ thể α có liên quan tới nguy cơ ung thư gây ra bởi estrogen Mặt khác, các thụ thể β chỉ có những tác động có lợi Vị trí và số lượng của hai loại thụ thể trong tế bào và các cơ quan là khác nhau Điều này giải thích tại sao isoflavones lại hoạt động khác so với estrogen mặc dù cấu trúc của chúng là tương tự nhau Isoflavones vừa có hoạt tính estrogen, lại vừa kháng estrogen Khi nồng độ của estrogen tự nhiên thấp, isoflavones tác động bằng cách kích hoạt các thụ thể β Khi cơ thể sản sinh nhiều estrogen, ví dụ ở thanh niên, các isoflavones liên kết với các thụ thể α, và ngăn cản estrogen tự nhiên liên kết với các thụ thể này Như vậy, isoflavones kích hoạt thụ thể β, tạo ra các hoạt tính estrogen có lợi Mặt khác, isoflavones bảo vệ cơ thể khỏi các thụ thể α do đó làm giảm nguy cơ ung thư liên quan estrogen Các thụ thể β được tìm thấy chủ yếu trong các tế bào máu, phổi, tuyến tiền liệt, bàng quang, tế bào xương và tuyến ức Isoflavones kích thích chức năng của chúng ngay sau khi mức độ estrogen giảm Các thụ thể α được tìm thấy chủ yếu trong mô vú, tử cung, buồng trứng, tinh hoàn và gan Ở đó, isoflavones bảo

vệ chống lại các liên kết với estrogen và giúp giảm hình thành các khối u [15]

1.2.3 Cơ chế hấp thu isoflavones

Isoflavones tồn tại trong thực phẩm ở dạng glycoside (daidzin, genistin, glycitin), có cấu trúc mạch vòng liên kết với phân tử đường Sau khi tiêu thụ sản phẩm đậu tương, glycoside được hấp thu ở ruột non ít hơn so với dạng aglycone do

có khối lượng phân tử lớn và có tính ưa nước Các glycoside phải biến đổi về cấu trúc để có hoạt tính sinh học cao hơn Sự thủy phân ban đầu như vậy là cần thiết để

giải phóng các aglycone tự do, các aglycone này được hấp thu nhanh qua khuếch tán thụ động ở các lông nhung của ruột có độ hấp thụ cao Qúa trình thủy phân này xảy ra dưới tác dụng của enzym β-glucosidase Enzym này có thể hoạt động ngay trong chính bản thân thức ăn, trong tế bào của niêm mạc ruột non hoặc sinh ra bởi

hệ vi sinh vật trong ruột già Aglycone nhanh chóng được hấp thu, và đạt mức đỉnh trong huyết tương ở khoảng 5 giờ sau khi ăn Sau đó nó có thể tiếp tục được chuyển hóa thành chất có hoạt tính sinh học cao hơn như equol [8, 15, 17]

Hình 1.6: Qúa trình chuyển hóa thành equol

Hệ vi khuẩn đường ruột có ảnh hưởng lớn tới sự trao đổi chất isoflavones Khi số lượng vi khuẩn trong đường ruột thấp, như khi sử dụng thuốc kháng sinh, quá trình chuyển hóa daidzein thành equol giảm Chế độ ăn uống cũng tác động lớn tới qúa trình này Khi chế độ ăn giàu cacbonhydrat, quá trình lên men trong đường ruột tăng lên, sản sinh nhiều equol hơn Khi chế độ ăn nhiều chất béo, hệ vi sinh đường ruột gặp nhiều khó khăn trong việc tổng hợp equol từ isoflavones [8]

Sau khi β-glucosidase cắt phân tử đường, aglycone được khuếch tán qua màng vào chu trình ruột Từ đó quá trình chuyển hóa isoflavones diễn ra ở ruột và gan, và xảy ra giống như với estrogen nội sinh (estradiol) Trong chu trình nội bào,

glucuronosyltransferase và gắn với sulphat bằng sulfotransferase Từ đó xảy ra quá trình glucuronid hóa và quá trình sunphat hóa ở trong gan Các chất tiếp hợp

glucuronid và sulphat có thể di chuyển thông qua hệ tuần hoàn mô, rồi được bài tiết qua thận hoặc mật và cuối cùng trở về ruột Sau khi vi khuẩn đường ruột phá vỡ liên hợp, isoflavone aglycones có thể được hấp thu lại, sau đó quay trở lại gan thông qua tĩnh mạch chính để tiếp hợp lại và được bài tiết qua thận [17]

1.2.4 Tác dụng của isoflavones đối với sức khỏe

Đậu tương là nguồn cung cấp canxi, chất xơ, chất sắt, và các vitamin nhóm

B Trong những năm gần đây, isoflavones được tập trung nghiên cứu nhiều hơn cả

vì nó có cấu trúc tương tự như hormone sinh dục nữ estrogen Theo nghiên cứu, có một mối liên hệ chặt chẽ giữa những bữa ăn giàu chất béo với các bệnh ung thư Chế độ ăn uống giàu đậu nành của người Châu Á giúp bảo vệ chống lại sự phát triển của các bệnh ung thư phụ thuộc hormone và bệnh tim mạch Các isoflavones,

cụ thể là genistin và daidzin được chuyển hóa thành genistein và daidzein Chúng được coi là cần thiết cho sự hoạt động của ruột, tim, gan, thận và dạ dày Hai thập

kỷ trước, lợi ích của isoflavones đối với sức khỏe đã được chứng minh Các tác dụng có thể kể đến như cải thiện bệnh tim mạch, các bệnh ung thư phụ thuộc hormone như ung thư vú, buồng trứng, ung thư tuyến tiền liệt, bệnh tim, bệnh loãng xương, và giảm các triệu chứng ở phụ nữ sau mãn kinh [17]

Chống ung thư

Với chế độ ăn mỗi ngày sử dụng chế phẩm từ đậu tương hoặc một ly sữa đậu nành là có thể phòng ngừa được nhiều loại ung thư như ung thư vú, ung thư phổi, ruột, trực tràng, dạ dày hay ung thư tuyến tiền liệt Phụ nữ châu Á với chế độ ăn kiêng chủ yếu sử dụng sữa đậu nành thì tỷ lệ ung thư vú giảm hơn hẳn so với phụ nữ phương Tây

Bảng 1.2: Tỷ lệ sử dụng đậu tương trung bình ở một số nước [25]

STT Tên nước Hàm lượng sử dụng đậu

tương trung bình (g/người/ngày)

Tỷ lệ mắc bệnh ung thư (%)

Nghiên cứu dịch tễ học cho thấy, tỷ lệ mắc bệnh ung thư tuyến tiền liệt thường thấp hơn ở các nước có thói quen sử dụng nhiều sản phẩm đậu tương trong bữa ăn hàng ngày Tỷ lệ tử vong do ung thư tuyến tiền liệt ở Nhật Bản thấp hơn 9 lần so với Hoa Kỳ Isoflavones được đề xuất như một chất có tác dụng bảo vệ này Một nghiên cứu trước đây tiến hành tại đại học Y khoa Nara Nhật Bản đã cho rằng equol (được chuyển hóa từ daidzein bởi vi khuẩn đường ruột) có tác dụng ngừa ung thư tuyến tiền liệt Cũng tại đây, một nghiên cứu mới được thực hiện xác định mối liên hệ giữa isoflavones và nguy cơ ung thư tuyến tiền liệt Nghiên cứu đối chứng giả dược được tiến hành ngẫu nhiên trên 158 người đàn ông Nhật Bản từ 50 - 75 tuổi bị giảm chức năng tuyến tiền liệt và cơ thể của một nửa số người trong đó không thể sản xuất equol Kết quả cho thấy chỉ có một trường hợp bị ung thư tuyến tiền liệt, các trường hợp còn lại đều chứng tỏ rằng điều trị bằng isoflavones không làm tăng lên mức độ PSA (Prostate - Specific Antigen), là một protein được sản xuất bởi các tế bào của tuyến tiền liệt Mức độ PSA trong máu thường cao ở những người đàn ông bị ung thư tuyến tiền liệt Như vậy isoflavones làm giảm đáng kể nguy cơ ung thư tuyến tiền liệt [20]

Các nhà khoa học đã nghiên cứu mối quan hệ giữa isoflavones trong đậu tương và các bệnh nhân ung thư vú Genistein, một loại isoflavones có khả năng kích hoạt các thụ thể estrogen ở các tế bào, kể cả tế bào ung thư ER+ (estrogen- receptor positive) Khi đó cả tế bào vú bình thường và tế bào ung thư đều nhận được

tín hiệu từ genistein để thúc đẩy tăng trưởng Tiến sĩ Shu và cộng sự đã trình bày trong cuộc họp thường niên năm 2011 của hiệp hội nghiên cứu ung thư Mỹ kết quả nghiên cứu của họ về sự an toàn của isoflavones đậu tương đối với 16000 phụ nữ bị ung thư vú Họ đã tìm ra rằng phụ nữ tiêu thụ một lượng lớn isoflavones đậu tương thì nguy cơ tử vong do ung thư vú giảm 9% và nguy cơ tái phát giảm 15% Từ đó khẳng định lợi ích của các thành phần từ đậu tương đặc biệt là isoflavones trong chế

độ ăn uống của phụ nữ, bao gồm cả những người bị ung thư vú [17]

Giảm nguy cơ mắc bệnh tim mạch

Protein đậu tương và isoflavones đã đạt được sự chú ý đáng kể với vai trò tiềm năng trong việc cải thiện các yếu tố nguy cơ bệnh tim mạch có liên quan đến mạch vành Cục Quản lý thực phẩm và dược phẩm Mỹ (FDA) đã phê duyệt ghi nhãn mác với thực phẩm có chứa protein đậu tương như một sản phẩm hỗ trợ chống lại bệnh mạch vành Quyết định này được đưa ra dựa trên kết luận dùng 20 - 50g protein đậu tương mỗi ngày có thể giảm được cholesterol tổng số và LDL-cholesterol [23]

Nghiên cứu trước đây chỉ ra rằng isoflavones trong đậu tương kích hoạt hoạt động của của enzym nitric oxide synthase nội mô, dẫn đến tăng sản xuất nitric oxide, làm giảm huyết áp Safiya Richardson và nhóm của bà đã nghiên cứu mối liên hệ giữa isoflavones và huyết áp với hơn 5000 người Mỹ trong thời gian 20 năm Kết quả nghiên cứu được trình bày tại hội nghị lần thứ 61 của Hội khoa học tim mạch Mỹ diễn ra hàng năm Họ phát hiện ra rằng những bệnh nhân cao huyết áp

có lượng isoflavones thấp hơn người bình thường, đặc biệt là người Mỹ gốc Phi Lượng sử dụng isoflavones nhiều nhất (> 2,5mg/ngày) có thể làm giảm 5,5mmHg huyết áp tâm thu và còn có thể giảm 10mmHg nếu tăng liều lượng sử dụng lên đối với những người bị cao huyết áp Nghiên cứu kết luận rằng đối với tất

cả mọi người khi sử dụng tối thiểu 2,5mg isoflavones/người/ngày có thể giúp giảm huyết áp tâm thu Đây là một kết luận đáng ngạc nhiên khi trên thực tế, người châu

Á thường sử dụng từ 40 đến 80mg isoflavones mỗi ngày [24]

Chống loãng xương

Loãng xương là hiện tượng tăng phần xốp của xương do giảm số lượng tổ chức xương, là hậu quả của việc suy giảm các khung protein và lượng canxi gắn với các khung này Cứ 5 phụ nữ Mỹ trên 50 tuổi thì có 1 người bị loãng xương Loãng xương là hậu quả của sự phá vỡ cân bằng bình thường của hai quá trình tạo xương

và hủy xương, quá trình tạo xương suy giảm trong khi quá trình hủy xương bình thường Đặc biệt, phụ nữ mãn kinh dễ bị loãng xương do nồng độ estrogen tự nhiên trong cơ thể bị giảm mạnh, dẫn đến thiếu lượng estrogen để thúc đẩy quá trình tạo xương, trong khi vẫn diễn ra quá trình hủy xương Một phương pháp hiệu quả điều trị bệnh loãng xương là liệu pháp thay thế hormone, nhưng phương pháp này lại làm tăng nguy cơ ung thư vú và ung thư nội mạc tử cung Với cấu trúc tương tự như estrogen, isoflavones trong đậu tương đang được nghiên cứu rộng rãi do các tác động tích cực lên mật độ xương cũng như giúp ngăn ngừa loãng xương [17, 31]

Nghiên cứu dịch tễ học cho thấy rằng phụ nữ có thói quen sử dụng thực phẩm đậu tương trong bữa ăn hàng ngày thì ít có nguy cơ loãng xương hơn những người có chế độ ăn uống phương Tây Pan Wei và các cộng sự thuộc Đại học Tứ Xuyên Trung Quốc đã tiến hành một phân tích tổng hợp từ các thử nghiệm lâm sàng

và đi đến kết luận rằng isoflavones trong đậu tương giúp tăng mật độ xương, đặc biệt là ở cột sống thắt lưng Họ cũng phát hiện ra rằng bổ sung isoflavones giúp giảm hàm lượng deoxypyridinoline trong nước tiểu (một dấu hiệu của quá trình hủy xương) Các nhà nghiên cứu kết hợp các kết quả của 14 thử nghiệm ngẫu nhiên về ảnh hưởng của chất isoflavones trong đậu tương lên loãng xương Sử dụng isoflavones đậu tương trong 1 tháng đến 2 năm giúp tăng mật độ xương 54%, trong khi deoxypyridinoline tiết niệu giảm 23% Như vậy, tương tự như estrogen trong cơ thể, isoflavones trong đậu tương có thể giúp ngăn ngừa loãng xương ở phụ nữ mãn kinh [29]

Giảm các chứng bệnh thời kì mãn kinh

Mãn kinh là một quá trình sinh học tự nhiên Thay đổi nội tiết gây ra các triệu chứng thể chất của thời kì mãn kinh Sự giảm tiết estrogen ở buồng trứng phụ

nữ tiền mãn kinh có thể phát sinh nhiều hội chứng như bốc hỏa, ra mồ hôi, mất ngủ, buồn phiền Phương pháp điều trị nội tiết tố thường được sử dụng để giảm chứng bốc hỏa Nhưng do những tác dụng phụ như tăng nguy cơ ung thư vú nên nhiều phụ

nữ đang tìm kiếm các phương pháp điều trị thay thế Isoflavones đậu tương được đưa ra như một giải pháp Nghiên cứu trước đây chỉ ra rằng, phụ nữ châu Á đã có thói quen sử dụng nhiều sản phẩm từ đậu thì ít xuất hiện các cơn bốc hỏa hơn các phụ nữ phương Tây Điều đó chứng tỏ isoflavones đóng một vai trò quan trọng trong việc kiểm soát các cơn bốc hỏa ở phụ nữ mãn kinh [17]

Tại Viện Sức khỏe Quốc gia Tokyo, Tiến sĩ Taku và đồng nghiệp đã tiến hành một nghiên cứu đánh giá dựa trên 17 thử nghiệm ngẫu nhiên về tác động của isoflavones trong đậu tương vào tần số và mức độ nghiêm trọng của các cơn bốc hỏa Kết quả cho thấy sử dụng 54mg isoflavones đậu tương hàng ngày trong 6 tuần đến 1 năm giúp giảm 20% tần suất xuất hiện các cơn bốc hỏa, đồng thời cũng làm giảm mức độ nghiêm trọng xuống 26% Các nhà nghiên cứu cũng cho thấy bổ sung chế phẩm isoflavones có chứa 18,8mg genistein có tác dụng gấp đôi trong trường hợp này Kiểm tra kết quả sau 12 tuần sử dụng cho thấy tần số của các cơn bốc hỏa giảm hơn ba lần Cơ chế tác động chính của isoflavones trong đậu tương được các nhà nghiên cứu đưa ra là có thể do sự giống nhau về cấu trúc giữa isoflavones và estrogen nội sinh trong cơ thể Như vậy bổ sung isoflavones đậu tương là một phương pháp hiệu quả trong việc làm giảm mức độ nghiêm trọng và tần số của các cơn bốc hỏa [27]

1.3 Tình hình nghiên cứu chiết xuất isoflavones trên thế giới và Việt Nam

Trong 20 năm qua, một lượng lớn các nghiên cứu về ảnh hưởng của việc tiêu thụ thực phẩm từ đậu tương tới sức khỏe con người đã được tiến hành, trong đó phần lớn là nghiên cứu sự có mặt của hợp chất isoflavones trong đó Isoflavones lần đầu tiên được cộng đồng khoa học chú ý đến là vào những năm 1940 Nhưng phải đến những năm 1990, các nghiên cứu được tài trợ bởi Viện Ung thư Quốc gia Hoa

Kỳ về vai trò của đậu tương trong phòng chống bệnh mới bắt đầu nhận được sự chú

ý rộng rãi Sau đó, isoflavones và thực phẩm từ đậu tương đã được nghiên cứu về

khả năng làm giảm bớt hội chứng bốc hỏa và hạn chế loãng xương ở phụ nữ mãn kinh Năm 1995, protein đậu tương thu hút sự chú ý của toàn thế giới với khả năng làm giảm cholesterol Cùng lúc này, isoflavones bắt đầu được thảo luận rộng rãi như lựa chọn thay thế tiềm năng cho liệu pháp hormone thông thường

Tại Hàn Quốc, các nhà khoa học đã nghiên cứu so sánh thành phần isoflavones trong hạt, phôi, lá mầm và vỏ hạt của 9 giống đậu tương khác nhau bằng cách sử dụng sắc kí lỏng hiệu năng cao HPLC Kết luận, phôi của đậu tương là bộ phận chứa nhiều isoflavones nhất và trong các dạng của isoflavones thì malonyl glycoside là dạng phổ biến nhất chiếm 66 - 79% tổng hàm lượng isoflavones [13]

Tại Trung tâm Nghiên cứu dược phẩm, Đại học Coimbra, Bồ Đào Nha,

Maria G Campos và cộng sự đã thực hiện các thí nghiệm lâm sàng, in vivo và in

vitro về các các trường hợp ăn hạt đâu tương và các snr phẩm từ đậu tương Mục

tiêu của nghiên cứu là xác định hàm lượng của các loại isoflavones trong hạt và khảo sát việc bổ sung isoflavones vào các chế phẩm thuốc viên OTC Isoflavones được phân tích bằng HPLC/DAD [18]

Tại Trung Quốc, Zhang và cộng sự đã nghiên cứu về quá trình chiết xuất và tinh chế isoflavones từ bột đậu tương, mục tiêu là tối ưu hóa các quá trình để thu được lượng isoflavones cao nhất Nghiên cứu sử dụng HPLC để phân tích và khảo sát hàm lượng isoflavones và hoạt tính estrogen Từ đó, các kết quả có thể ứng dụng làm dữ liệu trong liệu pháp estrogen [31]

Tại Mỹ và Nhật Bản cũng có nhiều nghiên cứu về quá trình sản xuất, chiết xuất cũng như ứng dụng của isoflavones trong việc phòng và chống lại các chứng bệnh thời kì mãn kinh, loãng xương, bệnh tim mạch, ung thư vú, ruột kết, ung thư tuyến tiền liệt

Tại Việt Nam, đã có các công trình nghiên cứu về chiết xuất cũng như ứng dụng của isoflavones trong lĩnh vực thực phẩm và dược phẩm Hiện nay, tại Công

ty TNHH Dược Phẩm Ích Nhân đã có một số sản phẩm bổ sung isoflavones với tác dụng cân bằng nội tiết tố nữ dành cho phụ nữ bị suy giảm nội tiết tiền mãn kinh và mãn kinh như viên uống Bảo Xuân và viên uống Sắc Xuân Thực phẩm chức năng

Tố Nữ Nhất Nhất của Công ty TNHH Nhất Nhất có bổ sung 50mg chiết xuất mầm đậu nành/1 viên 800 mg là một sản phẩm giúp kích thích cơ thể sản sinh nội tiết tố

nữ estrogen, điều hòa kinh nguyệt, hạn chế các triệu chứng tiền mãn kinh

CHƯƠNG 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

- Máy xay đậu tương (Trung Quốc)

- Máy cô quay chân không IKA (Đức, sản xuất tại Malaysia)

- Bộ chiết pha rắn SPE (Supelco, Mỹ)

- Máy ly tâm (Trung Quốc)

- Máy đo pH (HANNA, Ý)

- Máy khuấy từ gia nhiệt IKA (Đức)

- Tủ ấm, tủ sấy Sanyo (Nhật Bản)

- Cân phân tích Libror (Nhật Bản)

- Cân phân tích độ ẩm (Sartorius - Đức)

- Bình lóng

- Dụng cụ chạy sắc kí bản mỏng

- Các dụng cụ khác: Bình tam giác, cốc đong, bình định mức, pipet,

bể ổn nhiệt, giấy lọc

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp công nghệ

2.2.1.1 Phương pháp tách axit béo khỏi phôi đậu tương

Bột phôi đậu tương đã được nghiền tới kích thước 0,1mm được sử dụng để làm nguyên liệu cho quá trình tách béo bằng phương pháp chiết động

Điều kiện cho quá trình tách béo bột đậu tương bằng n-hexan: tỷ lệ nguyên liệu/dung môi = 1/5, thời gian 7 giờ, nhiệt độ 40oC [7] Thí nghiệm được tiến hành với 30g bột đậu nành được ngâm tách béo trong bình tam giác với 150 ml n-hexan trong máy lắc với tốc độ 200 vòng/phút trong 7 giờ, ở 40oC Mẫu được lọc qua giấy lọc, loại bỏ dịch chứa n-hexan và chất béo hòa tan Bột sau khi lọc được sấy khô, loại hoàn toàn n-hexan Sau đó dùng cân phân tích độ ẩm của bột sau tách béo và định lượng chất béo được tách ra

2.2.1.2 Sàng lọc yếu tố có ý nghĩa cho quá trình trích ly isoflavones bằng dung môi ethanol và thu nhận chế phẩm isoflavones

Sử dụng phương pháp tối ưu cổ điển là một cách có hiệu quả để sàng lọc các thông số ảnh hưởng chính trong một lượng lớn các yếu tố của quá trình tối ưu Từ

đó, lựa chọn được giá trị của các yếu tố có mức ảnh hưởng đến hiệu suất chiết xuất isoflavones Các yếu tố ảnh hưởng được lựa chọn là thời gian, nồng độ ethanol, pH

và tỷ lệ nguyên liệu/dung môi [4]

2.2.1.3 Phương pháp quy hoạch thực nghiệm

Xác định giá trị tối ưu của 4 yếu tố ảnh hưởng thời gian, nồng độ ethanol, pH

và tỷ lệ nguyên liệu/dung môi bằng cách sử dụng quy hoạch trực giao đối xứng, mỗi yếu tố tiến hành tại 3 mức (-1, 0, +1) như bảng 3.2 Quy hoạch thực nghiệm đưa ra bảng ma trận thực nghiệm gồm 29 thí nghiệm, trong đó có 5 thí nghiệm lặp tại tâm, với hàm mục tiêu là hàm lượng cao tổng chứa isoflavones thu được là lớn nhất

2.2.1.4 Trích ly isoflavones bằng dung môi ethanol và thu nhận chế phẩm isoflavones

Sử dụng phương pháp chiết động, mẫu được tiến hành chiết trong thiết bị lắc

có ổn nhiệt, tốc độ lắc 200 vòng/phút Lượng mẫu 26,66g bột đậu tương sau tách

béo được chiết trong dung môi ethanol ở điều kiện xác định Sau đó, ly tâm thu dịch chiết Cô quay chân không ở 45oC, áp suất 25mmHg để loại bỏ ethanol Thu dịch sau cô quay, sấy đến khối lượng không đổi Xác định lượng dịch chiết tổng số thu được

2.2.1.5 Xử lý dịch chiết thu được bằng enzyme

Dịch sau khi chiết động với ethanol, đưa về pH = 5 Sau đó dịch chiết được

xử lý với enzyme β-glucosidase, đặt 30 giây trong bể siêu âm, để trong bể ổn nhiệt

50oC trong 10 phút [30] Mẫu sau xử lý enzyme được xử lý với ethanol tuyệt đối 99,7% để kết tủa protein, để ở 4oC trong 5 giờ Cô quay chân không ở 45oC, áp suất 25inHg để loại bỏ ethanol

82ml dịch chiết được cho phản ứng với 197µl enzyme β-glucosidase ở 50oC trong 10 phút [28]

2.2.1.6 Tinh chế isoflavones

Sơ đồ 2.1: Quy trình tinh chế isoflavones

Sản phẩm