Bước đầu nghiên cứu một số chủng vi khuẩn pseudomonas để xử lý nước thải công nghiệp chế biến sữa

Phương pháp này có một loạt ưu điểm như khả năng tách các chất bẩn hữu cơ cao, thời gian lưu nước ngắn, vi sinh vật dễ thích nghi với nước thải, quản lý vận hành đơn giản, ít tốn năng lư

m thu trang tr-ờng đại học bách khoa hà nội

DANH MỤC VIẾT TẮT

TT Chữ viết tắt Chữ viết đầy đủ

1 COD Nhu cầu oxi hóa học (Chemical oxygen Demand)

2 BOD Nhu cầu oxi sinh hoá (Biochemical oxygen Demand)

3 SS Chất rắn lơ lửng (Suspended solid)

4 DO Oxi hòa tan (Dissolved oxygen)

6 TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam

DANH MỤC CÁC HÌNH

1.1.1 Các phương pháp cố định tế bào

3.1.1 Sản phẩm PCR gen 16S rDNA của các chủng

3.2.1 Ảnh hưởng của hàm lượng pepton đến sự tổng hợp proteaza

3.2.2: Ảnh hưởng của hàm lượng MgCl2 đến sự tổng hợp proteaza

3.2.3: Ảnh hưởng của hàm lượng K2SO4 đến sự tổng hợp proteaza

3.2.4: Ảnh hưởng của hàm lượng NaCl đến sự tổng hợp proteaza

3.2.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình tổng hợp proteaza

3.2.6 Động học quá trình sinh tổng hợp enzym proteaza

3.3.1: Hình ảnh miếng mút xốp và cấu trúc bên trong của nó

3.4.1: Sơ đồ mô hình xử lý nước thải bằng lọc sinh học trong phòng thí

nghiệm

3.4.2 Sự thay đổi hiệu suất xử lý theo thời gian

DANH MỤC CÁC BẢNG

1.1.1: So sánh giữa 2 phương pháp lọc sinh học

3.1.1 Danh sách các chủng giống được khảo sát về khả năng sinh tổng

hợp enzim proteaza và amylaza

3.1.2 Khả năng sinh tổng hợp enzim proteaza của các chủng giống

3.1.3 Đặc điểm hình thái của các chủng nghiên cứu

3.1.4 Phân loại các chủng dựa trên trình tự phân đoạn của 16S rDNA

3.1.5 Hoạt lực enzym proteaza của các chủng Pseudomonas

3.2.1 Ảnh hưởng của nguồn Nitơ đến hoạt lực của enzim

3.2.2 Ảnh hưởng của các loại Nitơ thay thế

3.2.3: Ảnh hưởng của pH đến quá trình tổng hợp proteaza

3.3.1 Ảnh hưởng của chất mang đến hiệu suất quá trình xử lý

3.4.1 Kết quả xử lý nước thải chế biến sữa bằng phương pháp lọc sinh

học

MỞ ĐẦU

Ngành công nghiệp thực phẩm Việt Nam trong những năm gần đây đã có bước phát triển nhảy vọt cả về số lượng và sự đa dạng sản phẩm Đi kèm theo sự phát triển đó là các tác động tích cực đối với nền kinh tế quốc dân và các tác động tiêu cực đối với môi trường Với đặc thù của các ngành chế biến thực phẩm, một lượng nước thải vô cùng lớn không được xử lý hoặc xử lý chưa đạt tiêu chuẩn thải ra môi trường Việc nghiên cứu xử lý nước thải mới được chú ý rất nhiều đơn vị nghiên cứu tham gia vào lĩnh vực này, đưa ra các công nghệ xử

lý nước thải khác nhau trên cơ sở xử lý hiếu khí và kị khí, liên tục hoặc gián đoạn, đã triển khai ở rất nhiều các nhà máy, đơn vị sản xuất khác nhau Mỗi công nghệ đều có những điểm mạnh, điểm yếu khác nhau; tuy nhiên, nói chung tất cả các công nghệ này đều chưa hoàn chỉnh, đều trong tình trạng vừa nghiên cứu vừa triển khai ứng dụng Một phương pháp mới trong xử lý nước thải có mức độ ô nhiễm cao hiện nay là phương pháp lọc sinh học Phương pháp này có một loạt

ưu điểm như khả năng tách các chất bẩn hữu cơ cao, thời gian lưu nước ngắn, vi sinh vật dễ thích nghi với nước thải, quản lý vận hành đơn giản, ít tốn năng lượng và dễ hợp khối với bể tự hoại và các công trình xử lý nước thải khác

Trong công nghệ lọc sinh học vai trò của các chủng vi khuẩn Pseudomonas đóng

vai trò cực kì quan trọng, các chủng này quyết định khả năng phân giải các hợp chất hữu cơ - tác nhân chính gây ô nhiễm nước thải ngành công nghiệp thực phẩm Các chủng có hoạt lực tốt sẽ nâng cao hiệu suất xử lý nước thải của hệ thống, đồng thời làm giảm thời gian lưu thủy lực, tiết kiệm chi phí xử lý… Một trong những yếu tố quan trọng khác của công nghệ xử lý nước thải bằng công nghệ lọc sinh học là công nghệ cố định tế bào (immobilization) Các chất mang

để cố định tế bào phải đảm bảo có khả năng bám dính tốt cho các chủng vi sinh vật cần cố định, có độ rỗng cao, không gây độc cho vi sinh vật, đặc biệt không gây ô nhiễm trở lại nguồn nước…

Mỗi chủng vi sinh vật thường có một vài loại chất mang phù hợp, tuy nhiên, điều kiện cố định tế bào lại hoàn toàn khác nhau tùy mục đích sử dụng Vấn đề ô nhiễm nước là một trong những thực trạng đáng ngại nhất của sự hủy hoại môi trường tự nhiên Công nghiệp là ngành làm ô nhiễm nước chủ yếu, mỗi ngành có một loại nước thải khác nhau Các nhà máy chế biến thực phẩm, chế biến sữa, sản xuất đồ hộp, thuộc da, lò mổ đều có nước thải chứa rất nhiều protein Khi được thải ra dòng chảy, protein nhanh chóng bị phân hủy cho ra acit amin, acid béo, acid thơm, H2S, nhiều chất chứa S và P có tính độc và mùi khó chịu

CHƯƠNG I TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước:

1.1.1 Tình hình ô nhiễm tại Việt Nam

Nước ta có nền công nghiệp chưa phát triển mạnh, các khu công nghiệp và các đô thị chưa nhiều lắm nhưng tình trạng ô nhiễm nước đã xảy ra ở nhiều nơi với các mức độ nghiêm trọng khác nhau Các cơ sở sản xuất công nghiệp là nguyên nhân chính gây ô nhiễm nước, mỗi cơ sở phát thải ra các loại nước thải

có đặc trưng ô nhiễm khác nhau Ngành công nghiệp chế biến thực phẩm chủ yếu là ô nhiễm hữu cơ, ngành chế tạo máy và sơn mạ chủ yếu là ô nhiễm kim loại nặng, ngành công nghiệp phân bón chủ yếu là ô nhiễm hóa chất Nước dùng trong sinh hoạt của dân cư ngày càng tăng nhanh do dân số và các đô thị Nước cống từ nước thải sinh hoạt cộng với nước thải của các cơ sở tiểu thủ công nghiệp trong khu dân cư là đặc trưng ô nhiễm của các đô thị ở nước ta Với lượng chất thải khá lớn từ các nhà máy, xí nghiệp, nước thải công nghiệp chiếm một lượng lớn trong tổng lượng nước thải hàng ngày hơn nữa mức độ gây ô nhiễm của nước thải công nghiệp cao hơn rất nhiều so với nước thải sinh hoạt do chứa nhiều hóa chất độc hại và khó phân hủy [3] Ðiều đáng nói là các loại nước thải đều được trực tiếp thải ra môi trường, chưa qua xử lý gì cả, vì nước ta chưa

có hệ thống xử lý nước thải nào đúng nghĩa như tên gọi

1.1.2 Tổng quan về Pseudomonas sử dụng trong xử lý nước thải

Phần lớn vi sinh vật xâm nhập vào nước từ đất, phân, nước tiểu, các nguồn thải và từ bụi trong không khí rơi xuống Số lượng và chủng loại vi sinh vật trong nước phụ thuộc nhiều yếu tố, nhất là những chất hữu cơ hoà tan trong

nước, các chất độc, tia tử ngoại, pH môi trường… Trong nước có rất nhiều loại

vi sinh vật: vi khuẩn, nấm men, nấm mốc, xạ khuẩn, virut,… nhưng chủ yếu là vi khuẩn Vi khuẩn đóng vai trò quan trọng trong quá trình phân huỷ chất hữu cơ, làm sạch nước thải, trong vòng tuần hoàn vật chất [2]

Nước thải mới thường ít vi sinh vật Sau một thời gian sinh trưởng, chúng tạo thành quần thể vi sinh vật có ở trong nước, đồng thời kéo theo sự phát triển của các giới thủy sinh Quần thể vi sinh vật ở các loại nước thải không giống nhau, mỗi loại nước thải có hệ vi sinh vật thích ứng Vi sinh vật trong nước thải đều là vi sinh vật hoại sinh và dị dưỡng, chúng không thể tổng hợp được các chất hữu cơ làm vật liệu xây dựng tế bào mới cho chúng, trong môi trường sống của chúng cần phải có mặt các chất hữu cơ để chúng phân hủy, chuyển hoá thành vật liệu xây dựng tế bào, đồng thời chúng cũng phân hủy các hợp chất nhiễm bẩn nước đến sản phẩm cuối cùng là CO2 và nước hoặc tạo thành các loại khác (CH4,

H2S…) Trong nước thải sinh hoạt, nước thải của các xí nghiệp chế biến nông sản, thực phẩm, thuỷ sản, các trại chăn nuôi… rất giàu các chất hữu cơ, gồm 3 nhóm chính: protein 4050%, hydratcacbon 50% và chất béo 10% Protein là polyme của các axitamin, là nguồn dinh dưỡng chính cho vi sinh vật Hidratcacbon là các chất đường bột và xenluloza Tinh bột và đường rất dễ bị phân huỷ bởi vi sinh vật, còn xenluloza bị phân huỷ muộn hơn và tốc độ phân huỷ cũng chậm hơn nhiều Chất béo ít tan và vi sinh vật phân giải với tốc độ rất chậm Các vi sinh vật muốn phân huỷ được các chất hữu cơ chúng phải có khả năng sinh tổng hợp các enzim tương ứng Mỗi loại nước thải có một khu hệ VSV đặc trưng Nước thải sinh hoạt chứa phân, nước rửa, tắm giặt, thức ăn thừa chứa rất nhiều vi khuẩn, trung bỡnh từ vài triệu đến vài chục triệu cá thể trong 1ml Các vi sinh vật hoại sinh có trong nước thải hầu hết là các vi khuẩn hiếu

khí, kị khí hoặc kị khí tuỳ tiện Ta thấy các giống vi khuẩn sau: Pseudomonas,

Bacillus, Alcaligenes, Lactobacillus, Flavobacterium, Cytophaga, Clostridium

Trong số này giống Pseudomonas thường gặp ở hầu hết các loại nước thải

Pseudomonas hầu như có thể đồng hoá được mọi chất hữu cơ, kể cả các hợp chất

hữu cơ tổng hợp và sống khá lâu trong môi trường nước thải.[2]

Pseudomonas là những trực khuẩn gram (-), chuyển động do có tiên mao

mọc ở một đầu Trực khuẩn có thể là hình que thẳng hoặc hơi cong, không tạo thành bào tử và phát triển ở điều kiện hiếu khí Nhiều loại của giống này ưa lạnh, nhiệt độ tối thiểu là -2oC đến 5 oC, tối thích là 20-25 oC Tất cả Pseudomonas đều

có hoạt tính amilaza và proteaza, đồng thời lên men được nhiều loại đường và

tạo màng nhầy pH môi trường dưới 5,5 sẽ kìm hãm vi khuẩn Pseudomonas phát

triển và kìm hãm sinh tổng hợp proteaza Nồng độ muối trong nước tới 5-6% thì sinh trưởng của vi khuẩn này bị ngừng trệ [2]

Theo nhiều nghiên cứu trên thế giới, người ta thấy rằng chủng vi khuẩn

Pseudomonas là chủng vi khuẩn rất có ích trong việc xử lý nước thải Nó có thể

làm giảm chỉ số COD của nước thải bằng cách phân hủy các hợp chất hữu cơ, benzen, naphtalen, pyridin [50]

Tại Thailand (Thái Lan) người ta đã nghiên cứu sử dụng chủng

Pseudomonas trong việc xử lý nước thải ô nhiễm dầu mỡ cao đặc biệt là nước

thải nhà máy dầu cọ và nhà máy bánh kẹo Tác giả Orapin Bhumibhamon đã báo

cáo kết quả ứng dụng Pseudomonas trong hệ thống xử lý làm COD giảm

90-96%, dầu mỡ giảm 87,7-80,6% đối với nước thải nhà máy dầu cọ và giảm 64% đối với nhà máy sản xuất bánh kẹo)[27]

70-Tại Chi lê người ta đã nghiên cứu sử dụng chủng Pseudomonas để hấp thụ

kim loại trong nước thải [47]

Việc nghiên cứu và ứng dụng hệ vi sinh bám dính để xử lý triệt để nước thải sinh hoạt và công nghiệp mở ra các khả năng mới trong việc giảm thiểu các chỉ tiêu như BOD, SS, N, P xuống dưới nồng độ cho phép Phương pháp này

có ưu điểm là đơn giản và tiết kiệm trong vận hành Lượng bùn dư của hệ vi sinh bám dính ít hơn nhiều so với hệ bùn hoạt tính lơ lửng, do đó chi phí để xử lý bùn cũng ít hơn Các công trình xử lý dùng hệ vi sinh bám dính cũng gọn nhẹ và dễ hợp khối, mở ra triển vọng ứng dụng rộng rãi, đặc biệt là đối với các công trình

xử lý vừa và nhỏ trong dân dụng và công nghiệp

Sử dụng hệ vi sinh bám dính còn có thể loại bỏ được kim loại nặng ra khỏi nước thải Công nghệ loại bỏ Hg2+ khỏi nước thải xí nghiệp hoá chất bằng vi sinh vật chịu được thuỷ ngân được phát minh và ứng dụng tại Trung tâm công nghệ sinh học GBF, Brauschweig, Đức [49] Các chủng vi sinh vật dòng

Pseudomonas được cấy lên các vật liệu bám dính của bể phản ứng sinh học

bioreactor Hiệu quả xử lý thuỷ ngân đạt 97% với thời gian xử lý 10h

1.1.3 Hệ thống lọc sinh học

1.1.3.1 Lọc sinh học

Trong khi việc sử dụng các hệ thống lọc sinh học chưa được phổ biến ở

Mỹ thì hàng trăm hệ thống lọc sinh học đã được ứng dụng thành công và có hiệu quả ở Châu Âu (Hà Lan, Tân Tây Lan, Đức) và Nhật Bản [2] Hệ thống lọc sinh học trước đây thường được thiết kế để xử lý mùi của các hệ thống xử lý nước thải, các nhà máy tái chế, quá trình ủ phân compost Sau đó, nó được ứng dụng phổ biến trong việc xử lý các hợp chất hữu cơ dễ bay hơi và các hợp chất hữu cơ khác Ở Việt Nam lọc sinh học là một biện pháp xử lý ô nhiễm tương đối mới

Nguyên tắt chính của hệ thống xử lý là tạo điều kiện cho vi sinh vật tiếp xúc với các chất ô nhiễm hữu cơ có trong nước thải Trong hệ thống này, các vi

sinh vật (chủ yếu là vi khuẩn) sẽ tạo thành một màng sinh học (biofilm), đây là một màng mỏng và ẩm bao quanh các nguyên liệu lọc Các vi khuẩn hiếu khí được tập trung ở phần lớp ngoài của màng lọc sinh học Ở đây chúng phát triển

và gắn kết với giá mang là các vật liệu lọc ( được gọi là sinh trưởng gắn kết hay sinh trưởng bám dính) [2]

Trong quá trình làm việc, các vật liệu lọc tiếp xúc với nước chảy từ trên xuống, sau đó nước thải đã được làm sạch được thu gom xả vào lắng 2 Chất hữu

cơ nhiễm bẩn trong nước thải bị oxi hóa bởi quần thể vi sinh vật ở màng sinh học Màng này thường dầy khoảng từ 0,1 – 0,4mm Các chất hữu cơ trước hết bị phân hủy bởi vi sinh vật kị khí Khi các chất hữu cơ trong nước thải cạn kiệt, vi sinh vật ở màng sinh học sẽ chuyển sang hô hấp nội bào và khả năng kết dính cũng giảm, dần dần bị vỡ cuốn theo nước lọc Hiện tượng này gọi là hiện tượng tróc màng Sau đó lớp màng mới lại xuất hiện Lọc sinh học đang được dùng hiện nay chia làm hai loại:

+ Lọc sinh học với vật liệu tiếp xúc không ngập nước

+ Lọc sinh học có vật liệu tiếp xúc đặt ngập trong nước

Đặc điểm của 2 loại hệ thống này được trình bày trong bảng 1.1.1[2]:

Bảng 1.1.1: So sánh giữa 2 phương pháp lọc sinh học

Lọc sinh học với vật liệu tiếp

xúc không ngập trong nước

Lọc sinh học với vật liệu tiếp xúc đặt ngập trong nước

- Vật liệu tiếp xúc không ngập

dòng hoặc hạt nhỏ chảy thành lớp

mỏng qua khe hở của vật liệu,

đồng thời tiếp xúc với màng sinh

học ở trên bê mặt vật liệu và được

làm sạch do vi sinh vật của màng

phân hủy hiếu khí và kị khí các

chất hữu cơ có trong nước Các

chất hữu cơ phân hủy hiếu khí

sinh ra CO2 và nước, phân hủy kị

khí sinh ra CH4 và CO2 làm tróc

màng ra khỏi vật mang, bị nước

cuốn theo Trên mặt giá mang là

vật liệu lọc lại hình thành lớp

màng mới Hiện tượng này được

lặp đi lặp lại nhiều lần Kết quả là

BOD của nước thải bị vi sinh vật

sử dụng làm chất dinh dưỡng

lên sẽ tiếp xúc với lớp vật liệu lọc Ở đây sẽ diễn ra qua trình phân hủy các chất hữu cơ có trong nước thải bởi các vi sinh vật của màng lọc Lớp màng sinh học bám quanh các hạt vật liệu lọc ít

bị tróc

- Ưu điểm:

+ Giảm việc trông coi

+ Tiết kiệm năng lượng, không

khí được cấp trong hầu hết thời

gian lọc làm việc bằng lưu thông

tự nhiên từ cửa thông gió đi vào

qua lớp vật liệu

- Ưu điểm:

+ Chiếm ít diện tích vì không cần

bể lắng 2 Đơn giản, dễ dàng cho việc bao, che công trình, khử độc hại (ít mùi và ít ồn), đảm bảo mĩ quan

+ Không cần phải rửa lọc vì quần thể vi sinh vật cố định trên giá đỡ

cho phép chống lại sự thay đổi tải lượng của nước thải

+ Dễ dàng phù hợp với nước thải pha loãng

+ Đưa vào hoạt động rất nhanh, ngay cả sau một thời gian dừng làm việc kéo dài hàng tháng

+ Có cấu trúc modun và dẽ dàng

tự động hóa

- Nhược điểm:

+ Hiệu suất làm sạch nhỏ hơn với

cùng một tải lượng khối

+ Dễ bị tắc nghẽn

+ Rất nhạy cảm với nhiệt độ

+ Không khống chế được quá

trình thông khí, dễ bốc mùi

+ Bùn dư không ổn định

+ Nước sau khi xử lý ở lọc sinh

học thường nhiều chất lơ lửng do

các mảnh vỡ của màng sinh học

cuốn theo, vì vậy cần phải đưa

vào lắng 2 và lưu ở đây thời gian

thích hợp để lắng cặn

- Nhược điểm + Làm tăng tổn thất tải lượng, giảm lượng nước thu hồi

+ Tổn thất khí cấp cho quá trình,

vì phải tăng lưu lượng khí không chỉ đáp ứng cho nhu cầu của vi sinh vật mà còn cho nhu cầu cơ thủy lực

+ Phun khí mạnh tạo nên dòng chuyển động xoáy làm giảm khả năng giữ huyền phù

Ưu và khuyết điểm của hệ thống lọc sinh học

Ưu điểm

 Ưu điểm chính là giá thành thấp, giá vận hành thấp, ít sử dụng hóa chất

 Thiết kế linh động, do đó có thể thích nghi với mọi loại hình công nghiệp

và diện tích của xí nghiệp

 Hệ thống lọc sinh học linh động trong việc xử lý mùi hôi, các hợp chất hữu cơ bay hơi và các chất độc Hiệu suất xử lý thường lớn hơn 90% đối với các khí thải có nồng độ các chất ô nhiễm < 1000 ppm

 Nhiều loại nguyên liệu lọc, vi sinh vật và điều kiện vận hành khác nhau có thể áp dụng để đáp ứng nhu cầu xử lý

Khuyết điểm

 Hệ thống lọc sinh học không thể xử lý được các chất ô nhiễm có khả năng hấp phụ thấp và tốc độ phân hủy sinh học chậm ví dụ như các hợp chất hữu cơ bay hơi có chứa chlor

 Các nguồn ô nhiễm có nồng độ hóa chất cao cần các hệ thống lớn và diện tích lớn để lắp đặt hệ thống lọc sinh học

 Nguồn gây ô nhiễm có mức độ phóng thích chất ô nhiễm biến động cao sẽ gây ảnh hưởng đến hệ vi sinh vật cũng như hiệu suất xử lý của chúng

Thời gian để cho các vi sinh vật thích nghi với môi trường và tạo thành các màng sinh học (biofilm) có thể kéo dài hàng tuần đến hàng tháng, đặc biệt là đối với việc xử lý các chất hữu cơ bay hơi [2]

Ngoài việc sử dụng phương pháp lọc sinh học bằng việc sử dụng công trình hiếu khí nhân tạo dựa trên cơ sở sinh trưởng bám dính của vi sinh vật như trên, người ta còn sử dụng phương pháp lọc kị khí Đây là phương pháp xử lý kị khí nước thải dựa trên cơ sở sinh trưởng dính bám với vi khuẩn kị khí trên các

giá mang Trong phương pháp này lớp vi sinh vật phát triển thành màng mỏng trên vật liệu làm giá mang bằng chất dẻo, có dòng nước đẩy qua.Vật liệu có thể

là chất dẻo ở dạng tấm sắp xếp hay bằng vật liệu rời hoặc hạt như polyspiren Cấu tạo bể phản ứng cấy cố định vi khuẩn trên lớp đỡ hữu cơ Lọc kị khí là một tháp chứa đầy các loại vật kiệu rắn khác nhau, dùng để khử các chất hữu cơ cacbon có trong nước thải Nước thải đi từ dưới lọc hướng lên phía trên được tiếp xúc với vật liệu Trên mặt các loại vật liệu có vi sinh vật kị khí và tùy tiện phát triển dính bám thành màng mỏng Lớp màng này không bị rửa trôi, thời gian lưu lại ở đó có thể tới 100 ngày Do vậy, bể lọc kị khí thích hợp cho việc xử

lý nước thải có độ ô nhiễm thấp ở nhiệt độ không khí ngoài trời Trong bể lọc các chất hữu cơ khi tiếp xúc với màng bám dính trên bề mặt vật liệu sẽ được hấp thu và phân hủy Bùn cặn được giữ lại trong khe rỗng của lớp lọc Sau 2-3 tháng làm việc xả bùn 1 lần, thau rửa lọc [2]

1.1.3.2 Sinh trưởng bám dính

Trong quá trình xử lý sinh học, các vi sinh vật chịu trách nhiệm phân hủy các chất hữu cơ phát triển thành màng (biofilm) dính bám hay gắn kết váo các vật liệu trơ như đá, xỉ, gỗ, sành sứ, chất dẻo

Trong dòng nước thải có những vật rắn làm giá đỡ (giá mang), các sinh vật (chủ yếu là các vi khuẩn) sẽ bám trên bề mặt Trong số các vi sinh vật có những loài sinh ra các polysacarit có tính chât như là các chất dẻo (gọi là polyme sinh học), tạo thành màng (màng sinh học) Màng này cứ dầy dần thêm và thực chất đây là sinh khối vi sinh vật dính bám hay cố định trên các chất mang Màng này có khả năng oxi hóa các chất hữu có có trong nước khi chảy qua hoặc tiếp xúc, ngoài ra màng này còn khả năng hấp thụ các chất bản lơ lửng hoặc trứng giun sán…[2]

Như vậy, màng sinh học là tập hợp các loài vi sinh vật khác nhau, có hoạt tính oxi hóa các chất hữu cơ có trong nước khi tiếp xúc với màng Màng này dầy

từ 1-3mm và hơn nữa Mầu của màng thay đổi theo thành phần theo thành của nước thải từ màu vàng xám đến màu nâu tối Trong quá trình xử lý nước thải chảy qua phin lọc sinh học có thể cuốn theo các hạt của màng vỡ với kích thước 15-30m có màu sáng vàng hoặc nâu

Màng sinh học là lớp màng nhầy như gelatin được hình thành giữa lớp vật liệu lọc khi nước được xử lý qua lớp vật liệu này Màng này được tạo thành từ hàng triệu đến hàng tỉ tế bào vi khuẩn, các vi sinh vật khác và có cả động vật nguyên sinh Khác với quần thể vi sinh vật của bùn hoạt tính, thành phần loài và

số lượng các loài ở màng lọc tương đối đồng nhất Mỗi màng lọc có một quần thể cho riêng mình Sự khác nhau không chỉ là số lượng mà cả chất lượng Khi nước thải chảy qua màng lọc sinh học, do hoạt động sống của quần thể vi sinh vật, sẽ thay đổi thành phần nhiễm bẩn các chất hữu cơ có trong nước Các chất hữu cơ dễ phân giải được vi sinh vật sử dụng trước với vận tốc nhanh, đồng thời

số lượng của quần thể tương ứng này phát triển nhanh Các chất hữu cơ khó phân giải sẽ được sử dụng sau với vận tốc cũng chậm hơn và quần thể vi sinh vật đồng hóa chúng phát triển muộn màng hơn [2]

Màng sinh học được tạo thành chủ yếu là các vi khuẩn hiếu khí và các phin lọc sinh học là các công trình làm sạch nước hiếu khí, nhưng thực ra phải coi đây là hệ tùy tiện Ngoài các vi khuẩn hiếu khí, màng còn có các vi khuẩn tùy tiện và kị khí Ở ngoài cùng lớp màng là lớp hiếu khí, rất dễ thấy loại trực khuẩn Bacillus Lớp trung gian là các vi khuẩn tùy tiện, như Pseudomonas, Alcaligenes, Flavobacterium, Micrococcus và cả Bacillus Lớp sâu bên trong màng là kị khí, thấy có vi khuẩn kị khí khử lưu huỳnh và khử nitrat Desulfovibrio Như vậy, hệ

vi sinh vật trong màng sinh học của phin lọc là các thể tùy tiện [2]Màng sinh học này được dùng trong các phin lọc sinh học hiếu khí hoặc đĩa quay sinh học

Phần dưới cùng của màng là lớp quần thể vi sinh vật với sự có mặt của động vật nguyên sinh và một số sinh vật khác Các loài này ăn vi sinh vật và sử dụng một phần màng sinh học để làm thức ăn tạo thành các lỗ nhỏ của màng trên

bề mặt chất mang Quần thể vi sinh vật của màng sinh học có tác dụng như bùn hoạt tính

Nhìn chung ở vùng trên cùng của phin lọc có sinh khối nhiều nhất và màng lọc cũng là dầy nhất, ở vùng giữa ít hơn và vùng dưới nữa là ít nhất Màng

vi sinh vật sẽ tăng dần lên và dầy thêm, các tế bào bên trong màng ít tiếp xúc với

cơ chất và ít nhận được oxi phải chuyển sang phân hủy kị khí Sản phẩm của biến đổi kị khí là các axit hữu cơ, các alcol… Các chất này tạo ra chưa kịp khuyếch tán ra ngoài đã bị các vi sinh vật khác sử dụng và nước lọc qua phin không ảnh hưởng gì lớn

Với đặc điểm như vậy, màng sinh học có thể oxi hóa được tất cả các chất hữu cơ dễ phân hủy có trong nước thải Màng này dần dần bịt các khe giữa các hạt cát, phin lọc giữ lại các tạp chất, các thành phần sinh học có trong nước làm cho vận tốc nước qua lọc chậm dần và phin làm việc có hiệu quả hơn Nó hấp thụ giữ lại các vi khuẩn cũng như các tạp chất hóa học Nó oxi hóa các chất hữu

cơ có trong nước và nước được dần dần làm sạch Nếu lớp màng quá dày ta có thể nước rửa, sục nước để loại bỏ màng và phin sẽ chảy nhanh hơn, hiệu quả của lọc có giảm, nhưng dần dần lại được hồi phục

Hiệu quả của phin lọc chậm có thể giữ được tới 99% vi khuẩn có trong nước[2]

Người ta có thể sử dụng các phin lọc nhanh Về nguyên lý phin này cũng giống như phin lọc trên nhưng bề mặt nhỏ hơn và làm việc không phụ thuộc vào

sự tạo thành của màng nhầy Quá trình lọc tương đối nhanh với vận tốc khoảng 500000m3/0,4ha.ngày

Nước đưa vào lọc nhanh cần phải qua lắng sơ bộ để bỏ phần lớn các loại hạt tạp bẩn Phin lọc này làm việc vài giờ hoặc vài ngày sẽ được rửa bằng các tia nước phun

Màng sinh học kị khí gồm chủ yếu là các vi khuẩn kị khí và tùy tiện và được áp dụng trong các lọc sinh học kị khí

Các hợp chất nitrogen (N) và phosphorus (P) trong nước thải là nguyên nhân gây ra hiện tượng phú dưỡng Trên thế giới phương pháp phổ biến để loại

bỏ P ra khỏi nước thải vẫn là phương pháp lý hoá kết hợp Việc loại bỏ phosphorus (P) theo phương pháp sinh học bằng hệ bùn hoạt tính đơn lơ lửng (single sludge system) chạy qua các vùng kị khí (anaerobic), thiếu khí (anoxic)

và hiếu khí (aerobic) là phổ biến nhất, đòi hỏi mức đầu tư cao và chi phí vận hành lớn (lưu lượng tuần hoàn tới 300% - 600%) Mặt khác, việc sao chép 100% công nghệ nước ngoài sẽ không có hiệu quả xử lý như mong muốn, do thành phần nước thải các thành phố trên thế giới khác nhau Bên cạnh đó việc xử lý loại bỏ phosphorus (P), giảm nồng độ (P) dưới tiêu chuẩn cho phép bằng phương pháp sinh học sử dụng hệ vi sinh bám dính là không thể được Tuy vậy, việc kết hợp phương pháp sinh học với quá trình xử lý hoá học có thể mang lại hiệu quả mong muốn [2]

Một nghiên cứu tại Đại học Xây dựng Mát-xcơ-va (MGSU), Liên bang Nga cho phép loại bỏ P ra khỏi nước thải sinh hoạt bằng hệ vi sinh bám dính dựa trên nguyên tắc ăn mòn sinh học Vật liệu bám dính có cốt sắt (Fe) được sử dụng

trong bể aeroten Các màng sinh học bám dính lên bề mặt kim loại thực hiện quá trình ăn mòn sinh học liên tục làm nồng độ sắt Fe trong aeroten tăng đột ngột, tạo điều kiện cho quá trình keo tụ hoá lý phosphate được diễn ra nhanh chóng Nồng độ bùn hoạt tính lơ lửng tăng, đồng thời chỉ số bùn giảm mạnh, khi đó hiệu quả loại bỏ phosphorus (P) đạt 100% cho nước thải sinh hoạt [50]

Sử dụng hệ vi sinh bám dính còn có thể loại bỏ được kim loại nặng ra khỏi nước thải Công nghệ loại bỏ Hg2+ khỏi nước thải xí nghiệp hoá chất bằng vi sinh vật chịu được thuỷ ngân được phát minh và ứng dụng tại Trung tâm công nghệ sinh học GBF, Brauschweig, CHLB Đức Các chủng vi sinh vật dòng

Psedomonas được cấy lên các vật liệu bám dính của bể phản ứng sinh học

bioreactor Nước thải công nghiệp hoá chất có nồng độ thuỷ ngân 3-10mg Hg/l

được trung hoà và cung cấp liên tục vào bể bioreactor với lưu lượng 0,7m3/h - 1,2m3/h Hiệu quả xử lý thuỷ ngân đạt 97% với thời gian xử lý 10h Nồng độ thuỷ ngân trong nước sau khi xử lý là 50g Hg/l Trong trường hợp kết hợp bể bioreactor với hấp thụ bằng than hoạt tính, nồng độ thuỷ ngân (Hg) sau khi xử lý đạt 10g Hg/l [49]

Ở Việt Nam hoàn toàn có thể áp dụng các mô hình công nghệ ở trên Tuy nhiên, do điều kiện khí hậu nhiệt đới, thêm vào đó là thành phần nước thải của Việt Nam như BOD, COD, N, P khác nhiều so với thành phần nước thải của các nước phát triển (Âu, Mỹ) mà việc áp dụng có hiệu quả các công nghệ xử lý triệt

để nước thải sinh học tiên tiến cần phải được nghiên cứu bổ sung bằng mô hình pilot thực nghiệm trong phòng thí nghiệm hoặc tại các khu đô thị và công nghiệp

để lựa chọn các thông số kỹ thuật công nghệ, thích hợp với điều kiện Việt Nam

1.1.3.3 Chất mang và các phương pháp cố định tế bào

a Chất mang:

Trong lọc sinh học hiện nay người ta sử dụng hai loại vật liệu lọc (hay còn gọi là chất mang) chia thành loại tự nhiên và loại nhân tạo Loại vật liệu tự nhiên như đất, phân compốt, than bùn thì trong quá trinh vận hành người ta không cần cung cấp dinh dưỡng cho VSV Loại tổng hợp như thủy tinh, len thì trong quá trình lọc người ta cần cung cấp dinh dưỡng cho vi sinh vật hoạt động Nguyên liệu lọc điển hình là hỗn hợp của các chất nền ủ phân compost, đất, cây thạch nam (heather), plastic ( nhựa) và các phụ phẩm gỗ Các nguyên liệu lọc nhằm cung cấp diện tích bề mặt lớn để hấp thụ và hấp phụ các chất ô nhiễm Ngoài ra nó còn làm nhiệm vụ cung cấp chất dinh dưỡng cho các vi sinh vật Một vài loại nguyên liệu lọc không đáp ứng được về nhu cầu dưỡng chất cho vi sinh vật, do đó chúng ta phải hiệu chỉnh bằng cách cho thêm vào các hợp chất đạm và phospho

Các nguyên liệu lọc thường có tuổi thọ từ 5 - 7 năm trước khi phải thay mới Các điểm cần quan tâm khi quyết định chọn nguyên liệu lọc:

 Khả năng giữ ẩm để tạo lớp màng sinh học

 Có diện tích bề mặt lớn tạo điều kiện cho quá trình hấp thụ và phát triển của

vi sinh vật

 Có chứa các dưỡng chất để cung cấp cho các vi sinh vật

 Tạo lực cản không khí thấp (giảm mức độ sụt áp và năng lượng cần sử dụng cho máy bơm)

 Các tính chất lý học khác như độ ổn định lý học và dễ dàng thao tác

Thông thường người ta phân loại chất mang dùng để cố định tế bào vi sinh vật ra thành 2 nhóm

- Nhóm có nguồn gốc tự nhiên: alginate, agar, k-carrageenan, collagen, gelatin, agarose, chitosan …

- Nhóm chất mang nhân tạo: polyacrylamide, polyester, polyurethane, PVA (polyvinyl alcohol), polyethylene glycol, sành sứ (ceramic), zeolite, gỗ…

Một số loại chất mang được sử dụng phổ biến trong phương pháp cố định

tế bào để xử lý nước thải bao gồm:

+Alginate:

Alginate là một polymer mạch thẳng, không phân nhánh bao gồm các monomer là acid -D-mannuronic và acid -L-guluronic Trong tự nhiên alginate thường tồn tại ở dạng Na-alginate, K-alginate, Mg-alginate, Ba-alginate Na-alginate thường được dùng và nó có khả năng tạo gel với hầu hết những muối của kim loại hóa trị II, III, IV Quá trình cố định tế bào sử dụng alginate làm chất mang thường đơn giản và được sử dụng rộng rãi

+Polyvinyl alcohol (PVA):

PVA có những đặc tính như : khả năng hình thành màng mỏng tốt, khả năng bám dính tốt, khả năng nhũ hóa (emulsifying) Nó cũng có khả năng chống lại dầu mỡ, dung môi Nó không độc và không có mùi Có khả năng co giãn cao,

có tính mềm dẻo … những thuộc tính này tùy thuộc vào độ ẩm

Đây là một polymer tổng hợp được dùng nhiều cho việc cố định tế bào vì

nó ít độc và rất bền Nó cũng được dùng cho cố định enzyme (glucoamylase, invertase, cellulase) Hai tác giả Hashimoto và Furukawa đã phát triển một phương pháp cố định bùn hoạt tính mới bằng việc sử dụng PVA liên kết chéo với acid boric, kết quả tạo ra những hạt có độ bền cao và ít mất hoạt tính sinh học (năm 1987) Trong phần thí nghiệm này, chúng tôi ứng dụng PVA làm chất mang để cố định tế bào vi khuẩn trong việc xử lý nước thải

+polyetylen (PE):

Polyetylen là một nhựa nhiệt dẻo được sử dụng rất phổ biến trên thế giới

Polyetylen là một hợp chất hữu cơ (poly) gồm nhiều nhóm etylen CH2-CH2 liên kết với nhau bằng các liên kết hydro no

+ K-Carrageenane :

K-carrageenan gồm các đơn phân là D-galactose sulfate và D-galactose Đây là một trong những vật liệu được sử dụng sớm nhất cho việc cố

3,6-anhydro-định tế bào sản xuất liên tục L-lactic acid bằng E.Coli cố 3,6-anhydro-định Quá trình cố 3,6-anhydro-định

tương tự như gel alginate

+ Cellulose triacetate:

Cellulose triacetate và những chất sợi xốp khác đã được sử dụng để nhốt enzyme Hoạt tính và tính ổn định của enzyme cao hơn so với nhựng chất sợi cellulose khác Cellulose triacetate cũng có thể được dùng ở dạng sợi, màng mỏng Đây là loại vật liệu có sức bền cơ học cao Độ xốp của nhóm chất mang này cho phép sự khuyếch tán tự do của những hợp chất có phân tử lượng thấp, nhưng không cho enzyme, tế báo thoát ra (do có kích thuớc lớn) Tính chất này

là một nhược điểm làm hạn chế khả năng sử dụng của cellulose triacetate như một chất đệm cho chế phẩm sinh học phân hủy FOG, do FOG thường có phân tử lượng từ trung bình đến cao

khả năng hoạt động lâu dài Ngày nay việc cố định tế bào vào ceramic xốp có thể được thực hiện bằng cách cho dịch huyền phù tế bào chảy qua một lớp ceramic (a ceramic bed) hay lắc dịch huyền phù tế bào với chất mang ceramic.Người ta

đã ứng dụng ceramic để cố định tế bào nấm men nhằm sản xuất alcohol và nước tương Tuy nhiên giá thành của ceramic đắt là nguyên nhân chính để chất này không được áp dụng rộng rãi

b Các phương pháp cố định tế bào:

Cố định tế bào có thể hiểu là việc bắt giữ tế bào hoặc định vị các tế bào nguyên vẹn tạo ra sự cố định chắc chắn nhằm duy trì các đặc tính sinh học của tế bào Sự cố định này làm tăng khả năng chống chịu của các tế bào bởi các điều kiện khác thường như pH và nhiệt độ, giúp cho việc ứng dụng vào các quá trình khác một cách có hiệu quả

Trong xử lý nước thải, cố định tế bào là một kỹ thuật mới đã được nghiên cứu và ứng dụng trong nhiều hệ thống xử lý Cố định tế bào có nhiều ưu điểm hơn so với tế bào lơ lửng tự do Việc cố định tế bào có thể bảo vệ tế bào chống lại sự cạnh tranh của các vi sinh khác và sự ức chế của các tác nhân hoá học, tránh được sự rửa trôi tế bào trong quá trình sử dụng Ngoài ra còn có thể sử dụng lại tế bào nhiều lần, giúp giảm thiểu chi phí Với những ưu điểm như vậy,

kỹ thuật cố định tế bào thường được áp dụng đối với những quá trình xử lý nước thải sử dụng vi khuẩn tự dưỡng (VD như vi khuẩn khử nitrat) [21]

Có nhiều kỹ thuật cố định tế bào, thông thường người ta phân ra làm 4 loai: [21]

- Hấp phụ lên bề mặt chất mang rắn, trơ

- Bắt nhốt vào các vật liệu bám thấm như hydogel, sợi hoặc màng

- Kết nối đồng hoá trị với các tác nhân liên kết chéo

- Cố định không chất mang (carrierless immobilisation) bao gồm sự hình thành tập hợp tế bào bằng việc kết bông tự nhiên hoặc nhân tạo

Trong các quy trình xử lý nước thải người ta thường sử dụng 3 phương pháp chính: hấp phụ, bắt nhốt và cố định không chất mang

Hình 1.1.1 Các phương pháp cố định tế bào[21]

1 Hấp phụ:

Hấp phụ là kỹ thuật đơn giản và cổ điển nhất trong việc cố định lượng lớn

tế bào Các tế bào tự động gắn vào vật mang và hình thành một lớp màng mỏng gọi là màng sinh học(biofilm) Những vật liệu khác nhau như thuỷ tinh xốp, than, cát, gỗ mùn) đều được sử dụng làm vật liệu mang Gần đây, các vật liệu nhựa với các hình dạng tròn, vuông hoặc các hình dạng khác đã được sử dụng vì chúng rẻ tiền và có bề mặt tiếp xúc lớn Các quy trình sử dụng màng sinh học đã được áp dụng ở những hệ thống riêng biệt Lọc nhỏ giọt là hệ thống được sử dụng ở Anh từ năm 1893 [21] Đá dăm là vật liệu được sử dụng đầu tiên trong hệ thống này Các quá trình xử lý này sử dụng kỹ thuật màng sinh học để loại bỏ các hợp chất hữu cơ ra khỏi nước thải Chúng cũng được sử dụng đối với quá trình khử nitrit và quá trình kết tủa kim loại Kỹ thuật hấp phụ có thể sử dụng hiệu quả mà không có sự rửa trôi tế bào từ hệ thống

2 Bắt nhốt

Bắt nhốt cũng là một kỹ thuật cố định chính và được áp dụng vào rất nhiều

hệ thống Các tế bào được bắt nhốt vào những vật liệu trơ khác nhau, cả polyme

tự nhiên và polyme nhân tạo còn được gọi là gel hydo Các polyme tự nhiên (ví

dụ như aga, carrageenan, alginate) thường được sử dụng trong những mô hình thí nghiệm nhỏ Tuy nhiên, các polyme này không thích hợp khi áp dụng thực tế do chúng dễ bị ảnh hưởng bởi các thác nhân cơ học và dễ bị phân huỷ bởi các loài

vi sinh vật khác Các polyme nhân tạo (ví dụ như polyvinyl alcôhl, polyetylen glycol) thường được dùng trong thực tế Phương pháp bắt nhốt này giúp bảo vệ những tế bào có ích chống lại các vi sinh vật có hại và các tác nhân có hại khác

từ dòng nước thải Phương pháp này thường được dùng trong các quá trình khử nitrit và các quá trình biến đổi sinh học phức tạp khác Kỹ thuật này ít được sử dụng trong các trường hợp loại bỏ các hợp chất hữu cơ ra khỏi dòng nước thải bằng phương pháp tự dưỡng thông thường vì chi phí cho phương pháp này là đắt nhất trong số các phương pháp cố định [21]

3.Cố định không chất mang

Cố định không chất mang thường được sử dụng trong các hệ thống UASB Dòng nước thải chảy ngược trong các tank phản ứng thúc đẩy sự tập kết các tế bào lại với nhau thông qua quá trình kết bông tự nhiên Sự tập kết ban đầu từ các hạt phôi sẽ phát triển thành các hạt trưởng thành có đường kính khoảng vài milimet Quy trình UASB sử dụng các hạt kết tụ này thường được chú ý nhiều trong việc xử lý nước thải ô nhiễm chất hữu cơ cao do các hạt bông này có hàm lượng sinh khối cao và giàu vi sinh vật đa dạng Sự kết hạt bông được hình thành trong cả điều kiện hiếu khí và kị khí Tuy nhiên, một trở ngại chính của kỹ thuật

cố định này là khoảng thời gian kết hạt bông dài, thường khoảng từ 2-8 tháng

Đã có nhiều biện pháp được đưa ra nghiên cứu và thử nghiệm để rút ngắn khoảng thời gian này Phương pháp có định này thường được áp dụng chính trong các hệ thống xử lý nước thải ô nhiễm chất hữu cơ cao.[21]

CHƯƠNG II NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị

2.1.1 Môi trường nuôi cấy

a Môi trường phân lập, giữ giống:

Pseudomonas Isolation Agar [17]

Hòa tan 45g bột môi trường vào 1 lít nước cất chứa 20ml glycerol Khuấy đều Sau đó vừa đun nóng cho đến khi sôi 1 phút để hòa tan hoàn toàn Cuối cùng hấp ở 121oC trong vòng 15 phút

b Môi trường nhân giống

 Tủ cấy Basaire (Anh)

 Cân kỹ thuật Ohaus (Canada)

 Cân điện tử Precisa (Thụy Sĩ)

 Kính hiển vi quang học Olympus CH30 (NhậtBản)

 Nồi hấp thanh trùng Tomy SS325 (Nhật Bản)

 Máy lắc ổn nhiệt Gyromax 737R (Mỹ)

 Máy đo DO, pH Horiba W 2010 (Nhật bản)

 Máy đo pH Hanna HI 9811 (Bồ Đào Nha)

 Máy Drell 2010 (Mỹ)

 Máy xác định COD Hach (Mỹ)

 Máy ly tâm (Pháp)

 Máy so màu (Nhật)

 Đĩa petri, bình định mức các loại, bình tam giác 100ml, 500ml, pipet 50

ml, que cấy các loại

2.1.3 Nguyên vật liệu và hóa chất

- Hóa chất làm môi trường: Yeast extract, glucose, agar, Skim milk, tinh bột tan, FeSO4 7H2O, pepton, MgCl2; K2SO4; NaCl, MgSO4, KCl, CaCl2;

K2HPO4, FeSO4, ZnSO4

- Hóa chất phân tích: H2SO4, KMnO4, Axit oxalic, K2Cr2O7, Ag2SO4, Fenanthroline monohidrat, Fe(NH4)2(SO4)2.6H2O, KI, KCNS, CuSO4.H2O, thymolphtalein, NaOH, êtanol, ête, (NH4)2(SO4),

Na2HPO4.7H2O, CH3COOH ,CH3COONa

- Kit phân tích: Cuver 1 Copper Reagent Powder Pillows, Copper Masking Reagent Powder Pillows, Porphyrin 1 Reagent Powder Pillows, Porphyrin

2 Reagent Powder Pillows, COD Catalyst Powder, Potassium Dichromate Standard Solution, 0.250N, Sulfuric Acid, ACS

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp lấy mẫu

Vi khuẩn Pseudomonas được phân lập từ các mẫu bùn cống tại chợ Vĩnh Hồ, nước thải tại một số nhà máy chế biến thực phẩm, lò mổ gia súc Khương

Thượng, nước sông Tô Lịch, đất…

2.2.2 Phương pháp phân lập

Tiến hành pha loãng mẫu có chứa Pseudomonas ở các nồng độ thích hợp sao cho các khuẩn lạc mọc riêng rẽ Sau đó lấy 50l dịch pha loãng các cấp độ khác nhau nhỏ lên bề mặt môi trường thạch Pseudomonas, trang đều Nuôi ở tủ ấm ở 35oC trong 24 giờ Chọn những khuẩn lạc riêng rẽ làm sạch và cấy lên môi trường thạch nghiêng, đồng thời quan sát hình thái tế bào dưới kính hiển vi quang học Các khuẩn lạc đã lựa chọn được làm sạch và cấy truyền vào ống nghiệm thạch nghiêng, làm tiêu bản nhuộm fuchsin để quan sát hình thái tế bào

2.2.3 Phương pháp xác định hình thái bào tử, tinh thể

Hình thái tế bào sinh dưỡng, bào tử, tinh thể trong quá trình phát triển trên môi trường phân lập được quan sát, chụp ảnh trên kính hiển vi quang học Olympus CH30 Nhận biết tế bào, bào tử và tinh thể bằng mức độ bắt màu với dịch Fusin bazo: tế bào bắt màu đỏ hồng, bào tử không bắt màu trong suốt, tinh thể bắt màu

đỏ đậm

2.2.4 Phương pháp đếm số lượng bào tử

Tế bào sinh dưỡng và bào tử tự do được đếm bằng buồng đếm hồng cầu

Neubauer Số lượng tế bào bào tử của Pseudomonas còn được xác định theo phương pháp đếm số khuẩn lạc phát triển trên môi trường thạch Petri Nuôi trên

hộp petri trong khoảng 24-72 giờ ở nhiệt độ 28-30oC Số lượng bào tử trong 1ml bằng sô khuẩn lạc trên hộp petri nhân với hệ số pha loãng

2.2.5 Các phương pháp xác định các chỉ tiêu nước thải

2.2.5.1 Xác định nhu cầu oxi hóa học

a) Phương pháp phân tích COD bằng KMnO4

b) Phương pháp phân tích COD bằng Kali Bicromat theo TCVN 6491:1999

2.2.5.2 Xác định pH: bằng máy đo Hanna HI 9811 (Bồ Đào Nha)

2.2.5.3 Xác định NH 4 + , NO 2 - : bằng máy DRELL 2010 (Mỹ)

2.2.6 Môi trường thử hoạt tính enzim vi sinh vật

a) Thử khả năng sinh proteaza

- Peptone from cazein: 5g

b) Thử khả năng sinh amilaza

- Peptone from cazein: 5g

- Thuốc nhuộm lugol 1%

Phương pháp chung thử hoạt tính enzim:

Đổ dịch lỏng vào các hộp petri với số lượng sao cho khi thạch đông lại có chiều dày 3mm Cấy chấm các chủng lên đĩa thạch Nuôi trong tủ ấm ở nhiệt độ 30-32C trong 18 giờ Sau đó đối với mẫu xác định hoạt lực amylaza tráng đều khắp mặt thạch bằng thuốc nhuộm luigol, giữ nguyên mẫu trong 15 phút, gạn bỏ thuốc nhuộm và quan sát vòng thuỷ phân Còn đối với mẫu xác định hoạt lực proteaza thì quan sát vòng thủy phân luôn

2.2.7 Phương pháp định tên vi sinh vật

2.2.7.1 Tách chiết ADN

Vi sinh vật được nuôi cấy 2 ngày trên môi trường thích hợp Lấy 1 vòng que cấy tế bào vào ống eppendorf vô trùng, thêm 500 µl 2×SSC vào mỗi ống Lắc đều và giữ ở 99 C trong 10 phút Ly tâm 13000 vòng/phút trong 2 phút Hút bỏ phần dịch và tiến hành rửa tế bào 1 lần bằng nuớc cất vô trùng Thêm khoảng

100 µl hạt thủy tinh có đường kính 0,2 - 0,5 mm (Roth, Đức), 100 µl dung dịch phenol/chloroform (tỉ lệ 1:1) và 100 µl nước cất vô trùng Lắc ở 1400 vòng/phút trong 10 phút trên máy Thermocomfort (Eppendorf, Đức) sau đó ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút Lấy phần dịch trong phía trên có chứa ADN làm khuôn cho phản ứng PCR ADN sau khi tách chiết được giữ ở -20C

2.2.7.2 Định tên vi sinh vật bằng giải trình tự

Phân đoạn 16S rADN của vi khuẩn được khuyếch đại trên thiết bị GeneAmp® PCRSystem 9700 (PE Applied Biosystem, Mỹ) sử dụng cặp mồi 16S-8F (5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’) và 16S1510R (5’-GGCTACCTTGTTACGA-3’) Chương trình nhiệt được thiết lập với pha biến tính ở 94C trong 2 phút kế tiếp là 35 chu kỳ nhiệt (94C trong 30 giây, 52 C

trong 30 giây và 72 C trong 1 phút) Quá trình khuyếch đại được hoàn tất ở 72

C trong 7 phút và sau đó sản phẩm PCR được bảo quản ở 10 C Sản phẩm PCR sau khi khuyếch đại được tinh chế bằng QIAEX II (Qiagen, Đức) theo khuyến cáo của hãng

Trình tự ADN được đọc bằng phương pháp “dideoxy chain termination” với việc sử dụng kit AmpliTaq (Amersham) theo hướng dẫn của hãng với các mồi 16S-8F và 16S1510R (đọc từ hai đầu của sản phẩm PCR) Máy đọc trình

tự, model 377 của hãng Applied Biosystem được sử dụng Các chuỗi ADN được

so sánh với GeneBank thông qua giao diện tìm kiếm BLAST nucleotide đặt tại National Center for Biotechnology Information, Bethesda, Mỹ (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) Các chuỗi liên quan được chuyển tải về sau đó

nucleotide-xử lý bằng phần mềm BioEdit [46] và so sánh bằng ClustalX [45] Cây tiến hóa được hiển thị bằng phần mềm TreeExplorer

CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 Phân lập và tuyển chọn các chủng Pseudomonas

3.1.1 Phân lập các chủng Pseudomonas

Từ các mẫu nước thải, đất, bùn thu thập tại một số điểm lấy mẫu chúng tôi

đã phân lập được 160 khuẩn lạc Từ các khuẩn lạc này chúng tôi đã lựa chọn 30

chủng dựa trên đặc điểm được coi là các chủng Pseudomonas (tế bào hình que,

không có bào tử, tiên mao mọc ở đầu, Gram (-)) Sau đó chúng tôi đã tiến hành đánh giá định tính hoạt lực sinh tổng hợp enzym proteaza và amylaza của 30 chủng này bằng phương pháp khuyếch tán đĩa thạch Trong số này chỉ có 18 chủng là có khả năng sinh tổng hợp enzim proteaza và amylaza Danh mục 18 chủng được trình bày trong bảng 3.1.1

Bảng 3.1.1 Danh sách các chủng giống được khảo sát về khả năng sinh

tổng hợp enzim proteaza và amylaza

TT Ký hiệu tên

chủng

Nguồn gốc phân lập

1 NN3 Nước thải từ cống sau phân xưởng nấu của Xưởng

bia Viện Công nghiệp Thực phẩm

18 NS11 Nước sông Tô Lịch

3.1.2 Đánh giá hoạt lực sinh tổng hợp enzim proteaza của các chủng Pseudomonas phân lập được

Từ 18 chủng giống sơ tuyển được chúng tôi tiến hành chọn lại các chủng

có khả năng sinh tổng hợp enzym proteaza Do đối tượng nghiên cứu là nước thải chế biến sữa Nước thải này chứa một lượng protein rất lớn Vì vậy chúng tôi lựa chọn mục tiêu tuyển chọn là khả năng sinh tổng hợp enzym proteaza tốt Chúng tôi sử dụng phương pháp Folin & Ciocalteu để xác định hoạt lực proteaza Các mẫu được nuôi ở pH =6,0; nhiệt độ là 30oC; thời gian là 42 giờ Kết quả được trình bày trong bảng 3.1.2

Bảng 3.1.2 Khả năng sinh tổng hợp enzim proteaza của các chủng giống

TT Ký hiệu chủng Khả năng tổng hợp enzim proteaza