Nghiên cứu sử dụng vi khuẩn probiotic để lên men cá

Các sản phẩm này sử dụng nguồn vi khuẩn có sẵn trong tự nhiên làm tác nhân của quá trình lên men do vậy chất lượng không kiểm soát được và đặc biệt là sự nhiễm tạp các vi sinh vật gây bệ

-*** -

NGÔ VĂN CHUNG

NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG VI KHUẨN PROBIOTIC ĐỂ LÊN MEN CÁ

LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT

CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

HÀ NỘI - 2017

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

-*** -

NGÔ VĂN CHUNG

NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG VI KHUẨN PROBIOTIC ĐỂ LÊN MEN CÁ

Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm

LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS TS TRẦN LIÊN HÀ

LỜI CẢM ƠN Trước hết, em xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Trần Liên Hà– Bộ

môn Vi sinh - Hóa sinh - Sinh học phân tử - Viện Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm - Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội, đã định hướng và tận tình hướng dẫn, truyền cho em niềm đam mê nghiên cứu trong suốt thời gian thực hiện đề tài

Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo, các anh chị, các bạn học viên, sinh viên phòng thí nghiệm Vi sinh - Hóa sinh - Sinh học phân tử đã nhiệt tình giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho em trong quá trình học tập và thực hiện luận văn

Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới gia đình, bạn bè và người thân

đã động viên, khuyến khích giúp em vượt qua những khó khăn trong suốt quá trình nghiên cứu

Hà Nội, ngày … tháng …năm 2017

Ngô Văn Chung

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan: Kết quả của luận văn này là kết quả nghiên cứu nhóm nghiên cứu chúng tôi được thực hiện dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS.TS Trần Liên Hà trường Đại học Bách khoa Hà Nội, cùng sự giúp đỡ của tập thể các cán bộ nghiên cứu, nghiên cứu sinh, học viên, sinh viên đang học tập và làm việc tại phòng thí nghiệm Vi sinh – Hóa sinh và Sinh học Phân tử, Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, trường Đại học Bách khoa Hà Nội cùng với các đồng nghiệp tại phòng thí nghiệm Công ty Cổ phần Công nghệ sinh học Mùa Xuân

Nội dung luận văn có tham khảo và sử dụng các tài liệu, thông tin được đăng tải trên các tác phẩm, tạp chí và trang web theo danh mục tài liệu kham khảo của luận văn Tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm với sự cam đoan trên

Hà Nội, ngày … tháng … năm 2017

Ngô Văn Chung

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

LỜI CAM ĐOAN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC VIẾT TẮT vii

DANH MỤC BẢNG viii

DANH MỤC HÌNH ix

LỜI MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

1.1 Tình hình nuôi trồng, khai thác và chế biến thủy sản của Việt Nam 2

1.1.1 Tình hình nuôi trồng và khai thác thủy sản 2

1.1.2 Tình hình chế biến và xuất khẩu thủy sản 4

1.2 Giới thiệu về nguyên liệu cá 6

1.2.1 Thành phần dinh dưỡng của cá 6

1.2.2 Nguyên nhân cá bị thối hỏng 7

1.3 Các phương pháp bảo quản cá 8

1.3.1 Phương pháp bảo quản lạnh 8

1.3.2 Phương pháp bảo quản lạnh đông 8

1.3.3 Phương pháp bảo quản bằng hóa chất 9

1.3.4 Phương pháp sấy khô 9

1.3.5 Bảo quản bằng các phương pháp sinh học 9

1.4 Các sản phẩm cá lên men truyền thống 10

1.4.1 Các sản phẩm cá lên men trên thế giới 10

1.4.2 Các sản phẩm chế biến cá lên men trong nước 13

1.5 Quy trình lên men và vai trò của vi khuẩn lactic trong lên men cá 18

1.5.1 Quy trình lên men cá 18

1.5.2 Vai trò của vi khuẩn lactic trong quá trình lên men cá 19

1.5.3 Lợi ích mang lại của các sản phẩm cá lên men 20

1.6 Định nghĩa probiotic và đặc điểm của vi khuẩn lacic 21

1.6.1 Định nghĩa probiotic 21

1.6.2 Giới thiệu về vi khuẩn lactic 21

1.6.3 Đặc điểm vi khuẩn lactic 21

1.6.4 Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic 23

1.6.4.1 Nguồn dinh dưỡng carbon 24

1.6.4.2 Nguồn dinh dưỡng nitơ 24

1.6.4.3 Nguồn dinh dưỡng vitamin 24

1.6.4.4 Các hợp chất khoáng 25

1.6.5 Ảnh hưởng của các yếu tố môi trường đến sự sinh trưởng, phát triển của vi khuẩn lactic 25

1.6.5.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ 25

1.6.5.2 Ảnh hưởng của pH 25

1.6.5.3 Ảnh hưởng của nồng độ oxy 26

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27

2.1 Đối tượng nghiên cứu: 27

2.2 Dụng cụ và hóa chất 28

2.2.1 Dụng cụ 28

2.2.2 Hóa chất 28

2.2.3 Môi trường 28

2.3 Phương pháp nghiên cứu 29

2.3.1 Phương pháp phân lập các chủng vi sinh vật 29

2.3.2 Phương pháp tuyển chọn 29

2.3.2.1 Phương pháp cấy chấm điểm 29

2.3.2.2 Phương pháp đục lỗ thạch 30

2.3.2.3 Phương pháp định tính acid lactic 30

2.3.2.4 Phương pháp xác định tổng lượng acid 31

2.3.2.5 Xác định khả năng chịu mặn 32

2.3.2.6 Phương pháp xác định độ mặn trong thực phẩm 33

2.3.2.7 Xác định khả năng kháng khuẩn và sinh bacteriocin 34

2.4 Đặc tính sinh lý – sinh hóa của chủng vi khuẩn được chọn 35

2.4.1 Quan sát mô tả đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào 35

2.4.2 Xác định hoạt tính catalase 35

2.5 Định tên vi sinh vật bằng phương pháp sinh học phân tử 36

2.5.1 Phản ứng PCR nhân đoạn gen 36

2.5.2 Phương pháp điện di gel agarose 37

2.5.3 Giải trình tự 16S rRNA 38

2.6 Khảo sát các điều kiện ảnh hưởng 38

2.6.1 Khảo sát sự ảnh hưởng của yếu tố nhiệt độ 38

2.6.2 Khảo sát sự ảnh hưởng của yếu tố pH ban đầu 39

2.6.3 Khảo sát nồng độ đường cấp vào ban đầu 39

2.6.4 Khảo sát tỷ lệ cấp giống 39

2.6.5 Khảo sát tốc độ lắc 39

2.6.6 Ứng dụng trong lên men cá thính 40

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 42

3.1 Phân lập chủng vi khuẩn 42

3.2 Tuyển chọn chủng vi khuẩn lên men cá 44

3.2.1 Định tính acid lactic 44

3.2.2 Phương pháp cấy chấm điểm 45

3.2.3 Phương pháp đục lỗ thạch 46

3.2.4 Phương pháp chuẩn độ NaOH 46

3.2.5 Khả năng chịu mặn 49

3.2.6 Khả năng kháng khuẩn và sinh bacteriocin của các chủng được lựa chọn 50 3.3 Đặc tính sinh lý – sinh hóa 52

3.4 Định tên bằng phương pháp sinh học phân tử 54

3.4.1 Kết quả PCR nhân đoạn gen 16S rRNA 54

3.4.2 Kết quả định danh chủng tuyển chọn 55

3.5 Kết quả khảo sát một số điều kiện nuôi cấy của chủng TC5 56

3.5.1 Khảo sát sự ảnh hưởng của yếu tố pH 56

3.5.2 Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ đường ban đầu 57

3.5.3 Khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy 58

3.5.4 Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ cấp giống 59

3.5.5 Khảo sát sự ảnh hưởng của tốc độ lắc 60

3.5.6 Ứng dụng trong lên men cá thính 61

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 68

4.1 Kết luận 68

4.2 Kiến nghị 68

TÀI LIỆU THAM KHẢO……….70

PHỤ LỤC 75

DANH MỤC VIẾT TẮT

Ký hiệu Chú thích Tiếng Anh EU European Union

PCR Polymerase Chain Reaction

w/w weight/ weight (khối lượng/ khối lượng)

DNA Deoxylribonucleic acid

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Kết quả sản xuất thủy sản năm 2016 3

Bảng 2.1 Bảng tính điểm cảm quan 41

Bảng 3.1 Các chủng phân lập được từ các nguồn khác nhau 42

Bảng 3.2 Tổng hợp kết quả tuyển chọn dựa vào khả năng sinh acid 47

Bảng 3.3 Xác định độ mặn của mẫu cá lên men 49

Bảng 3.4 Kết quả xác định khả năng chịu mặn của 3 chủng 50

Bảng 3.5 Kết quả tuyển chọn dựa vào khả năng kháng khuẩn và sinh bacteriocin 51

Bảng 3.6 Đặc tính sinh lý-sinh hóa chủng TC5 53

Bảng 3.7 Bảng đánh giá cảm quan các mẫu thí nghiệm 63

Bảng 3.8 Bảng đánh giá các chỉ tiêu vi sinh, vật lý và hóa học của các mẫu 65

Bảng 3.9 Ảnh hưởng của độ ẩm đến quá trình phát triển của L pentosus TC5 trong lên men cá thính 67

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Sản lượng nuôi trồng và khai thác thủy sản Việt nam 1995 – 2016 2

Hình 1.2 Biểu đồ xuất khẩu thủy sản 2005 – 2016 5

Hình 1.3 Một số sản phẩm cá lên men trên thế giới 11

Hình 1.4 Quy trình sản xuất cá thính Lập Thạch 15

Hình 1.5 Một số sản phẩm mắm cá 16

Hình 1.6 Sơ đồ quy trình sản xuất mắm cá 18

Hình 1.7 Sơ đồ ứng dụng vi khuẩn lactic trong lên men cá 19

Hình 2.1 Các mẫu phân lập được sử dụng 27

Hình 3.1 Định tính acid lactic bằng thuốc thử Uffelmann 44

Hình 3.2 Kết quả cấy chấm điểm các chủng 45

Hình 3.3 Kết quả đục lỗ thạch của các chủng 46

Hình 3.4 Hàm lượng acid tạo thành của các chủng 47

Hình 3.5 Kết quả kiểm tra khả năng kháng khuẩn và sinh bacteriocin 52

Hình 3.6 Hình thái chủng TC5 53

Hình 3.7 Bản điện di sản phẩm sau PCR 54

Hình 3.8 Cây phân loại thể hiện mối quan hệ của chủng TC5 với các chủng 55

Hình 3.9 Ảnh hưởng của pH tới chủng L pentossus TC5 56

Hình 3.10 Ảnh hưởng của nồng độ đường tới chủng L pentosus TC5 57

Hình 3.11 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới chủng L pentosus TC5 58

Hình 3.12 Ảnh hưởng của tỷ lệ cấp giống tới chủng L pentosus TC5 60

Hình 3.13 Ảnh hưởng của tốc độ lắc tới của chủng L pentosus TC5 61

Hình 3.14 Thí nghiệm cá thính lên men 62

Hình 3.15 Biểu đồ radar (spider) đánh giá cảm quan của các mẫu ứng dụng 64

Hình 3.16 Kiểm tra vi sinh trên môi trường Violet Red Bile Agar (VRBL) 67

LỜI MỞ ĐẦU

Việt Nam là nước nông nghiệp có nhiều sản phẩm lên men truyền thống Các sản phẩm này sử dụng nguồn vi khuẩn có sẵn trong tự nhiên làm tác nhân của quá trình lên men do vậy chất lượng không kiểm soát được và đặc biệt là sự nhiễm tạp các vi sinh vật gây bệnh Vì vậy, các sản phẩm này luôn tiềm ẩn nguy cơ gây ngộ độc thực phẩm rất cao Các mẫu thực phẩm được kiểm tra cho các chỉ tiêu về vi sinh vật cao gấp hàng trăm, có mẫu hàng nghìn lần so với tiêu chuẩn Việt Nam Nhằm hạn chế các vi sinh vật gây bệnh, nhiều cơ sở sản xuất thực phẩm lên men đôi khi cũng lạm dụng hóa chất bảo quản

Bổ sung canh trường thuần khiết của các chủng vi khuẩn probiotic cho thực phẩm để lên men tạo ra các sản phẩm có giá trị dinh dưỡng cao, an toàn và có thời gian bảo quản được lâu góp phần nâng cao sức khỏe cộng đồng đã trở thành mối quan tâm hàng đầu cho các nhà nghiên cứu cũng như ứng dụng Đây là hướng ứng dụng phổ biến trên thế giới và Việt Nam Các chủng vi khuẩn probiotic có các đặc tính như: ức chế nhiều loại vi sinh vật gây bệnh và tạo ra giá trị dinh dưỡng cao, giúp đề tăng cường sức đề kháng cho cơ thể

Cá là một nguồn protein phong phú cho con người ở các đất nước đang phát triển, gần 50% sản lượng cá trên thế giới được đánh bắt từ những nước này và hầu hết được tiêu thụ trong nước Ở khu vực Đông Nam Á, 60-70% protein cung cấp cho con người từ cá và Việt Nam thuộc trong nhóm 10 nước xuất khẩu thủy sản hàng đầu thế giới Các sản phẩm được chế biến từ cá rất đa dạng: nước mắm, cá muối, cá khô,

cá hộp, cá thính… Trong đó, cá lên men được cho là sản phẩm hấp dẫn và chứa nhiều chất dinh dưỡng

Trên cơ sở lý luận khoa học và ý nghĩa thực tiễn được trình bày ở trên chúng

tôi đề xuất thực hiện đề tài: “Nghiên cứu sử dụng vi khuẩn Probiotics để lên men cá”

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình nuôi trồng, khai thác và chế biến thủy sản của Việt Nam

1.1.1 Tình hình nuôi trồng và khai thác thủy sản

Việt Nam nằm bên bờ Tây của Biển Đông, là một biển lớn của Thái Bình Dương, có diện tích khoảng 3.448.000 km2, có bờ biển dài 3260 km Vùng nội thuỷ

và lãnh hải rộng 226.000 km2, vùng biển đặc quyền kinh tế rộng hơn 1 triệu km2 với hơn 4.000 hòn đảo, tạo nên 12 vịnh, đầm phá với tổng diện tích 1.160km2 được che chắn tốt dễ trú đậu tàu thuyền Biển Việt Nam có tính đa dạng sinh học (ĐDSH) khá cao, cũng là nơi phát sinh và phát tán của nhiều nhóm sinh vật biển vùng nhiệt đới ấn

Độ - Thái Bình Dương với chừng 11.000 loài sinh vật đã được phát hiện [48]

Nước ta với hệ thống sông ngòi dày đặc và có đường biển dài rất thuận lợi phát triển hoạt động khai thác và nuôi trồng thủy sản Sản lượng thủy sản Việt Nam

đã duy trì tăng trưởng liên tục trong 17 năm qua với mức tăng bình quân là 9,07%/năm Với chủ trương thúc đẩy phát triển của chính phủ, hoạt động nuôi trồng thủy sản đã có những bước phát triển mạnh, sản lượng liên tục tăng cao trong các năm qua, bình quân đạt 12,77%/năm, đóng góp đáng kể vào tăng trưởng tổng sản lượng thủy sản của cả nước [48]

Hình 1.1 Sản lượng nuôi trồng và khai thác thủy sản Việt nam 1995 – 2016 [48]

Theo báo cáo của Tổng cục Thủy sản, tổng sản lượng thủy sản sản xuất năm

2016 đạt hơn 6,7 triệu tấn, tăng 2,5% so với năm 2015

Bảng 1.1 Kết quả sản xuất thủy sản năm 2016 [48]

(đơn vị tính: sản lượng 1.000 tấn, diện tích: 1.000 ha)

1.1.2 Tình hình chế biến và xuất khẩu thủy sản

Ngành chế biến thủy sản hiện nay phát triển thành một ngành kinh tế mũi nhọn, ngành sản xuất hàng hóa lớn, đi đầu trong hội nhập kinh tế quốc tế Với sự tăng trưởng nhanh và hiệu quả, thủy sản đã đóng góp tích cực trong chuyển đổi cơ cấu kinh tế nông nghiệp, nông thôn, đóng góp hiệu quả cho công cuộc xóa đói, giảm nghèo, giải quyết việc làm cho trên 4 triệu lao động, nâng cao đời sống cho cộng đồng dân cư khắp các vùng nông thôn, ven biển, đồng bằng, trung du, miền núi…, đồng thời góp phần quan trọng trong bảo vệ an ninh quốc phòng trên vùng biển đảo của Tổ quốc

Chế biến thủy sản tiêu thụ nội địa

Mặc dù thói quen của người Việt Nam chủ yếu sử dụng sản phẩm thủy sản tươi sống trong các bữa ăn hàng ngày, nhưng từ năm 2001 đến nay, sản phẩm thủy sản qua chế biến tiêu thụ nội địa không ngừng tăng lên, từ 277 nghìn tấn năm 2001 đến 680 nghìn tấn năm 2010, đạt tốc độ tăng trưởng bình quân 10,5%/năm, giá trị tăng 20,1%/năm [48, 49]

Sản phẩm thủy sản chế biến ngày càng đa dạng về chủng loại, chất lượng ngày một nâng cao, giá bán ngày càng cao hơn

Hầu hết các doanh nghiệp chế biến thủy sản đều vừa tập trung chế biến xuất khẩu vừa kết hợp dây chuyền sản xuất chế biến các mặt hàng tiêu thụ nội địa [48]

Chế biến thủy sản xuất khẩu

Trong giai đoạn 2001 – 2015, xuất khẩu thủy sản Việt Nam tăng nhanh về cả giá trị và khối lượng Đến năm 2015, giá trị xuất khẩu đạt 6,57 tỷ USD, sản phẩm thủy sản được xuất khẩu sang 164 nước và vùng lãnh thổ, 3 thị trường chính là EU,

Mỹ và Nhật Bản chiếm trên 54% tỷ trọng [48]

Về sản phẩm chế biến xuất khẩu: trước đây chỉ xuất khẩu các sản phẩm đông lạnh, nhưng hiện nay tỷ lệ sản phẩm dinh dưỡng ngày càng tăng, đến nay ước đạt khoảng 35% Các sản phẩm sushi, sashimi, surimi đã có mặt ở hầu hết các nhà máy chế biến thủy sản xuất khẩu Các nhà máy sáng tạo nhiều mặt hàng, sản phẩm mới hấp dẫn, có giá trị, đồng thời khai thác các đối tượng thủy sản mới để chế biến

Một xu hướng mới là sử dụng phụ phẩm để chế biến đã đạt hiệu quả cao, mang lại lợi ích kinh tế lớn và giảm thiểu tác động đến môi trường: nhiều nhà máy nghiên cứu nhập dây truyền công nghệ đồng bộ chế biến phụ phẩm cá để sản xuất dầu cá và bột cá chất lượng cao

Xuất khẩu thủy sản của Việt Nam đã có những bước tiến vượt bậc trong gần

20 năm qua Kim ngạch xuất khẩu thủy sản từ mức thấp 550 triệu năm 1995 đã có những bước tăng trưởng mạnh mẽ qua từng năm với mức tăng trưởng bình quân 15,6%/năm Quá trình tăng trưởng này đã đưa Việt Nam trở thành một trong 5 nước xuất khẩu thủy sản lớn nhất thế giới, giữ vai trò chủ đạo cung cấp nguồn thủy sản toàn cầu [48]

Hình 1.2 Biểu đồ xuất khẩu thủy sản 2005 – 2016 [48]

Tuy nhiên, đa số lượng cá xuất khẩu ở dạng nguyên liệu hay dạng thô mang lại giá trị về kinh tế chưa cao như một số sản phẩm thành phẩm như các sản phẩm cá lên men

1.2 Giới thiệu về nguyên liệu cá

1.2.1 Thành phần dinh dưỡng của cá

Cá là loại thức ăn có giá trị dinh dưỡng cao và là món ăn quen thuộc trong bữa

ăn hàng ngày của chúng ta Thành phần hóa học của thịt cá gồm: protein, lipit, gluxit, muối vô cơ, vitamin và thành phần tro Các thành phần này khác nhau rất nhiều, thay đổi phụ thuộc vào giống, loài, giới tính, điều kiện sinh sống…

Nước: Thành phần chính của thịt cá, chiếm khoảng 80% trọng lượng cá tươi [6]

Protein: Protein cá là một trong những nguồn protein chất lượng cao, rất có giá

trị, chứa tất cả các amin cần thiết Cá có rất ít hoặc không có mô liên kết nên rất dễ tiêu hóa Phần lớn các loài cá chứa 18 – 20%, đó là hàm lượng protein tương đối cao

so với các loại thịt bò (chứa khoảng 15,89% protein), thịt heo (17 - 18% protein), thịt

gà (khoảng 19% protein) thì đa số các loài cá ta ăn thường chất lượng protein cao hơn hoặc tương đương với protein của gia súc, gia cầm [6]

Lipit: Thành phần lipit trong cá phụ thuộc vào loài cá và mùa Phần lớn các loài

cá đều có lượng lipit dưới 1% vì vậy có thể nói cá là loại thực phẩm chứa ít calo Lipit

cá chứa nhiều béo không no có lợi cho sức khỏe thường tập chung dưới da và nội tạng [6]

Gluxit: Lượng gluxit trong thịt cá tương đối thấp không đáng kể chủ yếu dưới

dạng glycogen, thành phần dưới 1% Lượng gluxit trong cá không đủ để tạo vị cho thịt cá nhưng lại góp phần quan trọng trong giai đoạn tê cứng của cá [6]

Vitamin: Cá rất giàu các loại vitamin con người cần để phát triển, duy trì các tế

bào thần kinh và tham gia vào các quá trình chuyển hóa Trong cá nhiều vitamin A

và D chủ yếu tập trung ở gan và trứng Cá còn là nguồn vitamin rất quan trọng vì cá

có chứa nhiều vitamin nhóm B: B1, B2, B6 Thịt cá màu sẫm như cá Thu, cá Ngừ,

cá Nục, chứa nhiều vitamin B12 (20 µg) Cá là một trong những nguồn chứa nhiều vitamin B6 (1 - 2µg) [6]

Khoáng chất: Hàm lượng tro trong cá phụ thuộc vào từng loài, điều kiện

sống.Trong các chất khoáng, các yếu tố vi lượng và đa lượng rất cần thiết cho cơ thể con người trước hết là iod, muối photphat, K, Ca, Cu, Fe, [6]

1.2.2 Nguyên nhân cá bị thối hỏng

Có hai hai nguyên nhân chính khiến cá bị thối hỏng là do vi sinh vật và do các enzyme nội tại trong cá [12]

Enzyme: Cá có hệ enzyme thủy phân hoạt lực cao Khi cá còn sống hệ enzyme

này đóng vai trò là chất xúc tác cho các phản ứng trong quá trình đồng hóa và dị hóa Ngay khi cá chết sự cân bằng giữa các quá trình bị xáo trộn Các enzyme sẽ hoạt động phân giải chính cấu trúc thịt cá [12]

Vi sinh vật: Khi cá còn sống trên cơ thể cá có rất nhiều vi sinh vật sinh trưởng

và phát triển Vi sinh vật chủ yếu tập chung ở da, mang và ruột cá Theo Shewan (1962) thì số lượng vi sinh vật trên da và nội tạng cá sống hay vừa đánh bắt là:

Nhìn chung, khi cá còn sống thịt cá hầu như vô trùng Tuy nhiên, sau khi cá chết, vi sinh vật từ nội tạng cá sẽ nhiễm vào thịt, từ nhớt cá sẽ đi sâu vào trong dẫn đến thối hỏng Điều này cho thấy cá trước khi đưa vào chế biến phải có khâu xử lý

sơ chế để loại bỏ tạp chất và vi sinh vật

1.3 Các phương pháp bảo quản cá

1.3.1 Phương pháp bảo quản lạnh

Dựa vào nguyên lý là khi nhiệt độ hạ thấp sẽ giảm hoạt động của enzyme và

vi sinh vật Trong phạm vi nhiệt độ bình thường, cứ nhiệt độ hạ xuống 10oC thì phản ứng sinh hóa giảm xuống 1/2 đến 1/3, như vậy nguyên liệu có thể giữ tươi được một thời gian

Phương pháp ướp lạnh là đưa nhiệt độ xuống nhiệt độ bảo quản lạnh,có thể sử dụng kho lạnh, nước biển lạnh hoặc nước đá để bảo quản Trong đó bảo quản bằng nước đá là phổ biến nhất, người ta sử dụng nước đá vụn kết hợp với muối ăn để tăng khả năng làm lạnh Tỷ lệ muối ăn dùng 15 – 20 % so với lượng cá [49] Tiến hành bảo quản bằng cách cứ một lớp muối đá rồi một lớp cá ướp cho vào thùng gỗ lớp trên cùng và dưới cùng của thùng là lớp đá Chiều cao nguyên liệu không quá 30cm

1.3.2 Phương pháp bảo quản lạnh đông [14]

Phương pháp làm lạnh đông là hạ thấp nhiệt độ của nguyên liệu xuống dưới nhiệt độ đóng băng Như vậy một lượng nước lớn ở trong nguyên liệu sẽ bị đông kết lại làm ngừng đến mức tối đa hoặc đình chỉ hoàn toàn hoạt động của enzyme nội tại

và vi sinh vật Hiện nay, đây là phương pháp giữ tươi nguyên liệu tốt nhất, đảm bảo được tính chất, mùi vị và giá trị dinh dưỡng của nguyên liệu Mặc dù vậy trong quá trình bảo quản chất lượng của nguyên liệu cũng có sự biến đổi như protein bị đông đặc biến tính, chất béo bị thủy phân hoặc bị oxy hóa, đặc biệt là các biến đổi về vật

lý và cấu trúc của nguyên liệu Nguyên liệu làm lạnh đông trước khi đưa vào chế biến hoặc tiêu thụ phải được tiến hành giã đông

1.3.3 Phương pháp bảo quản bằng hóa chất [14]

Cho đến nay người ta đã nghiên cứu nhiều loại hóa chất dùng trong bảo quản nguyên liệu rất có hiệu quả Dùng hóa chất bảo quản tốt nhất là kết hợp với nhiệt độ thấp thì giữ được tươi hơn

Yêu cầu của hóa chất dùng để bảo quản là không độc với con người, không có mùi vị lạ, tính chất hóa học phải ổn dịnh, dễ hòa tan trong nước, không làm cho nguyên liệu biến mùi, không làm mục dụng cụ bảo quản, phải có hiệu lực sát trùng mạnh, giá thành hạ và cách sử dụng đơn giản Các hóa chất thường được dùng trong bảo quản nguyên liệu thủy sản: muối vô cơ, acid, chất hữu cơ

1.3.4 Phương pháp sấy khô

Hàm lượng nước trong cá tươi chiếm khoảng 80% Khi giảm dộ ẩm của cá xuống dưới 25% giúp ngăn chặn sự phát triển của vi khuẩn gây hỏng và dưới 15% ngăn chặn sự phát triển của nấm mốc

Cá sẽ được ướp muối sau đó sấy tự nhiên hoặc nhân tạo để đạt được độ ẩm dưới 15% Cá sau sấy được bảo quản ở điều kiện thường trong thời gian 6 tháng đến

1 năm [13]

1.3.5 Bảo quản bằng các phương pháp sinh học

Bảo quản cá nguyên liệu bằng dịch bacteriocin

Bacteriocin là những đoạn peptit hoặc protein có hoạt tính kháng khuẩn được sản xuất từ nhiều loại vi khuẩn khác nhau Bacteriocin được ứng dụng trong bảo quản thực phẩm và nó được sử dụng trong nghành công nghiệp thực phẩm để giảm chất

quản bằng bacteriocin thì thực phẩm giữ được các tính chất đặc trưng về cảm quan

và dinh dưỡng Đây là phương pháp bảo quản tự nhiên, nó có thể đáp ứng nhu cầu ngày càng cao của người tiêu dùng về sản phẩm ăn liền tiện lợi, an toàn, tươi, sạch của chế biến thực phẩm và phát triển các sản phẩm mới Bacteriocin được sử dụng trong bảo quản nguyên liệu cũng như trong thực phẩm dưới các hình thức cho vào

phụ gia, làm chất độn, nuôi cấy vi sinh vật bổ sung vào [15]

Bảo quản bằng phương pháp lên men lactic

Tạo điều kiện cho vi khuẩn lactic phát triển trong điều kiện yếm khí sinh ra lactic làm giảm pH môi trường ức chế sự hoạt động của các enzyme và vi khuẩn gây hỏng thực phẩm Đây là một phương pháp bảo quản và chế biến đã được sử dụng rất lâu đời Bên cạnh đó vi khuẩn lactic là nhóm vi khuẩn an toàn, được ứng dụng nhiều trong công nghệ thực phẩm Vi khuẩn lactic được sử dụng trong các sản phẩm lên men tạo cấu trúc, màu sắc và hương vị đặc trưng cho sản phẩm Thêm vào đó, lượng lactic sinh ra làm giảm pH môi trường, tăng khả năng bảo quản nên vi khuẩn lactic đóng vai trò quan trọng trong quá trình lên men [12]

1.4 Các sản phẩm cá lên men truyền thống

1.4.1 Các sản phẩm cá lên men trên thế giới

Với 3/4 bề mặt trái đất được bao phủ bởi nước chính vì thế các sản phẩm chế biến từ cá rất đa dạng tại các nước cũng như các châu lục khác nhau Chính vì thế các sản phẩm cá lên men trên thế giới cũng rất đa dạng về chủng loại cũng như phương thức lên men khác nhau

Trên thế giới có rất nhiều các sản phẩm cá lên men khác nhau với sản phẩm lên men cuối cùng ở dạng lỏng hay dạng nguyên con ban đầu, có sản phẩm vẫn còn mùi khó chịu sau quá trình lên men trong khi đó có sản phẩm có mùi thơm đặc trưng

Tại các nước ở Châu Âu có một số sản phẩm cá lên men truyền thống, ví dụ

một số các sản phẩm như: surströmming của Thụy Điển, rakfisk của Na Uy, hákarl

của Iceland, và cá trích muối thùng thường được sản xuất ở hầu hết các khu vực Bắc

Âu [43]

Tại châu Á, có rất nhiều quốc gia có các sản phẩm cá lên men như: Thái Lan,

Nhật Bản, Philippin, Hàn Quốc…đặc biệt Thái Lan có tới 16 sản phẩm cá lên men

khác nhau [33]

Narezushi – Nhật Bản Hongeohoe – Hàn Quốc Bagoong - Philipin

Rakfisk - Na Uy Hákarl – Iceland Surströmming - Thụy Điển

Hình 1.3 Một số sản phẩm cá lên men trên thế giới [42, 43]

 Surströmming (Thụy Điển)

Các nguyên liệu tươi sống như cá trích tại biển Baltic được bắt ngay trước khi chúng đẻ trứng từ tháng năm cho đến tuần đầu tiên của tháng bảy Hàm lượng chất béo của cá trích tại thời điểm này là khá thấp Quá trình bắt đầu với việc muối cá trích trong 1-2 ngày trong dung dịch muối bão hòa và khuấy liên tục trong 4 giờ đầu tiên Sau khi muối, cá trích được bỏ đầu và moi ruột rồi đưa vào thùng với nước muối (1,7% muối) Các thùng được bảo quản ở 15-18°C trong 3-4 tuần Quá trình này được

đi kèm với sự hình thành của các chất khí thoát ra từ thùng Khi quá trình lên men kết thúc, cá trích được chuyển vào lon cùng với nước muối từ các thùng lên men [43]

Đầu tiên là quá trình lên men lactic dẫn đến sự hình thành acid lactic do quá trình lên men kỵ khí trong các mô cơ, tiếp tục là sự phân giải protein và lipit, tiếp theo

là hình thành một hệ vi khuẩn lên men, nhiều enzyme phân hủy được tìm thấy trong các mô cơ (calpains, cathepsins, caspase…), nguồn các enzyme quan trọng cho quá trình phân hủy là trong ruột cá cùng với enzyme ngoại bào mà vi khuẩn trong quá trình lên men tiết ra, acid tạo mùi được hình thành trong sản phẩm như acid propionic, butyric và acid acetic Muối làm tăng áp lực thẩm thấu của nước muối ngăn ngừa sự phân hủy của protein cá vào oligopeptide và amin Vi khuẩn sử dụng tốt trong lên

men surströmming là các loài vi khuẩn kỵ khí và chịu mặn ví dụ như Lactobacillus

Trong sản phẩm Surströmming thường có chứa 11,8% protein, 8,8% muối, và 3,8% chất béo [43]

 Narezushi – Nhật Bản

Là sản phẩm cá lên men với nguyên liệu từ cá thu hoặc cá basa

Trước tiên cá được loại bỏ mang và ruột và mắt cá sau đó được ướp muối 33%) trong thời gian 30-60 ngày, sau đó cá được ngâm trong dấm trong thời gian 5 giờ, tiếp sau đó cá và cơm được đổ vào một thùng kín và quá trình lên men và chín

(18-sinh hóa xảy ra (quá trình này kéo dài từ 2 tháng đến 1 năm), để tăng thêm hương vị thì ngày nay tỏi và hat tiêu được rắc lên trên trong quá trình lên men [42]

Trong Narezushi có nghiên cứu đã chứng minh rằng vi khuẩn lactic là vi sinh vật chiếm ưu thế với mật độ 108 CFU/g với sản phẩm được ủ chín trong 6 tháng,

người ta đã phân lập được 2 chủng vi khuẩn lactic đó là Lactobacillus plantarum và Lactobacillus rennin [42]

 Bagoong – Philippin

Là sản phẩm lên men từ nguyên liệu cá cơm, cá mòi, cá trích hoặc tôm Bagoong được chuẩn bị bằng cách trộn muối với cá đã được rửa sạch theo tỷ lệ 1:3-2:7 tùy thuộc vào số lượng lớn của việc chuẩn bị, tiếp theo ta đặt nguyên liệu vào bên trong lọ lên men bằng đất lớn, để lên men trong 30-90 ngày và thỉnh thoảng khuấy để chắc chắn rằng muối được trải đều với cá Một màu thực phẩm được gọi angkak được thêm vào cho bagoong màu đỏ hoặc màu hồng đặc trưng của sản phẩm [30]

Bagoong được ăn sống hoặc nấu chín và thường được sử dụng như là hương liệu hoặc gia vị trong nhiều món ăn truyền thống Như một món khai vị đó là xào với hành tây và tỏi và dùng với cà chua hoặc xoài xanh Tại các khu vực nông thôn, bagoong được ăn kèm với các loại rau, và đặc biệt là ở các vùng ven biển, nó thường

là nguồn protein chính trong chế độ ăn [30]

1.4.2 Các sản phẩm chế biến cá lên men trong nước

Các sản phẩm thực phẩm lên men truyền thống là một trong những loại sản phẩm lên men phổ biến của các dân tộc trên thế giới Đó là một loại thực phẩm được sản xuất thủ công, mang sắc thái của từng dân tộc Công nghệ sản xuất các sản phẩm lên men truyền thống được thực hiện của cả một dân tộc được truyền từ đời này sang đời khác Đất nước ta cũng có rất nhiều các sản phẩm lên men truyền thống, trong số

đó cá lên men là một phần của các sản phẩm lên men truyền thống đó Các sản phẩm

cá lên men truyền thống từ lâu đời như: mắm cá, cá thính…

 Cá thính

Cá thính còn gọi là cá muối chua là một món ăn rất phổ biến trong dân gian Việt Nam là một nước có bờ biển dài trải từ bắc vào nam, nguồn sông suối nhiều nên nguyên liệu thuỷ sản rất phong phú tạo điều kiện để người dân sống gần đó khai thác

và chế biến các món ăn thật đa dạng Cá thính là sản phẩm của quá trình lên men lactic với cơ chất có thể thính gạo hoặc thính ngô [52] Cá được đánh bắt còn tươi ta đem rửa sạch sau đó ướp muối và thính được nhã nhuyễn và các gia vị khác như riềng, tỏi, ớt…Các sản phẩm cá thính nổi tiếng như: Cá thính Lập Thạch-Vĩnh Phúc,

Cá thính Hạ Hòa-Phú Thọ…

 Nguyên liệu và xử lý nguyên liệu

Cá được đánh bắt tại các vùng sông, các khe núi đem về một phần chế biến các món ăn, phần còn lại đem làm mắm cá thính để dành sang năm ăn Những loại cá nhỏ như trê, rô, chày, trôi, diếc…làm sạch để cả con những loại cá lớn như chép, trắm, cá măng, cá kìm thì thái bằng bàn tay và lạng mỏng làm 2 hoặc 3, sau đem rửa sạch để ráo nước rồi đem muối cá

 Muối cá và tháo nước

Xếp cá vào vại cứ theo tỉ lệ cá: muối là 10:1,5 kg Sau 10 ngày sau lấy cá ra đem đổ nước đi chỉ lấy cá, lúc này cá có màu hồng đẹp vì các chất tanh đã đi theo nước ra khỏi cơ thịt cá, nồng độ muối trong cá lúc này là khoảng 5%

 Trộn thính

Thính ướp cá được làm bằng đỗ tương và gạo nếp cái rang vàng, cả hai đem nhã nhuyễn trộn đều vào nhau sau đó đem ướp cá Cứ một lớp cá lại phủ một lớp thính và lớp trên cùng rải thính dày hơn

Sau một tuần thính cá có thể sử dụng được Cá thính có hương vị đặc biệt không khô cũng không nhão Khi ăn thịt không bị dai và cứng

Hình 1.4 Quy trình sản xuất cá thính Lập Thạch [52]

 Mắm cá thính

Chế biến mắm cá là quá trình lên men cá trong môi trường có nồng độ muối cao, các vi khuẩn tham gia vào việc phân giải protein của cá thành amin Đặc điểm chung của các sản phẩm mắm cá đó là cá vẫn giữ được hình dạng ban đầu không bị chuyển lỏng như các sản phẩm nước mắm [10]

Trong nước hiện có nhiều sản phẩm mắm cá như: mắm cá lóc, mắm cá linh, mắm cá thu, mắm cá sặc …

Nguyên liệu

Xử lý nguyên liệu

Sản phẩm

Trộn thính Tháo nước Muối cá

Bảo quản

trưng Nếu gài nén tốt thì cá có cấu trúc cứng, thịt cá đỏ hồng, mùi tanh, nước gài nén

Tùy theo mắm nguyên con hay thái sợi mà lượng thính và lượng cá thay đổi,

cá nguyên con thì 10 cá: 1 thính, nếu mắm thái thì phải bóc lấy philê rồi thái sợi dày 0.5-0.6 cm rồi trộn thính, thính ở đây là gạo rang rồi xay nhiễn

 Cho vào dụng cụ chứa, gài nén

Cá sau khi được thính xong rồi cho vào dụng cụ chứa trong 1-2 ngày cho thính

nở rồi mới gài nén giống như gài nén và thêm nước bối (hỗn hợp nước máu, nước muối), làm ngập mắm

 Bảo quản, chờ chín

Khoảng 2 tháng thì mắm chín, với biểu hiện nước có màu sậm hơn không còn hiện tượng sủi bọt nữa, có mùi thơm đặc trưng Đến giai đoạn này có thể mang ra chao đường và sử dụng ngay hoặc bảo quản đến khi nào sử dụng thì chao đường

 Chao đường

Sau khi chao đường thì mắm cá có thể sự dụng được ngay Đường sử dụng để chao mắm thường là đường thốt lốt, đường mía và đường cát Đường được hòa tan trong nước rồi đun sôi và phối trộn gia vị Khi chao đường cần đổ dịch ngập cá, đậy

kỹ từ 15-30 ngày cá thành mắm là có thể sử dụng được

 Thành phẩm

Mắm sau khi chao đường khoảng 1 tháng thì có thể bắt đầu dùng được, ta có sản phẩm mắm cá hoàn chỉnh

Hình 1.6 Sơ đồ quy trình sản xuất mắm cá [10, 16]

1.5 Quy trình lên men và vai trò của vi khuẩn lactic trong lên men cá

1.5.1 Quy trình lên men cá

- Cá nguyên liệu được xử lý bằng cách loại bỏ mang và ruột rồi rửa sạch

- Các nguyên liệu phụ như muối, gạo rang… được bổ sung cùng chủng vi khuẩn lactic để chuẩn bị cho quá tình lên men

Nguyên liệu

Xử lý nguyên liệu

Sản phẩm

Bảo quản chờ chín

chủng vi khuẩn lactic

- Sau khi trộn đều các nguyên liệu ta lên men ở điều kiện nhiệt độ phòng và thời gian thích hợp

Hình 1.7 Sơ đồ ứng dụng vi khuẩn lactic trong lên men cá [10]

1.5.2 Vai trò của vi khuẩn lactic trong quá trình lên men cá

Axit lactic và các chất kháng khuẩn được tạo ra bởi vi khuẩn lactic, làm giảm

pH của môi trường tác dụng ức chế các vi khuẩn có hại gây hư hỏng thực phẩm hay ảnh hưởng xấu tới con người qua đó thời gian bảo quản của sản phẩm lâu hơn so với

cá tươi hay các phương pháp chế biến thông thường Tạo vị chua đặc trưng cho sản phẩm.Vị chua do hàm lượng lactic sinh ra giúp cơ thể tiêu hoá tốt protein sản phẩm

Nguyên liệu

Thành phẩm

Nước muối

Xử lý

Muối cá

Cho vào dụng cụ chứa Gài nén

Rửa để tháo

Trộn thính

Vào lu gài nén Bảo quản chờ

chín Chao đường Thính

Một số chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh bacteriocin, đây là những chất kháng khuẩn có bản chất là protein trong tự nhiên Chúng được sản xuất bởi nhiều vi khuẩn lactic khác nhau, với một số vi khuẩn lactic có thể sản xuất một loại duy nhất trong khi những chủng khác tạo ra hai hoặc ba loại khác nhau như Budu (nước sốt cá cơm lên men ở miền nam Thái Lan và Malaysia) đã được phát hiện có chứa bacteriocin tích cực chống lại cả gram âm và vi khuẩn gram dương; Jeot-gal một sản phẩm cá lên men của Hàn Quốc chứa lacticin NK24 Trong khi plaasom , một sản phẩm nước mắm của Thái Lan, đã được phát hiện có chứa Weissellicin 110, hoạt động chống lại vi khuẩn gram dương Nisin cho thấy hoạt tính chống vi khuẩn gây

bệnh như Escherichia coli và Salmonella [24, 29, 36]

Ngoài những tác dụng là giúp bảo quản cá không bị thối rữa bởi những vi sinh vật có hại vi khuẩn lactic con có tác dụng hạn chế sự tích tụ histamine trong các sản phẩm thủy sản khi mà histamine được biết đến như là môt nguyên nhân gây ngộ độc trong các sản phẩm thủy sản nếu có nồng độ quá cao [37]

1.5.3 Lợi ích mang lại của các sản phẩm cá lên men

Những lợi ích rõ ràng nhất của sản phẩm cá lên men là sự có mặt của vi khuẩn lactic và các vi khuẩn có lợi khác của quá trình lên men Nghiên cứu về vi sinh vật trong ruột của con người cho thấy tầm quan trọng của việc ăn thực phẩm lên men để duy trì sức khỏe tổng thể, hỗ trợ một hệ thống miễn dịch khỏe mạnh, tiêu hóa và sức khỏe tâm thần, tăng cường giải độc, có thể ảnh hưởng đến trọng lượng cơ thể [19]

Ngoài ra, quá trình lên men đã được chứng minh là làm giảm thành phần độc hại trong thực phẩm Một nghiên cứu gần đây cho thấy các chất độc thần kinh gây chết người ở cá nóc (terodotoxin) đã hầu như loại bỏ bằng phương pháp truyền thống như lên men kéo dài, và nó mang lại một sản phẩm không độc hại, sản phẩm thực phẩm ăn được [20]

1.6 Định nghĩa probiotic và đặc điểm của vi khuẩn lacic

1.6.1 Định nghĩa probiotic

Là những vi sinh vật như vi khuẩn hay nấm men nếu được đưa vào cơ thể với

số lượng được kiểm soát hợp lí sẽ đem lại sức khỏe cho người sử dụng Probiotics là các vi khuẩn sống đã được chứng minh là tốt cho sức khỏe do chúng giúp cải thiện

sự cân bằng của hệ vi khuẩn đường ruột

Theo phân loại của tổ chức y tế thế giới (WHO) và Tổ chức Lương nông thế giới (FAO), probiotic bao gồm phần lớn các chủng vi khuẩn thuộc nhóm sinh axit

lactic như là Lactobacillus và Bifidobacteria Ngoài ra, một số chủng thuộc nhóm Bacillus và nấm men được sử dụng trong sản xuất probiotic

1.6.2 Giới thiệu về vi khuẩn lactic

Năm 1780, nhà hoá học Thụy Điển Karl W Scheele lần đầu tiên tách được lactic từ sữa bò lên men chua Năm 1856, Louis Pasteur chứng minh được rằng sự hình thành lactic trong quá trình lên men sữa chua có liên quan đến một nhóm vi sinh vật đặc biệt gọi là vi khuẩn lactic Năm 1878, Joseph Lister phân lập thành công vi

khuẩn lactic đầu tiên và đặt tên là Bacterium lactis (hiện nay gọi là Streptococcus lactis) Từ đó đến nay các nhà hoá học liên tiếp phân lập được các loại vi khuẩn lactic

khác nhau [7]

1.6.3 Đặc điểm vi khuẩn lactic

Vi khuẩn lên men lactic thuộc họ Lactobacterium Đây là những trực khuẩn,

cầu khuẩn không tạo bào tử và hầu hết không di động, hô hấp tùy tiện Chúng có khả năng lên men nhiều loại đường đơn và đường đôi nhưng không có khả năng lên men các loại glucid phức tạp và tinh bột Sự phát triển của nó cần có sự mặt của pepton, amin, hay muối amon Chúng có yêu cầu đặc biệt về chất dinh dưỡng là giàu vitamin, amin và khoáng chất [7]

Vi khuẩn lactic là tên gọi chung của những vi khuẩn có khả năng sinh ra lactic, sản phẩm chính trong quá trình chuyển hoá carbonhydrate Chúng được xếp vào họ

Lactobacteriaccae, có thể là cầu khuẩn (lưỡng cầu, tứ cầu, liên cầu…), trực khuẩn

ngắn hoặc dài đứng đơn độc thành chuỗi nhưng đều là vi khuẩn gram dương, không tạo bào tử (tuy nhiên hiện nay người ta tìm thấy một số giống trong họ vi khuẩn lactic

có khả năng tạo bào tử) và hầu hết không chuyển động Chúng không chứa cytochrome và enzyme catalase nhưng vì có khả năng sinh tổng hợp enzyme peroxydase rất mạnh và chính enzyme này đã phân giải H2O2 tạo thành H2O và O2 nên chúng có thể sống trong điều kiện có oxy không khí Vì vậy vi khuẩn lactic được gọi là vi khuẩn hiếu khí tuỳ tiện [7]

Vi khuẩn lactic thu nhận năng lượng nhờ chuyển hoá đường thành lactic, ngoài sản phẩm chính quá trình lên men đường còn cho nhiều sản phẩm đường khác như: ethanol, axetic, CO2… Chính vì vậy nhóm vi khuẩn lactic là nhóm vi sinh vật có ý nghĩa rất quan trọng, được ứng dụng rộng rãi trong rất nhiều lĩnh vực như: thực phẩm,

y học, sản xuất lactic và lactate

Vi khuẩn lactic có tế bào dạng hình que và hình cầu, kích thước của chúng phụ thuộc vào môi trường và điều kiện nuôi cấy

- Dạng hình que có thể là ngắn gần như hình cầu, chiều dài khoảng 0.5 – 0,7µm

và mọc thành sợi dài, đôi khi tới 8µm Chúng đứng riêng rẽ, kết đôi hoặc kết thành chuỗi

- Dạng hình cầu còn có dạng ovan, đường kính 0,5 ÷ 0,6 tới 1µm, đứng riêng lẻ hoặc kết đôi hay kết chuỗi Chuỗi có chiều dài khác nhau

Thành phần môi trường có ảnh hưởng đến hình dạng tế bào Trong môi trường

có hàm lượng rượu cao sẽ làm cho tế bào dài ra Rượu etylic còn có tác dụng kìm hãm sự phân chia tế bào mạnh hơn so với sinh trưởng của vi khuẩn

Các tế bào vi khuẩn lactic không chuyển động, không tạo thành bào tử, gram(+), không tạo thành sắc tố, không khử nitrate thành nitrite, không có hoạt tính catalase

Vi khuẩn lactic là thể kị khí, vi hiếu khí Trong điều kiện kị khí chúng sinh trưởng và hoạt động mạnh, nhưng ở điều kiện hiếu khí chúng vẫn sống nhưng hoạt động kém

Vi khuẩn lactic sinh sản bằng cách phân chia tế bào cùng với cơ chất Tùy vào loại cơ chất, con đường chuyển hóa khác nên có sự sai lệch về thời gian sinh trưởng

chiếm ưu thế trong dạ dày mật ong của ong mật A mellifera, A dorsata và

bumblebees đã được báo cáo là thuộc chi Lactobacillus [32, 46, 44]

1.6.4 Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic

Vi khuẩn lactic mặc dù chúng không đồng nhất về mặt hình thái nhưng về mặt sinh lý chúng tương đối đồng nhất Đặc biệt, tất cả các loại vi khuẩn lactic đều đòi hỏi nguồn dinh dưỡng tổng hợp chứa hydratcarbon, amin, peptit, vitamin, chất khoáng… Việc lựa chọn và nồng độ các chất dinh dưỡng phụ thuộc vào đặc tính sinh

lý của từng chủng, từng loài và điều kiện nuôi cấy chúng [4]

1.6.4.1 Nguồn dinh dưỡng carbon

Carbon có trong thành tế bào, tế bào chất, trong tất cả các phân tử enzyme, nucleic và các sản phẩm trao đổi chất Chính vì vậy những hợp chứa carbon có ý nghĩa hàng đầu trong sự sống của vi sinh vật nói chung và của vi khuẩn lactic nói riêng

Các loài vi khuẩn lactic khác nhau đòi hỏi nguồn carbon khác nhau Có loài sử dụng nguồn carbon là các loại đường, có loài sử dụng nguồn carbon là các loại tinh

bột Chẳng hạn như Streptococcus sp sử dụng rất tốt glucose, lactose, maltose Lactobacillus bulgaricus sử dụng tốt glucose, lactose nhưng không sử dụng được maltose và saccharose Một số loài L plantarum có khả năng sử dụng tinh bột tốt

Trong quá trình lên men, khi không có mặt của các cơ chất carbon, vi khuẩn lactic sẽ sử dụng nguồn năng lượng từ các amin như glutamic, arginin, tyrozyl Khi

đó sẽ xảy ra quá trình decarboxyl và tạo ra CO2 [4]

1.6.4.2 Nguồn dinh dưỡng nitơ

Đa số các vi khuẩn lactic đều không tự tổng hợp được các hợp chất hữu cơ phức tạp có chứa nitơ Vì vậy, để đảm bảo cho sự phát triển của mình, vi khuẩn lactic phải sử dụng nitơ có sẵn trong môi trường Nguồn nitơ này thường là các amin Ngoài amin thì các peptide và các muối amôn cũng là nguồn cung cấp nitơ cho vi khuẩn lactic Nhóm vi khuẩn này cũng có thể đồng hoá các amin cần thiết cho sự phát triển của chúng từ nguồn nitơ phức tạp như dịch chiết nấm men, dịch chiết thịt, pepton, trypton… [4]

1.6.4.3 Nguồn dinh dưỡng vitamin

Các vi khuẩn lactic khác nhau thì nhu cầu dinh dưỡng vitamin cũng khác nhau Tuy nhiên, chúng đều cần các vitamin nhóm B để kích thích sự phát triển Theo nghiên cứu cho thấy nhu cầu vitamin còn bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố như: nhiệt

độ nuôi cấy, pH, lượng CO2 ban đầu và thế oxy hoá khử của môi trường Chẳng hạn nếu thay đổi nhiệt độ khoảng 3 – 4ºC thì nhu cầu trao đổi riboflavin với môi trường

bên ngoài của L helveticus thay đổi khoảng 25% Nhu cầu vitamin cũng bị ảnh hưởng

bởi các thành phần môi trường Điều này có liên quan chặt chẽ với sự có mặt của các chất hữu cơ, dezoxyriboxit Nhu cầu vitamin B12 của vi khuẩn lactic sẽ không còn khi trong môi trường đã có dezoxyriboxit hoặc cần bổ sung aspactic khi vi khuẩn lactic sinh trưởng trong môi trường thiếu biotin [4]

1.6.4.4 Các hợp chất khoáng

Để đảm bảo cho sự sinh trưởng và phát triển đầy đủ của mình các vi khuẩn lactic cần phức hợp các hợp chất vô cơ như: photpho, lưu huỳnh, kali, magie, mangan, đồng, sắt, natri… đặc biệt là mangan Mangan ngăn cản quá trình tự phân của tế bào

và nó cần thiết cho quá trình sống bình thường của vi khuẩn Chính vì vậy mà trong môi trường nuôi cấy vi khuẩn lactic, người ta thường bổ sung muối MnSO4 Đối với

Lactobacillus thì Mn2+, Mg2+, Fe2+ có tác dụng tích cực lên sự phát triển và sản sinh

ra lactic [4]

1.6.5 Ảnh hưởng của các yếu tố môi trường đến sự sinh trưởng, phát triển của vi khuẩn lactic

1.6.5.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến hoạt động của vi khuẩn lactic Khoảng nhiệt

độ của vi khuẩn lactic khá rộng: một số loài có thể phát triển được ở 55ºC nhưng cũng

có loài phát triển được ở 5ºC Nhìn chung đa số vi khuẩn lactic có thể phát triển được trong khoảng nhiệt độ từ 15 – 40ºC

1.6.5.2 Ảnh hưởng của pH

Có thể nói, pH là một trong những yếu tố có tác động rất mạnh đến hoạt động của vi sinh vật nói chung và vi khuẩn lactic nói riêng Đặc biệt là hệ enzyme của

chúng, mỗi enzyme đều có một vùng pH tối ưu mà tại đó hoạt lực của enzyme là cao nhất Tuy nhiên, pH nội bào của vi khuẩn lactic lại không tương ứng với pH tối ưu của các enzyme nội bào mà nó chứa Có thể nói pH tối ưu cho sự phát triển của các

vi khuẩn lactic cũng như giá trị pH cuối cùng mà mỗi giống vi khuẩn lactic chịu được

là khác nhau Chẳng hạn như Lactobacillus có thể chịu được pH là 3,2 ÷ 3,5; Pediococcus có thể chịu được là 3,5 ÷ 4,0; Leuconostoc có thể chịu được pH 5 Nói

chung quá trình lên men sẽ dừng lại khi giá trị pH đạt 3,5

1.6.5.3 Ảnh hưởng của nồng độ oxy

Các loài vi khuẩn lactic khác nhau có phản ứng khác nhau với nồng độ oxy của môi trường Đối với loài vi khuẩn lactic yếm khí tuỳ tiện chúng có thể sinh trưởng

được trong môi trường chứa oxy Ví dụ như Lactobacillus plantarum có thể đồng hoá được glycerin trong điều kiện hiếu khí Một số loài Lactobacillus như L brevis, L buchneri cần oxy để oxy hoá hexose, gluconate Một số chủng khác lại cần oxy cho

sự tăng sinh khối Người ta đã chứng minh được rằng hệ enzyme peroxydase có trong

vi khuẩn lactic có thể thực hiện chức năng thay thế cho hệ enzyme dehydrogenase, khi đó oxy được sử dụng như chất nhận hydro

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu:

Tiến hành phân lập từ 12 mẫu khác nhau từ 6 nguồn cá lên men và các sản phẩm khác tại các khu vực khác nhau: thịt chua, nem chua, tôm chua, ruột cá, mắm

2.2 Dụng cụ và hóa chất

2.2.1 Dụng cụ

Các dụng cụ, thiết bị của phòng thí nghiệm bộ môn Vi sinh – Hóa sinh – Sinh học phân tử, viện Công nghệ sinh học - Công nghệ thực phẩm, trường đại học Bách Khoa Hà Nội Thiết bị bao gồm: Tủ cấy vô trùng (JSR, Hàn Quốc), tủ ấm (JSR, Hàn Quốc), tủ ấm nuôi cấy vi sinh vật (Memmert, Đức), tủ lạnh thường (LG, Việt Nam),

tủ lạnh sâu (Operon, Hàn Quốc), máy đo pH (METTLERTOLEDO, Thụy Sỹ), máy vortex (VELP, Đức), máy đo quang phổ (Ultrospec 2000, Pharmacia Biotech), máy

ly tâm lạnh 13.000 vòng/phút (Hettich, Đức), cân kỹ thuật chính xác 0,01g (Ohaus, Thụy Sỹ), lò vi sóng ( SANYO, Việt Nam), tủ sấy dụng cụ (JSR, Hàn Quốc)

MgSO4.7H2O (0,1g/l), MnSO4.4H2O (0,28g/l), Agar (20g/l), pH 6,5 và được thanh trùng ở nhiệt độ 110ºC trong 30 phút [44, 25]

Môi trường NA (Nutrient Agar): Extract yeast (3g/l), peptone (5g/l), Agar

(15g/l), pH 7,0 và được thanh trùng ở nhiệt độ 121ºC trong 15 phút

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp phân lập các chủng vi sinh vật

Phân lập theo phương pháp pha loãng mẫu trên môi trường MRS có bổ sung CaCO3 Dựa vào phản ứng giữa CaCO3 và axit ta sẽ xác định được hoạt tính của chủng phân lập [2]

2.3.2 Phương pháp tuyển chọn

 Tuyển chọn chủng có khả năng sinh acid lactic cao

 Tuyển chọn chủng có khả năng sinh trưởng trong điều kiện môi trường có nồng độ muối cao

 Tuyển chọn những chủng có một số hoạt tính probiotic giúp tăng lợi ích của sản phẩm [2, 35]

- Khả năng kháng khuẩn

- Khả năng sinh bacteriocin

2.3.2.1 Phương pháp cấy chấm điểm

Các chủng sau khi được phân lập và sơ chọn đem cấy chấm điểm trên môi trường MRS bổ sung CaCO3 và agar, nuôi ở 37ºC Sau 48 giờ, quan sát lựa chọn chủng có vòng phân giải CaCO3 cao nhất bằng xác định đường kính vòng phân giải D/d1