Nghiên cứu xây dựng và ứng dụng thử nghiệm quy trình tách chiết RNA virút từ các loại nhuyễn thể hai mảnh vỏ

Phương pháp phổ biến nhất hiện nay được sử dụng để phân tích sự nhiễm tạp của Norovirus và HAV trong thực phẩm là phương pháp ISO/TS 15216-2:2013; trong phương pháp này, RNA virút được l

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC :

TS LÊ QUANG HÒA

Hà Nội – Năm 2017

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN 4

LỜI CAM ĐOAN 5

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT 6

MỞ ĐẦU 11

CHƯƠNG I TỔNG QUAN 13

1.1 Tình hình tiêu thụ và xuất khẩu nhuyễn thể hai mảnh vỏ ở Việt Nam 13

1.2 Tác nhân gây ngộ độc thực phẩm phổ biến: Norovirus và HAV 15

1.2.1 Norovirus 16

1.2.2 Virút viêm gan A 17

1.3 Khó khăn khi phát hiện virút trong thực phẩm 18

1.4 Chiến lược phát hiện virút trong thực phẩm 19

1.5 Quy trình tách chiết virút từ thực phẩm 19

1.5.1 Quy trình tách chiết virút từ thực phẩm bằng cách rửa giải và cô đặc virút 19

1.5.2 Quy trình tách chiết virút từ thực phẩm bằng cách xử lý proteinase K 23

1.5.3 Quy trình tách chiết trực tiếp virút từ thực phẩm 24

1.6 Quy trình tinh sạch dịch rửa giải / cô đặc virút hoặc RNA sau khi tách chiết 24

1.7 Kiểm soát quá trình tách chiết và tinh sạch RNA virút từ thực phẩm 27

1.8 Các phương pháp phát hiện Norovirus và HAV 28

1.8.1 Phương pháp sử dụng kính hiển vi điện tử 28

1.8.2 Kỹ thuật ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) 28

1.8.3 Kỹ thuật RT-PCR (Reverse transcriptase-polymerase chain reaction) 29

1.8.4 Kỹ thuật RT-LAMP (Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification) 30

1.9 Phương pháp phát hiện và định lượng HAV và NoV trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ hiện nay ISO/TS 15216-1:2013 và ISO/TS 15216-2:2013 30

1.9.1 Nguyên tắc của phương pháp ISO 30

1.9.2 Các nghiên cứu trên thế giới sử dụng phương pháp ISO 31

CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 34

2.1 Vật liệu nghiên cứu 34

2.1.1 Chủng virút và mẫu chuẩn RNA 34

2.1.2 Mẫu nhuyễn thể hai mảnh vỏ 34

2.1.3 Mồi và mẫu dò 34

2.1.4 Hóa chất 34

2.1.5 Thiết bị 35

2.2 Phương pháp nghiên cứu 35

2.2.1 Thiết kế nghiên cứu 35

2.2.2 Phương pháp Trizol 37

2.2.3 Phương pháp tinh sạch bằng cột silica Purelink RNA mini Kit 38

2.2.4 Phương pháp xử lý mẫu bằng CTAB 39

2.2.5 Phương pháp kết tủa RNA bằng LiCl 40

2.2.6 Phương pháp tinh sạch bằng bi từ silica 41

2.2.7 Phương pháp Real-time RT-PCR 41

2.2.8 Phương pháp tách chiết RNA virút theo ISO/TS 15216-2:2013 43

2.2.9 Phương pháp nhiễm chủ động Mengovirus, Norovirus và HAV theo ISO 44

CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 45

3.1 Hiệu quả tách chiết và tinh sạch RNA Mengovirus của các phương pháp dựa trên Trizol và màng silica 45

3.1.1 Hiệu quả tách chiết và tinh sạch RNA Mengovirus của phương pháp A (Trizol) 46 3.1.2 Hiệu quả tách chiết và tinh sạch RNA Mengovirus của phương pháp B (Trizol và tinh sạch bằng Purelink RNA mini Kit) 48

3.1.2 Hiệu quả tách chiết và tinh sạch RNA Mengovirus của phương pháp C (Trizol, tinh sạch bằng Purelink RNA mini Kit và kết tủa với LiCl) 49

3.1.3 Hiệu quả tách chiết và tinh sạch RNA Mengovirus của phương pháp D (Trizol

kết hợp với Purelink RNA mini Kit và xử lý với CTAB) 503.1.3 Hiệu quả tách chiết và tinh sạch RNA Mengovirus của phương pháp E (Trizol,

tinh sạch bằng Purelink RNA mini Kit, xử lý bằng CTAB và kết tủa với LiCl) 513.1.6 Tổng hợp kết quả tách chiết và tinh sách RNA Mengovirus của các phương pháp

dựa trên Trizol và màng silica 53

3.2 Hiệu quả tinh sạch RNA Mengovirus bằng bi từ silica 57

3.2.1 Tối ưu lượng bi từ silica sử dụng để tinh sạch RNA Mengovirus đạt hiệu quả

cao 57

3.2.2 Tối ưu nồng độ cồn trong dịch nổi khi ủ với bi từ silica để tinh sạch RNA

Mengovirus đạt hiệu quả cao 583.2.3 Tối ưu nhiệt độ rửa giải RNA Mengovirus khi tinh sạch bằng bi từ silica 59

3.3 So sánh hiệu quả tách chiết RNA virút giữa phương pháp E và phương pháp ISO trên các mẫu nhuyễn thể hai mảnh vỏ được nhiễm chủ động 61

3.3.1 So sánh hiệu suất thu hồi RNA Mengovirus của các mẫu hàu, ngao và vẹm

được nhiễm chủ động 4 ngưỡng virút 63

3.3.2 So sánh hiệu quả tách chiết RNA virút giữa phương pháp E và phương pháp

ISO trên mẫu hàu được nhiễm chủ động 643.3.3 So sánh hiệu quả tách chiết RNA virút giữa phương pháp E và phương pháp

ISO trên mẫu ngao được nhiễm chủ động 653.3.4 So sánh hiệu quả tách chiết RNA virút giữa phương pháp E và phương pháp

ISO trên mẫu vẹm được nhiễm chủ động 673.3.5 Tổng hợp kết quả so sánh phương pháp E và phương pháp ISO khi tách chiết

RNA từ nhuyễn thể hai mảnh vỏ được nhiễm chủ động virút 69

3.4 So sánh hiệu quả tách chiết của phương pháp ISO và phương pháp E khi tách chiết NoV từ mẫu nhuyễn thể hai mảnh vỏ tự nhiên 71 3.5 Ứng dụng thử nghiệm phương pháp E để tách chiết RNA virút từ nhuyễn thể 2 mảnh vỏ 75 CHƯƠNG IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 78

LỜI CẢM ƠN

Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Lê Quang Hòa, trưởng phòng thí nghiệm Kỹ thuật gen, Trung tâm nghiên cứu và phát triển Công nghệ Sinh học, viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, trường Đại học Bách khoa

Hà Nội đã tận tình chỉ bảo và hướng dẫn tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn

Tôi cũng xin trân trọng cảm ơn các thầy, cô trong Viện đã nhiệt tình giảng dạy và giúp đỡ trong quá trình học tập và nghiên cứu Qua đây, tôi cũng xin chân thành cảm

ơn các cán bộ phòng thí nghiệm viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, các bạn sinh viên, học viên trường Đại học Bách khoa Hà Nội đã giúp đỡ tôi trong quá trình thí nghiệm

Bên cạnh đó, tôi cũng xin chân thành cảm ơn TS Elisabetta Suffredini (Istituto Superiore di Sanità) đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận văn

Đặc biệt là tôi xin chân thành cảm ơn Bộ Khoa Học Công Nghệ đã cấp kinh phí

cho nhiệm vụ Nghị Định Thư giữa Việt Nam và Cộng hòa Ý với tiêu đề “Nghiên cứu phát triển phương pháp, công cụ phân tích nhanh vi sinh vật gây bệnh và độc tố trong các sản phẩm thủy sản”, mã số : 06/2014/HĐ-NĐT để tôi có thể hoàn thành

được nghiên cứu này

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè đã động viên giúp đỡ, tạo điều kiện để tôi hoàn thành luận văn

Tôi xin trân trọng cảm ơn !

Học viên

Phạm Tiến Dũng

LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan những số liệu được công bố trong đề tài : “Nghiên cứu xây

dựng và ứng dụng thử nghiệm quy trình tách chiết RNA virút từ các loại nhuyễn thể hai mảnh vỏ” là trung thực, do tôi thực hiện dưới sự hướng dẫn của TS Lê Quang

Hòa và chưa từng được công bố trong công trình khoa học khác

Học viên

Phạm Tiến Dũng

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

BSA bovine serum albumin

DNA Deoxyribonucleic acid

HAV Hepatitis A virus

ISO International Organization for Standardization

LBM Live bivalve molluscs

RT-LAMP Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification

RT-PCR Reverse transcriptase polymerase chain reaction

RT-qPCR Real time Reverse transcriptase polymerase chain reaction

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Một số lô hàng nhuyễn thể Việt Nam xuất khẩu sang châu Âu bị phát hiện nhiễm Norovirus……… 14 Bảng 1.2 Đệm rửa giải và các chất thêm vào để tách chiết virus từ mẫu thực phẩm 21 Bảng 1.3 Thuận lợi và khó khăn của các phương pháp được sử dụng để cô đặc hạt virút……… 23 Bảng 1.4 Tổng kết các phương pháp ly giải virus, cô đặc và tách chiết axit nucleic từ nhuyễn thể hai mảnh vỏ dựa trên kỹ thuật RT-PCR……… 26 Bảng 2.1 Trình tự mồi và mẫu dò định lượng Mengovirus, NoV và HAV sử dụng trong phản ứng RT-qPCR………42 Bảng 2.2 Thành phần phản ứng Real-time RT-PCR định lượng Mengovirus, NoV và HAV 42 Bảng 2.3 Chu trình nhiệt phản ứng Real-time RT-PCR định lượng Mengovirus, NoV

và HAV 43 Bảng 3.1 Kết quả đánh giá hiệu quả tách chiết và tinh sạch của phương pháp A (Trizol) bằng kỹ thuật RT-qPCR……….47 Bảng 3.2 Kết quả đánh giá hiệu quả tách chiết và tinh sạch của phương pháp B (Trizol kết hợp với Purelink RNA mini Kit) bằng kỹ thuật RT-qPCR……… 49 Bảng 3.3 Kết quả đánh giá hiệu quả tách chiết và tinh sạch của phương pháp C (Trizol kết hợp với Purelink RNA mini Kit và kết tủa RNA bằng LiCl) bằng kỹ thuật RT-qPCR……… 50 Bảng 3.4 Kết quả đánh giá hiệu quả tách chiết và tinh sạch RNA Mengovirus của phương pháp D (Trizol kết hợp với Purelink RNA mini Kit và xử lý CTAB) bằng kỹ thuật RT-qPCR………51 Bảng 3.5 Kết quả đánh giá hiệu quả tách chiết và tinh sạch RNA Mengovirus của phương pháp E (Trizol kết hợp với Purelink RNA mini Kit, xử lý với CTAB rồi kết tủa RNA bằng LiCl) bằng kỹ thuật RT-qPCR……… 52 Bảng 3.6 Hiệu quả tách chiết và tinh sạch RNA Mengovirus của các phương pháp

Bảng 3.7 Kết quả tối ưu lượng bi từ silica sử dụng để tinh sạch RNA Mengovirus đạt hiệu quả cao……… 58 Bảng 3.8 Kết quả tối ưu nồng độ cồn trong dịch nổi khi ủ với bi từ silica để tinh sạch RNA Mengovirus đạt hiệu quả cao……… 59 Bảng 3.9 Kết quả tối ưu nhiệt độ rửa giải RNA Mengovirus khi tinh sạch bằng bi từ silica……… 60 Bảng 3.10 nồng độ HAV và NoV trong các ngưỡng được nhiễm chủ động vào mẫu nhuyễn thể hai mảnh vỏ……… 61 Bảng 3.11 nồng độ phiên bản thể gen của HAV và NoV trong các plasmid dựng đường chuẩn định lượng RT-qPCR……… 61 Bảng 3.12 So sánh hiệu suất thu hồi RNA Mengovirus của các mẫu hàu, ngao và vẹm được nhiễm chủ động 4 ngưỡng virút……… 63 Bảng 3.13 So sánh hiệu quả tách chiết RNA virút giữa phương pháp E và phương pháp ISO trên mẫu hàu được nhiễm chủ động……….64 Bảng 3.14 So sánh hiệu suất thu hồi RNA của Norovirus GI trong mẫu hàu được nhiễm chủ động giữa phương pháp E và phương pháp ISO……… 64 Bảng 3.15 So sánh hiệu suất thu hồi RNA của Norovirus GII trong mẫu hàu được nhiễm chủ động giữa phương pháp E và phương pháp ISO………65 Bảng 3.16 So sánh hiệu suất thu hồi RNA của HAV trong mẫu ngao được nhiễm chủ động giữa phương pháp E và phương pháp ISO……… 65 Bảng 3.17 So sánh hiệu suất thu hồi RNA của Norovirus GI trong mẫu ngao được nhiễm chủ động giữa phương pháp E và phương pháp ISO……… 66 Bảng 3.18 So sánh hiệu suất thu hồi RNA của Norovirus GII trong mẫu ngao được nhiễm chủ động giữa phương pháp E và phương pháp ISO……… 66 Bảng 3.19 So sánh hiệu suất thu hồi RNA của HAV trong mẫu vẹm được nhiễm chủ động giữa phương pháp E và phương pháp ISO……….67 Bảng 3.20 So sánh hiệu suất thu hồi RNA của Norovirus GI trong mẫu vẹm được nhiễm chủ động giữa phương pháp E và phương pháp ISO……… 68

Bảng 3.21 So sánh hiệu suất thu hồi RNA của Norovirus GII trong mẫu vẹm được nhiễm chủ động giữa phương pháp E và phương pháp ISO……….68 Bảng 3.22 So sánh phương pháp E và phương pháp ISO khi tách chiết RNA của HAV

từ nhuyễn thể hai mảnh vỏ được nhiễm chủ động virút………69 Bảng 3.23 So sánh phương pháp E và phương pháp ISO khi tách chiết RNA của NoV

GI từ nhuyễn thể hai mảnh vỏ được nhiễm chủ động virút……… 69 Bảng 3.24 So sánh phương pháp E và phương pháp ISO khi tách chiết RNA của NoV GII từ nhuyễn thể hai mảnh vỏ được nhiễm chủ động virút………70 Bảng 3.25 Kết quả định lượng NoV GI và NoV GII trong 20 mẫu nhuyễn thể hai mảnh vỏ khi tách chiết bằng cả phương pháp ISO và phương pháp E……… 72 Bảng 3.26 Kết quả định lượng các loại virút bằng RT-qPCR khi ứng dụng phương pháp E để tách chiết 30 mẫu nhuyễn thể hai mảnh vỏ thu thập tại Việt Nam………76 Bảng 3.27 Phân tích kết quả sử dụng phương pháp E định lượng RNA của HAV và NoV trong 30 mẫu nhuyễn thể hai mảnh vỏ thu thập tại Việt Nam………77

DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ ĐỒ THI

Hình 1.1 Một số món ăn làm từ nhuyễn thể hai mảnh vỏ……… 13

Hình 1.2 Norovirus……… 17

Hình 1.3 Virút viêm gan A……… … 18

Hình 1.4 Quy trình phân tích các loại mẫu theo tiêu chuẩn ISO………24

Hình 1.6 Mengovirus……… 27

Hình 2.1 Thiết kế nghiên cứu xây dựng phương pháp mới dựa trên Trizol và màng silica tách chiết và tinh sạch RNA virút đạt hiệu quả cao……… …35

Hình 2.2 Sự phân pha và kết tủa RNA trong phương pháp Trizol……… …38

Hình 2.3 Quy trình tinh sạch RNA bằng cột silica……… …39

Hình 3.1: Các bước chính trong quy trình tách chiết RNA virút từ mẫu nhuyễn thể hai mảnh vỏ sau khi đã xây dựng xong……… …55

Hình 3.2 Đồ thị so sánh lượng Norovirus GI phát hiện được giữa phương pháp ISO và phương pháp E trong các mẫu nhuyễn thể hai mảnh vỏ tự nhiên ……… 73

Hình 3.3 Đồ thị so sánh lượng Norovirus GII phát hiện được giữa phương pháp ISO và phương pháp E trong các mẫu nhuyễn thể hai mảnh vỏ tự nhiên ……… …74

Hình 4.1 Học viên Phạm Tiến Dũng quan sát TS Elisabetta Suffredini làm thí nghiệm….80

MỞ ĐẦU

Phần lớn bệnh ngộ độc thực phẩm xuất phát từ một số nhóm virút đường ruột như Norovirus (NoV), virút viêm gan A (HAV), Astrovirus, Sapovirus và Enterovirus Một nghiên cứu gần đây ở Mỹ ước tính rằng 59% các vụ ngộ độc thực phẩm là do yếu

tố virút Đối với nhiều quốc gia, NoV trở thành độc tố thực phẩm thông báo Khi so sánh với NoV, ngộ độc do HAV thường ít gặp hơn Tuy nhiên, virút này có thể dẫn đến những chứng bệnh nghiêm trọng Vụ ngộ độc do HAV lớn nhất (300.000 trường hợp ở Thượng Hải, Trung Quốc, 1988) có liên quan đến việc tiêu thụ ngao nhiễm virút

Dữ liệu gần đây ở Châu Âu cho thấy rằng nhuyễn thể hai mảnh vỏ sống (LBM)

là loại thực phẩm phổ biến nhất liên quan đến các vụ dịch ngộ độc thực phẩm do virút Trong một nghiên cứu được thực hiện ở 7 thành phố ven biển ở Trung Quốc trong tháng 12 năm 2009 và tháng 11 năm 2011, NoV đã được phát hiện trong 13,3% (112/840) của LBM Tại Việt Nam, nhuyễn thể hai mảnh vỏ không chỉ là sản phẩm thực phẩm giàu dinh dưỡng mà còn có chất lượng cảm quan đặc trưng, do đó thời gian gần đây loại thực phẩm này đang rất được ưa chuộng cùng với sự đóng góp không nhỏ vào kim ngạch xuất khẩu thủy hải sản của đất nước

Phương pháp phổ biến nhất hiện nay được sử dụng để phân tích sự nhiễm tạp của Norovirus và HAV trong thực phẩm là phương pháp ISO/TS 15216-2:2013; trong phương pháp này, RNA virút được ly giải bằng proteinase K cùng với guanidine thiocyanate sẽ được hấp thụ vào silica Trình tự mục tiêu của RNA virút sau đó sẽ được khuếch đại và phát hiện dựa trên kỹ thuật RT-qPCR có độ nhạy và độ đặc hiệu cao Hiện nay, đây là phương pháp tiêu chuẩn nhưng vẫn có những mặt hạn chế như yêu cầu thiết bị NucliSENS miniMAG (Biomerieux) – thiết bị này không phải phòng thí nghiệm nào cũng chuẩn bị được và hiệu suất thu hồi RNA virút rất thấp

Vì những nhược điểm đó, mục tiêu của luận văn này là phát triển một phương

bị, ngoài ra có thể loại bỏ chất ức chế mà vẫn đạt hiệu suất thu hồi cao Do đó, đề tài

“Nghiên cứu xây dựng và ứng dụng thử nghiệm quy trình tách chiết RNA virút từ

các loại nhuyễn thể hai mảnh vỏ” đã được thực hiện

CHƯƠNG I TỔNG QUAN

1.1 Tình hình tiêu thụ và xuất khẩu nhuyễn thể hai mảnh vỏ ở Việt Nam

Thời gian gần đây tại Việt Nam, trong số các sản phẩm thực phẩm không gia nhiệt thì nhuyễn thể hai mảnh vỏ là sản phẩm được tiêu thụ với số lượng lớn do có chất lượng cảm quan đặc trưng với hàm lượng chất dinh duỡng cao hơn những sản phẩm cùng loại; đặc biệt, sản lượng xuất khẩu các loại nhuyễn thể hai mảnh vỏ của nước ta sang các thị trường chung Châu Âu đã tăng nhanh trong những năm gần đây Theo số liệu của Hải Quan Việt Nam, trong 11 tháng đầu năm 2016 kim ngạch xuất khẩu của nhuyễn thể hai mảnh vỏ đạt 75 triệu USD và dự kiến tới năm 2020 con số này sẽ tăng gấp đôi lên 150 triệu USD, điều này cho thấy tầm quan trọng của việc xuất khẩu nhuyễn thể hai mảnh vỏ cũng như tốc độ phát triển nhanh chóng của ngành

Hình 1.1 Một số món ăn làm từ nhuyễn thể hai mảnh vỏ

Tuy nhiên, trong sáu tháng đầu năm 2014, Cơ quan thẩm quyền Châu Âu (EU)

đã cảnh báo 23 lô hàng nhuyễn thể hai mảnh vỏ của Việt Nam về chỉ tiêu Norovirus Đến tháng 7 năm 2014, Cục quản lý chất lượng Nông lâm sản và Thủy sản thuộc Bộ

việc lấy mẫu giám sát nhuyễn thể hai mảnh vỏ [6] Có thể nhận thấy, vấn đề nhiễm Norovirus trong thực phẩm không những ảnh hưởng lớn đến sức khỏe người tiêu dùng

mà còn gây tác động không nhỏ đến nền kinh tế quốc dân và tính cạnh tranh lành mạnh của thực phẩm Việt Bên cạnh Norovirus, virút viêm gan A (HAV) là một trong những loại virút có khả năng truyền nhiễm cao nhất, gây ảnh hưởng xấu đến sức khỏe cộng đồng, đặc biệt là tại những quốc gia đang phát triển Nguyên nhân chính của việc lây nhiễm HAV là việc sử dụng nước và các sản phẩm thực phẩm tươi sống hoặc nấu không kỹ, trong đó các loại nhuyễn thể hai mảnh vỏ là tác nhân phổ biến mang HAV

do kiểu sinh sống lọc nước để lấy thức ăn của chúng

Bảng 1.1 Một số lô hàng nhuyễn thể Việt Nam xuất khẩu sang châu Âu bị

phát hiện nhiễm Norovirus

STT Mặt hàng nhiễm Norovirus Nước nhập khẩu Ngày lấy mẫu Ngày thông báo Mã trích dẫn

5 Ngao trắng đã chế biến đông lạnh Tây Ban Nha 27/06/2014 14/07/2014 2014.BDO

công cụ kiểm soát sự nhiễm tạp của NoV và HAV trong các sản phẩm nhuyễn thể hai mảnh vỏ Ngoài các số liệu báo cáo dịch tễ, những lô hàng nhuyễn thể xuất khẩu của Việt Nam sang các nước châu Âu thường xuyên bị phát hiện chứa Norovirus

Các lô sản phẩm xuất khẩu, chỉ với 1 mẫu bị phát hiện nhiễm Norovirus sẽ ngay lập tức bị trả lại, tiêu hủy hoặc rút hết khỏi thị trường nước nhập khẩu Với việc chiếm tới 8-10% trong các mặt hàng thủy sản xuất khẩu, vấn đề nhuyễn thể bị trả lại gây ra thiệt hại lớn về kinh tế Hơn nữa, các lô hàng này chỉ được phát hiện nhiễm virus khi

đã chuyển sang nước đối tác, gây mất uy tín trên thị trường nhuyễn thể Thế giới Tại Việt Nam, còn hạn chế trong khâu kiểm tra chất lượng sản phẩm trước khi xuất khẩu Các phương pháp phát hiện Norovirus trong nhuyễn thể hiện nay tương đối phức tạp, đòi hỏi kĩ thuật và chi phí cao để có thể phát hiện lượng Norovirus thấp trong các mẫu nhuyễn thể

1.2 Tác nhân gây ngộ độc thực phẩm phổ biến: Norovirus và HAV

Trên thế giới, việc đảm bảo chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm là một trong những vấn đề được lưu tâm hàng đầu Ở Mỹ, theo ước tính có khoảng 67% các bệnh do thực phẩm gây ra bởi virút, nhiều gấp đôi so với nguyên nhân do vi khuẩn (30%) và ký sinh trùng (3%) Nghiên cứu về nhóm các virút gây ô nhiễm nguồn nước có khả năng lây nhiễm sang thực phẩm, có đến hơn 100 loại virút được tìm thấy trong đường ruột người Trong số các virút này, Norovirus (NoV) và Hepatitis A virus (HAV) là hai virút gây bệnh phổ biến, chiếm tỉ lệ lần lượt là 83,7% và 12,8%, được tìm thấy nhiều nhất ở nhóm thủy hải sản [18] Nhuyễn thể hai mảnh vỏ có thể sống được cả ở vùng nước ngọt và nước mặn, do tập tính lọc nước để lấy thức ăn nên chúng có thể tích trữ rất nhiều loại virút trong ống tiêu hóa, nổi bật trong đó phải kể đến Norovirus và HAV

1.2.1 Norovirus

Nghiên cứu dịch tễ học đầu tiên chứng minh mối liên hệ giữa virút gây viêm dạ dày ruột và nhuyễn thể hai mảnh vỏ được thực hiện vào mùa đông năm 1976-1977 tại Anh, nơi xảy ra 33 vụ ngộ độc riêng biệt với khoảng 800 người nhập viện do sử dụng

sò đã qua nấu chín Norovirus là virút gây bệnh xuất hiện nhiều nhất trong các loại nhuyễn thể hai mảnh vỏ, chiếm 83,7%, tiếp đến là HAV chiếm 12,8% Rất nhiều các nghiên cứu khẳng định sự có mặt của Norovirus trong nhuyễn thể hai bảnh vỏ đã được thực hiện tại châu Âu, châu Đại Dương, Mỹ và Úc [22]

Theo các số liệu thống kê dịch tễ gần đây, Norovirus được coi là một trong những nguyên nhân chính gây bệnh lan truyền do thực phẩm trên toàn thế giới Ở Mỹ, Norovirus là nguyên nhân của 2/3 các ca viêm dạ dày ruột do thực phẩm nhiễm khuẩn (23 triệu ca/năm) Các đối tượng thường bị bệnh viêm dạ dày ruột do Norovirus bao gồm trẻ em, người già, người bị suy giảm miễn dịch, nhân viên nhà hàng, bệnh viện, quân đội, người đi du lịch đến các vùng có dịch [15] Đối với trẻ em, Norovirus là nguyên nhân thứ hai, sau Rotavirus gây ra bệnh viêm dạ dày ruột cấp tính ở trẻ dưới năm tuổi Ước tính hàng năm trên thế giới, Norovirus gây ra ít nhất trên 2 triệu ca viêm

dạ dày ruột cấp tính ở trẻ em với trên 200 000 trường hợp bị tử vong Tại các nước phát triển, Norovirus là nguyên nhân dẫn tới 900.000 ca nhập viện mỗi năm, trong đó có 64.000 ca ở trẻ dưới 5 tuổi Ở các nước đang phát triển, ít nhất trên 1,1 triệu ca tiêu chảy ở trẻ dưới 5 tuổi trong đó hơn 218.000 ca tử vong do Norovirus gây ra [28] Đến nay, vacxin Rotavirus đã được phổ biến tại nhiều quốc gia, nên Norovirus có nguy cơ trở thành tác nhân gây bệnh đường ruột ở trẻ em phổ biến nhất trong tương lai gần

Hình 1.2 Norovirus

Ở nước ta, theo số liệu thống kê của Cục An toàn vệ sinh thực phẩm Bộ Y tế, trong năm 2008, trên toàn quốc đã xảy ra 205 vụ ngộ độc thực phẩm làm 7.828 người mắc và 61 người tử vong Theo thống kê năm 2008, các vụ ngộ độc thực phẩm xảy ra tập trung chủ yếu tại bếp ăn gia đình (54,6%), bếp ăn tập thể (15,6%), đám cưới/giỗ (16,6%), tại các cơ sở thức ăn đường phố Một nghiên cứu được thực hiện từ tháng 12/1999 đến tháng 11/2000, trong 448 mẫu phân trẻ em tiêu chảy tại Bệnh viện Nhi Đồng I và Nhi Đồng II có 72 mẫu dương tính với Norovirus [9] Nghiên cứu dịch tễ học phân tử thực hiện năm 2007 (Nguyễn Vân Trang và cộng sự) đã chỉ ra trong 501 mẫu phân trẻ em bị viêm dạ dày ruột tại viện Nhi TW có 180 mẫu dương tính với

Norovirus [19]

1.2.2 Virút viêm gan A

Trong các vi sinh vật gây bệnh thực phẩm, các virút là một trong những tác nhân gây bệnh thường gặp nhất Theo các số liệu thống kê ở Mỹ, các virút là nguyên nhân

gây ra 66,6% các trường hợp ngộ độc thực phẩm trong khi đó Salmonella và

Mỹ, hàng năm có khoảng 80000 ca nhiễm viêm gan A mới được ghi nhận 23 Ở Châu

Âu, Norovirus (NoV) và virút viêm gan A (HAV) được coi là các tác nhân gây bệnh

đều có khả năng lây nhiễm rất cao và có thể gây ra các vụ dịch lớn Ví dụ như trong vụ dịch ở Thượng Hải (Trung Quốc) vào năm 1988, đã có 250 000 người bị nhiễm HAV sau khi tiêu thụ các loại ngao bị nhiễm 8

Hình 1.3 Virút viêm gan A

Ở nước ta, cho đến thời điểm này vẫn chưa có các báo cáo về số lượng các vụ ngộ độc thực phẩm do HAV nói riêng và virút gây bệnh thực phẩm nói chung Tuy nhiên, một nghiên cứu đã chỉ ra rằng có đến 97% số người có kháng thể kháng HAV trong máu tại khu vực đồng bằng sông Cửu Long 10 Điều này cho thấy đa số người dân ở nước ta đều đã tiếp xúc với HAV qua con đường thực phẩm

1.3 Khó khăn khi phát hiện virút trong thực phẩm

Phát hiện virút trong thực phẩm là một nhiệm vụ rất khó khăn vì các lý do chủ yếu sau: virút không thể sinh trưởng bên ngoài vật chủ nên không thể sử dụng phương pháp tăng sinh như đối với vi khuẩn, nồng độ virút trong thực phẩm thường rất thấp và tồn tại nhiều chất ức chế phản ứng PCR trong thực phẩm Trong việc phát hiện virút trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ nói riêng, tồn tại một loại polysaccharide là glycogen có mặt rất nhiều trong cơ thể khiến cho thành phần này thường có mặt trong mẫu sau khi

tách chiết RNA dẫn đến sự ức chế của phản ứng RT-PCR khi phát hiện virút Điều này đòi hỏi cần sử dụng thêm các phương pháp khác để loại bỏ chúng [7]

1.4 Chiến lƣợc phát hiện virút trong thực phẩm

Hiện nay, chiến lược chung để phát hiện virút trong thực phẩm bao gồm 3 bước: 1) tách chiết virút, 2) tinh sạch RNA virút và 3) phát hiện RNA sau khi đã được tinh sạch Trong quá trình tách chiết virút, hạt virút được tách ra từ matrix thực phẩm, sau

đó được kết tủa xuống thể tích nhỏ và cuối cùng là loại bỏ các thành phần như polysaccharide, protein và lipid gây ức chế khả năng phát hiện RNA [18, 44, 47] Ngoài ra, virút cũng cần được cô đặc bởi vì thông thường chúng chỉ có mặt với liều lượng rất thấp trong thực phẩm Đối với nhuyễn thể hai mảnh vỏ, mức nhiễm tạp thông thường từ 102

đến 104 phiên bản thể gen của virút trên 1 gam ống tiêu hóa [12, 32, 33] Trong suốt quá trình phát hiện, kết quả âm tính giả và dương tính giả đều có thể xuất hiện Kết quả âm tính giả là do sự ức chế trong phản ứng phát hiện còn dương tính giả

là kết quả do khả năng nhiễm chéo Vì vậy, trong quá trình phát hiện thường sử dụng kiểm chứng âm và kiểm chứng dương

1.5 Quy trình tách chiết virút từ thực phẩm

Có rất nhiều quy trình đã được sử dụng để tách chiết virút từ thực phẩm, các quy trình này có thể được chia làm 3 cách tiếp cận chính: 1) rửa giải virút và sau đó là cô đặc - quy trình thông thường ; 2) xử lý bằng proteinase K - quy trình tiêu chuẩn mà ISO đang sử dụng; và 3) tách chiết trực tiếp tiếp virút bao gồm cả quá trình rửa giải và

cô đặc – quy trình trong đề tài này được sử dụng

1.5.1 Quy trình tách chiết virút từ thực phẩm bằng cách rửa giải và cô đặc virút

Quá trình này dựa trên việc sử dụng một loại đệm có khả năng rửa để tách virút

ra khỏi bề mặt thực phẩm và sau đó cô đặc dung dịch rửa giải virút và thường được sử

nhuyễn thể hai mảnh vỏ Nhìn chung, bước rửa thường là sử dụng các loại đệm kiềm tính hoặc trung tính Để cô đặc, rất nhiều phương pháp được sử dụng như kết tủa với PEG (polyethylene glycol), siêu ly tâm, siêu lọc, cô đặc miễn dịch và phân tách cation

Rửa giải virút

Trong hầu hết các trường hợp, đệm kiềm tính với pH 9 – 10,5 được sử dụng để giải phóng virút ra khỏi bề mặt thực phẩm Môi trường kiềm cho phép hạt virút tách ra khỏi matrix thực phẩm Môi trường axit, ngược lại khiến cho virút càng bám chặt vào

bề mặt thực phẩm hơn [58] Đệm trung tính có thể được sử dụng khi áp dụng siêu ly tâm để cô đặc virút [1,45] Một vài loại đệm khác đã được sử dụng như đệm phosphate

pH 7.6 đã được sử dụng để rửa giải HAV từ rau diếp và dâu tây [4] hay dùng để rửa giải NoV và HAV từ hàu [34]

Dịch chiết thịt bò và glycine thường được sử dụng kết hợp để rửa giải virút vì chúng làm giảm khả năng bám của virút vào matrix thực phẩm Hơn nữa, nồng độ protein lớn của dịch chiết thịt bò khiến cho NoV bị kết tụ lại cùng với PEG [29] Đệm kiềm tính với 1% dịch chiết thịt bò đã được sử dụng để tăng hiệu suất thu hồi HAV, NoV và RoV từ quả mâm xôi lên đến 7; 3,5 và 5,7 lần Tuy nhiên quá trình phát hiện bằng phương pháp sinh học phân tử lại cho kết quả âm tính giả do sự có mặt của chất

ức chế [27, 47, 58]

Đệm Glycine nồng độ 0,05 M được sử dụng phổ biến trong các nghiên cứu [48, 52] Pectinase cũng thường được bổ sung vào dịch rửa giải virút khi tách chiết từ các thực phẩm dạng lỏng giàu carbohydrate bởi khả năng phá vỡ các liên kết pectin trong hoa quả và rau xanh [34] Bột đậu tương được sử dụng để giải phóng virút từ bề mặt thực phẩm khi sử dụng phương pháp siêu ly tâm với hiệu suất tăng lên 10 lần [45] Cuối cùng là Cat-floc đã được sử dụng để kết tụ virút từ mẫu thực phẩm rắn

Bảng 1.2 Đệm rửa giải và các chất thêm vào để tách chiết virus từ mẫu thực phẩm [53]

Thành phần/ Điều kiện Chi tiết Chức năng

kết tủa virút bằng PEG

của protein hoặc virút

pha nước (virút)

Cô đặc virút

Phương pháp kết tủa PEG: đây là phương pháp thường được sử dụng để cô

đặc hỗ trợ quá trình phát hiện sau này Polyethylene glycol (PEG) thường được sử dụng cho mục đích này bởi khả năng kết tủa virút ở pH trung tính ở nồng độ ion cao

mà không bị kết tủa cùng với các thành phần hữu cơ khác [36] Trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ, rửa giải và kết tủa PEG đã cho kết quả hiệu suất thu hồi khác nhau khi phát hiện NoV từ các toàn bộ cơ thể hay chỉ ở phần ống tiêu hóa của nhuyễn thể Một số nghiên cứu đã thu hồi được 5 – 22,4 phiên bản NoV trong 1,5 – 25 g mô nhuyễn thể [2, 16] Trong khi nghiên cứu khác lại thông báo khả năng phát hiện cao hơn: 3 x 103phiên bản NoV trong 1,25 g ống tiêu hóa của hàu [51] Cách tiếp cận này đã được sử dụng để chỉ ra mức nhiễm tạp của AdV và NoV ở loại vẹm ở Ma rốc và hàu ở Pháp [28] Đệm kiềm tính và trung tính cùng với kết tủa PEG đã được áp dụng trong phát hiện NoV trong 2 vụ dịch liên quan đến hàu và ngao [17]

Phương pháp siêu ly tâm: phương pháp này đã được sử dụng để cô đặc hạt

virút của HAV và NoV từ nhuyễn thể hai mảnh vỏ và các nguồn thực phẩm giàu carbohydrate và lipid Khi so sánh với phương pháp kết tủa PEG, phương pháp siêu ly tâm cho kết quả hiệu suất thu hồi thấp hơn với 0,1% ở NoV và 2,5% ở HAV khi tách chiết virút từ dâu tây và quả mâm xôi [45] Trong quá trình ly tâm, hạt virút sẽ được kết tủa bởi lực ly tâm lên tới 120000 g Phương pháp có một số nhược điểm như thiết

bị đắt tiền, vấn đề loại bỏ các thành phần của mẫu khỏi dịch rửa giải và kết tủa thường

rất khó để hòa tan [1]

Phương pháp siêu lọc: đây là phương pháp cô đặc hạt virút dựa trên khối lượng

phân tử Màng lọc được trang bị lỗ màng cho phép dịch lỏng và những phân tử nhỏ (50 – 100 kDa) đi qua còn virút được giữ lại trên màng lọc [32] Tương tự như phương pháp siêu ly tâm, dịch rửa giải virút phải cần thêm bước làm sạch trước để tránh tắc màng Ưu điểm của phương pháp này là những thành phần ức chế phản ứng RT-PCR được phân tách khỏi hạt virút Hiệu suất thu hồi có thể tăng lên bằng cách xử lý màng lọc với bovine serum albumin (BSA) hoặc siêu âm [50] Hiệu suất thu hồi của phương pháp này khi tách chiết NoV từ rau xanh có thể lên tới 9% nhưng vẫn thấp hơn phương pháp kết tủa PEG với 23% Tuy nhiên, trong nghiên cứu khác khi tách chiết NoV từ

dâu tâu và quả mâm xôi phương pháp này lại hiệu quả hơn kết tủa PEG

Cô đặc miễn dịch: trong kỹ thuật này, bi từ được bao bọc bởi kháng nguyên có

khả năng gắn với hạt virút Đối với NoV, kháng nguyên có thể là histo-bloodgroup antigens (HBGA) nhóm A, B và H hoặc porcine gastric mucin - một loại protein trong

dạ dày lợn chịu được pH thấp [53] Đối với HAV, kháng nguyên có thể là kháng thể đơn dòng K3-2F2 [4] Phương pháp này đã thành công khi ứng dụng trên một số loại rau và hoa quả [40] Ưu điểm của phương pháp này là khả năng gắn rất đặc hiệu với virút khiến việc loại bỏ chất ức chế PCR không mấy khó khăn nhưng nhược điểm lại cần thời gian dài để virút gắn được

Phân tách cation: đây là phương pháp dựa trên giả thiết rằng virút mang điện

âm có khả năng gắn với hạt bi từ mang điện dương Phương pháp này sử dụng hệ thống làm giàu mẫu PathatrixTM (Matrix MicroScience, Newmarket, UK) đã ứng dụng để cô đặc HAV từ một số loại thực phẩm như rau xanh, quả, hàu và bánh với hiệu suất thu hồi dao động từ 17,0% đến 81,7% Tuy nhiên, hiệu suất thu hồi NoV từ các loại thực phẩm này lại thấp hơn rất nhiều trong nghiên cứu khác [40] Hiệu quả của phương pháp này cần phải được xem xét thêm nhưng nhược điểm của nó tương tự như phương pháp siêu ly tâm vì đòi hỏi cao về thiết bị

Bảng 1.3 Thuận lợi và khó khăn của các phương pháp được sử dụng để cô đặc hạt virút

Phương pháp cô đặc Ưu điểm Nhược điểm

mẫu thực phẩm không chứa virus khác

1.5.2 Quy trình tách chiết virút từ thực phẩm bằng cách xử lý proteinase K

Phương pháp hiện nay được sử dụng phổ biến là xử lý bằng proteinase K và đun nóng ở 65oC [26] Trong phương pháp này, quá trình xử lý enzyme và nhiệt sẽ phá hủy

vỏ virút để giải phóng axít nucleic [43] Cho đến nay, phương pháp này mới chỉ được

áp dụng trên nhuyễn thể nhưng đã cho kết quả đáng tin cậy trong nhiều vụ dịch NoV

và chính thức trở thành phương pháp tiêu chuẩn của ISO

Hình 1.4 Quy trình phân tích các loại mẫu theo tiêu chuẩn ISO

1.5.3 Quy trình tách chiết trực tiếp virút từ thực phẩm

Phương pháp tách chiết trực tiếp virút từ thực phẩm bao gồm quá trình xử lý với hợp chất chứa thành phần chính là guanidinium isothiocyanate (GITC) và phenol, tiếp theo là quá trình tinh sạch dịch sau khi tách chiết Phương pháp này đã thành công trong khi ứng dụng trong các thực phẩm giàu lipid và protein với ngưỡng phát hiện là 1-102 NoV trong 10–30 g hamburger, gà tây, thịt cừu [7] Trong nhuyễn thể hai mảnh

vỏ, phương pháp này đã thành công với hiệu suất thu hồi đạt 10 phiên bản NoV trong 0,15 g ống tiêu hóa của hàu Hơn nữa phương pháp này cũng được sử dụng để chứng minh sự có mặt của NoV trong hàu liên quan đến các vụ dịch NoV [7]

1.6 Quy trình tinh sạch dịch rửa giải / cô đặc virút hoặc RNA sau khi tách chiết

Đây là quá trình rất quan trọng đối với việc phát hiện virút Sau công đoạn tách chiết virút, dịch chiết không chỉ chứa virút mà còn chứa các chất ức chế vốn tồn tại trong thực phẩm như protein, glycogen, muối, các hợp chất phenol, lipit và pectin

Những chất này sẽ ức chế hoạt động của enzyme trong quá trình khuếch đại axit nucleic (RT-PCR) dẫn đến giảm độ nhạy cũng như đưa đến kết quả âm tính giả

Một số nhóm nghiên cứu đã sử dụng biện pháp pha loãng mẫu thực phẩm tách chiết chứa virút, nhằm pha loãng cả các chất ức chế trước khi tiến hành phản ứng RT-PCR và/hoặc nested PCR để phát hiện virút đối với các loài động vật có vỏ, các loại thịt, quả mâm xôi, dâu tây, rau diếp và bánh mì kẹp [14] Nghiên cứu của Schwab và cộng sự đã chỉ ra hiện tượng âm tính giả khi mẫu thịt được tách chiết bằng phương pháp sử dụng Trizol, ly tâm, sau đó kết tủa bằng isopropanol nhằm phát hiện NoV mà không pha loãng mẫu 100 lần trước khi tiến hành phản ứng RT-PCR, điều này cho thấy

rõ tác động của các chất ức chế lên kết quả phát hiện NoV [21] Tuy nhiên cách pha loãng mẫu nhằm làm giảm tác động của các chất ức chế này cũng không phải là một phương pháp hiệu quả, vì pha loãng mẫu đồng thời sẽ làm giảm nồng độ virút, sẽ dẫn tới kết quả âm tính giả khi nồng độ virút ban đầu đã quá thấp

Trong hầu hết các quy trình, quá trình tinh sạch được thực hiện thông qua việc lọc hoặc xử lý với Freon 113, Vertrel® XF hoặc chloroform:butanol Freon 113 (1,1,2-trichloro-1,2,2-trifluoroethane) có khả năng tách lipid khỏi thành phần phân cực trong

đó có virút [37], mặc dù vậy chất này lại phá hủy tầng Ôzôn và gây ảnh hưởng xấu đến môi trường Để thay thế, Vertrel® XF (1,1,1,2,3,4,4,5,5,5-decafluoropentane) đã được

sử dụng để tinh sạch RNA của NoV từ mẫu phân [8] hay một số thực phẩm giàu protein và chất béo nhưng lại chưa được nghiên cứu khi tách chiết virút từ nhuyễn thể hai mảnh vỏ Một lựa chọn khác thay thế Freon 113 là hỗn hợp chloroform:butanol đã cho kết quả tốt hơn khi tinh sạch HAV từ hàu Phương pháp này cũng đã được sử dụng

để tách chiết trực tiếp RNA từ nhuyễn thể hai mảnh vỏ và phát hiện NoV [52] Cuối cùng, phương pháp tinh sạch bằng cách lọc với lỗ màng cỡ 0,45 μm và 0,20 μm [48]

Bảng 1.4 Tổng kết các phương pháp ly giải virus, cô đặc và tách chiết axit nucleic từ

nhuyễn thể hai mảnh vỏ dựa trên kỹ thuật RT-PCR [53]

Khối lƣợng

(BioMerieux)

Boom

Nucleospin RNA

(M-N)

DT: ống tiêu hóa

1.7 Kiểm soát quá trình tách chiết và tinh sạch RNA virút từ thực phẩm

Đối với việc phát hiện virút bằng kỹ thuật sinh học phân tử, việc sử dụng mẫu kiểm chứng âm và dương trở nên rất cần thiết [44] Thông thường quá trình tách chiết virút được thực hiện thông qua một loạt các phương pháp với thao tác phức tạp trong thời gian dài, vì vậy cần phải có mẫu kiểm chứng quá trình tách chiết để đảm bảo độ tin cậy của kết quả Mẫu kiểm chứng quá trình thường được sử dụng để xem xét hiệu quả của quá trình tách chiết virút của matrix thực phẩm bằng cách thêm vào mẫu một loại virút Điều kiện lý tưởng là virút này giống hoặc tương tự về mặt cấu trúc với virút cần phát hiện, dễ dàng nuôi cấy và không lây nhiễm vào mẫu thực phẩm cần phân tích Murine norovirus 1 (MNV-1), feline calicivirus (FCV), MS2 bacteriophage và mengovirus (vMC0) là những virút được sử dụng phổ biến nhất để kiểm chứng quá trình trong việc phát hiện các virút trong thực phẩm MNV-1 là Norovirus thuộc phân nhóm V lây bệnh ở chuột có đặc điểm di truyền tương tự NoV gây bệnh ở người (Wobus et al., 2006) đã được sử dụng trong phát hiện NoV ở nhuyễn thể hai mảnh vỏ

và thực phẩm ăn nhanh [30] FCV là virút thuộc chi Vesivirus lây bệnh ở mèo cũng được ứng dụng trong phát hiện NoV trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ, nước uống đóng chai và sản phẩm tươi sống [30] Bacteriophage MS2 thuộc chi Levivirus, không gây độc cũng đã được sử dụng trong phát hiện HAV ở quả mềm và nước [6]

Hình 1.6 Mengovirus

Cuối cùng, nổi bật nhất là chủng mengovirus vMCO được biến đổi gen để không gây bệnh trên người mà lại có thể nuôi cấy trên tế bào HeLa – một dòng tế bào phân chia không giới hạn và ổn định thường dùng để nuôi cấy virút Đây là chủng virút được ứng dụng rộng rãi và thành công để làm kiểm chứng quá trình khi phát hiện NoV

và HAV trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ [59] Vì những thành công như vậy, chủng virút này đã được lựa chọn làm chứng quá trình tiêu chuẩn của ISO

1.8 Các phương pháp phát hiện Norovirus và HAV

1.8.1 Phương pháp sử dụng kính hiển vi điện tử

Phương pháp này được sử dụng bởi đặc tính không nuôi cấy được HAV và NoV Đây là phương pháp phát hiện nhanh NoV và HaV Kính hiển vi điện tử là thiết bị nghiên cứu vi cấu trúc vật rắn sử dụng chùm điện tử có năng lượng cao truyền chiếu xuyên qua mẫu vật rắn mỏng và sử dụng các thấu kính từ để tạo độ phóng đại lớn (có thể tới hàng triệu lần), ảnh có thể tạo ra trên mặt huỳnh quang hay được ghi nhận bằng các máy chụp kĩ thuật số [8]

Phương pháp sử dụng kính hiển vi điện tử để phát hiện các hạt virút có kích thước 27-30nm là phương pháp truyền thống để phát hiện Norovirus trong các mẫu bệnh phẩm Tuy nhiên phương pháp này chỉ cho phép phát hiện với lượng virút tối thiểu là 106 hạt virút/g mẫu bệnh phẩm; do đó chỉ phù hợp với việc phát hiện Norovirus trong mẫu bệnh phẩm với lượng lớn Norovirus Ngoài ra, do Norovirus không có hình thái bề mặt điển hình như một số virút khác nên không được ứng dụng phổ biến

1.8.2 Kỹ thuật ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay)

Kỹ thuật ELISA được phát triển để phát hiện trực tiếp các yếu tố quyết định kháng nguyên trên vỏ capsid của Norovirus Kỹ thuật này cho phép xác định Norovirus trong mẫu phân với một quy trình đơn giản, có thể ứng dụng được tại nhiều phòng thí nghiệm Một số bộ sinh phẩm đã được ra đời cho phép phát hiện Norovirus

bằng việc sử dụng các giếng được phủ trước bởi các kháng thể đơn dòng đặc hiệu cho Norovirus nhóm GI và GII, phù hợp để xác định đặc hiệu Norovirus nhóm GI và GII trong vòng 2 giờ Tuy nhiên, độ nhạy của các bộ sinh phẩm này còn thấp (78,9%) khi

so sánh với phương pháp RT-PCR (>90%) Kỹ thuật ELISA thường được sử dụng trong bệnh viện với cỡ mẫu lớn, yêu cầu xác định nhanh; tuy nhiên kết quả âm tính cần được khẳng định lại bằng kỹ thuật RT-PCR Kỹ thuật ELISA cho phép xác định nhanh với giá thành rẻ nhưng độ nhạy chưa cao nên không thể ứng dụng để phát hiện Norovirus trong các mẫu thực phẩm với lượng nhỏ virút

1.8.3 Kỹ thuật RT-PCR (Reverse transcriptase-polymerase chain reaction)

Kỹ thuật RT-PCR là kỹ thuật phân tích dựa trên sự khuếch đại axit nucleic, kĩ thuật này có thể khắc phục hạn chế về độ nhạy của các phương pháp miễn dịch Với khả năng khuếch đại chính xác một trình tự gen mục tiêu lên hàng tỉ lần, các kỹ thuật khuếch đại axit nucleic về lý thuyết có độ nhạy có thể đạt đến ngưỡng 1 bản sao/phản ứng Trong số các kỹ thuật khuếch đại axit nucleic để phát hiện Norovirus và HAV, RT-PCR (Reverse Trancription Polymerase Chain Reaction) là kỹ thuật được sử dụng phổ biến hơn cả Đoạn gen mục tiêu thường được sử dụng để phát hiện Norovirus trong các phương pháp RT-PCR là vùng gen mã hóa RNA-dependent RNA polymerase trong vùng đọc mở ORF1 do có tính bảo thủ cao Tuy nhiên, chưa có một tổ hợp mồi nào cho phép khuếch đại được toàn bộ các chủng Norovirus vì tính đa hình trong các trình tự gen mục tiêu Trong một nghiên cứu so sánh hiệu quả của 3 phương pháp phát hiện Norovirus trên một tập hợp gồm 244 mẫu bệnh phẩm, Rabenau và các cộng sự (2003)

đã chỉ ra phương pháp RT-PCR có độ nhạy cao nhất (94,1%), sau đó đến phương pháp

sử dụng kính hiển vi điện tử (58,3%) và ELISA (31,3%) Gần đây, các phương pháp dựa trên kỹ thuật REAL-TIME TaqMan RT-PCR đã cho phép cải thiện độ nhạy, độ đặc hiệu, độ lặp lại, giảm thời gian phân tích và hạn chế hiện tượng nhiễm tạp, trở

thành phương pháp tiêu chuẩn để phát hiện, định lượng Norovirus trong các mẫu phân tích

1.8.4 Kỹ thuật RT-LAMP (Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification) RT-LAMP là kỹ thuật khuếch đại đẳng nhiệt được sử dụng phổ biến nhất trong số các kỹ thuật khuếch đại đẳng nhiệt axit nucleic hiện có; với kỹ thuật này, việc phát hiện nhanh các vi sinh vật gây bệnh đã được đơn giản hóa thêm một bước Ra đời vào năm

2000, kỹ thuật RT-LAMP sử dụng đặc tính chuyển vị mạch của enzyme Bst DNA polymerase và 4 cặp mồi nhắm đến 6 vùng khác nhau trên gen mục tiêu [24] Nhờ việc tạo ra các cấu trúc thòng lọng đơn nhánh (loop structures), quá trình khuếch đại có thể diễn ra tại một nhiệt độ mà không cần thông qua giai đoạn biến tính như ở kỹ thuật PCR Khi được tối ưu hóa, khả năng khuếch đại DNA của LAMP là rất cao, đến hàng chục tỉ lần trong thời gian 1 giờ Ngoài ra, khả năng phát hiện trực tiếp sản phẩm của phản ứng LAMP không cần điện di là một trong các ưu điểm nổi trội của phương pháp này, giúp đơn giản hóa và rút ngắn thời gian phân tích

1.9 Phương pháp phát hiện và định lượng HAV và NoV trong nhuyễn thể hai

mảnh vỏ hiện nay ISO/TS 15216-1:2013 và ISO/TS 15216-2:2013

1.9.1 Nguyên tắc của phương pháp ISO

Hiện nay, phương pháp phát hiện và định lượng NoV và HAV trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ đã được công bố (ISO/TS 15216-1:2013 và ISO/TS 15216-2:2013) Trong những quy trình này, virút được giải phóng ra khỏi ống tiêu hóa của nhuyễn thể hai mảnh vỏ (DT) bằng việc phân cắt bởi proteinase K, RNA virút được tách chiết bằng việc sử dụng hỗn hợp hóa chất và được hấp thu vào hạt silica, sau đó trình tự mục tiêu

sẽ được phát hiện hoặc định lượng bằng kỹ thuật real-time RT-PCR sử dụng mẫu dò Taqman Hiệu suất của toàn bộ quá trình tách chiết (giải phóng virút và chiết RNA) được đánh giá dựa trên việc nhiễm chủ động mẫu kiểm soát quá trình (một loại virút có

thể nuôi cấy được với những đặc điểm tương tự với các virút cần phát hiện), ngoài ra

về tiêu chuẩn ISO, hiệu suất thu hồi đạt từ 1% trở lên được chấp nhận

1.9.2 Các nghiên cứu trên thế giới sử dụng phương pháp ISO

Trong nghiên cứu của Elisabetta Suffredini và cộng sự (2012), các tác giả đã khảo sát mức độ nhiễm tạp Norovirus trong 70 mẫu nhuyễn thể hàu, ngao và vẹm thu thập tại 2 địa điểm tại khu vực sông Po ở Ý Các mẫu nhuyễn thể được mổ lấy phần ống tiêu hóa rồi băm nhỏ lấy 1,5 g / mẫu Sau khi xử lý proteinase K ở 37oC trong 60 phút và bất hoạt enzyme ở 60oC trong 15 phút, mẫu được ly tâm ở 3000 x g trong 5 phút để thu dịch nổi Tinh sạch axit nucleic bằng hệ thống BioMerieux (Marcy l’Etoile, Pháp) theo quy trình như sau: 500 µl dịch nổi sau khi bổ sung đệm ly giải, sau đó được

bổ sung bi từ silica, sau quá trình rửa, axit nucleic được hòa tan trong 100 µl đệm rửa giải và bảo quản ở -80oC trước khi được phân tích bằng RT-qPCR Kết quả cho thấy không có sự khác biệt đáng kể nào giữa 2 khu vực lấy mẫu và 3 loại nhuyễn thể hai mảnh vỏ Về tỉ lệ nhiễm tạp, có tới 51,4% số mẫu nhiễm Norovirus, trong đó 2,9% chỉ nhiễm NoV GI, 14,3% chỉ nhiễm NoV GII trong khi phần lớn (34,3%) nhiễm cả NoV

GI và GII Hiệu suất thu hồi Mengovirus của các mẫu dao động từ 0,46 – 1,15%

Trong nghiên cứu của Katrine Uhrbrand và cộng sự (2010), các tác giả đã sử dụng 5 phương pháp tách chiết và tinh sạch RNA virút từ hàu và vẹm dựa trên việc xử

lý với proteinase K Mẫu hàu và vẹm sau khi được thu thập từ chợ ở Đan Mạch từ 2003-2004 sẽ được mổ lấy phần ống tiêu hóa Sau quá trình xử lý, mẫu nhuyễn thể được cất vào -20oC cho tới khi sử dụng Trước khi tiến hành nhiễm chủ động, mẫu nhuyễn thể được kiểm tra âm tính với Norovirus theo quy trình mô tả bởi Le Guyader,

2000 và kỹ thuật RT-seminested PCR với các cặp mồi đặc hiệu theo Nishida, 2003 Sau đó 1,5 g mẫu được nhiễm chủ động Norovirus GII (từ 10-1 đến 104 phiên bản thể gen) và FCV (100 đến 106 phiên bản thể gen) cùng mẫu không nhiễm làm kiểm chứng

âm của quá trình Kết quả cho thấy phương pháp dựa trên proteinase K và sử dụng hệ

mẫu hàu và vẹm lần lượt là 62 và 12 phiên bản thể gen / 1,5 g nhuyễn thể Hiệu suất thu hồi Mengovirus của phương pháp đạt 1,8% và 1,2% lần lượt với mẫu hàu và mẫu vẹm

Trong nghiên cứu của J.S Krog và cộng sự (2014), 29 mẫu vẹm thu thập từ 19 địa điểm khác nhau của Đan Mạch trong năm 2008 và 2009 đã được kiểm tra về HEV

(Hepatitis E virus, RoV, Salmonella và PCV (porcine circovirus) Các mẫu vẹm được

mổ lấy phần ống tiêu hóa, sau quá trình xử lý, 2 g mẫu được tách chiết lấy axit nucleic theo phương pháp phát triển dựa trên tiêu chuẩn ISO/TS 15216 (Anonymous, 2013):

xử lý proteinase K và sử dụng hệ thống BioMerieux Kết quả cho thấy, tất cả các mẫu

đều âm tính với HEV, RV và Salmonella, 12 mẫu (41%) mẫu dương tính với PCV với

mức độ nhiễm tạp là 1,02 – 92,3 x 102 phiên bản thể gen / g DT (ống tiêu hóa) của nhuyễn thể Hiệu suất thu hồi Mengovirus của phương pháp đạt 1,16% ± 1.78 và 1,58% ± 1.96 lần lượt với mẫu không pha loãng và pha loãng 10 lần cho thấy còn tồn tại chất ức chế trong mẫu RNA sau khi tách chiết và tinh sạch theo phương pháp này

Trong nghiên cứu của M.F Varela và cộng sự (2015), các mẫu nhuyễn thể bao gồm vẹm tự nhiên và nuôi trồng, ngao và sò được thu thập tại vùng Tây Bắc của Tây

Ban Nha Tổng cộng 168 mẫu được phát hiện và định lượng Sapovirus theo phương

pháp tiêu chuẩn ISO/TS 15216-1:2013 Kết quả cho thấy 30/168 mẫu (17,9%) dương

tính với Sapovirus, trong đó cao nhất là mẫu sò (28,1%), sau đó là ngao (22,6%), cuối

cùng là vẹm tự nhiên (14,3%) và vẹm nuôi trồng (12,9%) Các mẫu thu thập ở vùng cửa sông phía nam có tỉ lệ dương tính cao hơn so với phía bắc (21,8% so với 14,4%) Mức độ nhiễm tạp của mẫu dương tính dao động từ 1,9 x 103 đến 1,4 x 105 phiên bản thể gen / g DT Hiệu suất thu hồi Mengovirus của phương pháp đạt >5% ở tất cả các mẫu

Trong nghiên cứu của J A Lowther và cộng sự (2011) này, các mẫu hàu được thu thập từ các vùng buôn bán tại các đảo ở Anh trong thời gian từ 2007 - 2010 Tổng

cộng 873 mẫu hàu được kiểm tra cùng với 12 mẫu hàu liên quan đến các vụ dịch Norovirus đều được định lượng Norovirus theo phương pháp tiêu chuẩn ISO/TS 15216-1:2013 Kết quả cho thấy trong tổng số 873 mẫu hàu không liên quan đến các vụ dịch có 625 mẫu (71,6%) dương tính với Norovirus với 177 mẫu (20,3%) chỉ dương tính với NoV GI, 92 (10,5%) chỉ dương tính với NoV GII và 356 (40,8%) dương tính với cả NoV GI và GII Tất 12 mẫu hàu liên quan đến các vụ dịch đều dương tính với NoV với mức nhiễm tạp trung bình là 2148 phiên bản thể gen / g DT cao hơn so với mức nhiễm tạp trung bình của các mẫu dương tính không liên quan đến các vụ dịch là

682 phiên bản thể gen / g DT Hiệu suất thu hồi Mengovirus của phương pháp đạt trung bình là 13,2%

Từ các nghiên cứu trên, có thể thấy hiệu suất thu hồi của phương pháp ISO dao động từ 0,2% đến 1,2% trong vẹm, 0,1% đến 19,4% trong ngao và 0,6% đến 13,2% trong hàu Với hiệu suất thu hồi thấp như vậy, một số phương pháp khác dựa trên việc tách chiết RNA bằng Trizol, đã được phát triển để chiết RNA virút từ nhuyễn thể hai mảnh vỏ Tuy nhiên độ nhạy của những quy trình này đều không đạt, có lẽ bởi sự xuất hiện của những chất ức chế phản ứng PCR có mặt trong mẫu RNA được tách chiết Trong luận văn này, năm quy trình tách chiết đã được thực hiện một cách hệ thống, dựa trên việc tách chiết trực tiếp từ Trizol, với mục đích phát triển một phương pháp mới

để tách chiết RNA từ nhuyễn thể hai mảnh vỏ đạt hiệu quả cao hơn

CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Chủng virút và mẫu chuẩn RNA

- Các mẫu virút chuẩn: Mengovirus, Hepatitis A virus, Norovirus GI và GII được cung cấp bởi TS Elisabetta Suffredini (Istituto Superiore di Sanità, Rome, Cộng hòa Ý)

- Các mẫu plasmid chuẩn Hepatitis A virus, Norovirus GI và GII được cung cấp bởi TS Elisabetta Suffredini (Istituto Superiore di Sanità, Rome, Cộng hòa Ý)

2.1.2 Mẫu nhuyễn thể hai mảnh vỏ

- Các mẫu nhuyễn thể hai mảnh vỏ được thu thập tại các chợ và siêu thị ở Việt Nam và Ý

- Các mẫu nhuyễn thể hai mảnh vỏ không nhiễm HAV, NoV GI, NoV GII (được kiểm tra trước bằng phương pháp ISO)

- Các mẫu nhuyễn thể hai mảnh vỏ trong đề tài Nghị Định Thư giữa Việt Nam và

- Trizol Reagent (Invitrogen);

- PureLink® RNA Mini Kit (Thermo Fisher Scientific);

- CTAB - Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide (Sigma);

- LiCl - Lithium chloride (Sigma);

- H2O không chứa Rnase (Invitrogen);

- Bi từ silica (Merck)

- Ultrasens quantitative RT-PCR kit (Life Technologies)

2.1.5 Thiết bị

- Máy vortex (Labnet)

- Máy ly tâm Sorvall Legend X1R (Thermo Fisher Scientific)

- Bể ổn nhiệt (Eppendorf)

- Sonic Vibra-Cell VCX130

- Hệ thống Real-time PCR Eppendorf Realplex4

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Thiết kế nghiên cứu

Các mẫu nhuyễn thể hai mảnh vỏ được trộn vào thành lượng lớn Mengovirus được

sử dụng làm virút đại diện và được bổ sung vào các ống với liều lượng như nhau, sau

đó các mẫu được tách chiết RNA ngay Các mẫu nhuyễn thể được tách chiết 3 lần, RNA sau khi tinh sạch được thực hiện lặp lại 2 lần RT-qPCR để xác định hiệu suất thu hồi của Mengovirus

Hình 2.1 Thiết kế nghiên cứu xây dựng phương pháp mới dựa trên Trizol và màng silica

Phương pháp xử lý mẫu nhuyễn thể hai mảnh vỏ: Các mẫu nhuyễn thể hai

mảnh vỏ sống sau khi thu thập được rửa sạch dưới vòi nước Tiếp đó tách vỏ và mổ lấy phần ống tiêu hóa, băm nhuyễn tuyến tiêu hóa và cân 1 g phân phối vào ống eppendorf

2 ml Chuẩn bị 2 ống eppendorf cho mỗi mẫu Mẫu sau khi xử lý được bảo quản ở 20°C đến khi phân tích

Đồng hóa mẫu bằng Trizol: Một gam mẫu nhuyễn thể hai mảnh vỏ được bổ

sung 10 µl Mengovirus, sau đó được thêm 4 ml Trizol và vortex trong 10 giây, ly tâm ở

1000 g trong 20 giây, sau đó hỗn hợp được siêu âm với cường độ 100% trong 30 giây bằng thiết bị Sonic Vibra-Cell VCX130 Dịch sau siêu âm được ủ trong 5 phút ở nhiệt

độ phòng trước khi cho thêm 1 ml Chloroform Hỗn hợp được ủ trong 3 phút ở nhiệt độ phòng rồi ly tâm 8000 g, 20 phút, 4oC Sau đó 2,8 ml dịch trong được chuyển qua một ống đựng mới

Phương pháp A: 0,7 ml dịch nổi thu được phía trên được kết tủa bằng cách thêm

0,7 ml Isopropanol rồi ly tâm 12000 g trong 30 phút Sau quá trình rửa và làm bay hơi hết EtOH, RNA được hòa tan trong 100 µl nước

Phương pháp B: Dịch trong chứa RNA virút sau khi được tách chiết bằng Trizol

tiếp tục được tách chiết và tinh sạch bằng Purelink RNA Mini Kit (Thermo Fisher Scientific) theo hướng dẫn của nhà sản xuất Đầu tiên 2,7 ml dịch trong được bổ sung EtOH, đảo trộn và đưa lên cột để ly tâm cho tới khi hết dịch Sau quá trình rửa bằng Wash Buffer I và Wash Buffer II, cột tinh sạch được ly tâm khô màng Sau cùng RNA được rửa giải trong 600 μL nước

Phương pháp C: 190 µL dịch rửa giải từ phương pháp B được kết tủa bằng cách

bổ sung 45 μL LiCl, đảo trộn và ủ trong -20oC trong 1 giờ Sau đó, ly tâm ở 12000 g

trong 30 phút để kết tủa RNA Dịch nổi được loại bỏ hoàn toàn, kết tủa được rửa bằng EtOH 70% Sau khi làm khô, RNA được hòa tan trong 100 μL nước

Phương pháp D: 400 µl của dịch rửa giải thu được ở phương pháp B được bổ

sung NaCl, CTAB và Chloroform Hỗn hợp sau đó được ly tâm và dịch nổi (200 µl) được kết tủa với Isopropanol theo mô tả ở phương pháp A Kết tủa RNA được hòa tan trong100 μL nước

Phương pháp E: Phương pháp này được thực hiện giống như phương pháp D

nhưng có thêm sự điều chỉnh Sau quá trình phân pha, dịch nổi (200 µl) được kết tủa bằng cách trộn với 50 µl của 10M LiCl Hỗn hợp được đảo trộn và ủ trong -20oC trong

1 giờ Sau đó, ly tâm ở 12000 g trong 30 phút để kết tủa RNA Dịch nổi được loại bỏ hoàn toàn, kết tủa được rửa bằng EtOH 70% Sau khi làm khô, RNA được hòa tan trong 100 μL nước

2.2.2 Phương pháp Trizol

Đây là phương pháp được thiết kế để tách chiết lấy toàn bộ RNA từ các mẫu tế bào, mô động, thực vật hay có nguồn gốc vi sinh vật Trizol là dung dịch đơn pha bao gồm thành phần chính là phenol và guanidine isothiocyanate được sử dụng để tách chiết RNA Trizol duy trì sự nguyên vẹn của RNA bởi khả năng ức chế hiệu quả hoạt tính của Rnase trong khi phá vỡ tế bào và hòa tan các thành phần của tế bào trong suốt quả trình đồng hóa mẫu Sau giai đoạn đồng hóa mẫu, chloroform được bổ sung vào hỗn hợp với mục đích phân chia thành các pha riêng biệt, trong đó DNA và protein nằm ở mặt phân cách giữa 2 lớp dung dịch, RNA nằm ở pha dịch nổi phía trên cùng có thể dễ dàng lấy ra bằng cách hút pipet RNA tiếp tục được kết tủa với Isopropanol., sau

đó được rửa loại bỏ tạp chất và cuối cùng là hòa tan để sử dụng cho các ứng dụng tiếp theo như RT-PCR, phân tích Northern Blot, phiên mã invitro, v.v…

Hình 2.2 Sự phân pha và kết tủa RNA trong phương pháp Trizol

Trong luận văn này, phương pháp được thực hiện như sau: Mẫu nhuyễn thể 1 g được bổ sung 4 ml Trizol, sau khi đảo trộn đều được siêu âm liên tục với cường độ 100% trong 30s Sau khi ủ tại nhiệt độ phòng 5 phút, hỗn hợp được bổ sung 1 ml Chloroform và đảo trộn rồi ủ tiếp trong 3 phút Hỗn hợp sau đó được ly tâm ở 8000g,

15 phút , 4oC để phân pha, dịch nổi chứa RNA được hút lấy 2,7 ml và được bổ sung 2,7

ml Isopropanol rồi đảo trộn Sau khi ly tâm ở 12000g, 30 phút, dịch được loại bỏ Kết tủa được thêm 2 ml EtOH 70%, vortex và ly tâm ở 12000g, 5 phút, dịch được loại bỏ Kết tủa được hòa tan trong 100 µl H2O

2.2.3 Phương pháp tinh sạch bằng cột silica Purelink RNA mini Kit

Phương pháp tinh sạch RNA sử dụng cột silica nói chung hay PureLink RNA

Mini Kit nói riêng là phương pháp đơn giản, tin cậy và nhanh chóng để thu hồi được RNA có chất lượng cao từ nguồn mẫu đa dạng, bao gồm tế bào, mô từ động, thực vật, máu, vi sinh vật và mẫu lỏng RNA tinh sạch từ phương pháp này thường đạt chất lượng cao phù hợp với các nghiên cứu về sinh học phân tử Khi kết hợp với Trizol để tách chiết RNA, phương pháp này rất phù hợp bởi RNA sau khi được ly giải bằng Trizol có chứa nhiều guanidine isothiocyanate phù hợp ngay với việc RNA bám lên màng silica Sau quá trình đồng hóa mẫu bằng Trizol, EtOH được thêm vào dịch trong